CN113759049A - 一种依折麦布瑞舒伐他汀钙片有关物质的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种依折麦布瑞舒伐他汀钙片有关物质的检测方法方法。运用高效液相色谱法，采用通过核壳技术将十八烷基和五氟苯基共同键合的硅胶为填料的HORIZON Aurashell C18为色谱柱，以甲醇‑水‑三氟乙酸为A流动相，含三氟乙酸的乙腈溶液为B流动相，通过梯度洗脱完成。本发明公开的方法能同时检测依折麦布瑞舒伐他汀钙片中23种已知杂质，本法流动相配制简单、专属性强、分离度高、灵敏度高、准确度好，提高了分离检测的效率。为依折麦布瑞舒伐他汀钙片有关物质研究提供了可靠的杂质谱参考，可作为依折麦布瑞舒伐他汀片产品中有关物质的杂质归属及检测，具有积极的效果和实际应用价值。

Description

一种依折麦布瑞舒伐他汀钙片有关物质的检测方法
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种运用高效液相色谱检测依折麦布瑞舒伐他汀钙片有关物质的方法。
背景技术
依折麦布是一种口服、强效的降脂药物，其作用机制与其它降脂药物不同，本品附着于小肠绒毛刷状缘，抑制胆固醇的吸收，从而降低小肠中的胆固醇向肝脏中转运，使得肝脏胆固醇贮量降低从而增加血液中胆固醇的清除，其结构如下所示：
Figure 76699DEST_PATH_IMAGE001
瑞舒伐他汀钙是一种选择性HMG-CoA还原酶抑制剂。HMG-CoA还原酶抑制剂是转变3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A为甲戊酸盐—胆固醇的前体的限速酶。瑞舒伐他汀增加了肝LDL细胞表面受体数目，促进LDL的吸收和分解代谢，抑制了VLDL的肝合成，由此降低VLDL和LDL微粒的总数。其结构如下所示：
Figure 703859DEST_PATH_IMAGE002
瑞舒伐他汀钙联合依折麦布应用，可以弥补他汀类药对于急性冠状动脉综合征(ACS)患者的降脂局限性，特别是在患者单一他汀类药物治疗效果不佳或不能耐受大剂量他汀类药物时，瑞舒伐他汀钙联合依折麦布是一种安全有效的选择。
依折麦布瑞舒伐他汀钙片杂质较多，依折麦布原料的杂质主要来源于合成过程中引入的反应原料（依折杂质C、依折杂质D、依折杂质E、依折杂质F），降解杂质（依折杂质A、依折杂质B、依折杂质G、依折杂质H），中间体残留杂质（依折杂质I、依折杂质J）及副产物杂质(依折杂质K)。瑞舒伐他汀钙原料的杂质主要来源于合成过程中引入的反应原料（瑞舒杂质A），降解产生（瑞舒杂质B、瑞舒杂质C、瑞舒杂质D、瑞舒杂质E、瑞舒杂质J、瑞舒杂质K、瑞舒杂质M），其他杂质（瑞舒杂质N）及瑞舒伐他汀钙片特有杂质（瑞舒杂质H、瑞舒杂质I），其中瑞舒伐他汀钙杂质D和瑞舒伐他汀钙杂质H在光照条件下极易降解。
表1 依折麦布瑞舒伐他汀钙片杂质列表
Figure 507867DEST_PATH_IMAGE003
Figure 971209DEST_PATH_IMAGE004
依折麦布瑞舒伐他汀钙片涉及杂质较多，现有文献报道的关于依折麦布瑞舒伐他汀钙片的有关物质方法较少，且杂质归属控制较少。流动相体系复杂，含有缓冲盐及四氢呋喃等，配制方法和操作繁琐。
为保证药品质量和临床用药的安全有效，必须对药物中的杂质进行归属控制。由于涉及杂质较多，归属和分离依折麦布瑞舒伐他汀钙片中的相关的杂质显得极为重要，目前建立在全面杂质谱分析基础上的依折麦布瑞舒伐他汀钙片的分析方法未见文献报道。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术对依折麦布瑞舒伐他汀钙片全面杂质鉴定和分离的缺失的问题，提供一种简单易操作、同时检测出多种依折麦布瑞舒伐他汀钙片有关物质的分析方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明公开了一种依折麦布瑞舒伐他汀钙片有关物质的检测方法，运用高效液相色谱法，采用通过核壳技术将十八烷基和五氟苯基共同键合的硅胶为填料的色谱柱，以含酸的水相为A流动相，含酸的有机相为B流动相，设置流速、柱温、检测波长及进样体积，梯度洗脱；该检测方法能同时检测依折麦布瑞舒伐他汀钙片中23种有关物质。
本发明通过对依折麦布瑞舒伐他汀钙片杂质进行了溯源归属，共包括表1所列的23种杂质。发明人曾试图采用ACE Ultracore 2.5 super C18（150mm×4.6mm）、GLsciences Intertsil ODS-3（150mm×3.0mm）、菲罗门 Fastcore Super C18 2.6μ （150mm×4.6mm）、HORIZON Aurashell C18 PFP 5μ（250mm×4.6mm）等色谱柱分离各已知杂质，依折麦布杂质C与依折麦布主成分均完全重叠，由此可见，该类色谱柱不适用于依折麦布杂质的分离。依折麦布杂质B、依折麦布杂质C、依折麦布杂质D、依折麦布杂质E、依折麦布杂质F、依折麦布杂质H和依折麦布杂质J均含有氮杂环结构，改用通过核壳技术将十八烷基和五氟苯基共同键合的硅胶为填料的 HORIZON Aurashell C18/PFP 2.7μm（150mm×4.6mm）色谱柱，该色谱柱含五氟苯基可产生较强的偶极诱导作用，对氮杂环化合物等易极化的物质有较强的分离能力，含核壳技术可以缩短分析时间。经对流动相组成、梯度及柱温的优化及筛选，确定本发明的分析方法。同时按中国药典2020年版四部通则<0512>（高效液相色谱法）及通则<9101>（药品质量标准分析方法验证指导原则）的定义和验证方法，进行专属性验证，结果表明该方法可同时分离依折麦布瑞舒伐他汀钙片中所有23种已知杂质，并且通过加校正因子的主成分外标法有效控制各已知杂质含量，各杂质峰与两主峰之间的分离度大于1.5，主峰与各杂质峰峰纯度均为1.0。
根据本发明的实施方式，本发明采用的通过核壳技术将十八烷基和五氟苯基共同键合的硅胶为填料的色谱柱优选自HORIZON Aurashell C18/PFP，规格为150mm×4.6mm，2.7µm。
根据本发明的实施方式，A流动相中的酸选自三氟乙酸，A流动相选自甲醇-水-三氟乙酸。
优选地，A流动相中甲醇：水：三氟乙酸的体积比为15:85:0.01。
根据本发明的实施方式，B流动相中的有机相优选自甲醇、乙腈、四氢呋喃中的一种或几种。
优选地，B流动相中的有机相选自乙腈。
根据本发明的实施方式，B流动相中的有机相乙腈中含有酸，具体地，酸选自磷酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸中的一种或几种，优选三氟乙酸，B流动相中乙腈与三氟乙酸的体积比为100:0.01。
根据本发明的实施方式，本发明公开的高效液相色谱法中，当流速选自1.0~1.2mL/min，柱温为33~37℃，检测波长为215nm和242nm，进样体积为10μL时，能够有效的分离依折麦布瑞舒伐他汀钙片有关物质，从而确保了依折麦布瑞舒伐他汀钙片的质量可控。
根据本发明的实施方式，本发明优选如下梯度洗脱程序：以体积比计，以流动相A76%，流动相B 24%开始洗脱，持续洗脱至25min，逐渐减少流动相A比例，增加流动相B比例，至60min将流动相A比例调整至74%，流动相B比例调整至26%，继续逐渐降低流动相A比例，增加流动相B比例，至85-88min，流动相A调整至20%，流动相B调整至80%，逐渐增加流动相A比例，降低流动相B比例，至0.1min后，流动相A调整至76%，流动相B调整至24%，保持该流动相比例继续洗脱至90-95min。该方法能有效地控制依折麦布瑞舒伐他汀钙片中的23种有关物质，依折麦布相关杂质和瑞舒伐他汀钙相关杂质均能分析出来，各杂质峰与相邻主峰之间的分离度均大于1.5，主峰与各杂质峰峰纯度均为1.0，结果见表2。
表2 依折麦布瑞舒伐他汀钙片与各已知杂质色谱分离参数结果
Figure 784444DEST_PATH_IMAGE005
本发明的有益效果是：本发明首次对依折麦布瑞舒伐他汀钙片杂质进行溯源归属，鉴定了23种依折麦布瑞舒伐他汀钙片中的已知杂质，本发明公开的检测方法可以同时分离23种相关依折麦布瑞舒伐他汀钙片杂质，该方法流动相配制简单、专属性强、分离度高、灵敏度高、准确度好，提高了分离检测的效率。为依折麦布瑞舒伐他汀钙片有关物质研究提供了可靠的杂质谱参考，可以用来作为依折麦布瑞舒伐他汀片产品中有关物质的杂质归属及检测，具有积极的效果和实际应用价值。
附图说明
图1为实施例1空白溶剂的高效液相色谱图。
图2为实施例1依折麦布瑞舒伐他汀钙片有关物质系统适用性的高效液相色谱图，“R-”表示瑞舒伐他汀钙，“E-”表示依折麦布。
图3为实施例1依折麦布瑞舒伐他汀片辅料空白的高效液相色谱图。
图4为依折麦布瑞舒伐他汀片对照品的高效液相色谱图，“R-”表示瑞舒伐他汀钙，“E-”表示依折麦布。
图5为依折麦布瑞舒伐他汀钙片供试品有关物质的高效液相色谱图，“R-”表示瑞舒伐他汀钙，“E-”表示依折麦布。
图6为实施例2依折麦布瑞舒伐他汀钙片有关物质系统适用性的高效液相色谱图，“R-”表示瑞舒伐他汀钙，“E-”表示依折麦布。
图7为实施例3依折麦布瑞舒伐他汀钙片有关物质系统适用性的高效液相色谱图，“R-”表示瑞舒伐他汀钙，“E-”表示依折麦布。
图8为实施例4依折麦布瑞舒伐他汀钙片有关物质系统适用性的高效液相色谱图，“R-”表示瑞舒伐他汀钙，“E-”表示依折麦布。
具体实施方式
实施例1
（1）样品配制：取依折麦布瑞舒伐他汀钙片5片，置50ml量瓶中，再加水-乙腈-醋酸（40:60:0.1）12ml，超声30min后，冷却至室温，加水-乙腈-醋酸（40:60:0.1）定容至刻度，离心5min（10000转），取上清液，用0.45μmPP滤头过滤，弃去1ml续滤液，即得。
（2）对照品溶液：取依折麦布对照品约10mg和瑞舒伐他汀钙对照品约10mg（规格：10mg/10mg）或5mg（规格：10mg/5mg），精密称定，置100ml量瓶中，加水-乙腈-醋酸（40:60:0.1）稀释至刻度，摇匀。精密量取1ml，置100ml量瓶中，加水-乙腈-醋酸（40:60:0.1）稀释至刻度，摇匀。
（3）高效液相色谱仪的品牌型号：赛默飞 U3000
（4）检测器：DAD
（5）色谱柱：HORIZON Aurashell C18/PFP（150mm×4.6mm，2.7µm）
（6）流动相A：甲醇-水-三氟乙酸 (15:85:0.01），流动相B: 乙腈-三氟乙酸 (100:0.01）按以下梯度洗脱：
以流动相A 76%，流动相B 24%开始洗脱，持续洗脱至25min，逐渐减少流动相A比例，增加流动相B比例，至60min将流动相A比例调整至74%，流动相B比例调整至26%，继续逐渐降低流动相A比例，增加流动相B比例，至85min，流动相A调整至20%，流动相B调整至80%，逐渐增加流动相A比例，降低流动相B比例，至0.1min后，流动相A调整至76%，流动相B调整至24%，保持该流动相比例继续洗脱至90min。
（7）流速为每分钟1.2ml；
（8）检测波长0-5min为215nm、5-90min为242nm；
（9）柱温为35℃；
（10）进样体积10μl；
（11）图1空白溶剂和图3空白辅料均不干扰有关物质检测，图2中系统适用性溶液，保留时间为17.353min的色谱峰为瑞舒伐他汀钙的色谱峰，保留时间为48.035min的色谱峰为依折麦布的色谱峰，其余色谱峰为依折麦布和瑞舒伐他汀钙各杂质的色谱峰，由图2可以看出，依折麦布、瑞舒伐他汀钙与各杂质能够达到基线分离，符合中国药典的要求，图4、图5分别为对照品溶液和供试品溶液，可以检测出样品中的各杂质含量。
实施例2
（1）样品配制：取依折麦布瑞舒伐他汀钙片5片，置50ml量瓶中，再加水-乙腈-醋酸（40:60:0.1）12ml，超声30min后，冷却至室温，加水-乙腈-醋酸（40:60:0.1）定容至刻度，离心5min（10000转），取上清液，用0.45μmPP滤头过滤，弃去1ml续滤液，即得。
（2）对照品溶液：取依折麦布对照品约10mg和瑞舒伐他汀钙对照品约10mg（规格：10mg/10mg）或5mg（规格：10mg/5mg），精密称定，置100ml量瓶中，加水-乙腈-醋酸（40:60:0.1）稀释至刻度，摇匀。精密量取1ml，置100ml量瓶中，加水-乙腈-醋酸（40:60:0.1）稀释至刻度，摇匀。
（3）高效液相色谱仪的品牌型号：赛默飞 U3000
（4）检测器：DAD
（5）色谱柱：HORIZON Aurashell C18/PFP（150mm×4.6mm，2.7µm）
（6）流动相A：甲醇-水-三氟乙酸 (15:85:0.01），流动相B: 乙腈-三氟乙酸 (100:0.01），按以下梯度洗脱：
以流动相A 76%，流动相B 24%开始洗脱，持续洗脱至25min，逐渐减少流动相A比例，增加流动相B比例，至60min将流动相A比例调整至74%，流动相B比例调整至26%，继续逐渐降低流动相A比例，增加流动相B比例，至85min，流动相A调整至20%，流动相B调整至80%，逐渐增加流动相A比例，降低流动相B比例，至0.1min后，流动相A调整至76%，流动相B调整至24%，保持该流动相比例继续洗脱至90min。
（7）流速为每分钟1.2ml；
（8）检测波长0-5min为215nm、5-90min为242nm；
（9）柱温为33℃；
（10）进样体积10μl；
（11）图6中保留时间为18.210min的色谱峰为瑞舒伐他汀钙的色谱峰，保留时间为50.612min的色谱峰为依折麦布的色谱峰，其余色谱峰为依折麦布和瑞舒伐他汀钙各杂质的色谱峰，由图6可以看出，依折麦布、瑞舒伐他汀钙与各杂质能够达到基线分离，符合中国药典的要求。
实施例3
（1）样品配制：取依折麦布瑞舒伐他汀钙片5片，置50ml量瓶中，再加水-乙腈-醋酸（40:60:0.1）12ml，超声30min后，冷却至室温，加水-乙腈-醋酸（40:60:0.1）定容至刻度，离心5min（10000转），取上清液，用0.45μmPP滤头过滤，弃去1ml续滤液，即得。
（2）对照品溶液：取依折麦布对照品约10mg和瑞舒伐他汀钙对照品约10mg（规格：10mg/10mg）或5mg（规格：10mg/5mg），精密称定，置100ml量瓶中，加水-乙腈-醋酸（40:60:0.1）稀释至刻度，摇匀。精密量取1ml，置100ml量瓶中，加水-乙腈-醋酸（40:60:0.1）稀释至刻度，摇匀。
（3）高效液相色谱仪的品牌型号：赛默飞 U3000
（4）检测器：DAD
（5）色谱柱：HORIZON Aurashell C18/PFP（150mm×4.6mm，2.7µm）
（6）流动相A：甲醇-水-三氟乙酸 (15:85:0.01），流动相B: 乙腈-三氟乙酸 (100:0.01），按以下梯度洗脱：
以流动相A 76%，流动相B 24%开始洗脱，持续洗脱至25min，逐渐减少流动相A比例，增加流动相B比例，至60min将流动相A比例调整至74%，流动相B比例调整至26%，继续逐渐降低流动相A比例，增加流动相B比例，至85min，流动相A调整至20%，流动相B调整至80%，逐渐增加流动相A比例，降低流动相B比例，至0.1min后，流动相A调整至76%，流动相B调整至24%，保持该流动相比例继续洗脱至90min。
（7）流速为每分钟1.2ml；
（8）检测波长0-5min为215nm、5-90min为242nm；
（9）柱温为37℃；
（10）进样体积10μl；
（11）图7中保留时间为17.083min的色谱峰为瑞舒伐他汀钙的色谱峰，保留时间为47.262min的色谱峰为依折麦布的色谱峰，其余色谱峰为依折麦布和瑞舒伐他汀钙各杂质的色谱峰，由图7可以看出，依折麦布、瑞舒伐他汀钙与各杂质能够达到基线分离，符合中国药典的要求。
实施例4
（1）样品配制：取依折麦布瑞舒伐他汀钙片5片，置50ml量瓶中，再加水-乙腈-醋酸（40:60:0.1）12ml，超声30min后，冷却至室温，加水-乙腈-醋酸（40:60:0.1）定容至刻度，离心5min（10000转），取上清液，用0.45μmPP滤头过滤，弃去1ml续滤液，即得。
（2）对照品溶液：取依折麦布对照品约10mg和瑞舒伐他汀钙对照品约10mg（规格：10mg/10mg）或5mg（规格：10mg/5mg），精密称定，置100ml量瓶中，加水-乙腈-醋酸（40:60:0.1）稀释至刻度，摇匀。精密量取1ml，置100ml量瓶中，加水-乙腈-醋酸（40:60:0.1）稀释至刻度，摇匀。
（3）高效液相色谱仪的品牌型号：赛默飞 U3000
（4）检测器：DAD
（5）色谱柱：HORIZON Aurashell C18/PFP（150mm×4.6mm，2.7µm）
（6）流动相A：甲醇-水-三氟乙酸 (15:85:0.01），流动相B: 乙腈-三氟乙酸 (100:0.01），按以下梯度洗脱：
以流动相A 76%，流动相B 24%开始洗脱，持续洗脱至25min，逐渐减少流动相A比例，增加流动相B比例，至60min将流动相A比例调整至74%，流动相B比例调整至26%，继续逐渐降低流动相A比例，增加流动相B比例，至88min，流动相A调整至20%，流动相B调整至80%，逐渐增加流动相A比例，降低流动相B比例，至0.1min后，流动相A调整至76%，流动相B调整至24%，保持该流动相比例继续洗脱至95min。
（7）流速为每分钟1.0ml；
（8）检测波长0-5min为215nm、5-95min为242nm；
（9）柱温为35℃；
（10）进样体积10μl；
（11）图8中保留时间为20.682min的色谱峰为瑞舒伐他汀钙的色谱峰，保留时间为55.643min的色谱峰为依折麦布的色谱峰，其余色谱峰为依折麦布和瑞舒伐他汀钙各杂质的色谱峰，由图8可以看出，依折麦布、瑞舒伐他汀钙与各杂质能够达到基线分离，符合中国药典的要求。
本发明公开了一种能同时检测依折麦布瑞舒伐他汀钙片中23种有关物质的检测方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别指出的是，所有类似的替代和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述检测方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

Claims (10)

1.一种依折麦布瑞舒伐他汀钙片有关物质的检测方法，其特征在于，运用高效液相色谱法，采用通过核壳技术将十八烷基和五氟苯基共同键合的硅胶为填料的色谱柱，以含酸的水相为A流动相，含酸的有机相为B流动相，设置流速、柱温、检测波长及进样体积，梯度洗脱；该检测方法能同时检测依折麦布瑞舒伐他汀钙片中23种有关物质。
2.根据权利要求1所述的一种依折麦布瑞舒伐他汀钙片有关物质的检测方法，其特征在于，所述的色谱柱选自HORIZON Aurashell C18/PFP，规格为150mm×4.6mm，2.7µm。
3.根据权利要求1所述的一种依折麦布瑞舒伐他汀钙片有关物质的检测方法，其特征在于，所述的A流动相中的酸选自三氟乙酸，A流动相选自甲醇-水-三氟乙酸。
4.根据权利要求3所述的一种依折麦布瑞舒伐他汀钙片有关物质的检测方法，其特征在于，所述的A流动相中甲醇-水-三氟乙酸的体积比选自15:85:0.01。
5.根据权利要求1所述的一种依折麦布瑞舒伐他汀钙片有关物质的检测方法，其特征在于，所述的B流动相中有机相选自甲醇、乙腈、四氢呋喃中的一种或几种。
6.根据权利要求5所述的一种依折麦布瑞舒伐他汀钙片有关物质的检测方法，其特征在于，所述的B流动相中有机相选自乙腈。
7.根据权利要求6所述的一种依折麦布瑞舒伐他汀钙片有关物质的检测方法，其特征在于，所述的B流动相中有机相乙腈中含有酸，酸选自磷酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸中的一种或几种。
8.根据权利要求7所述的一种依折麦布瑞舒伐他汀钙片有关物质的检测方法，其特征在于，所述的酸选自三氟乙酸，B流动相中乙腈与三氟乙酸体积比为100:0.01。
9.根据权利要求1所述的一种依折麦布瑞舒伐他汀钙片有关物质的检测方法，其特征在于，所述的高效液相色谱法中流速选自1.0~1.2mL/min，柱温选自33~37℃，检测波长选自215nm和242nm，进样体积选自10μL。
10.根据权利要求1所述的一种依折麦布瑞舒伐他汀钙片有关物质的检测方法，其特征在于，所述的梯度洗脱为：以体积比计，以流动相A 76%，流动相B 24%开始洗脱，持续洗脱至25min，逐渐减少流动相A比例，增加流动相B比例，至60min将流动相A比例调整至74%，流动相B比例调整至26%，继续逐渐降低流动相A比例，增加流动相B比例，至85-88min，流动相A调整至20%，流动相B调整至80%，逐渐增加流动相A比例，降低流动相B比例，至0.1min后，流动相A调整至76%，流动相B调整至24%，保持该流动相比例继续洗脱至90-95min。
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