CN109020968A

CN109020968A - 小檗碱晶体盐及其制备方法

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Publication number: CN109020968A
Application number: CN201810856177.XA
Authority: CN
Inventors: 朱静; 周慧宇; 索金帅; 张卓珺
Original assignee: Nanjing University of Chinese Medicine
Current assignee: Nanjing University of Chinese Medicine
Priority date: 2018-07-31
Filing date: 2018-07-31
Publication date: 2018-12-18

Abstract

本发明提供了两种小檗碱晶体盐及其制备方法，即十二烷基硫酸小檗碱、布洛芬小檗碱，并公开了制备方法，分别测定其熔点、溶解性，使用核磁共振氢谱、X‑射线衍射以及差示扫描量热分析法对其进行结构和理化性质的研究，继而对大鼠进行灌胃给药，经时血药浓度通过高效液相色谱法进行测定，考察小檗碱离子液体的口服相对生物利用度，结果发现可以通过制备药物离子液体小檗碱的方法来提高生物利用度，为小檗碱在临床推广应用提供了强有力的证据，总而言之，药物离子液体的研究能够为探索提高药物的生物利用度、促进药物吸收提供了一条新的思路，具有很大的发展潜力和空间，意义深远。

Description

小檗碱晶体盐及其制备方法

技术领域

本发明属于药物化学技术领域，具体涉及两种小檗碱晶型及其制备方法。

背景技术

小檗碱(berberine)又称黄连素，是一种从毛茛科植物中提取出的季铵类生物碱，目前已广泛地将其作为抑菌、抗感染药物来使用。近年来有学者发现，小檗碱在应对胃肠炎、肿瘤、心律失常、高血脂等疾病时同样能表现出很好的治疗效果，小檗碱盐酸盐是临床上使用最为广泛的药物形式。但现有药动学研究指出小檗碱盐酸盐口服吸收较差、生物利用度低并且大剂量服用时胃肠道反应严重，这在很大程度上对拓宽小檗碱的临床运用造成了阻碍。为解决此类问题，现多通过结构修饰和制剂学的方法来改善小檗碱的口服生物利用度。

离子液体是一类由有机阳离子和有机阴离子所构成的有机盐类，其熔点能够低于100℃。离子液体可以通过配对不同的阴阳离子而获得，并由此具备一些特殊的性质，这种结构可设计的盐类逐渐引起了医药行业的广泛关注。现有的研究表明，可将目标药物离子和与它相对应的反离子进行结合，并由此获得药物离子液体。反离子的选择范围十分的广泛，既可以是药用辅料，例如阴离子表面活性剂，也可以是一些自身就具备某些药理作用的其他药物离子。制备得到的药物离子液体与传统的盐类药物相比在脂溶性、晶型、生物膜透过性、生物利用度等方面性质差异较为明显，为优化药物吸收提供了新的思路。

目前，尚未有关于提高小檗碱生物利用度的新技术方法的报道。

发明内容

为了克服现有小檗碱脂溶性低、生物利用度低等不足，本发明提供了小檗碱新晶型及其制备方法，其制备得到的药物离子液体与传统的盐类药物相比在脂溶性、晶型、生物利用度等方面性质差异较为明显。

本发明提供的两种小檗碱新晶型，其形貌是在显微镜下观察发现，十二烷基硫酸小檗碱呈细密短小的黄色簇状结晶状态，布洛芬小檗碱则是细长的黄色针簇状结晶，二者均与小檗碱黄色絮状的结晶形态有所差异。

一种十二烷基硫酸小檗碱，X射线粉末衍射图谱在衍射角2θ＝4.3°±0.2,12.8°±0.2，19.9°±0.2，18.0°±0.2，19.7°±0.2，25.3°±0.2，8.6°±0.2，17.3°±0.2，18.7°±0.2和22.0°±0.2处有特征峰。

一种布洛芬小檗碱，X射线粉末衍射图谱在衍射角2θ＝3.8°±0.2,9.5°±0.2，20.3°±0.2，16.7°±0.2，10.8°±0.2，28.3°±0.2，24.9°±0.2，19.1°±0.2，22.8°±0.2，11.9°±0.2，7.7°±0.2，18.4°±0.2和13.6°±0.2处有特征峰。

所述的十二烷基硫酸小檗碱，制备方法为：称取小檗碱和十二烷基硫酸钠倒入预先装有磁力搅拌子的三颈瓶中，向其中倒入乙酸乙酯和蒸馏水进行反应，反应结束后将反应液尽数转移到分液漏斗中静置后分离，将乙酸乙酯层静置分离，得到的沉淀即为十二烷基硫酸小檗碱。

所述的十二烷基硫酸小檗碱，制备方法中小檗碱、十二烷基硫酸钠、乙酸乙酯和蒸馏水的重量比为4:3：50-100:50-100。

所述的十二烷基硫酸小檗碱，制备方法为：称取2.0g小檗碱和1.5g十二烷基硫酸钠倒入预先装有磁力搅拌子的三颈瓶中，向其中倒入25g乙酸乙酯和25g蒸馏水进行反应，反应结束后将反应液尽数转移到分液漏斗中静置后分离，将乙酸乙酯层静置分离，得到的沉淀即为十二烷基硫酸小檗碱。

所述的布洛芬小檗碱，制备方法为：称取布洛芬、氢氧化钠以及小檗碱倒入预先装有磁力搅拌子的三颈瓶中，向其中倒入蒸馏水和乙酸乙酯进行反应，反应结束后将反应液尽数转移到分液漏斗中静置后分离，将乙酸乙酯层静置分离，得到的沉淀即为布洛芬小檗碱。

所述的布洛芬小檗碱，制备方法中布洛芬、氢氧化钠、小檗碱、蒸馏水和乙酸乙酯的重量比为1:0.2：1.8：25-100:25-100.

所述的布洛芬小檗碱，制备方法为：称取1.0g布洛芬、0.2g氢氧化钠以及1.8g小檗碱倒入预先装有磁力搅拌子的三颈瓶中，向其中倒入25g蒸馏水和25g乙酸乙酯进行反应，反应结束后将反应液尽数转移到分液漏斗中静置后分离，将乙酸乙酯层静置分离，得到的沉淀即为布洛芬小檗碱。

本发明提供的小檗碱新晶型，用差示扫描量热仪(DSC)测定，十二烷基硫酸小檗碱在219.888℃有一个熔化吸热峰，布洛芬小檗碱在111.049℃和151.775℃有两个熔化吸热峰,测试条件范围30-250/300℃，升温10℃/min，保护氮气50mL/min，如附图2A-2B所示。

本发明所述的小檗碱新晶型，十二烷基硫酸小檗碱和布洛芬小檗碱在水中的溶解度较小檗碱均有下降，表示其水溶性降低。二者在正辛醇中的溶解度较小檗碱均有增加，十二烷基硫酸小檗碱在正辛醇中的溶解度约是小檗碱的1.5倍，布洛芬小檗碱则达到了小檗碱的15倍，这说明十二烷基硫酸小檗碱和布洛芬小檗碱的脂溶性较小檗碱均有增强，并且布洛芬小檗碱脂溶性提高更为显著。对比十二烷基硫酸小檗碱和布洛芬小檗碱的水溶性和脂溶性数据发现，布洛芬小檗碱的脂溶性和水溶性均优于十二烷基硫酸小檗碱。

本发明所述的小檗碱、十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸小檗碱、布洛芬、布洛芬小檗碱结果表明制备所得的十二烷基硫酸小檗碱和布洛芬小檗碱中同时含有小檗碱母核和相应的反离子结构，并且阴阳离子结合处附近碳原子上的氢的化学位移值均发生了显著变化。

本发明将小檗碱分别与常用的药用辅料十二烷基硫酸钠和同样具有抗炎作用的药物布洛芬配对，制备出十二烷基硫酸小檗碱和布洛芬小檗碱两种药物离子液体，其制备方法操作简单，结晶过程易于控制，且制备出的小檗碱新晶型较现有小檗碱有较为明显的差异，并显著提高其生物利用度。

附图说明

图1A是十二烷基硫酸小檗碱的X-射线衍射图，图1B是布洛芬小檗碱的X-射线衍射图；

图2A是十二烷基硫酸小檗碱的的差示扫描量热分析图，图2B是布洛芬小檗碱的差示扫描量热分析图；

图3A小檗碱的¹H NMR，图3B是十二烷基硫酸钠¹H NMR，图3C十二烷基硫酸小檗碱的¹H NMR，图3D是布洛芬的¹H NMR，图3E是布洛芬小檗碱的¹H NMR；

图4是小檗碱吸光度标准曲线图；

图5是小檗碱母核在大鼠血浆中色谱图；

图6是小檗碱母核标准曲线图；

图7是小檗碱母核的平均血药浓度-时间曲线图。

具体实施方式

实施例1

称取2.0g小檗碱和1.5g十二烷基硫酸钠倒入预先装有磁力搅拌子的三颈瓶中，向其中加入25g乙酸乙酯和25g蒸馏水进行反应。反应结束后分液离取乙酸乙酯层，静置使沉淀充分析出。抽滤取滤渣，干燥得十二烷基硫酸小檗碱粗品。

称取制备所得的十二烷基硫酸小檗碱粗品1.0g，倒入大致5g的乙酸乙酯，随后加入乙醇，直到溶液中的固体被溶解。抽滤后取滤液，向滤液中添加大致2倍量的乙酸乙酯，静置使结晶充分地从溶剂中析出。抽滤取滤渣，干燥得到十二烷基硫酸小檗碱精品。

所得产物用于X-射线衍射实验。经测定，十二烷基硫酸小檗碱的X射线粉末衍射图谱在衍射角2θ＝4.3°±0.2,12.8°±0.2，19.9°±0.2，18.0°±0.2，19.7°±0.2，25.3°±0.2，8.6°±0.2，17.3°±0.2，18.7°±0.2和22.0°±0.2处有特征峰，图谱详见附图1A。

实施例2

称取1.0g布洛芬和0.2g氢氧化钠倒入预先装有磁力搅拌子的三颈瓶中，向其中倒入约25g蒸馏水，1.8g小檗碱和25g乙酸乙酯进行反应。反应结束后分液离取乙酸乙酯层，静置使沉淀充分析出。抽滤取滤渣，干燥得布洛芬小檗碱粗品。

称取制备所得的布洛芬小檗碱粗品1.0g，加入大致5g的乙酸乙酯，随后加入乙醇，直到溶液中的固体被溶解。抽滤后取滤液，向滤液中添加大致2倍量的乙酸乙酯，静置使结晶充分地从溶剂中析出。抽滤取滤渣，干燥得到布洛芬小檗碱精品。

所得产物用于X-射线衍射实验。经测定，布洛芬小檗碱X射线粉末衍射图谱在衍射角2θ＝3.8°±0.2,9.5°±0.2，20.3°±0.2，16.7°±0.2，10.8°±0.2，28.3°±0.2，24.9°±0.2，19.1°±0.2，22.8°±0.2，11.9°±0.2，7.7°±0.2，18.4°±0.2和13.6°±0.2处有特征峰，图谱详见附图1B。

实施例3

称取4.0g小檗碱和3.0g十二烷基硫酸钠倒入预先装有磁力搅拌子的三颈瓶中，向其中加入75g乙酸乙酯和75g蒸馏水进行反应。反应结束后分液离取乙酸乙酯层，静置使沉淀充分析出。抽滤取滤渣，干燥得十二烷基硫酸小檗碱粗品。

称取制备所得的十二烷基硫酸小檗碱粗品1.8g，倒入15g的乙酸乙酯，随后加入乙醇，直到溶液中的固体被溶解。抽滤后取滤液，向滤液中添加大致2倍量的乙酸乙酯，静置使结晶充分地从溶剂中析出。抽滤取滤渣，干燥得到十二烷基硫酸小檗碱精品。

所得产物用于差示扫描量热分析实验。经测定，十二烷基硫酸小檗碱在219.888℃有一个熔化吸热峰，布洛芬小檗碱在111.049℃和151.775℃有两个熔化吸热峰,测试条件范围30-250/300℃，升温10℃/min，保护氮气50mL/min，结果如附图2A所示。

实施例4

称取2.5g布洛芬和0.5g氢氧化钠倒入预先装有磁力搅拌子的三颈瓶中，向其中倒入约60mL蒸馏水，4.5g小檗碱和60mL乙酸乙酯进行反应。反应结束后分液离取乙酸乙酯层，静置使沉淀充分析出。抽滤取滤渣，干燥得布洛芬小檗碱粗品。

称取制备所得的布洛芬小檗碱粗品2.3g，加入大致12mL的乙酸乙酯，随后加入乙醇，直到溶液中的固体被溶解。抽滤后取滤液，向滤液中添加大致2倍量的乙酸乙酯，静置使结晶充分地从溶剂中析出。抽滤取滤渣，干燥得到布洛芬小檗碱精品。

所得产物用于差示扫描量热分析实验。经测定，十二烷基硫酸小檗碱在219.888℃有一个熔化吸热峰，布洛芬小檗碱在111.049℃和151.775℃有两个熔化吸热峰,测试条件范围30-250/300℃，升温10℃/min，保护氮气50mL/min，结果如附图2B所示。

实施例5

称取2.0g小檗碱和1.5g十二烷基硫酸钠倒入预先装有磁力搅拌子的三颈瓶中，向其中加入25mL乙酸乙酯和25mL蒸馏水进行反应。反应结束后分液离取乙酸乙酯层，静置使沉淀充分析出。抽滤取滤渣，干燥得十二烷基硫酸小檗碱粗品。

称取制备所得的十二烷基硫酸小檗碱粗品1.0g，倒入大致5mL的乙酸乙酯，随后加入乙醇，直到溶液中的固体被溶解。抽滤后取滤液，向滤液中添加大致2倍量的乙酸乙酯，静置使结晶充分地从溶剂中析出。抽滤取滤渣，干燥得到十二烷基硫酸小檗碱精品。

所得产物用于¹H NMR实验，十二烷基硫酸小檗碱的¹H NMR结果如附图3C所示。

实施例6

称取1.0g布洛芬和0.2g氢氧化钠倒入预先装有磁力搅拌子的三颈瓶中，向其中倒入约25mL蒸馏水，1.8g小檗碱和25mL乙酸乙酯进行反应。反应结束后分液离取乙酸乙酯层，静置使沉淀充分析出。抽滤取滤渣，干燥得布洛芬小檗碱粗品。

称取制备所得的布洛芬小檗碱粗品1.0g，加入大致5mL的乙酸乙酯，随后加入乙醇，直到溶液中的固体被溶解。抽滤后取滤液，向滤液中添加大致2倍量的乙酸乙酯，静置使结晶充分地从溶剂中析出。抽滤取滤渣，干燥得到布洛芬小檗碱精品。

所得产物用于¹H NMR实验，布洛芬小檗碱的¹H NMR结果如附图3E所示。

实施例7

所得产物用于熔点测定、溶解性测定与结构分析。经测定，其熔点测定结果详见表1，溶解性结果详见表5，结构分析结果详见附图3C(十二烷基硫酸小檗碱)。

实施例8

所得产物用于熔点测定、溶解性测定与结构分析。经测定，其熔点测定结果详见表1，溶解性结果详见表5，结构分析结果详见附图3E(布洛芬小檗碱)。

1.熔点

利用显微熔点仪对小檗碱(上海源叶生物科技有限公司公司购买)、十二烷基硫酸-小檗碱(实施例7中制备所得)、布洛芬小檗碱(实施例8中制备所得)的熔点进行测定，观察它们的晶型并且记录每个样品的初熔温度以及终熔温度，每个样品均平行测定3次。实验所得熔点数据如表1所示。

表1小檗碱、十二烷基硫酸小檗碱、布洛芬小檗碱的熔点测定结果(n＝3)

熔点数据表明，制备所得的十二烷基硫酸小檗碱和布洛芬小檗碱的熔点均低于小檗碱，其中布洛芬小檗碱熔点下降极为显著，其熔点甚至低于100℃，这说明十二烷基硫酸小檗碱和布洛芬-小檗碱都具有不同于小檗碱的性质。同时，这两种产物的熔距均在2℃以内，说明制备所得的十二烷基硫酸小檗碱和布洛芬小檗碱纯度均较为理想。

2.溶解性

1)实验条件:

a.测定波长

配置浓度均为10μg ·mL^-1的小檗碱、十二烷基硫酸钠、布洛芬、十二烷基硫酸小檗碱和布洛芬小檗碱的水溶液并对其进行紫外-可见光扫描，发现小檗碱、十二烷基硫酸小檗碱和布洛芬小檗碱的紫外吸收光谱相似且三者在345nm处均存在吸收峰，十二烷基硫酸钠、布洛芬在345nm处对测定均无干扰，因此测定波长选择345nm。

b.标准曲线

精密称取10mg小檗碱对照品于100mL容量瓶中，加水溶解并定容，得到0.1mg ·mL^-1的小檗碱储备液。

用移液枪分别精密吸取小檗碱储备液100μL、500μL、1000μL、1500μL、2000μL、5000μL、7000μL、10000μL加入到10mL容量瓶中，加水定容，得到摩尔浓度分别是2.95、14.74、29.48、44.22、58.95、147.39、206.34、294.77nmol ·mL^-1的小檗碱对照品溶液，在345nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，小檗碱的摩尔浓度为横坐标，绘制标准曲线如附图4所示。

所得标准曲线方程为y＝0.0232x+0.0304，R²＝0.999，线性范围为2.95～294.77nmol ·L^-1，在该浓度范围内小檗碱母核浓度线性关系良好。

c.精密度

取上述低(14.74nmol ·mL^-1)、中(147.39nmol ·mL^-1)、高(294.77nmol ·mL^-1)三种浓度的小檗碱对照品溶液进行测定，每个浓度均分别进行3次平行试验，记录345nm波长处上述各样品的吸光度，然后带入标准曲线方程计算其摩尔浓度。实验结果如表2所示。

表2精密度实验结果(n＝3)

三组样品所测结果的RSD＜2％，精密度满足要求。

d.准确度

取上述低(14.74nmol ·mL^-1)、中(14.74nmol ·mL^-1)、高(294.77nmol ·mL^-1)三种浓度的小檗碱对照品溶液进行测定，每个浓度分别进行3次平行试验，记录345nm波长处上述各样品的吸光度，然后带入标准曲线方程计算其摩尔浓度。其回收率根据小檗碱的测得量与加入量之比求得。实验结果如表3所示。

表3准确度实验结果(n＝3)

三组样品所测得回收率在98.33％～100.69％，RSD＜2％，准确度符合要求。

e.稳定性

配置29.48nmol ·mL^-1的小檗碱水溶液，并分别在第0、2、4、6、8、12小时测定345nm波长处的吸光度，带入标准曲线方程计算其摩尔浓度。实验结果如表4所示。

表4稳定性实验结果

小檗碱水溶液所测得浓度在12个小时内的RSD＜2％，稳定性满足要求。

2)样品溶解性实验：

称取过量的小檗碱、十二烷基硫酸小檗碱和布洛芬小檗碱各两份，一份加入10mL水，另一份加入10mL正辛醇。两组样品均于室温下搅拌24小时后静置12小时。精密吸取两组样品上清液各20μL于10mL的容量瓶中，以水为溶剂的样品组加水定容到刻度。溶剂为正辛醇的样品组加入60μL乙醇后再加水定容。在345nm波长处分别测定两组样品的吸光度，每组样品均进行3次平行试验，带入标准曲线方程计算其浓度。实验结果如表5所示。

表5小檗碱、十二烷基硫酸小檗碱和布洛芬小檗碱在水和正辛醇中的溶解度(n＝3)

实验结果表明，十二烷基硫酸小檗碱和布洛芬小檗碱在水中的溶解度较小檗碱均有下降，表示其水溶性降低。二者在正辛醇中的溶解度较小檗碱均有增加，十二烷基硫酸小檗碱在正辛醇中的溶解度约是小檗碱的1.5倍，布洛芬小檗碱则达到了小檗碱的15倍，这说明十二烷基硫酸小檗碱和布洛芬小檗碱的脂溶性较小檗碱均有增强，并且布洛芬小檗碱脂溶性提高更为显著。对比十二烷基硫酸小檗碱和布洛芬小檗碱的水溶性和脂溶性数据发现，布洛芬小檗碱的脂溶性和水溶性均优于十二烷基硫酸小檗碱，可以猜测布洛芬小檗碱可能会拥有比十二烷基硫酸小檗碱更加良好的药动学性质。

3.含水量

Karl Fischer法测定微量水分(Mettler Toledo Coulometric KF TitratorC30)，结果显示十二烷基硫酸-小檗碱的含水量为2.1％，布洛芬-小檗碱的含水量为6.6％，含水量符合要求。

4.结构分析

取小檗碱(上海源叶生物科技有限公司公司购买)、十二烷基硫酸-小檗碱(实施例7中制备所得)、布洛芬小檗碱(实施例8中制备所得)以及十二烷基硫酸钠(BIOSHARP生物科技公司购买)、布洛芬(上海源叶生物科技有限公司公司购买)各5mg，用0.6mL氘代甲醇(MeOD)试剂(内含0.03％TMS)加以溶解，进行¹H NMR分析。

¹H NMR谱图如附录所示。测得的¹H NMR数据如下。

小檗碱：¹H NMR(500MHz,MeOD)δ9.77(s,1H,H-8),8.70(s,1H,H-13),8.11(d,J＝9.1Hz,1H,H-11),8.00(d,J＝9.1Hz,1H,H-12),7.66(s,1H,H-1),6.96(s,1H,H-4),6.10(s,2H,-OCH₂O-),4.92(t,J＝6.2Hz,2H,H-6),4.20(s,3H,9-OCH₃),4.11(s,3H,10-OCH₃),3.25(t,J＝6.2Hz,2H,H-5).

十二烷基硫酸钠小檗碱：¹H NMR(500MHz,MeOD)δ9.76(s,1H,H-8),8.70(s,1H,H-13),8.11(d,J＝9.1Hz,1H,H-11),8.00(d,J＝9.1Hz,1H,H-12),7.66(s,1H,H-1),6.96(s,1H,H-4),6.10(s,2H,-OCH₂O-),4.95(t,J＝6.2Hz,2H,H-6),4.20(s,3H,9-OCH₃),4.11(s,3H,10-OCH₃),3.96(t,J＝6.6Hz,2H,-OCH₂-),3.26(t,J＝6.2Hz,2H,H-5),1.40(m,20H,-(CH₂)₁₀),0.89(t,J＝6.9Hz,3H,-CH₃).

布洛芬小檗碱：¹H NMR(500MHz,MeOD)δ9.76(s,1H,H-8),8.70(s,1H,H-13),8.11(d,J＝9.1Hz,1H,H-11),7.99(d,J＝9.1Hz,1H,H-12),7.66(s,1H,H-1),7.24(d,J＝8.0Hz,2H,H-A),7.00(d,J＝8.0Hz,2H,H-B),6.96(s,1H,H-4),6.10(s,2H,-OCH₂O-),4.20(s,3H,9-OCH₃),4.10(s,3H,10-OCH₃),3.53(q,J＝7.1Hz,1H,H-C),3.23(m,2H,H-5),2.39(d,J＝7.2Hz,2H,H-D),1.80(m,1H,H-E),1.37(d,J＝7.1Hz,3H,H-F),0.86(d,J＝6.6Hz,6H,H-G).

十二烷基硫酸钠：¹HNMR(500MHz,MeOD)δ3.98(t,J＝6.6Hz,2H,-OCH₂-),1.39(m,20H,-(CH₂)₁₀),0.90(t,J＝6.9Hz,3H,-CH₃).

布洛芬：¹H NMR(500MHz,MeOD)δ7.20(d,J＝8.1Hz,2H,H-A),7.09(d,J＝8.1Hz,2H,H-B),3.66(q,J＝7.1Hz,1H,H-C),2.44(d,J＝7.2Hz,2H,H-D),1.84(dp,J＝13.6,6.8Hz,1H,H-E),1.43(d,J＝7.2Hz,3H,H-F),0.89(d,J＝6.6Hz,6H,H-G).

由以上氢谱数据以及十二烷基硫酸钠和布洛芬的图谱(图3A小檗碱的¹H NMR，图3B是十二烷基硫酸钠¹H NMR，图3C十二烷基硫酸小檗碱的¹H NMR，图3D是布洛芬的¹H NMR，图3E是布洛芬小檗碱的¹H NM)对照分析可知，十二烷基硫酸小檗碱和布洛芬小檗碱的小檗碱母核部分的氢谱数据与小檗碱的氢谱数据基本保持一致；十二烷基硫酸小檗碱的十二烷基硫酸根部分的氢谱数据与十二烷基硫酸钠的氢谱数据基本保持一致；布洛芬小檗碱的布洛芬根部分的氢谱数据与布洛芬的氢谱数据基本保持一致。这显示十二烷基硫酸小檗碱同时含有小檗碱母核和十二烷基硫酸根结构，布洛芬小檗碱同时含有小檗碱母核和布洛芬根结构。

从氢谱的峰强度推断可知，所得十二烷基硫酸小檗碱产物中小檗碱母核和十二烷基硫酸根的摩尔比值为1；布洛芬小檗碱产物中小檗碱母核和布洛芬根的摩尔比值亦为1。对比十二烷基硫酸小檗碱、小檗碱、十二烷基硫酸钠的化学位移值发现，小檗碱结构中第5、6、8位H的化学位移值发生了变化，十二烷基硫酸钠结构中-OCH₂-的H化学位移值发生了变化；对比布洛芬小檗碱、小檗碱、布洛芬的化学位移值发现，小檗碱结构中第5、6、8位H的化学位移值发生了变化，布洛芬结构中第A、B、C、D位H的化学位移值均发生了显著变化。二者化学位移值发生显著变化的H均位于于阴阳离子结合点附近的C原子上。上述结果进一步说明，制备所得的十二烷基硫酸小檗碱和布洛芬小檗碱中同时含有小檗碱母核和相应的反离子结构，并且他们二者的结合相当紧密。十二烷基硫酸小檗碱和布洛芬小檗碱并非二者相应反应物的物理混合物。

解析十二烷基硫酸钠小檗碱和布洛芬小檗碱¹H NMR谱图共振峰归属。根据小檗碱、十二烷基硫酸钠和布洛芬的反应推断其结构式如附图3A(小檗碱)、3B(十二烷基硫酸钠)、图3C(十二万基硫酸小檗碱)、图3D(布洛芬)、3E(布洛芬小檗碱)所示。

实施例9

称取6.0g小檗碱和4.5g十二烷基硫酸钠倒入预先装有磁力搅拌子的三颈瓶中，向其中加入75mL乙酸乙酯和75mL蒸馏水进行反应。反应结束后分液离取乙酸乙酯层，静置使沉淀充分析出。抽滤取滤渣，干燥得十二烷基硫酸小檗碱粗品。

称取制备所得的十二烷基硫酸小檗碱粗品2.8g，倒入15mL的乙酸乙酯，随后加入乙醇，直到溶液中的固体被溶解。抽滤后取滤液，向滤液中添加大致2倍量的乙酸乙酯，静置使结晶充分地从溶剂中析出。抽滤取滤渣，干燥得到十二烷基硫酸小檗碱精品。

所得产物用于药动学研究。

实施例10

所得产物用于药动学研究。

小檗碱离子液体的药动学研究

三组大鼠进行称重后分别对其灌胃给予小檗碱(上海源叶生物科技有限公司公司购买)、十二烷基硫酸小檗碱(实施例9中制备所得)、布洛芬小檗碱(实施例10中制备所得)。

小檗碱，十二烷基硫酸小檗碱，布洛芬小檗碱，口服入血后它们代谢初产物中都有小檗碱母核，所以可以直接通过检测口服后血浆中小檗碱母核的浓度，来衡量小檗碱离子液体在提高生物利用度的作用。

药动学研究分为三个部分：第一部分小檗碱母核在血浆中含量测定实验方法，第二部分为实验方法学验证，第三部分为实验结果。

1.大鼠血浆中小檗碱含量测定方法

1)给药方案与血样采集

取雄性SD大鼠共15只，将它们随机分成三组，每组各5只。实验开始前的12小时内以及实验过程中禁止大鼠进食、不禁止它们饮水。三组大鼠进行称重后分别对其灌胃给予小檗碱、十二烷基硫酸小檗碱、布洛芬小檗碱混悬液，给药剂量以小檗碱为母核记均为200μmol ·kg^-1。各只鼠分别在给药后的第5、10、20、30、45分钟,1、2、3、4、6、8、12小时从它们的眼底静脉丛中取血不少于0.5mL，血样用经过0.5％肝素浸润处理过的1.5mL离心管进行收集，将全血于4000rpm的条件下离心10分钟，吸取上层血浆并将其放置在-20℃冰箱内冷冻贮存。

2)大鼠空白血浆的制备：

对未给药的大鼠进行眼眶取血，血样用经过0.5％肝素浸润处理过的离心管进行收集，将所有收集到的大鼠全血在4000rpm的条件下离心10分钟。用移液枪吸取上层血浆得到空白血浆。

3)血浆样品处理方法：

将血浆样品于室温下自然化冻，涡旋混匀，用移液枪精密移取200μL于1.5mL离心管中，加入400μL乙腈沉淀蛋白，涡旋1分钟使样品充分地混合均匀，然后在12000rpm的条件下离心l0分钟，吸取上清液进行进样分析。

4)血样的处理与检测

采集到的大鼠给药后血浆样品采用本文中所述的血浆样品处理方法进行处理，处理后的样品依照本文中所述的HPLC色谱条件进行进样分析，测定样品中小檗碱母核的峰面积，带入小檗碱母核的标准曲线计算出血浆样品中小檗碱母核的摩尔浓度。

5)HPLC色谱条件：

色谱柱：Waters XBridge^TMC₁₈(5μm,4.6mm×150mm)；流动相：0.04mol ·L^-1磷酸二氢铵缓冲液(用磷酸调节pH为3.0):乙腈＝70:30；检测波长：345nm；流速：l.0mL ·min^-1；柱温：30℃；进样量：20μL。

6)供试品的配置

A.小檗碱供试品制备：

精密称取74mg小檗碱置于10mL容量瓶中，加水适量，超声30分钟后再向其中补充加入蒸馏水并定容，于4℃条件下贮藏备用。所得小檗碱的摩尔浓度为20μmol·mL^-1。

B.十二烷基硫酸小檗碱供试品制备：

精密称取120mg精制十二烷基硫酸小檗碱(实施例9中制备所得)置于10mL容量瓶中，加水适量，超声30分钟后再向其中补充加入蒸馏水并定容，于4℃条件下贮藏备用。所得十二烷基硫酸小檗碱供试品中小檗碱母核的摩尔浓度为20μmol ·mL^-1。

C.布洛芬小檗碱供试品制备：

精密称取108mg精制布洛芬小檗碱(实施例10中制备所得)于10mL容量瓶中，加水适量，超声30分钟后再向其中补充加入蒸馏水并定容，于4℃条件下贮藏备用。所得布洛芬小檗碱供试品中小檗碱母核的摩尔浓度为20μmol·mL^-1。

供试品线性与范围：

精密称取10mg的小檗碱对照品于100mL容量瓶中，加水使小檗碱溶解并稀释到刻度，得到0.1mg ·mL^-1的小檗碱的储备液。用移液枪分别精密地吸取小檗碱储备液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0mL于10mL容量瓶中，加水定容到刻度线，从而得到浓度分别为1、2、5、10、15、20μg ·mL^-1的小檗碱对照品溶液。

用移液枪分别精密吸取20μL上述各浓度项下的小檗碱对照品溶液，向其中加入180μL的大鼠空白血浆，涡旋使它们能够充分地混合均匀，从而得到小檗碱母核的摩尔浓度分别为0.30、0.54、1.34、2.69、4.03、5.38nmol ·mL^-1的小檗碱血浆标准品溶液。依据本文中所述的血浆样品处理方法对小檗碱血浆标准品进行预处理，利用HPLC进行进样分析，记录峰面积。以小檗碱母核的峰面积为纵坐标，小檗碱母核的摩尔浓度为横坐标进行线性回归，所得结果如附图6所示。

所得小檗碱母核标准曲线的回归方程为y＝8587.9x+358.2，R²＝0.992。线性范围为0.29～5.90nmol ·mL^-1，在该浓度范围内小檗碱母核浓度线性关系良好。

2.方法学验证

1)系统适应性与专属性试验：

依据文中所述的血浆样品处理方法分别对大鼠空白血浆、0.54nmol ·mL^-1的小檗碱血浆标准品、大鼠服用小檗碱30分钟后的血浆样品进行处理，然后进行进样分析，记录色谱图如附图5所示。

由以上色谱图分析可知，在该色谱条件下，小檗碱母核的保留时间为4.76分钟，理论塔板数为5374，拖尾因子为1.04，分离度为6.92。实验结果表明，小檗碱色谱峰与血浆内杂质色谱峰分离良好，该方法专属性较高。

2)精密度试验：

用移液枪分别精密吸取20μL的2、10、20μg ·mL^-1小檗碱对照品溶液，向其中加入180μL的大鼠空白血浆，涡旋使他们能够充分地混合均匀，依据本文中所述血浆样品处理方法对它们进行预处理，得到低、中、高浓度分别为0.59、2.95、5.90nmol ·mL^-1的小檗碱样品溶液，每个浓度均分别进行5次平行试验。依据本文中所述的HPLC色谱条件对它们进行进样分析，记录小檗碱的峰面积，然后带入标准曲线方程计算其浓度。实验结果如表6所示。

表6精密度试验测定结果(n＝5)

试验结果表明，小檗碱低浓度组RSD＜15％，中、高浓度组RSD＜10％，结果符合样品精密度测定的限度要求，说明该方法精密度良好。

3)准确度试验：

用移液枪分别精密量取20μL的2、10、20μg ·mL^-1小檗碱对照品溶液，向其中加入180μL的大鼠空白血浆，涡旋使它们能够充分地混合均匀，依据本文中所述血浆样品处理方法对它们进行预处理，得到低、中、高浓度分别为0.59、2.95、5.90nmol ·mL^-1的小檗碱血浆样品溶液，每个浓度均分别进行5次平行试验。依据本文中所述HPLC色谱条件对它们进行进样分析，记录小檗碱的峰面积，然后带入标准曲线方程计算其浓度。回收率通过小檗碱的测得量与加入量的比值求得。实验结果如表7所示。

表7准确度试验测定结果(n＝5)

试验结果表明，小檗碱低浓度组的回收率范围在80％～120％，且RSD＜15％，中、高浓度组的回收率范围在85％～115％，且RSD＜10％，结果符合准确度测定的限度要求，说明该方法准确度良好。

4)稳定性试验：

用移液枪分别精密量取20μL的2、10、20μg ·mL^-1小檗碱对照品溶液，向其中加入180μL的大鼠空白血浆，涡旋使它们能够充分地混合均匀，得到低、中、高浓度分别为0.59、2.95、5.90nmol ·mL^-1的小檗碱血浆样品溶液，然后进行室温放置试验，分别于第0、3、8小时依据本文中所述的血浆样品处理方法对以上样品进行预处理，按照所述HPLC色谱条件进行进样分析，继而记录小檗碱的峰面积并带入标准曲线方程，计算血浆中小檗碱的浓度，试验结果如表8所示。

表8稳定性试验测定结果

试验结果表明，在室温放置8小时的过程中，大鼠的血浆样品中小檗碱的浓度变化不明显，说明其稳定性良好。

3、大鼠服药后血药浓度测定结果

1)平均血药浓度-时间曲线：

各组大鼠分别灌胃给予小檗碱、十二烷基硫酸小檗碱、布洛芬小檗碱混悬液后小檗碱母核的平均血药浓度-时间曲线如附图7所示。

2)药动学参数：

利用DAS 3.2.7对大鼠口服小檗碱、十二烷基硫酸小檗碱、布洛芬小檗碱混悬液后所测得的经时血药浓度数据进行分析。药动学参数运用非房室模型统计矩法进行计算，所得主要药动学参数如表9所示。

表9大鼠口服小檗碱、十二烷基硫酸小檗碱、布洛芬小檗碱后药动学参数(n＝5)

3)相对生物利用度计算：

在相同的给药剂量下，以小檗碱为参比，根据公式F＝AUC_{(0-∞)A or B}/AUC_{(0-∞)小檗碱}*100％(A为十二烷基硫酸小檗碱，B为布洛芬小檗碱)计算得到十二烷基硫酸小檗碱的相对生物利用度为227.3％，布洛芬小檗碱的相对生物利用度为308.5％。

由上述数据分析可知，当灌胃给予大鼠相同剂量的小檗碱后，十二烷基硫酸小檗碱的达峰时间较小檗碱略有缩短，达峰浓度约是小檗碱的1.2倍，以小檗碱为参比，其相对生物利用度为227.3％。布洛芬小檗碱的达峰时间延长至3.8小时，达峰浓度约是小檗碱的1.8倍，以小檗碱为参比，其相对生物利用度为308.5％。说明十二烷基硫酸小檗碱和布洛芬小檗碱均对小檗碱的口服吸收起到了促进作用，增强了小檗碱的生物利用度。

Claims

1.一种十二烷基硫酸小檗碱，其特征在于：X射线粉末衍射图谱在衍射角2θ＝4.3°±0.2,12.8°±0.2，19.9°±0.2，18.0°±0.2，19.7°±0.2，25.3°±0.2，8.6°±0.2，17.3°±0.2，18.7°±0.2和22.0°±0.2处有特征峰。

2.一种布洛芬小檗碱，其特征在于：X射线粉末衍射图谱在衍射角2θ＝3.8°±0.2,9.5°±0.2，20.3°±0.2，16.7°±0.2，10.8°±0.2，28.3°±0.2，24.9°±0.2，19.1°±0.2，22.8°±0.2，11.9°±0.2，7.7°±0.2，18.4°±0.2和13.6°±0.2处有特征峰。

3.根据权利要求1所述的十二烷基硫酸小檗碱，其特征在于：制备方法为：称取小檗碱和十二烷基硫酸钠倒入预先装有磁力搅拌子的三颈瓶中，向其中倒入乙酸乙酯和蒸馏水进行反应，反应结束后将反应液尽数转移到分液漏斗中静置后分离，将乙酸乙酯层静置分离，得到的沉淀即为十二烷基硫酸小檗碱。

4.根据权利要求3所述的十二烷基硫酸小檗碱，其特征在于：制备方法中小檗碱、十二烷基硫酸钠、乙酸乙酯和蒸馏水的重量比为4:3：50-100:50-100。

5.根据权利要求4所述的十二烷基硫酸小檗碱，其特征在于：制备方法为：称取2.0g小檗碱和1.5g十二烷基硫酸钠倒入预先装有磁力搅拌子的三颈瓶中，向其中倒入25g乙酸乙酯和25g蒸馏水进行反应，反应结束后将反应液尽数转移到分液漏斗中静置后分离，将乙酸乙酯层静置分离，得到的沉淀即为十二烷基硫酸小檗碱。

6.根据权利要求2所述的布洛芬小檗碱，其特征在于：制备方法为：称取布洛芬、氢氧化钠以及小檗碱倒入预先装有磁力搅拌子的三颈瓶中，向其中倒入蒸馏水和乙酸乙酯进行反应，反应结束后将反应液尽数转移到分液漏斗中静置后分离，将乙酸乙酯层静置分离，得到的沉淀即为布洛芬小檗碱。

7.根据权利要求6所述的布洛芬小檗碱，其特征在于：制备方法中布洛芬、氢氧化钠、小檗碱、蒸馏水和乙酸乙酯的重量比为1:0.2：1.8：25-100:25-100。

8.根据权利要求7所述的布洛芬小檗碱，其特征在于：制备方法为：称取1.0g布洛芬、0.2g氢氧化钠以及1.8g小檗碱倒入预先装有磁力搅拌子的三颈瓶中，向其中倒入25g蒸馏水和25g乙酸乙酯进行反应，反应结束后将反应液尽数转移到分液漏斗中静置后分离，将乙酸乙酯层静置分离，得到的沉淀即为布洛芬小檗碱。