CN103864646A - 甲磺酸雷沙吉兰的杂质制备及分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种甲磺酸雷沙吉兰的杂质A、杂质B和杂质C制备，并提供一种将所制备的杂质标准品用于甲磺酸雷沙产品原料药及其制剂的质量分析的方法。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学领域，尤其涉及药物分析化学领域，特别涉及甲磺酸雷沙吉兰的杂质分析和制备方法。
背景技术
雷沙吉兰是由Teva公司和Lundbeck公司共同开发的第二代选择性的、不可逆转的单胺氧化酶-B(MAO-B)抑制剂，可用于治疗帕金森症(PD)。该药于2005年1月第一次获准在以色列上市单独使用作为帕金森病(PD)早期治疗的一线用药，或与levodopa(左旋多巴)联用治疗中、重度帕金森病，商品名为Azilect，随后该药于2005年2月获欧盟批准在欧洲上市，并已获得FDA的可批准函。此外，该药目前还在进行用于治疗老年痴呆(A D)、抑郁症、儿童多动症的临床研究。
帕金森病(PD)是一种常见于中老年的神经系统变性疾病，病变部位在人脑的一个叫中脑的部位。该处有一群神经细胞，叫做黑质神经元，它们合成一种叫做“多巴胺”的神经递质，其神经纤维投射到大脑的其他一些区域，如纹状体，对大脑的运动功能进行调控。当这些黑质神经元变性死亡至80％以上时，大脑内的神经递质多巴胺便减少到不能维持调节神经系统的正常功能，便出现帕金森病的症状。作为一种新颖、有效的、第二代选择性、不可逆转的单胺氧化酶-B(MAO-B)抑制剂，雷沙吉兰的药理作用与第一代选择性的不可逆转的单胺氧化酶的抑制剂司来吉兰(该药目前已用于治疗帕金森症和老年痴呆，其透皮剂已用于治疗抑郁症。)相似，但其在体内对MAO-B的抑制作用更强，并且由于该药的代谢不同于司来吉兰，因而不会产生诸如司来吉兰代谢而引起的副作用如血压升高、心率增加、睡眠障碍和兴奋。实验室动物模型中有确实证据表明此药能避免神经细胞因帕金森氏病引起的细胞凋亡。临床研究结果表明，甲磺酸雷沙吉兰不论是单独使用或与其他药物合用，耐受性及安全性皆良好，副作用轻，常见副作用有头疼、恶心等；在长期治疗上，最常見的副作用为感染、意外受伤、恶心及关节痛等。
欧洲专利EP436492、美国专利US5457133、US5786390、中国专利CN91100031等均报道了制备雷沙吉兰的制备方法，上述专利都广泛采纳了以R-(-)-1-氨基茚满为原料，与3-溴丙炔或3-氯丙炔在60℃过夜反应得到R-(+)-N-炔丙基-1-氨基茚满(雷沙吉兰)，再与盐酸成盐反应得到雷沙吉兰盐酸盐。上述方法因使用含卤素离子特别是氯离子的试剂如3-氯丙炔容易生成具基因毒性的物质2-C1-AAI，见文献US7598420，US7572834以及US7619117等。
发明内容
本发明人在参考现有文献的基础上，经反复实验，设计了可工业化生产雷沙吉兰的方法：以R-(-)-1-氨基茚满(化合物II)为原料，与炔丙基衍生物(化合物III)在适当的溶剂、温度、碱等存在下反应得到R-(+)-N-丙炔基-1-氨基茚满(Rasagiline，雷沙吉兰)(化合物I)(Scheme III)，再经与甲磺酸反应得到N-丙炔基-1-氨基茚满甲磺酸盐。
该方法可高收率高纯度制备雷沙吉兰及其盐，同时避免生成具基因毒性的物质2-Cl-AAI。
该方法与现有专利方法相比，反应专一、副产物少、收率高、反应条件更加温和、反应时间短，后处理简单，所生成的杂质在成盐的时候容易除去，得到的产物纯度高。
使用HPLC对以上方法制备得到的产品产品进行检测，发现其中含有三种杂质，这三种杂质会对甲磺酸雷沙吉兰原料药的质量产生影响。因此，本发明人对这三种杂质进行进一步的研究，确证了其化学结构，以控制生产过程中药品的质量。
本发明的一个目的在于分离制备甲磺酸雷沙吉兰原料药中杂质的标准品并且对杂质进行结构鉴定。
本发明的另一个目的在于将所制备的杂质标准品用于该产品原料药及其制剂的质量分析，同时也为工艺条件的选择提供参考，有利于生产过程中药品质量的控制。
本发明的再一个目的在于提供甲磺酸雷沙吉兰原料的杂质制备和分析方法，该方法用于从制备甲磺酸雷沙吉兰原料药过程中分离制备所述杂质，并用于对甲磺酸雷沙吉兰及其制剂进行分析。
本申请人对采用上述方法制备的甲磺酸雷沙吉兰原料药经LC-MS分析，发现3种杂质。制备过程中处理的母液分别经制备液相纯化，制得3种杂质的标准品，并经结构确证，3种杂质结构分别为：
为此，本发明人分析了这三种杂质的产生过程：
1、杂质A和杂质B
近年有报道，胺类化合物进行N-烷基化反应时，有可能产生氨基甲酸类副产物。如果反应体系中有其它的有机化合物存在，则可能得到氨基甲酸酯类产物。起步原料R-氨基茚满、甲磺酸炔丙酯在反应过程中可能生成杂质A，并且反应生成的目标产物(雷沙吉兰)在反应体系中也可能进一步参与反应生成杂质B。经对反应体系中各生成产物分离后进行结构确证，得到证实有杂质A和B的存在。反应式如下：
2、杂质C
N-烷基化反应过程中，已经反应生成的R-(+)-N-炔丙基-1-氨基茚满(雷沙吉兰)，继续与甲磺酸炔丙酯反应，生成叔胺R-(+)-N,N-二炔丙基氨基茚满，该化合物可再与甲磺酸成盐得到R-(+)-N,N-二炔丙基氨基茚满甲磺酸盐。
任何影响药物纯度的物质统称为杂质。杂质的研究是药品研发的一项重要内容。它包括选择合适的分析方法，准确地分辨与测定杂质的含量并综合药学、毒理及临床研究的结果确定杂质的合理限度。这一研究贯穿于药品研发的整个过程。药品中的杂质按其理化性质一般分为三类：有机杂质、无机杂质及残留溶剂。按照其来源，杂质可以分为工艺杂质(包括合成中未反应完全的反应物及试剂、中间体、副产物等)、降解产物、从反应物及试剂中混入的杂质等。按照其毒性分类，杂质又可分为毒性杂质和普通杂质等。杂质还可按其化学结构分类，如其它甾体、其它生物碱、几何异构体、光学异构体和聚合物等。有机杂质包括工艺中引入的杂质和降解产物等，可能是已知的或未知的、挥发性的或不挥发性的。由于这类杂质的化学结构一般与活性成分类似或具渊源关系，故通常又可称之为有关物质。分析方法的选择直接关系到杂质测定结果的专属性与准确性，因此，在进行杂质研究时首要问题是选择合适的杂质分析方法。
药物杂质检查分析方法应灵敏、专属。通过合适的分析技术将不同结构的杂质进行分离、检测，从而达到对杂质的有效控制。随着分离、检测技术的发展与更新，高效、快速的分离技术与灵敏、稳定、准确、适用的检测手段相结合，几乎所有的有机杂质均能在合适的条件下得到很好的分离与检测。在质量标准中，目前普遍采用的杂质检测方法主要为高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography；HPLC)、薄层色谱法(Thin Layer Chromatography；TLC)、气相色谱法(GasChromatography；GC)和毛细管电泳法(Capillary Electrophoresis；CE)。近年来，质谱技术在药物杂质分析方面应用日益广泛，气相色谱联用技术、液相色谱联用技术已经成为药物杂质分析的重要手段。
本发明方法对原料药中的杂质进行分析、制备和结构确证，所制备的杂质标准品可用于该产品原料药及其制剂的质量分析，同时也可以为工艺条件的选择提供参考，有利于生产过程中药品质量的控制。
附图说明：
附图1：甲磺酸雷沙吉兰及杂质A、B、C反应示意流程图
附图2：甲磺酸雷沙吉兰及杂质分离度图谱
附图3：甲磺酸雷沙吉兰检测图谱
附图4：杂质A HPLC测定线性关系图
附图5：杂质A HPLC-MS测定线性关系图
附图6：杂质B HPLC测定线性关系图
附图7：杂质B LC-MS测定线性关系图
附图8：杂质C测定线性关系图
本发明的杂质A、B、C可通过以下方法制备得到。
1、甲磺酸雷沙吉兰的制备过程
①R-氨基茚满(1mol)用二甲基甲酰胺溶解于反应瓶中，搅拌均匀，加入1mol碳酸钾或碳酸钠，搅拌，滴加1mol甲磺酸炔丙酯的DMF溶液。过程控制温度25-35℃，搅拌反应20小时以上；冷却，加入水，水相用二氯甲烷萃取2次，合并二氯甲烷，用酸水洗涤，分出水相，加入乙酸乙酯并用氢氧化钠溶液洗涤，乙酸乙酯萃取2次，干燥，过滤，减压浓缩得到粘稠液体(雷沙吉兰粗品)约112g。
②将上述所得粘稠液体溶于异丙醇，加热60℃以上，搅拌下加入计算量甲烷磺酸，加毕，pH≤4，回流约20分钟，冷却结晶，过滤，滤饼减压干燥，得白色固体约95g(甲磺酸雷沙吉兰)，异丙醇滤液浓缩干得固体，待用。
所得甲磺酸雷沙吉兰经LC-MS分析，含有3个未知杂质，MS检测结果为：
杂质A：[M+H+]216.1，杂质B：[M+H+]254.1，杂质C：[M+H+]210.1
所采用的LC-MS条件为：
HPLC：流动相50％乙腈、0.1％甲酸水
柱温25～35℃
流速0.3ml/min
检测波长215nm
色谱柱：Agilent Poroshell120EC-C182.7μm4.6×50mm
MS：条件
ESI，fg＝25，MS2scan
2、杂质A、B和C的制备过程
经HPLC分析，成品中3种杂质的含量低于0.1％，采用从成品中制备分离杂质的可行性不强，但经对合成过程中的母液进行分析，其中三种杂质的含量较高，故采用从合成过程中处理过的母液中制备分离杂质。
I、杂质A、杂质B的制备
将步骤①中所得用酸水洗涤后的二氯甲烷溶液浓缩至干得到固体，此固体中含较高比例杂质A和杂质B，将此固体经高压制备液相纯化、处理可得到高纯的的杂质对照品，具体操作如下：
纯化条件：
梯度洗脱比例：
| 时间(分) | A％ | B％ |
| 0 | 80 | 20 |
| 30 | 50 | 50 |
| 60 | 50 | 50 |
具体操作步骤：
将二氯甲烷浓缩至干得到固体，取约1g，用50％乙腈/水溶解，上柱，梯度洗脱，根据出峰情况，分段收集洗脱液，每次纯化完成后，纯化柱用20％乙腈水溶液重新平衡后，可重复进样纯化。将多批次纯化得到的含组份A或组份B纯度＞98％的洗脱液分别合并。浓缩除去大部分乙腈，水层用乙酸乙酯提取，浓缩乙酸乙酯至干，分别得到白色固体(杂质A)和粘稠液体(杂质B)。每批次纯化可得杂质A约为30mg，杂质B约为15mg
II、杂质C的制备
步骤②中所得异丙醇滤液浓缩干所得固体中含较高比例杂质C，将此固体经高压制备液相纯化、处理可得到高纯的的杂质C对照品，具体操作如下：
纯化条件：
梯度洗脱比例：
| 时间(分) | A％ | B％ |
| 0 | 80 | 20 |
| 30 | 50 | 50 |
| 60 | 50 | 50 |
具体操作步骤：
取步骤②中所得异丙醇滤液浓缩干所得的固体约1g，用20％乙腈/水溶解，上柱，梯度洗脱，根据出峰情况，分段收集洗脱液，每次纯化完成后，纯化柱用20％乙腈水溶液重新平衡后，可重复进样纯化。将多批次纯化得到的含同一组份纯度＞95％的洗脱液分别合并。浓缩蒸干得到白色或类白色固体(杂质C)，将所得固体加入3倍量乙醇，加热至全溶，冷冻结晶，过滤、干燥得高纯度样品(杂质C)。每批次纯化可得杂质C约为50mg
杂质C还可通过以下方法，采用正相硅胶柱进行纯化：
将步骤②中所得异丙醇滤液浓缩干所得的固体溶于水，用碱(氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠等)水溶液，调节PH大于8，乙酸乙酯提取，分去水层，乙酸乙酯层浓缩干得粘稠液体，将此粘稠液体用乙酸乙酯溶解，加入3倍重量的正相硅胶，蒸干后用石油醚拌匀上柱，乙酸乙酯∶石油醚＝1∶150～1∶10洗脱，可得叔胺化合物经甲磺酸成盐、乙醇结晶可得杂质C，约4g粘稠液体可分离得到0.3g杂质C
上述纯化过程中的分析检测条件为：
流动相为pH＝5.5缓冲液∶乙腈＝50∶50
检测波长215nm
柱温：30℃
本发明还提供杂质A、杂质B和杂质C在甲磺酸雷沙吉兰原料及其制剂产品质量检测方法中的用途。
一种甲磺酸雷沙吉兰原料及其制剂的产品质量检测方法，其特征在于，检测甲磺酸雷沙吉兰原料及其制剂中杂质A的含量。其中，优选用HPLC和/或HPLC-MS检测杂质A的含量。
一种甲磺酸雷沙吉兰原料及其制剂的产品质量检测方法，其特征在于，检测甲磺酸雷沙吉兰原料及其制剂中杂质B的含量。其中，优选用HPLC和/或HPLC-MS检测杂质B的含量。
一种甲磺酸雷沙吉兰原料及其制剂的产品质量检测方法，其特征在于，检测甲磺酸雷沙吉兰原料及其制剂中杂质C的含量。其中，优选用HPLC和/或HPLC-MS检测化合物C的含量。
本发明还提供甲磺酸雷沙吉兰原料及其制剂的产品质量检测方法，其特征在于，检测甲磺酸雷沙吉兰原料及其制剂中杂质A和/或杂质B和/或杂质C的含量。其中，优选用HPLC和/或HPLC-MS检测杂质A和/或杂质B和/或杂质C的含量。更优选地，所述HPLC所采用的条件为：
流动相：pH5.0～6.0的三乙胺-冰醋酸缓冲液-乙腈体积比：(40∶60～60∶40)，优选50∶50，其中pH5.0～6.0的三乙胺-冰醋酸缓冲液是由三乙胺-冰醋酸缓冲对组成，900份水加4份三乙胺，以冰醋酸调节pH为5.0～6.0；
流速：0.8～1.2mL/min(优选流速1.0mL/min)；
柱温：25～35℃，优选30℃；
检测波长：210～220nm，优选215nm
色谱柱：Hypersil ODS(2)4.6*200mm，5μm；ACR C184.6*250mm，5μm。
更进一步优选地，所述HPLC-MS所采用的条件为：
杂质A HPLC-MS方法：
色谱条件为：流动相：0.05％～0.5％HAc/水∶乙腈＝(75～80)∶(25～20)；优选0.1％HAc/水，与乙腈比例优选78∶22
流速：0.1～0.5ml/min优选0.3ml/min，；柱温：20～40℃，优选30℃
质谱条件为：采用选择性离子监测(SIM)法，检测母离子[M+H]+m/z216.1
干燥气温度：300～400℃，优选350℃
载气流速：8-12L/min，优选10L/min
雾化气压力：30～50psi，优选40psi
毛细管电压：4000V
杂质B HPLC-MS方法：
色谱条件为：流动相：：0.05％～0.5％HAc/水∶甲醇＝(15～25)∶(85～75)；优选0.1％HAc/水，与甲醇比例优选20∶80
流速：0.1～0.5ml/min优选0.3ml/min，；柱温：20～40℃，优选30℃
质谱条件为：采用选择性离子监测(SIM)法，检测母离子[M+Na]+m/z276.1
干燥气温度：300～400℃，优选350℃
载气流速：8-12L/min，优选10L/min
雾化气压力：30～50psi，优选40psi
毛细管电压：4000V
本发明一个优选实施方式的甲磺酸雷沙吉兰及其杂质的检测方法如下：
本发明甲磺酸雷沙吉兰有关物质的检测的方法采用液相色谱检测，HPLC检测条件如下：
固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂
●流动相：pH5.5的三乙胺-冰醋酸缓冲液-乙腈体积比：(40-60∶60-40)，优选50∶50，其中pH5.5的三乙胺-冰醋酸缓冲液是由三乙胺-冰醋酸缓冲对组成，900ml水加4ml三乙胺，以冰醋酸调节pH5.5。
●流速：0.8～1.2mL/min(优选流速1.0mL/min)
●柱温：25～35℃，优选30℃。
理论板数按甲磺酸雷沙吉兰峰计算应不小于2000
检测波长：杂质A和杂质B紫外光谱扫描显示，最大吸收波长均在215nm，杂质C为，经紫外光谱扫描，在213nm波长处有最大吸收；因此选择215nm为检测波长。
实验操作：
分别称取甲磺酸雷沙吉兰对照品及杂质A、B、C和甲烷磺酸对照品各适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml中分别含甲磺酸雷沙吉兰、杂质A、B、C各约20μg，含甲烷磺酸约1mg的混合溶液，作为系统适用性试验溶液。精密量取系统适用性试验溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，各成分的出峰顺序依次为甲烷磺酸、雷沙吉兰、杂质A、B、C，雷沙吉兰及各杂质A、B、C峰相互间的分离度应符合要求，理论板数按甲磺酸雷沙吉兰峰计算应不小于2000。
测定法取甲磺酸雷沙吉兰待测品约20mg，精密称定，至10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液I；精密量取供试品溶液I1ml，至100ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。精密量取对照溶液10μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的20％～50％；再分别精密量取供试品溶液I、对照溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的5倍。供试品溶液I的色谱图中如有杂质峰，以峰面积计算，与杂质A、B、C相对应的峰各不得大于对照溶液的0.15倍(即杂质含量不超过0.15％)；其他任一单个杂质峰均不得大于对照溶液的0.15倍(即杂质含量不超过0.15％)，总杂质不得超过1.0％，溶剂峰及甲烷磺酸峰不计，小于对照溶液主峰面积0.05倍(即含量小于0.05％)的峰忽略不计。
该方法的优点是：操作简便，测定结果准确可靠，专属性强，在一个系统条件下就能同时检测3种指定杂质。实用性强。现有技术的检测方法中，色谱系统流动相为pH＝5.5的三乙胺-冰醋酸缓冲液∶乙腈＝80∶20。该系统由于洗脱强度不够，杂质A、B、C均无法检测出峰。经调节流动相比例，当流动相中pH＝5.5缓冲液∶乙腈＝50∶50时，杂质A、B、C也能有效检出，且雷沙吉兰及各杂质间均达到良好分离，采用该系统可同时检测多种杂质。
本方法同样适用甲磺酸雷沙吉兰制剂的有关物质分析。
实施例
实施例1：甲磺酸雷沙吉兰的制备
①R-氨基茚满133g用二甲基甲酰胺溶解于反应瓶中，搅拌均匀，加入碳酸钾138g，搅拌，滴加96.1g甲磺酸炔丙酯的DMF溶液。过程控制温度25-35℃，搅拌反应20小时以上；冷却，加入水，水相用二氯甲烷萃取2次，合并二氯甲烷，用酸水洗涤，分出水相，加入乙酸乙酯并用氢氧化钠溶液洗涤，乙酸乙酯萃取2次，干燥，过滤，减压浓缩得到粘稠液体(雷沙吉兰粗品)约112g。
②将上述所得粘稠液体溶于异丙醇560mL，加热60℃以上，搅拌下加入甲烷磺酸调节pH，加毕pH≤4，回流约20分钟，冷却结晶，过滤，减压干燥，得白色固体约95g(甲磺酸雷沙吉兰)，滤液浓缩干得固体。
实施例2：杂质A、杂质B的分离
将实施例1步骤①中用酸水洗涤后的二氯甲烷溶液浓缩至干得到固体，将此固体经高压制备液相纯化、处理可得到高纯的的杂质对照品，具体操作如下：
纯化条件：
梯度洗脱比例：
| 时间(分) | A％ | B％ |
| 0 | 80 | 20 |
| 30 | 50 | 50 |
| 60 | 50 | 50 |
具体操作步骤：
将实施例1中用酸水洗涤后的二氯甲烷溶液浓缩至干得到固体，取1g，用50％乙腈/水溶解、过滤，上柱，梯度程序洗脱，根据出峰情况，分段收集洗脱液，分别收集含杂质A、杂质B纯度＞98％的洗脱液分别合并。分别浓缩除去大部分乙腈，水层用乙酸乙酯提取，浓缩乙酸乙酯至干，分别得到白色固体(杂质A)约30mg和粘稠液体(杂质B)约15mg。
所得杂质A、杂质B的结构分别为：
所述杂质A，中文化学名为：(R)-1-茚满氨基甲酸炔丙酯
结构式：
分子式：C13H13N02
分子量：215.25
杂质A熔点：110℃(DSC法测定)。
所用仪器型号：NETZSCH DSC204
BRUKER AV-500型核磁共振仪
MS：216.1015[M+H]+，238.0831[M+Na]+，254.1895[M+K]+
杂质A的1H-NMR谱、13C-NMR谱、DEPT谱、COSY谱、HSQC谱和HMBC谱归属如下表所示
所述杂质B，结构式：
分子式：C16H15N02
分子量：253.3
中文化学名：(R)-N-炔丙基-1-茚满氨基甲酸炔丙酯
杂质B为无色至淡黄色粘稠液体
MS：254.1181[M+H]+，276.0987[M+Na]+，292.0727[M+K]+
仪器型号：BRUKER AV-500型核磁共振仪
杂质B的1H-NMR谱、13C-NMR谱、DEPT谱、COSY谱、HSQC谱和HMBC谱归属如下表所示
实施例3：杂质C的分离
将实施例1步骤②中所得异丙醇滤液浓缩干得到固体，将此固体经高压制备液相纯化、处理可得到高纯的的杂质C对照品，具体操作如下：
纯化条件：
梯度洗脱比例：
| 时间(分) | A％ | B％ |
| 0 | 80 | 20 |
| 30 | 50 | 50 |
| 60 | 50 | 50 |
具体操作步骤：
取实施例1步骤②中所得异丙醇滤液浓缩干得到的固体1g，用20％乙腈/水溶解，上柱，梯度洗脱，根据出峰情况，分段收集洗脱液，纯度＞95％的洗脱液合并。浓缩蒸干得到白色或类白色固体(杂质C)，将所得固体加入3倍量乙醇，加热至全溶，冷冻结晶，过滤、干燥得高纯度样品(杂质C)约50mg
杂质C还可通过以下方法，采用正相硅胶柱进行纯化：
将步骤②中所得异丙醇滤液浓缩干得到的固体6g溶于水，用碱(氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠等)水溶液，调节PH大于8，乙酸乙酯提取，分去水层，乙酸乙酯层浓缩干得粘稠液体4g，将此粘稠液体用乙酸乙酯溶解，加入3倍重量的正相硅胶，蒸干后用石油醚拌匀上柱，乙酸乙酯∶石油醚＝1∶150～1∶10洗脱，可得叔胺化合物经甲磺酸成盐、乙醇结晶可得杂质C0.3g。
所得杂质C结构为：
所述杂质C，结构式：
分子式：C15H15N.CH4O3S 分子量：305.39
中文化学名：R-(+)-N，N-二丙炔基-1-氨基茚满甲磺酸盐
杂质C为白色固体
MS：210.1290[M+H]+
仪器型号：BRUKER AV-500型核磁共振仪
杂质C的1H-NMR谱、13C-NMR谱、DEPT谱、COSY谱、HSQC谱和HMBC谱归属如下表所示
实施例4：甲磺酸雷沙吉兰及其杂质的检测方法
本发明甲磺酸雷沙吉兰有关物质的检测的方法采用液相色谱检测，HPLC检测条件如下：
固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂
●流动相：pH5.5的三乙胺-冰醋酸缓冲液-乙腈体积比50∶50，其中pH5.5的三乙胺-冰醋酸缓冲液是由三乙胺-冰醋酸缓冲对组成，900ml水加4ml三乙胺，以冰醋酸调节pH5.5。
●流速：1.0mL/min
●柱温：30℃。
理论板数按甲磺酸雷沙吉兰峰计算不小于2000
检测波长：杂质A和杂质B紫外光谱扫描显示，最大吸收波长均在215nm，杂质C为，经紫外光谱扫描，在213nm波长处有最大吸收；因此选择215nm为检测波长。
实验操作：
分别精密称取甲磺酸雷沙吉兰标准品20.59mg、杂质A10.50mg、杂质B10.69mg、C10.55mg，加流动相溶解并稀释制成每1ml中分别含甲磺酸雷沙吉兰20.59μg/ml、杂质A20.6μg/ml、杂质B21.38μg/ml、杂质C21.10μg/ml的溶液，作为系统适用性试验溶液。精密量取系统适用性试验溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图(图2)
精密称定甲磺酸雷沙吉兰待测品21.02mg，，至10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液I；精密量取供试品溶液I1ml，至100ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。精密量取对照溶液10μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的20％～50％；再分别精密量取供试品溶液I、对照溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的5倍。供试品溶液I的色谱图中杂质峰，以峰面积计算(图3)，杂质A测定结果为0.09％，杂质B测定结果为0.07％，杂质C测定结果为0.08％.总杂质为0.75％，溶剂峰及甲烷磺酸峰不计，小于对照溶液主峰面积0.05倍(0.05％)的峰忽略不计。
方法学验证
实施例5：杂质A测定方法学验证
1、杂质A HPLC测定方法学验证总结
杂质A测定方法学验证结果总结表
2、杂质A HPLC-MS方法验证
(1)测定方法及条件如下。
色谱条件为：色谱柱：Agilent Poroshell120EC-C18，4.6×50mm，2.7μm；
流动相：0.1％HAc/水∶乙腈＝78∶22；
流速：0.3ml/min；柱温：30℃
质谱条件为：采用选择性离子监测(SIM)法，检测母离子[M+H]+m/z216.1
干燥气温度：350℃
载气流速：10L/min
雾化气压力：40psi
毛细管电压：4000V
(2)杂质A测定方法学验证总结
依照定量检测方法学研究要求，分别对各项方法验证进行试验，结果见下表。
杂质A测定方法学验证结果总结表
实施例6：杂质B测定方法学验证
1、HPLC方法
(1)杂质B测定方法学验证总结
表杂质B测定方法学验证结果总结表
2、杂质B LC-MS方法学验证
(1)采用LC-MS方法测定杂质B的研究，具体测定方法与验证过程如下：
测定方法及条件如下。
色谱条件为：色谱柱：Agilent Poroshell120EC-C18，4.6×50mm，2.7μm；
流动相：0.1％HAc/水∶甲醇＝20∶80；
流速：0.3ml/min；柱温：30℃
质谱条件为：采用选择性离子监测(SIM)法，检测母离子[M+Na]+m/z276.1
干燥气温度：350℃
载气流速：10L/min
雾化气压力：40psi
毛细管电压：4000V
(2)杂质B测定方法学验证总结
杂质B测定方法学验证结果总结表(LC-MS)
实施例7：杂质c测定方法学验证
(1)杂质C测定方法学验证总结
杂质C测定方法学验证结果总结表
Claims (20)
1.一种结构如下所示的化合物A：
2.一种结构如下所示的化合物B：
3.一种结构如下所示的化合物C：
4.权利要求1-3的化合物在甲磺酸雷沙吉兰原料及其制剂产品质量检测方法中的用途。
5.一种甲磺酸雷沙吉兰原料及其制剂的产品质量检测方法，其特征在于，检测甲磺酸雷沙吉兰原料及其制剂中权利要求1所述化合物A的含量。
6.如权利要求5所述的产品质量检测方法，其特征在于，用HPLC和/或HPLC-MS检测化合物A的含量。
7.一种甲磺酸雷沙吉兰原料及其制剂的产品质量检测方法，其特征在于，检测甲磺酸雷沙吉兰原料及其制剂中权利要求2所述化合物B的含量。
8.如权利要求7所述的产品质量检测方法，其特征在于，用HPLC和/或HPLC-MS检测化合物B的含量。
9.一种甲磺酸雷沙吉兰原料及其制剂的产品质量检测方法，其特征在于，检测甲磺酸雷沙吉兰原料及其制剂中权利要求3所述化合物C的含量。
10.如权利要求9所述的产品质量检测方法，其特征在于，用HPLC和/或HPLC-MS检测化合物C的含量。
11.一种甲磺酸雷沙吉兰原料及其制剂的产品质量检测方法，其特征在于，检测甲磺酸雷沙吉兰原料及其制剂中权利要求1所述化合物A和权利要求2所述化合物B的含量。
12.如权利要求11所述的产品质量检测方法，其特征在于，用HPLC和/或HPLC-MS检测化合物A和化合物B的含量。
13.一种甲磺酸雷沙吉兰原料及其制剂的产品质量检测方法，其特征在于，检测甲磺酸雷沙吉兰原料及其制剂中权利要求1所述化合物A和权利要求3所述化合物C的含量。
14.如权利要求13所述的产品质量检测方法，其特征在于，用HPLC和/或HPLC-MS检测化合物A和化合物C的含量。
15.一种甲磺酸雷沙吉兰原料及其制剂的产品质量检测方法，其特征在于，检测甲磺酸雷沙吉兰原料及其制剂中权利要求2所述化合物B和权利要求3所述化合物C的含量。
16.如权利要求15所述的产品质量检测方法，其特征在于，用HPLC和/或HPLC-MS检测化合物B和化合物C的含量。
17.一种甲磺酸雷沙吉兰原料及其制剂的产品质量检测方法，其特征在于，检测甲磺酸雷沙吉兰原料及其制剂中权利要求1所述化合物A、权利要求2所述化合物B和权利要求3所述化合物C的含量。
18.如权利要求17所述的产品质量检测方法，其特征在于，用HPLC和/或HPLC-MS检测化合物A、化合物B和化合物C的含量。
19.如权利要求18所述的产品质量检测方法，其特征在于，所述HPLC所采用的条件为：
●流动相：pH5.0～6.0的三乙胺-冰醋酸缓冲液-乙腈体积比为40∶60～60∶40，
优选50∶50，其中pH5.0～6.0的三乙胺-冰醋酸缓冲液是由三乙胺-冰醋酸
缓冲对组成，900份水加4份三乙胺，以冰醋酸调节pH为5.0～6.0；
●流速：0.8～1.2mL/min(优选流速1.0mL/min)；
●柱温：25～35℃，优选30℃；
●检测波长：210～220nm，优选215nm。
20.如权利要求18所述的产品质量检测方法，其特征在于，所述HPLC-MS所采用的条件为：
杂质A HPLC-MS方法：
色谱条件为：流动相：0.05％～0.5％HAc/水∶乙腈＝(75～80)∶(25～20)；优选0.1％HAc/水，与乙腈比例优选78∶22
流速：0.1～0.5ml/min优选0.3ml/min，；柱温：20～40℃，优选30℃
质谱条件为：采用选择性离子监测(SIM)法，检测母离子[M+H]+m/z216.1
干燥气温度：300～400℃，优选350℃
载气流速：8-12L/min，优选10L/min
雾化气压力：30～50psi，优选40psi
毛细管电压：4000V
杂质B HPLC-MS方法：
色谱条件为：流动相：：0.05％～0.5％HAc/水∶甲醇＝(15～25)∶(85～75)；优选0.1％HAc/水，与甲醇比例优选20∶80
流速：0.1～0.5ml/min优选0.3ml/min，；柱温：20～40℃，优选30℃
质谱条件为：采用选择性离子监测(SIM)法，检测母离子[M+Na]+m/z276.1
干燥气温度：300～400℃，优选350℃
载气流速：8-12L/min，优选10L/min
雾化气压力：30～50psi，优选40psi
毛细管电压：4000V。
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