CN114137115B - 一种采用lc-ms法检测血浆中醋酸优力司特及其代谢物的方法 - Google Patents

一种采用lc-ms法检测血浆中醋酸优力司特及其代谢物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种采用LC‑MS法检测血浆中醋酸优力司特及其活性代谢物单去甲基‑醋酸优力司特的方法，该方法用二氯甲烷/异丙醇对血浆样品进行萃取、进样LC‑MS/MS检测。该方法能检测醋酸优力司特，还能检测其活性代谢物单去甲基‑醋酸优力司特，同时具有快速、高灵敏，使用少量血浆就能同时监测两个组分的特点，可以应用于醋酸优力司特以及活性代谢物单去甲基‑醋酸优力司特的药代动力学与生物等效性研究。

Description

一种采用LC-MS法检测血浆中醋酸优力司特及其代谢物的 方法
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种液相色谱-串联质谱法检测血浆中醋酸优力司特以及活性代谢物单去甲基-醋酸优力司特的方法。
背景技术
醋酸优力司特(Ulipristal acetate,UPA)(11β)-17α-(乙酰氧基)-11-[4-(二甲基氨基)苯基]-19-去甲孕甾-4,9-二烯-3,20-二酮，是一种选择性的孕激素受体调节剂，具有甾体结构。在美国和其他国家的药品被批准为紧急避孕药。在欧洲也是如此已批准用于治疗子宫肌瘤，该药物已进入临床卵巢癌和乳腺癌的治疗进展。UPA有很多潜在的应用目前正在评估，研究一个经过充分验证的且适用性高的分析方法是势在必行的。
现有技术Journal of Chromatography B，1059(2017)43-48)公开一种采用LC-MS检测血浆中醋酸优力司特的方法，采用0.1％的甲酸水溶液作为流动相A，0.1％甲酸乙腈溶液作为流动相B，采用总时间为7分钟的梯度洗脱。0.25ml空白人血清或患者血清样品用于UPA的方法开发和定量。将浓度为10ng/mL的内标加入标准品QCs中和样品，旋转并用6毫升己烷：二氯甲烷(60:40v/v)萃取。混合物旋转10分钟，2000rpm离心10分钟，冷冻水层在液氮浴中。收集有机层，并进行处理在氮气流下蒸发。提取物被重新悬浮在空气中1毫升二氯甲烷，旋转，转移至LCMS小瓶中，干燥在氮气下，用100微升的30％甲醇(含有0.1％甲酸,)重新复溶注入LC-MS仪中检测。但是该方法血浆用量大，仅能检测醋酸优力司特，不能检测同时其活性代谢物单去甲基-醋酸优力司特，且检测时间较长。因此，有必要开发一种快速灵敏的LC-MS/MS方法，可同时检测醋酸优力司特及其活性代谢物单去甲基-醋酸优力司特。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)检测血浆样品醋酸优力司特及其代谢物的方法。该方法仅用少量血浆不但可以检测醋酸优力司特(简称“UPA”)的含量，而且还可以同时检测UPA的活性代谢物单去甲基-醋酸优力司特(Dme-UPA)的含量，并根据“生物样品定量分析验证指仅能导原则”进行验证。本文中的HPLC-MS/MS也称“LC-MS或LC-MS/MS”。
为实现本发明的目的，提供如下实施方案。
本发明提供一种采用LC-MS法检测血浆中醋酸优力司特及其代谢物的方法，所述代谢物为单去甲基-醋酸优力司特，该方法包括以下步骤：
(1)取血浆样品用二氯甲烷/异丙醇进行萃取处理；
(2)将萃取得到的样品挥干，用乙腈/水混合溶剂复溶后注入LC-MS/MS仪检测，
其中，色谱柱为C18硅胶柱，0.1％甲酸水溶液为流动相A，0.01％甲酸乙腈溶液为流动相B，采用梯度洗脱法，采用梯度洗脱法，其中，其梯度变化如下：
在一些实施方案中，上述本发明的方法，步骤1)中所述萃取包括：取血浆样品，加入萃取溶剂二氯甲烷/异丙醇，振摇、离心，取上清液，在氮气下蒸发至干燥即得样品。
优选的，上述本发明的方法，步骤1)中所述萃取包括，血浆样品与萃取溶剂混合后，振摇10min，4000rpm离心5分钟，取上清液在氮气下蒸发，蒸发温度为45℃，干燥残留品。
优选的，上述本发明的方法，步骤1)中，血浆样品与萃取溶剂的体积比为1：30，所述萃取溶剂，二氯甲烷与异丙醇的体积比为90/10。
在一优选实施方案中，上述本发明的方法，步骤1)中，血浆量为0.1ml,步骤2)的混合溶剂乙腈/水的量为50μL，其中，乙腈/水的体积比为1：1，进一步包括在血浆中加入20μL内标工作液混匀。
上述本发明的方法，其色谱条件为：流速0.4ml/min、柱温：40℃，进样量：5μL；其质谱条件包括：离子模式：ESI+；毛细管电压：2.5kV；去溶剂温度：500℃；去溶剂流速：1000L/H；离子源温度：150℃；反吹流速：150L/Hr；分析室气体：7.0Bar。
在一具体实施方案中，一种采用LC-MS法检测血浆中醋酸优力司特(UPA)及其代谢物的方法，所述代谢物为单去甲基-醋酸优力司特(Dem-UPA)，该方法包括以下步骤：
(1)对血浆样品进行萃取处理，包括：
取0.1mL血浆样品，加入20μL内标工作液混匀2min，加入3ml萃取溶剂二氯甲烷/异丙醇(9/1v/v)，振摇10min、离心(4000rpm 5min)，取上清液2.4mL到5ml的EP管中，
所述内标工作液为100ng/mL的醋酸优力司特-d6溶液，其溶剂为体积比为甲醇：水＝50:50(或1：1)的混合溶剂；
(2)UPA和Dem-UPA的萃取物的获得，包含将步骤(1)取得的上清液在45℃的氮气下蒸发至干燥(挥干)即得；
(3)UPA和Dem-UPA的萃取物的复溶，包括：用50μL的乙腈/水(1:1v/v)混合溶剂复溶步骤2)的挥干萃取物，复溶液注入LC-MS/MS仪检测。
其中，LC-MS/MS的色谱条件和质谱条件为：
所述色谱条件包含：以0.1％甲酸水溶液为流动相A，0.01％甲酸乙腈溶液为流动相B，以ACQPITY UPLC BEH C18 1.7μm 2.1x50mm为色谱柱，流速0.4ml/min、柱温40℃，进样量5μL，采用梯度洗脱，其梯度变化如下：
所述质谱条件包括：离子模式：ESI+；毛细管电压：2.5kV；去溶剂温度：500℃；去溶剂流速：1000L/H；离子源温度：150℃；反吹流速：150L/Hr；分析室气体：7.0Bar。
优先的，在上述具体实施方案中，本发明的方法，所述色谱条件还包括：用于定量的离子反应分别为m/z 476.41/134.42(醋酸优力司特)、锥孔电压40V、碰撞能量24V，m/z462.31/402.51(单去甲基-醋酸优力司特)、锥孔电压39V、碰撞能量16V，m/z 482.63/140.31(醋酸优力司特-d6)、锥孔电压40V、碰撞能量26V。
令人惊奇的是，本发明的方法，因采用向含UPA及其活性代谢产物Dme-UPA的血浆样品中加入二氯甲烷/异丙醇的萃取溶剂提取样品，不但可以提高检测限，减少血浆量，而且还可同时提取出UPA和Dem-UPA，并在同一个用时较短的液相梯度下同时检测UPA和Dem-UPA两个组分，使本发明的方法在血浆用量低到0.1mL时也能实现检测。
本发明的有益效果：
(1)本发明针对伊醋酸优力司特以及活性代谢物单去甲基-醋酸优力司特的性质，可以使用液相色谱-串联质谱法测定。
(2)本发明新开发的液液萃取的方法，能同时萃取出醋酸优力司特以及活性代谢物单去甲基-醋酸优力司特两种组分，比分别处理血浆样取更简单，经济，使用更少的血浆样品；并对色谱条件进行优化，使醋酸优力司特以及活性代谢物单去甲基-醋酸优力司特两个待测组分在同一个液相色谱条件上保留显著，避免内源性物质的干扰。可以用在醋酸优力司特以及活性代谢物单去甲基-醋酸优力司特的药物代谢研究与生物等效性研究。
附图说明
图1为醋酸优力司特[M+H]+的产物离子扫面图；
图2为单去甲基-醋酸优力司特的[M+H]+的产物离子扫面图；
图3为醋酸优力司特-d6[M+H]+的产物离子扫面图；
图4为空白血浆样品中醋酸优力司特(4-1)和定量下限样品中醋酸优力司特(4-2)的典型色谱图；
图5为空白血浆样品中单去甲基-醋酸优力司特(5-1)和定量下限样品中单去甲基-醋酸优力司特(5-2)的典型色谱图；
图6为空白血浆样品中醋酸优力司特-d6(6-1)和定量下限样品中醋酸优力司特-d6(6-2)的典型色谱图；
图7为比格犬给药后的醋酸优力司特血浆药物-时间曲线；
图8为比格犬给药后的单去甲基-醋酸优力司特血浆药物-时间曲线。
具体实施方式
以下实施例是示例性的，旨在对本发明作进一步的详细说明，以助理解本发明的实质。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解相同的含义。
以下实施例中所用的试验材料，除非有具体说明，则均为通过商业渠道购买得到的常规的试验材料，其中：
醋酸优力司特(批号：161010，纯度：99.65％)原料药；单去甲基醋酸优力司特(批号：4071-044A3，纯度：98.7％)购于TLC；醋酸优力司特-d6(批号：3077-045A3，化学纯度99.6％，同位素纯度：99.0％，水分2.0％)购于TLC；质谱级甲酸购于Fisher公司；色谱级甲醇、乙腈均购于德国默克公司；质谱级异丙醇购于Fisher公司；二氯甲烷购于成都科隆；去离子水由Milli-Q Reference超纯水仪制备。
Waters公司的超高效液相色谱串联四级杆质谱联用仪，型号：UPLC I-Class/XevoTQ-s和Waters UNIFI V1.8数据处理软件；色谱柱为Waters ACQPITY UPLC BEH C18 1.7μm2.1x50mm；湘仪的台式离心机；MD200-2氮气吹扫仪。
实施例1液相色谱-串联质谱法检测血浆中醋酸优力司特和单去甲基醋酸优力司特
1.血浆样品的前处理
取0.1mL血浆样品，加入20μL内标工作液(100ng/mL)混匀2min，加入3ml萃取溶剂二氯甲烷/异丙醇(9/1v/v)，振摇10min、离心(4000rpm 5min)，取上清液2.4mL加入到5ml的EP管中，在45℃的氮气下蒸发至干燥后，再用50μL乙腈/水(1:1v/v)的混合溶剂来复溶。复溶液转移至96孔板中，进行LC-MS/MS分析。结果见图1，图2和图3，分别代表醋酸优力司特，单去甲基-醋酸优力司特以及醋酸优力司特-d6的典型质谱图。
2.标准系列样品和质控样品的配制
(1)醋酸优力司特储备液的配制
分别称取两份醋酸优力司特标准品置5mL容量瓶中，用50％甲醇溶解，定容，获得浓度分别为1.25mg/mL和1.38mg/mL的醋酸优力司特储备液，一份用于标准系列溶液的配制，一份用于质控溶液的配制。
(2)单去甲基-醋酸优力司特储备液的配制
分别称取两份单去甲基-醋酸优力司特标准品置5mL容量瓶中，用50％甲醇溶解，定容，获得浓度分别为1.39mg/mL和1.45mg/mL的单去甲基-醋酸优力司特储备液，一份用于标准系列溶液的配制，一份用于质控溶液的配制。
(3)醋酸优力司特和单去甲基-醋酸优力司特标准曲线用混合溶液的配制
分别将配制标准曲线用的醋酸优力司特储备液和单去甲基-醋酸优力司特储备液分别用50％的甲醇稀释至20μg/mL，再分别取20μg/mL的醋酸优力司特溶液500μL和20μg/mL的单去甲基-醋酸优力司特溶液500μL混匀，即得标准曲线醋酸优力司特及单去甲基-醋酸优力司特均为10μg/mL的混合溶液。
(4)醋酸优力司特和单去甲基-醋酸优力司特质控混合溶液的配制
分别将配制质控用的醋酸优力司特储备液和单去甲基-醋酸优力司特储备液用分别50％的甲醇稀释至20μg/mL，再分别取20μg/mL的醋酸优力司特溶液500μL和20μg/mL的单去甲基-醋酸优力司特溶液500μL混匀，即得质控用醋酸优力司特及单去甲基-醋酸优力司特均为10μg/mL的混合溶液。
(5)标准曲线样品和质控样品的配制
分别取醋酸优力司特和单去甲基-醋酸优力司特标准曲线用混合溶液以及醋酸优力司特和单去甲基-醋酸优力司特质控混合溶液，用50％的甲醇稀释获得标准曲线和质控样本的工作液，以空白血浆稀释成标准系列工作液和质控工作液，获得浓度分别0.2、0.5、1、5、50、100、150和250ng/mL标准曲线系列样品，以及浓度分别为0.2(LLOQ)、0.6(QL)、25(QML)、125(QMH)和200(QH)ng/mL的质控样品。
3.LC-MS/MS分析:
3.1色谱条件
采用Waters ACQPITY UPLC BEH C18 1.7μm 2.1x50mm色谱柱，以0.1％甲酸水溶液为流动相A，0.01％甲酸乙腈溶液为流动相B，梯度洗脱。在0min时，流动相A：流动相B体积比为60:40，在0.5min-1.2min时，流动相A与流动相B的体积比由60:40到5:95，在1.2min-1.8min时，流动相A与流动相B的体积比为5:95，在1.8min-2.0min时，流动相A与流动相B的体积比由5:95到60:40，在2.0min-2.5min时，流动相A与流动相B体积比为60:40；流速0.4ml/min；柱温：40℃；进样量：5μL。
3.2质谱条件
离子模式：ESI+；毛细管电压：2.5kV；去溶剂温度：500℃；去溶剂流速：1000L/H；离子源温度：150℃；反吹流速：150L/Hr；分析室气体：7.0Bar。用于定量的离子反应分别为：m/z 476.41/134.42(醋酸优力司特)，锥孔电压40V，碰撞能量24V；m/z462.31/402.51(单去甲基-醋酸优力司特)，锥孔电压39V，碰撞能量16V；m/z 482.63/140.31(醋酸优力司特-d6)，锥孔电压40V，碰撞能量26V。
实施例2方法学验证
1.选择性
取不同来源的空白血浆0.1mL(n＝6)，分别用实施例1中的方法处理样品，取(不加内标)样品进行质谱分析，获得空白血浆样本色谱图。取不同来源的空白血浆(n＝6)分别配制标准曲线最低点浓度血浆样品0.1mL，用实施例1的方法处理样品，进行质谱分析，标准曲线最低点浓度血浆样品进行质谱分析，评价方法的选择性。
结果表明，内源性物质不干扰醋酸优力司特、单去甲基-醋酸优力司特和醋酸优力司特-d6的测定。典型的空白血浆样本色谱图和典型的LLOQ色谱图见图4，图5和图6。
2.标准曲线
以醋酸优力司特理论浓度为横坐标(x)，醋酸优力司特与内标醋酸优力司特-d6的面积比为纵坐标(y)，进行线性回归计算(权重因子W＝1/x2)，醋酸优力司特的典型回归方程为Y＝0.124*X+0.00191(R2＝0.996854)，醋酸优力司特在0.2-250ng/mL线性关系良好。以单去甲基-醋酸优力司特理论浓度为横坐标(x)，单去甲基-醋酸优力司特与内标醋酸优力司特-d6的面积比为纵坐标(y)，进行线性回归计算(权重因子W＝1/x2)，单去甲基-醋酸优力司特的典型回归方程为Y＝0.0424*X+0.000649(R2＝0.996111)，单去甲基-醋酸优力司特在0.2-250ng/mL线性关系良好。
3.精密度和准确度
方法验证三个分析批，酸优力司特和单去甲基-醋酸优力司特每个分析批检测定量下限样品(LLOQ:0.2ng/mL)、低(QL:0.6ng/mL)、中低(QML:25ng/mL)、中高(QMH:125ng/mL)、高(QH200ng/mL)水平QC样本各6个。计算批内及批间的精密度和准确度。
结果表明：本方法测定醋酸优力司特和单去甲基-醋酸优力司特的精密度和准确度均可接受，酸优力司特和单去甲基-醋酸优力司特的最低定量下限为0.2ng/mL。
4.回收率与基质效应
分析低、中、高质控样本各6个。同时另取空白血浆0.1mL，按血浆样品前处理方法处理；处理完后，按比例在复溶剂中加入醋酸优力司特和单去甲基-醋酸优力司特对照溶液和内标溶液，配制成低、中、高质控样本浓度，进样分析。2种样品中醋酸优力司特峰面积比值即为醋酸优力司特的提取回收率，单去甲基-醋酸优力司特峰面积比值即为单去甲基-醋酸优力司特的提取回收率。结果表明，醋酸优力司特3个浓度水平的提取回收率为82.3％；单去甲基-醋酸优力司特3个浓度水平的提取回收率为85.7％；内标的回收率为88.6％。
取不同来源的空白血浆0.1mL(n＝6)，按血浆样品前处理方法处理；处理完后再按比例在复溶剂中加入醋酸优力司特和单去甲基-醋酸优力司特对照溶液和内标溶液，配制成低、中、高质控样本浓度，进样分析。另取0.1mL的超纯水，按上述步骤处理，进样分析。醋酸优力司特3个质控浓度水平下的内标归一化基质效应因子均值分别为0.899、0.956和0.950，精密度均小于2.24％。单去甲基-醋酸优力司特3个质控浓度水平下的内标归一化基质效应因子均值分别为0.872、0.940和0.916，精密度均小于2.58％。表明在本试验条件下，可以忽略基质效应对醋酸优力司特和单去甲基-醋酸优力司特测定的影响。
上述实验结果表明：本发明的方法经过方法学验证，建立的方法灵敏度高、选择性好、准确、精密、稳定性好，线性良好。
实施列3临床样本检测
醋酸优力司特片药代动力学研究。采用4只比格犬进行实验，其中2只口服参比制剂，剩余2只口服受式制剂。单次给药，每次一片。在给药前和给药后不同时间点采集血样200ul并分离获得血浆。经过7天的洗脱期后，首次服用参比制剂的2只比格犬再次口服受式制剂，首次服用受式制剂的2只比格犬再次口服参比制剂。单次给药，每次一片。在给药前和给药后不同时间点采集血样200ul并分离获得血浆。两次获得的血浆采用本发明建立的方法测定血浆中的醋酸优力司特和单去甲基-醋酸优力司特浓度。其中一只比格犬口服参比制剂和受式制剂的醋酸优力司特药物浓度-时间曲线图，见图7，单去甲基-醋酸优力司特药物浓度-时间曲线图，见图8。
综上实施例的结果表明：本发明的方法通过(二氯甲烷/异丙醇)液液萃取的方法萃取醋酸优力司特和单去甲基-醋酸优力司特，与现有的方法比较，使用更少的血浆量能同时提取并检测两种组分。采用本发明方法可以实现对血浆中醋酸优力司特和单去甲基-醋酸优力司特的快速、高灵敏的检测，可以应用于醋酸优力司特和单去甲基-醋酸优力司特药代动力学与生物等效性的研究。

Claims (7)

1.一种采用LC-MS法检测血浆中醋酸优力司特及其代谢物的方法，所述代谢物为单去甲基-醋酸优力司特，该方法包括以下步骤：
(1)取血浆样品用二氯甲烷/异丙醇进行萃取处理；
(2)将萃取得到的样品挥干，用乙腈/水混合溶剂复溶后注入LC-MS/MS仪检测，乙腈/水的体积比为1：1；
其中，色谱柱为C18硅胶柱，0.1％甲酸水溶液为流动相A，0.01％甲酸乙腈溶液为流动相B，采用梯度洗脱法，
步骤1)中所述萃取包括：取血浆样品，加入萃取溶剂二氯甲烷/异丙醇，振摇、离心，取上清液，在氮气下蒸发至干燥即得样品，血浆样品与萃取溶剂的体积比为1：30，所述的二氯甲烷与异丙醇的体积比为90/10。
2.如权利要求1所述的方法，所述梯度洗脱法，其梯度变化如下：
3.如权利要求1所述的方法，步骤1)中所述的萃取具体包括，血浆样品与萃取溶剂混合后，振摇10min，4000rpm离心5分钟，取上清液在氮气下蒸发，蒸发温度为45℃，干燥残留品。
4.如权利要求1所述的方法，其色谱条件为：流速0.4ml/min，柱温40℃，进样量5μL。
5.如权利要求1所述的方法，其质谱条件包括：离子模式为ESI+，毛细管电压2.5kV，去溶剂温度500剂，去溶剂流速1000L/H，离子源温度150℃，反吹流速150L/Hr，分析室气体7.0Bar。
6.如权利要求1所述的方法，步骤1)的血浆量为0.1ml，步骤2)的混合溶剂乙腈/水的量为50μL。
7.如权利要求6所述的方法，进一步包括在血浆中加入20μL内标工作液混匀，所述内标工作液为100ng/mL的醋酸优力司特-d6溶液，其溶剂为体积比甲醇：
水＝1:1的混合溶剂。
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