CN105319289A - 一种高效液相色谱法分离测定依折麦布及有关物质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种高效液相色谱法分离测定依折麦布及有关物质的方法。该方法在高效液相色谱法分析过程中采用的色谱柱是以苯基硅烷键合硅胶为填料，以溶液A和有机溶剂B按一定比例混合为流动相进行洗脱；所述的溶液A为酸的水溶液、乙腈和甲醇的混合溶液。该方法对依折麦布6种有关物质均能适用，可以同时对其中的一种或多种有关物质进行分离检测，与现有技术相比，提高了分离检测的效率；且利用本发明的方法检测依折麦布碱降解杂质，能更准确、更有效地将有关物质6和其他降解杂质有效分离开，能更精准的确保依折麦布原料及其制剂的质量可控，并最终确定产品的安全有效。

Description

一种高效液相色谱法分离测定依折麦布及有关物质的方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种采用高效液相色谱法分离和测定依折麦布及有关物质的方法。

背景技术

依折麦布是降胆固醇药物，可单独或与HMG-CoA还原酶抑制剂（他汀类）联合应用于治疗原发性（杂合子家族性或非家族性）高胆固醇血症，可降低总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、载脂蛋白、非高密度脂蛋白胆固醇；还可用于纯合子家族性高胆固醇血症的治疗。分子式为C₂₄H₂₁F₂NO₃，化学名为1-(4-氟苯基)-3(R)-[3-(4-氟苯基)-3(S)-羟丙基]-4(S)-(4-羟苯基)-2-吖丁啶(氮杂环丁烷)酮，其化学结构式如下：

在依折麦布合成过程中，会产生一些相关的杂质物质如生产过程中产生的副产物或中间体或降解产物等，这些杂质可能会由于去除不完全而影响药物的纯度和质量，目前，已知的杂质物质有6种，分别为：有关物质1（副产物杂质）、有关物质2（副产物杂质）、有关物质3（中间体杂质）、有关物质4（中间体杂质）、有关物质5（既是副产物又是降解杂质）和有关物质6（降解杂质），这6种杂质物质的结构式如下：

对于依折麦布合成工艺中引入的上述副产物和中间体，在依折麦布原料药中需要进行质量控制，而依折麦布相关的降解杂质需要在依折麦布原料药及制剂中进行质量控制，因此，实现依折麦布及有关物质的分离和测定对依折麦布原料及制剂的生产和贮存具有重要的意义。

目前对于依折麦布有关物质的分析检测方法有进口注册标准（JX20070201），采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.05mol/L磷酸二氢钾溶液：乙腈：四氢呋喃（65：25：10）为流动相进行等度洗脱，流速为1.0ml/min，检测波长为232nm，柱温为25℃，进样体积为30μl，检测时间为主峰保留时间的2倍，但是，该标准的方法对上述的有关物质3和有关物质4不能检出；在碱降解试验中，有关物质6和其他降解杂质不能分离。

另外，申请号为201210337025.1的发明专利中公开了一种用液相色谱法分离测定依折麦布有关物质的方法，该方法以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，以一定比例的酸性水溶液-有机相为流动相，定量测定依折麦布及其有关物质的含量，酸性水溶液的酸为磷酸、碳酸、甲酸、乙酸中的一种，有机相为甲醇、乙腈、丙醇、异丙醇中的一种；申请号为201410015689.5的发明专利公开了一种用液相色谱法分离测定依折麦布中间体有关物质化学纯度的方法，该方法以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，以一定比例的磷酸水溶液-有机相为流动相，定量测定依折麦布中间体及其有关物质的含量，有机相为甲醇、乙腈、丙醇、异丙醇中的一种；但是同样，采用申请号为201210337025.1的发明专利中公开的方法和申请号为201410015689.5的发明专利中公开的方法均不能完全分离检测上述杂质，说明目前现有技术中公开的方法均不能同时适用于上述的6种杂质的检测。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高效液相色谱法分离测定依折麦布及有关物质的方法，该方法适用于上述6种有关物质的分离和检测，可同时实现上述6种有关物质的分离和检测，提高了分离检测的效率。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种高效液相色谱法分离测定依折麦布及有关物质的方法，所述高效液相色谱法分析过程中采用的色谱柱是以苯基硅烷键合硅胶为填料，以溶液A和有机溶剂B按一定比例混合为流动相进行洗脱；所述的溶液A为酸的水溶液、乙腈和甲醇的混合溶液。

本发明所述的方法适用于上述的6种杂质的分离和测定，可用于单独检测某一种杂质，也可同时分离和检测这6种杂质，与现有技术相比，本发明的方法更快捷，提高了效率，具有显著的进步性。

上述的方法中，所述酸为磷酸、甲酸、乙酸、柠檬酸和三氟乙酸中的一种或多种，优选为磷酸。

上述的方法中，所述酸的水溶液的体积百分浓度为0.05-0.15%，优选为0.1%。

上述的方法中，所述有机溶剂B为乙腈和/或甲醇，优选为乙腈。

本发明所述的高效液相色谱方法为反相液相色谱法，采用的色谱柱是以苯基硅烷键合硅胶为填料，所述苯基硅烷键合硅胶颗粒粒径为3-5μm，优选粒径为5μm。所述的苯基硅烷键合硅胶色谱柱柱长为150-250mm，优选为250mm。采用所述的色谱柱进行分离时，色谱柱适用的柱温范围为20-40℃，优选为30℃。在本发明的一个具体实施方式中，色谱柱为苯基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱（PhenomenexLunaPhenylHexyl，型号为250mm×4.6mm，5μm）。

优选的，本发明所述的一种高效液相色谱法分离测定依折麦布及有关物质的方法，当采用所述流动相进行洗脱时，流动相的流速为0.5-1.5ml/min，优选为1.0ml/min。

上述方法中，优选的，所述溶液A中酸的水溶液、乙腈和甲醇的体积比为40-55:35-50:10，更优选的，所述溶液A中酸的水溶液、乙腈和甲醇的体积比为48:42:10。

上述的方法中，以溶液A和有机溶剂B按一定比例混合为流动相进行梯度洗脱，所述梯度比例为：

0min，溶液A与有机溶剂B的体积比为100:0；

25min，溶液A与有机溶剂B的体积比为100:0；

35min，溶液A与有机溶剂B的体积比为55:45；

45min，溶液A与有机溶剂B的体积比为55:45；

46min，溶液A与有机溶剂B的体积比为100:0；

55min，溶液A与有机溶剂B的体积比为100:0。

洗脱时，流动相的流速为0.5-1.5ml/min，优选为1.0ml/min。

洗脱后采用紫外检测器进行检测，DAD检测器和VWD均适用，检测波长为232nm。

本发明所述的一种高效液相色谱法分离测定依折麦布及有关物质的方法，在进行高效液相色谱法分析之前，对照品或待测样品均需先溶解，在本发明中，采用所述的溶液A溶解对照品或待测样品。

本发明所述的方法，在一个具体实施方式中，按照以下方法实现：

取依折麦布、有关物质1、有关物质2、有关物质3、有关物质4、有关物质5、有关物质6对照品各适量，用0.1%磷酸溶液-乙腈-甲醇（48:42:10）溶解，配制成每1ml含依折麦布200μg、有关物质1、有关物质2、有关物质3、有关物质4、有关物质5和有关物质6各2μg的系统适用性溶液。

取依折麦布对照品，用0.1%磷酸溶液-乙腈-甲醇（48:42:10）溶解，配制成每1ml含0.2μg的对照品溶液。

取待测样品（依折麦布或含依折麦布药物组合物）适量，用0.1%磷酸溶液-乙腈-甲醇（48:42:10）溶解，配制成每1ml含依折麦布200μg的供试品溶液，分别取系统适用性溶液、供试品溶液和对照品溶液，注入液相色谱仪，按本发明色谱条件（色谱柱填料为苯基硅烷键合硅胶，柱长为250mm，检测波长为232nm，以0.1%磷酸溶液-乙腈-甲醇（48:42:10）和乙腈为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱的比例如表1所示，流动相的流速为1.0ml/min，色谱柱柱温箱温度为30℃，进样体积为30μl）进行测定，按带校正因子的对照品外标法计算供试品中各已知杂质的含量，按对照品外标法计算供试品中其他单个杂质的含量，总杂质为各已知杂质与其他单个杂质之和。

本发明的方法还可对依折麦布碱降解杂质进行分离测定，碱降解待测样品的制备如下：

取依折麦布适量，置量瓶中，加0.01mol/L乙醇制氢氧化钠溶液10ml使溶解，密塞，于55℃加热15分钟，取出，立即加0.1mol/L盐酸溶液2ml，用0.1%磷酸溶液-乙腈-甲醇（48:42:10）溶解，配制成每1ml含依折麦布200μg的供试品溶液，取30μl注入高效液相色谱仪，按照上述的色谱条件完成依折麦布碱降解杂质的测定。

表1梯度洗脱溶液A与有机溶剂B的体积

本发明的有益效果在于：（1）本发明的一种高效液相色谱法分离测定依折麦布及有关物质的方法，该方法对上述的6种有关物质均能适用，可以同时对其中的一种或多种有关物质进行分离检测，与现有技术相比，提高了分离检测的效率；（2）利用本发明的方法检测依折麦布碱降解杂质，能更准确、更有效地将有关物质6和其他降解杂质有效分离开，进口注册标准（JX20070201）方法却不能分离有关物质6和其他降解杂质。

因此本发明的方法与现有技术相比，检测结果更准确，从而能更精准的确保依折麦布原料及其制剂的质量可控，并最终确定产品的安全有效。

附图说明

图1为实施例1和实施例2中系统适用性溶液的HPLC图（图中12.910出峰为依折麦布）；

图2为实施例1中测定依折麦布有关物质HPLC图（图中12.704出峰为依折麦布）；

图3为实施例2中测定依折麦布片有关物质HPLC图（图中12.717出峰为依折麦布）；

图4为对比例1中系统适用性溶液HPLC图（图中30.443出峰为依折麦布）；

图5为对比例1中有关物质3和有关物质4混合溶液HPLC图；

图6为实施例3中采用本发明方法测定依折麦布碱降解溶液HPLC图（图中13.365出峰为依折麦布）；

图7为对比实施例2中采用进口注册标准方法测定依折麦布碱降解溶液HPLC图（图中27.981出峰为依折麦布）；

图8为对比实施例2中采用本发明方法测定碱降解溶液中RRT1.52峰的收集液HPLC图；

图9为对比实施例2中保留时间为17.498min峰的[M+H]质谱图；

图10为对比实施例2中保留时间为17.498min峰的[M-H]质谱图。

具体实施方式

所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

以下实施例中，本发明的方法中，采用的仪器及色谱条件如下：

（1）高效液相色谱仪：Waters-2695-2487（Waters）；

检测器：UV；

色谱工作站：Empower。

（2）色谱柱：以苯基硅烷键合硅胶为填充剂，硅胶颗粒粒径为5μm，色谱柱柱长250mm，直径为4.6mm。

（3）质谱仪：API3000；

工作站：Analyst1.4.2；

离子源：ESI；。

（4）流动相

溶液A：0.1%磷酸溶液、乙腈和甲醇按体积比48：42：10混合；

有机溶剂B：乙腈。

（5）检测条件

流动相：溶液A和有机溶剂B按照下表所示的体积比例进行混合作为流动相进行梯度洗脱；

流动相流速：1.0ml/min；

柱温箱温度：30℃；

洗脱后检测器检测波长：232nm；

进样量：30μl。

实施例1依折麦布原料药有关物质的测定

取依折麦布、有关物质1、有关物质2、有关物质3、有关物质4、有关物质5、有关物质6对照品各适量，用0.1%磷酸溶液-乙腈-甲醇（48:42:10）溶解，配制成每1ml含依折麦布200μg，有关物质1、有关物质2、有关物质3、有关物质4、有关物质5和有关物质6各2μg的系统适用性溶液。

取依折麦布对照品，用0.1%磷酸溶液-乙腈-甲醇（48:42:10）溶解并配制成每1ml含0.2μg的对照品溶液。

取依折麦布原料药适量，用0.1%磷酸溶液-乙腈-甲醇（48:42:10）溶解，配制成每1ml含依折麦布200μg的供试品溶液。

分别取系统适用性溶液、对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定，记录色谱图，结果见图1和图2。按带校正因子的对照品外标法计算供试品中各已知杂质的含量，按对照品外标法计算供试品中其他单个杂质的含量，总杂质为各已知杂质与其他单个杂质之和。

计算公式如下：

100（C/W）（FAt/As）；

式中：C为对照品溶液中依折麦布浓度，μg/ml；

W为供试品溶液浓度，μg/ml；

At为供试品溶液中各杂质峰的峰面积；

As为对照品溶液中依折麦布峰面积；

F为各杂质的校正因子。

实施例2依折麦布制剂（依折麦布片）中有关物质的测定

取依折麦布、有关物质1、有关物质2、有关物质3、有关物质4、有关物质5、有关物质6对照品各适量，用0.1%磷酸溶液-乙腈-甲醇（48:42:10）溶解，配制成每1ml含依折麦布200μg，有关物质1、有关物质2、有关物质3、有关物质4、有关物质5和有关物质6各2μg的系统适用性溶液。

取依折麦布对照品，用0.1%磷酸溶液-乙腈-甲醇（48:42:10）溶解并配制成每1ml含0.4μg的对照品溶液。

取依折麦布片研细，取适量，用0.1%磷酸溶液-乙腈-甲醇（48:42:10）超声处理30分钟（随时振摇），配制成每1ml含依折麦布200μg的供试品溶液，分别取系统适用性溶液、对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定，记录色谱图，结果见图1和图3。按带校正因子的对照品外标法计算供试品中各已知杂质的含量，按对照品外标法计算供试品中其他单个杂质的含量，总杂质为各已知杂质与其他单个杂质之和。

计算公式如下：

100（C/W）（FAt/As）；

式中：C为对照品溶液中依折麦布浓度，μg/ml；

W为供试品溶液浓度，μg/ml；

At为供试品溶液中各杂质峰的峰面积；

As为对照品溶液中依折麦布峰面积；

F为各杂质的校正因子。

对比实施例1进口注册标准（JX20070201）测定依折麦布有关物质

进口注册标准（JX20070201）测定依折麦布有关物质的色谱条件为：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶（HypersilBDSC18），柱长150mm，直径4.6mm，十八烷基硅烷键合硅胶颗粒粒径为5μm。

流动相：0.05mol/L磷酸二氢钾溶液、乙腈、四氢呋喃按照体积比65：25：10的比例混合为流动相。

检测波长：232nm；

进样量：30μl；

检测时间：主峰的2倍保留时间。

取依折麦布、有关物质1、有关物质2、有关物质3、有关物质4、有关物质5、有关物质6对照品各适量，用0.1%磷酸溶液-乙腈-甲醇（48:42:10）溶解，配制成每1ml含依折麦布200μg，有关物质1、有关物质2、有关物质3、有关物质4、有关物质5和有关物质6各2μg的系统适用性溶液，取该溶液注入液相色谱仪，按进口注册标准（JX20070201）的色谱条件进行测定，记录色谱图，结果见图4。

图4和实施例1中图1相比，检出已知杂质峰的个数为4个，有两个已知杂质有关物质3和有关物质4未检出。

另外再取有关物质3和有关物质4对照品各适量，用0.1%磷酸溶液-乙腈-甲醇（48:42:10）溶解，配制成每1ml含有关物质3和有关物质4各20μg的溶液，取该溶液注入液相色谱仪，按进口注册标准（JX20070201）的色谱条件进行测定，记录色谱图，结果见图5。

由图5可知，即使提高进样液中有关物质3和有关物质4的浓度，按照进口注册标准（JX20070201）的色谱条件进行检测，有关物质3、有关物质4仍然未能检出。

由此可见，本发明的方法能同时检测出有关物质1、有关物质2、有关物质3、有关物质4、有关物质5和有关物质6，而进口注册标准（JX20070201）方法不能检出有关物质3和有关物质4。

实施例3依折麦布碱降解后有关物质的检测

色谱柱：苯基硅烷键合硅胶为填充剂（PhenomenexLunaPhenylHexyl250mm×4.6mm，5μm）；

流动相：0.1%磷酸溶液：乙腈：甲醇（48：42：10）；

检测波长：232nm；

进样量：30μl；

检测时间：25min（本发明方法的等度洗脱部分）。

取依折麦布适量，置量瓶中，加0.01mol/L乙醇制氢氧化钠溶液10ml使溶解，密塞，于55℃加热15分钟，取出，立即加0.1mol/L盐酸溶液2ml，用0.1%磷酸溶液-乙腈-甲醇（48:42:10）溶解，配制成每1ml含依折麦布200μg的供试品溶液，取该供试品溶液注入高效液相色谱仪，按本发明色谱条件，记录色谱图，结果见图6。

对比实施例2依折麦布碱降解后有关物质的检测（进口注册标准（JX20070201）的方法）

进口注册标准（JX20070201）色谱条件：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶（HypersilBDSC18150mm×4.6mm，5μm）；

流动相：0.05mol/L磷酸二氢钾溶液：乙腈：四氢呋喃（65：25：10）；

检测波长：232nm；

进样量：30μl；

检测时间：主峰的2倍保留时间。

取实施例3中制备的供试品溶液注入高效液相色谱仪，按进口注册标准（JX20070201）色谱条件进行检测，记录色谱图，结果图7。

取实施例3中制备的供试品溶液100μl，注入液相色谱仪，按进口注册标准（JX20070201）色谱条件进行检测，收集最大降解杂质RRT1.52的色谱峰溶液，取该收集液100μl，注入液相色谱仪中，按照本发明的色谱条件进行检测，记录色谱图，结果见图8，并收集保留时间为17.498min的色谱峰溶液，采用API3000MS，ESI离子源的正离子、负离子模式进行分析，结果见图9、10。

由图6和图7可知，图6检出杂质峰个数更多，图7最大降解杂质峰（相对保留时间（RRT）1.52）的峰面积百分含量为55.44%，与图6中的两个连续降解杂质（RRT1.30和RRT1.39）的峰面积之和（47.68%+6.94%＝54.62%）相当。

由图8可知，RRT1.52实际为两个杂质的混合峰，进口注册标准（JX20070201）不能分离这两个降解杂质。

由图9和图10可知，保留时间为17.498min峰的分子量为409.1，和有关物质6的分子量一致。

由实施例3和对比实施例2的结果可知，利用本发明的方法对依折麦布碱降解后的有关物质进行检测，能将有关物质6和其他降解杂质有效分离开，进口注册标准（JX20070201）方法分离杂质能力不如本发明方法，不能分离有关物质6和其他降解杂质，本发明的方法检测结果更准确。

综上所述，与现有技术相比，本发明的一种高效液相色谱法分离测定依折麦布及有关物质的方法：首先，对上述的6种有关物质均能适用，可以同时对其中的一种或多种有关物质进行分离检测，与现有技术相比，提高了分离检测的效率；其次，利用本发明的方法检测依折麦布碱降解杂质，能更准确、更有效地将有关物质6和其他降解杂质有效分离开，进口注册标准（JX20070201）方法却不能分离有关物质6和其他降解杂质，能更精准的确保依折麦布原料及其制剂的质量可控，并最终确定产品的安全有效。因此，本发明的方法带来了有意的效果，具有显著的进步性。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种高效液相色谱法分离测定依折麦布及有关物质的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法分析过程中采用的色谱柱是以苯基硅烷键合硅胶为填料，以溶液A和有机溶剂B按一定比例混合为流动相进行洗脱；所述的溶液A为酸的水溶液、乙腈和甲醇的混合溶液。

2.根据权利要求1所述的一种高效液相色谱法分离测定依折麦布及有关物质的方法，其特征在于，所述酸为磷酸、甲酸、乙酸、柠檬酸和三氟乙酸中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的一种高效液相色谱法分离测定依折麦布及有关物质的方法，其特征在于，所述的有机溶剂B为乙腈和/或甲醇。

4.根据权利要求1或2所述的一种高效液相色谱法分离测定依折麦布及有关物质的方法，其特征在于，所述酸的水溶液的浓度为0.05-0.15%。

5.根据权利要求1所述的一种高效液相色谱法分离测定依折麦布及有关物质的方法，其特征在于，所述苯基硅烷键合硅胶粒径为3-5μm。

6.根据权利要求1所述的一种高效液相色谱法分离测定依折麦布及有关物质的方法，其特征在于，所述流动相进行洗脱的流速为0.5-1.5ml/min。

7.根据权利要求1所述的一种高效液相色谱法分离测定依折麦布及有关物质的方法，其特征在于，所述溶液A中酸的水溶液、乙腈和甲醇的体积比为40-55:35-50:10。

8.根据权利要求1所述的一种高效液相色谱法分离测定依折麦布及有关物质的方法，其特征在于，以溶液A和有机溶剂B按一定比例混合为流动相进行梯度洗脱，所述梯度比例为：

0min，溶液A与有机溶剂B的体积比为100:0；

25min，溶液A与有机溶剂B的体积比为100:0；

35min，溶液A与有机溶剂B的体积比为55:45；

45min，溶液A与有机溶剂B的体积比为55:45；

46min，溶液A与有机溶剂B的体积比为100:0；

55min，溶液A与有机溶剂B的体积比为100:0。

9.根据权利要求1所述的一种高效液相色谱法分离测定依折麦布及有关物质的方法，其特征在于，在进行高效液相色谱法分析之前，采用溶液A溶解样品。

10.根据权利要求1所述的一种高效液相色谱法分离测定依折麦布及有关物质的方法，其特征在于，流动相进行洗脱后采用紫外检测器进行检测，检测波长为232nm。