CN105111312A - 具有adcc和cdc功能及改善的糖基化特征的抗-cd19抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及抗-CD19抗体,其具有赋予一种或几种有用的效应子功能的相对于野生型Fc区具有一些特定氨基酸修饰的变体Fc区。本发明尤其涉及包含该变体Fc区的嵌合,人源化的或全人抗-CD19抗体。其有利地涉及具有感兴趣的和有价值的糖基化特征,尤其低岩藻糖水平和/或高寡甘露糖水平和低水平的唾液酸化的糖型的抗体。本发明也涉及这些抗体在疾病或病症,诸如癌,尤其B细胞恶性肿瘤,及自-免疫疾病的治疗,防止或管理中的用途。
Description
本申请是2011年7月18日提交的同名发明专利申请201180044951.3的分案申请。
【技术领域】
本发明涉及抗-CD19抗体,其具有赋予一种或几中有用的效应子功能的相对于野生型Fc区具有一些特定氨基酸修饰的变体Fc区。本发明尤其涉及包含该变体Fc区的嵌合,人源化的或全人抗-CD19抗体。其有利地涉及具有感兴趣的和有价值的糖基化特征,尤其低岩藻糖水平和/或高寡甘露糖水平和/或更高水平的唾液酸化的糖型的抗体。本发明也涉及这些抗体在疾病或病症,诸如癌,尤其B细胞恶性肿瘤,及自-免疫疾病的治疗,防止或管理中的用途。
【背景技术】
在自身免疫和/或炎性病症中,免疫系统在无要抵御的外源物质时引发炎性应答,及身体的正常保护性免疫系统通过错误地攻击本身来导致对其自身组织的损伤。有以不同方式影响身体的许多不同自身免疫病症。例如,在患多发性硬化的个体中影响脑,在患克罗恩病的个体中影响肠,及在患类风湿性关节炎的个体中影响各种关节的滑膜,骨和软骨。
B细胞恶性肿瘤构成癌的重要组,其包括B细胞非-霍奇金氏淋巴瘤(NHL),B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)和毛细胞白血病和B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)。
目前,癌治疗可涉及手术,化学治疗,激素治疗和/或放射治疗,以根除患者中的肿瘤形成细胞。最近,癌治疗也可涉及生物学治疗或免疫治疗。
有对于替代性的癌治疗,特别对于已证明了对标准癌治疗,诸如手术,放射治疗,化学治疗和激素治疗难治性的癌治疗的显著需求。
有希望的替代性的是免疫治疗,其中癌细胞特别由癌抗原-特异性抗体靶向。
主要努力已指向利用免疫应答的特异性,例如,杂交瘤技术致使肿瘤选择性单克隆抗体的开发,且在过去几年,食品和药物管理局批准了用于癌治疗的第1MAb:用于非-霍奇金氏淋巴瘤的(抗-CD20)和用于转移性乳腺癌的赫赛汀[抗-(c-erb-2/HER-2)]。
(俗名是利妥昔单抗)是针对在外周血和淋巴样组织中的大多数B细胞表面发现的人CD20,35kDa,4跨膜-跨蛋白的嵌合小鼠-人单克隆抗体。
抗体治疗(美国专利5,736,137)被美国食品和药物管理局(FDA)批准用于治疗复发的或难治性低度或滤泡,CD20-阳性B细胞非-霍奇金氏淋巴瘤。
此外,采用放射性标记的抗-CD20抗体的淋巴瘤治疗已描述于美国专利5,595,721,5,843,398,6,015,542和6,090,365。
在肿瘤学中,也在US被作为单剂用于治疗复发的或难治性,低度或滤泡,CD20-阳性,B细胞NHL,用于治疗NHL,用于之前未治疗的滤泡,CD20-阳性,B细胞NHL组合环磷酰胺,长春新碱,泼尼松龙(CVP)化学治疗,作为单剂用于治疗非-进展(包括稳定的疾病),低度,CD20阳性,B细胞NHL,在第1-线CVP化学治疗之后,及用于之前未治疗的扩散大B细胞,CD20-阳性,NHL组合标准化学治疗(CHOP)或其他基于蒽环类抗生素的化学治疗方案。
在肿瘤学中,在EU被用于患之前未治疗的或复发的/难治性慢性淋巴细胞白血病(CLL)的患者的治疗组合化学治疗,用于之前未治疗的患阶段III-IV滤泡淋巴瘤的患者的治疗组合化学治疗,作为对于应答诱导利用用或不用的化学治疗的治疗的患复发的/难治性滤泡淋巴瘤的患者的维持治疗,用于患CD20-阳性扩散大B细胞非-霍奇金氏淋巴瘤(NHL)的患者的治疗组合CHOP(环磷酰胺,多柔比星,长春新碱,泼尼松龙)化学治疗,及作为用于是化疗抗性或在它们的在化学治疗之后的二次或随后复发的患阶段III-IV滤泡淋巴瘤的患者的治疗的单一治疗。
此外,在风湿病学中,指示组合甲氨喋呤用于已具有对其他疾病-修饰抗-风湿性药物(DMARD)的不充足的应答或不耐性的患严重的有活性的类风湿性关节炎的成年患者的治疗,包括一种或更多肿瘤坏死因子(TNF)抑制物治疗。MabThera已在美国,日本和加拿大被知为Rituxan。
阿仑珠单抗是靶向CD52的另一抗体,其已被批准用于复发的慢性淋巴细胞白血病(CLL),但相关于显著毒性,因为最正常免疫细胞包括T-细胞和自然杀伤(NK)细胞上靶抗原的普遍存在的表达。
但是,呈现了一些对利妥昔单抗治疗的抗性或复发。复发可通过各种机理呈现,其中一些导致损失CD20表达和对进一步利妥昔单抗治疗的抗性。抗性可呈现,其可导致CD20表达的损失或调节,及特征在于重复的利妥昔单抗治疗的功效的缺乏,或在一些情况中,由初次利妥昔单抗治疗的功效的缺乏。抗性也发生在组成性缺少CD20表达的淋巴瘤病例中,包括一些B-细胞淋巴瘤诸如成血浆细胞性淋巴瘤。而且,CD20+患者可不应答,或获取对治疗的抗性。
而且,在高B细胞负荷的病情下,身体的效应子机理,例如,NK-细胞-介导的杀伤的耗竭,可导致此MAb的免疫治疗功效的实质性减小。而且,具有慢性淋巴细胞白血病和高水平的循环B细胞的患者的利妥昔单抗治疗可导致CD20自细胞移出,由此允许它们持续及抵抗清除。
基于利妥昔单抗和阿仑珠单抗的成功和限制,尤其是用利妥昔单抗治疗的抗性和复发现象,需要靶向B细胞上的替代性的抗原的替代性的抗体的鉴定。
CD19是免疫球蛋白(Ig)超家族的95kDa糖蛋白成员。CD19在来自它们的早期前-B细胞阶段的滤泡树突细胞和全部B细胞上表达,直到浆细胞分化的时间。CD19表面表达在B-细胞发育期间紧密调控,更高水平见于更成熟细胞和CD5+(B-1)B细胞。CD19通过B细胞分化的成血浆细胞阶段而晚于CD20表达。因而,CD19表达在CD20差地表达的许多前-B和未成熟的B-成淋巴细胞白血病和B细胞恶性肿瘤中相对高。CD19+成血浆细胞也可在自身免疫疾病的永存中起到作用。
CD19作为与CD21,CD81和CD225的多分子复合物在B细胞的表面上表达。与此复合物一起,CD19涉及与B细胞受体的共信号传导,及在B-淋巴样细胞的分化,活化和增殖的控制中起到作用(Sato等人,1997)。
CD19存在于不同类型的人B细胞恶性肿瘤(包括促-及前-B细胞急性成淋巴细胞白血病(ALL),儿童和年轻成年的常见的ALL(cALL),NHL,B-CLL和多毛-细胞白血病(HCL))的胚细胞。其未自恶性肿瘤细胞脱落,及在一些抗体结合之后内化(Press等人,1989)。抗原密度,在健康外周B细胞上,为10000~30000个分子/细胞,及在来自各种淋巴样癌的恶性肿瘤细胞上,为7000~30000个分子/细胞(Olejniczak等人,1983)。
相比CD20,CD19在B-细胞发育中更广泛地和更早表达,其由销售的抗癌MAb靶向,且如此可用于更宽范围的癌包括非-霍奇金氏淋巴瘤和急性成淋巴细胞白血病以及CLL。
CD19已20年为免疫治疗开发的焦点,但用针对CD19的单克隆抗体的初始临床试验未导致耐久效应,尽管在一些患者中作为单剂或组合其他治疗剂展示应答(Hekman等人,1991;Vlasved等人,1995)。
已在小鼠模型,及在临床试验中评价几种CD19-特异性抗体用于体外治疗B-系恶性肿瘤。这些包括了靶向CD19和CD3或CD16的未修饰的抗-CD19抗体,抗体-药物缀合物和双特异性抗体,以着手细胞毒性淋巴细胞效应子功能。
本文所用的术语“单克隆抗体”指称自一群基本上均质抗体获得的抗体,即,包含群的个体抗体是同一的,除非可以少数量存在的可能的天然存在的突变或替代性的翻译后修饰,无论自杂交瘤或重组DNA技术产生。
抗体是蛋白,其呈现对特异性抗原的结合特异性。天然抗体通常是约150,000Da的异源四聚体糖蛋白,由2个同一轻(L)链和2个同一重(H)链组成。各轻链由一个共价二硫键连接到重链,而二硫键数在不同免疫球蛋白同种型的重链之间变化。各重和轻链也具有规则链内二硫键桥。
各重链在一端具有可变结构域(VH)之后是许多恒定区。各轻链在一端具有可变结构域(VL)和在其另一端具有恒定区;轻链的恒定区与重链的第1恒定区对齐,及轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。
术语‘变体’指称可变结构域的特定部分在抗体间在序列上广泛地不同,且负责对其特定抗原的各特定抗体的结合特异性。但是,变异性通过抗体的可变结构域未均匀地分布。其在轻链和重链可变结构域二者中被称为互补决定区(CDR)的3段中浓缩。
可变结构域的更高度保守的部分被称为框架区(FR)。天然重和轻链的可变结构域各包含4个FR区,大地采用β-折叠片构型,由3个CDR连接,其形成环连接,及在一些情况中,形成β-折叠片结构的部分。在各链中的CDR由FR区紧密保持在一起,且自其他链的CDR,贡献于抗体的抗原结合位点的形成(Kabat等人,1991)。
恒定区未直接涉及抗体结合抗原,但呈现各种效应子功能。依赖于它们的重链的恒定区的氨基酸序列,抗体或免疫球蛋白可分为不同类。有5种主要类的免疫球蛋白:IgA,IgG,IgD,IgE和IgM,及这些中的几种可还分为亚类(同种型),例如。IgG1,IgG2,IgG3和IgG4;IgA1和IgA2。对应于不同类的免疫球蛋白的重链恒定区分别被称为α,δ,ε,γ和μ。在各种人免疫球蛋白类中,仅IgG1,IgG2,IgG3和IgM已知活化补体。
已显示贡献于抗体-介导的细胞毒性的免疫效应子功能包括抗体-依赖性细胞-介导的细胞毒性(ADCC),抗体-依赖性细胞-介导的吞噬(ADCP),及补体-依赖性细胞毒性(CDC)。
细胞毒性也可经抗增殖效应介导。尚不清楚肿瘤细胞增殖的抗体调节机理。但是,对抗体与免疫效应细胞上的Fcg受体(FcgR)的相互作用的理解的发展允许了具有显著地改善的效应子功能的抗体的加工。
MAb的作用机理是复杂的,且呈现对不同MAb而改变。有MAb导致靶细胞死亡的多种机理。这些包括凋亡,CDC,ADCC和信号转导的抑制。
研究最多的是ADCC,其由自然杀伤(NK)细胞介导。此涉及抗体的Fab部分与癌细胞上的特定表位的结合和抗体的Fc部分与NK细胞上的Fc受体的随后结合。此引发穿孔素,及导致DNA降解的粒酶的释放,诱导凋亡及导致细胞死亡。在对MAb的Fc部分的不同受体之中,FcgRIIIa在ADCC中起到主要作用。
之前研究显示,FcgRIIIa基因的多态性在氨基酸158编码苯丙氨酸(F)或缬氨酸(V)。缬氨酸同种型的表达与增加的亲和性关联及结合MAb(Rowland等人,1993;Sapra等人,2002;Molhoj等人,2007)。一些临床研究用对患非-霍奇金氏淋巴瘤的显示V/V多态性的患者中利妥昔单抗的更大临床应答支持了此发现(Cartron等人,2002,Bruenkeetal.2005,Hekmann等人,1991,Bargou等人,2008)。
WO1999051642描述了在第270或329位,或在第270,322,329和331位的2个或更多包含氨基酸取代的变体人IgGFc区。这些修饰旨在增加CDC和ADCC效应子功能。
WO2002080987描述了治疗受试者中的B细胞恶性肿瘤的方法,包括施用抗-CD19免疫毒素,更特别是人源化的或人,单克隆抗体。B细胞恶性肿瘤可为包含不表达CD20的B细胞的恶性肿瘤。
WO2007024249涉及人IgGFc区的修饰,以便赋予由FcγR介导的增加效应细胞功能,尤其ADCC。Fc区在各氨基酸位置包含特定修饰。
WO2008022152也与靶向CD19的抗体相关,其中抗体包含对Fc受体的修饰及改变抗体介导一种或更多效应子功能,包括ADCC,ADCP和CDC的能力。例证了ADCC测定。
其他相关于抗-CD19抗体的专利申请包括WO2009052431,WO2009054863,WO2008031056,WO2007076950,WO2007082715,WO2004106381,WO1996036360,WO1991013974,US7,462,352,US20070166306和WO2005092925。
US20090098124也涉及用含有IgG2,3或4的Fc区,具有一个或更多氨基酸修饰的变体重链加工抗体。建议了Fc区之内的许多突变和突变组。它们之一是在第243位用亮氨酸,在第292位用脯氨酸,在第300位用亮氨酸,在第305位用异亮氨酸,及在第396位用亮氨酸取代(MgFc88)。另外的突变可导入Fc区,以提供用于改变的C1q结合和/或CDC功能。待修饰的氨基酸位置通常选自第270,322,326,327,329,331,333和334位。
J.B.Stavenhagen等人(CancerRes.2007,67(18):8882-8890)公开了治疗性抗体的Fc优化。用突变体18获得最高水平的ADCC(F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L)。公开了具有此突变的Fc的抗-CD20和抗-CD32B单克隆抗体。
尽管CD19是在慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞上表达的B细胞特异性抗原,至今CD19未用治疗性单克隆抗体有效靶向。作者描述了XmAb5574,具有设计为增强FcγRIIIa的结合的修饰的Fc结构域的新加工的抗-CD19单克隆抗体。它们展示,此抗体介导有力的ADCC,中等直接细胞毒性和ADCP,但无CDC(Awan等人,2010)。
而且,糖蛋白介导人类中的许多必要的功能,包括催化,信号传导,细胞间交往和分子识别和关联。已开发许多糖蛋白用于治疗性目的。蛋白的寡糖组分可影响与治疗性糖蛋白的功效关联的性质,包括物理稳定性,对蛋白酶攻击的抗性,与免疫系统的相互作用,药代动力学和特定生物学活性。该性质不仅可依赖于寡糖的存在或缺失,而且依赖于寡糖的特定结构。例如,特定寡糖结构介导糖蛋白通过与特定碳水化合物结合蛋白相互作用而自血流快速清除,而其他可被抗体结合及引发不期望的免疫反应(Jenkins等人,1996)。
已许可及开发为医疗剂的多数既有的治疗性抗体具有人IgG1同种型,其分子量是约150kDa。人IgG1是带有结合到抗体恒定区(Fc)的2N-联双触角复合物-型寡糖的糖蛋白,其中大多数寡糖是核心岩藻糖基化的,及其通过Fc与白细胞受体(FcγR)或补体的相互作用训练抗体-依赖性细胞毒性(ADCC)和补体-依赖性细胞毒性(CDC)的效应子功能。
最近,治疗性抗体已显示改善总体存活以及各种人恶性肿瘤,诸如乳腺,结肠和血液癌中疾病进展的时间,及癌患者的FcγR多态性的遗传分析展示了ADCC是负责临床功效的主要抗-肿瘤机理。但是,既有许可的治疗性抗体的ADCC已发现被血清强烈抑制,由于非特异性IgG竞争治疗剂与自然杀伤细胞上的FcγRIIIa的结合,其导致显著量的药物需求和与该治疗关联的非常高成本。
通过改善的FcγRIIIa结合的非-岩藻糖基化的形式的治疗性抗体的增强的ADCC显示被岩藻糖基化的对应物抑制。实际上,在该具有改善的FcγRIIIa结合的抗体变体之中,非-岩藻糖基化的治疗性抗体,不包括岩藻糖基化的形式,呈现最强和最可饱和的体外和离体ADCC,由于那些带有天然存在的寡糖异质性和人工氨基酸突变,甚至在血浆IgG的存在下。
通过在衣霉素的存在下培养来抑制人IgG1的糖基化导致,例如,此抗体对单核细胞和巨噬细胞上存在的FcγRI受体的亲和性50倍减小(Leatherbarrow等人,1990)。与FcγRIII受体结合也受IgG上碳水化合物的损失影响,由于已描述非-糖基化的IgG3不能经NK细胞的FcγRIII受体诱导ADCC类型的裂解(Lund等人,1995)。但是,除了含有聚糖的残基的必需存在之外,其更精确地是它们的可导致起始效应子功能的能力的差异的结构的异质性。
已进行研究,以研究寡糖残基对抗体生物学活性的功能。已显示,IgG的唾液酸对ADCC无效应(Boyd等人,1995)。几个报道显示,Gal残基增强ADCC(Kumpel等人,1994)。两断GlcNac,其是转移到核心β-甘露糖(Man)残基的β,4-GlcNac残基,已牵涉治疗性抗体的生物学残基(Lifely等人,1995,Shield等人,2002)揭示了岩藻糖基化的寡糖对抗体效应子功能的效应;Fuc-缺陷型IgG1显示了50倍增加的结合FcγRIII及增强的ADCC。
今天,用于治疗性应用(即癌,炎性疾病…)的广范围的重组蛋白包括糖基化的单克隆抗体。为治疗和经济的原因,在获得更高特异性抗体活性上有大的兴趣。一种获得大的效力增加,而维持在细胞系中的简单产生过程和潜在地避免显著,不期望的副作用的方式在于增强MAb的天然的,细胞-介导的效应子功能。因而,加工IgG的寡糖可产生优化的ADCC,其被认为是一些治疗性抗体的主要功能,尽管抗体具有多种治疗功能(例如抗原结合,凋亡诱导,及CDC)。
一般而言,嵌合及人源化的抗体通过使用遗传重组技术制备及通过使用CHO细胞作为宿主细胞产生。为了修饰抗体的糖链结构,已尝试各种方法,有针对与糖链修饰相关的酶的抑制物的应用,突变体的选择,或编码与糖链修饰相关的酶的基因的导入。
GLYCARTBIOTECHNOLOGYAG(Zurich,CH)在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系中表达了催化两断GlcNac残基添加到N-联寡糖的N-乙酰-葡萄糖胺基转移酶III(GnTIII),并显示产生的IgG1抗体的更大ADCC(WO99/54342;WO03/011878;WO2005/044859)。
通过自抗体的Fc部分移出或代替岩藻糖,KYOWAHAKKOKOGYO(Tokyo,日本)增强了Fc结合及改善了ADCC,由此改善了MAb的功效(US6,946,292)。
近来,Morerecently,LaboratoireduFractionnementetdesBiotechnologies(LFB)(法国)显示,MAb寡糖中的比Fuc/Gal应是等同或少于0.6,以获得具有高ADCC的抗体(FR2861080)。
P.M.Cardarelli等人(CancerImmunol.Immunother.2010,59:257-265)在编码α1,6-岩藻糖基转移酶的FUT8基因缺陷的M-704PFCHO细胞中产生抗-CD19抗体。此文章中抗体的非-岩藻糖基化需要酶-缺陷型细胞系的加工。此文章考虑了氨基酸突变。
JohnLund等人(JournalofImmunology,1996,vol.157,no.11,pp4963-4969)描述了非糖基化的人嵌合IgG3保留了结合人C1q及引发通过豚鼠C介导的裂解的显著能力。
效应子功能诸如CDC和ADCC是可为对于MAb的临床功效重要的效应子功能。全部这些效应子功能由抗体Fc区介导,及使作者尝试氨基酸修饰,或多或少成功。糖基化,尤其是,Fc区的岩藻糖基化对抗体功效具有显著影响。此使作者修饰CHO细胞中的抗体产生条件,以便在此再次尝试变化糖基化特征,以改善一些效应子功能,再次或多或少成功。
增强嵌合MAb抗-CD19MAb4G7的ADCC的方法公开于US2007/0166306。通过使用人哺乳动物293T-细胞系,在β(1,4)-N-乙酰葡萄糖胺基转移酶III(GnTIII)酶的存在下,在对于抗体产生有效的条件下产生MAb4G7,由含有(1)至少60%N-乙酰葡萄糖胺双选择寡糖和(2)仅10%的非岩藻糖基化的N-乙酰葡萄糖胺双选择寡糖的Asn297-连接的寡糖表征的Fc片段。
H.M.Horton等人(CancerRes.2008,68(19):8049-8057)描述具有S239D和I332E突变的Fc-加工的抗-CD19抗体。将此在本文被称为Fc14的Fc结构域与本发明的被称为chR005-Fc20(F243L/R292P/Y300L/V305L/P396L)的Fc结构域比较。本发明的Fc结构域在全血效应细胞的存在下显示ADCC,然而用Fc14,在相同的条件下,在含有循环天然的免疫球蛋白的全血的存在下未检测到显著ADCC活性。
哺乳动物细胞是用于产生治疗性糖蛋白的优选的宿主,由于它们以为人应用最相容的形式糖基化蛋白的能力(Jenkis等人,1996)。细菌非常罕见糖基化蛋白,且如同其他类型的常见的宿主,诸如酵母,丝状真菌,昆虫和植物细胞产生与自血流快速清除关联的糖基化模式。
在哺乳动物细胞之中,中国仓鼠卵巢(CHO)细胞已在最近二十年期间最通常使用。除了给出适合的糖基化模式之外,这些细胞允许遗传稳定的,高产率克隆细胞系的一致的产生。它们可在简单生物反应器中使用无血清的培养基培养到高密度,及允许安全的和可再现的生物过程的开发。其他通常使用的动物细胞包括幼仓鼠肾(BHK)细胞,NSO-及SP2/0-小鼠骨髓瘤细胞。也已测试自转基因动物产生(Jenkins等人,1996)。
由于糖链结构在抗体的效应子功能中起到显著地重要作用,且在由宿主细胞表达的糖蛋白的糖链结构中观察到差异,可用于产生具有更高效应子功能的抗体的宿主细胞的开发已经是目的。
为了修饰产生的糖蛋白的糖链结构,已尝试各种方法,诸如(1)针对与糖链修饰相关的酶的抑制物的应用,(2)细胞突变体的选择,(3)编码与糖链修饰相关的酶的基因的导入,等。特定例在以下描述。
针对与糖链修饰相关的酶的抑制物的例包括:衣霉素,其选择性地抑制GlcNAc-P-P-Dol的形成,这是N-糖苷-连接的糖链的前体的核心寡糖的形成的第1步骤;粟精胺和W-甲基-1-脱氧野尻霉素,其是糖苷酶I的抑制物;溴牛菜醇,其是糖苷酶II的抑制物;1-脱氧野尻霉素和1,4-二氧基-1,4-亚氨基-D-甘露糖醇,其是甘露糖苷酶I的抑制物;苦马豆素,其是甘露糖苷酶II的抑制物;苦马豆素,其是甘露糖苷酶II的抑制物等。
特异于糖基转移酶的抑制物的例包括:针对N-乙酰葡萄糖胺转移酶V(GnTV)的底物的脱氧衍生物等。也知道,1-脱氧野尻霉素抑制复合物类型糖链的合成,和增加高甘露糖类型和混合型糖链的比(Glycobiologyseries2-DestinyofSugarChaininCell,由KatsutakaNagai,SenichiroHakomori和AkiraKobata,1993编辑)。
主要选择及获得关于与糖链修饰相关的酶的活性的细胞突变体作为耐凝集素的细胞系。例如,已使用凝集素获得具有各种糖链结构的CHO细胞突变体作为耐凝集素的细胞系,所述凝集素诸如WGA(源于小麦(T.vulgaris)的小麦胚凝集素),ConA(源于直立刀豆(C.ensiformis)的伴刀豆球蛋白A),RIC(源于蓖麻(R.communis)的毒素),L-PHA(源于菜豆(P.vulgaris)的白细胞凝集素),LCA(源于兵豆(L.culinaris)的扁豆凝集素),PSA(源于豌豆(P.sativum)的豌豆凝集素)等(Genetetal.1986)。
作为通过将与糖链修饰相关的酶的基因导入宿主细胞获得的产物的糖链结构的修饰的一例,已报道,许多唾液酸加入糖链的非-还原端的蛋白可通过将大鼠β-半乳糖苷酶-a-5,6-唾液酸转移酶导入CHO细胞来产生。不同类型的糖蛋白-修饰糖基转移酶也可在宿主系统中表达,诸如GnTIII,或,替代性地,b(1,4)-N-乙酰葡萄糖胺基转移酶V(GnTV),β(1,4)-半乳糖基转移酶(GalT)和甘露糖苷酶II(ManII)。
WO20070166306涉及禽胚胎来源的干细胞系,命名的用于产生蛋白和更特别糖蛋白,诸如相比用通常的CHO细胞欠岩藻糖基化的抗体的用途。
RameshJassal等人用FA243突变或通过使用大鼠a2,6-唾液酸转移酶转染的CHO-K1细胞系产生抗NIPIgG3抗体的唾液酸化。FA243IgG3具有由补体的靶细胞裂解恢复的a2,6和a2,3唾液酸化。
JohnLund等人(JournalofImmunology,1996,vol.157,no.11,pp4963-4969)描述,非糖基化的人嵌合IgG3保留了结合人C1q及引发通过豚鼠C介导的裂解的显著能力。
本发明人评价了由未用糖基化抑制物修饰的及未处理的中国仓鼠卵巢细胞CHO/DG44细胞(由ECACC购买的)产生的针对CD19抗原的人IgG1亚类的各种Fc嵌合变体抗体的糖基化特征。通过分析及比较产生的chR005-1Fc0和优化的chR005-1Fc20变体抗体的糖链的结构,本发明提供,无任何加工的野生型CHO宿主细胞表达感兴趣的和有价值的糖基化特征,尤其低岩藻糖水平和/或高寡甘露糖水平和/或更高水平的唾液酸化的糖型。
【发明概述】
本发明提供结合人B细胞标记物的嵌合,人源化的及人抗-CD19抗体,抗-CD19抗体融合蛋白,及其片段。
优化治疗性抗体功能性(例如.ADCC,CDC)的当前方法聚焦在天然Fc区的氨基酸修饰或糖基化状态的修饰。相反,本发明基于关乎氨基酸修饰和糖基化修饰的同时组合的方法。
本发明涉及蛋白的糖基化加工领域。更特定,本发明针对通过使用野生型哺乳动物CHO细胞系的蛋白的糖基化加工,以通过用具有改善的治疗性性质,诸如有效ADCC然而亲本分子(鼠或野生型嵌合抗体)不可检测地呈现此功能的氨基酸突变来提供变体蛋白。
本发明的分子仍保留了由亲本鼠抗体赋予的凋亡性效应子功能。
更具体而言,本创新涉及用来自IgG1同种型的Fc区修饰免疫球蛋白中的抗体官能性,以具有引发CDC效应子功能的能力。
更特别是,本发明的分子呈现ADCC的互补活化和有效诱导二者。
本发明的分子对于B细胞病症,诸如但不限于,B细胞恶性肿瘤的治疗,对于自身免疫疾病的治疗和预防,及对于人移植受者中的移植物-抗宿主疾病(GVHD),体液拒绝和移植后淋巴组织增生性病症的治疗和预防,对于用出治疗性抗体诸如但不限作为抗-CD20抗体治疗的或对于用出治疗性抗体诸如但不限作为抗-CD20抗体的联合治疗难治性的患者特别有用。
本工作旨在产生克服这些缺点的具有修饰的Fc区的抗-CD19抗体。发明人展示,这些抗-CD19抗体的Fc区内的氨基酸修饰可具有不仅对于效应子功能,包括ADCC和/或CDC的结果,而且直接对于抗体的糖基化特征。它们尤其是展示,Fc区内的一些修饰可导致抗-CD19抗体具有感兴趣的和有价值的糖基化特征,尤其当抗体在哺乳动物细胞,包括野生型哺乳动物细胞,尤其是啮齿动物细胞,尤其CHO细胞,诸如野生型dhfr-/-CHO细胞(由ATCC收集购买的)产生或表达时,低岩藻糖水平和/或高寡甘露糖水平和/或更高水平的唾液酸化的糖型。
本发明的第1目的旨在提供赋予感兴趣的和有价值的糖基化特征,尤其对抗-CD19抗体,包括在哺乳动物细胞,尤其啮齿动物细胞,诸如CHO细胞,优选野生型细胞,诸如野生型CHO细胞中产生的或表达的抗体的低岩藻糖水平和/或高寡甘露糖水平和/或更高水平的唾液酸化的糖型的修饰的Fc区。通过定义,野生型表示细胞未修饰或加工,以便修饰天然细胞的糖基化机理。
本发明的第2目的旨在提供给含有此Fc区的抗-CD19抗体赋予ADCC功能的修饰的Fc区。
本发明的第3目的旨在提供给含有此Fc区的抗-CD19抗体赋予CDC功能的修饰的Fc区。
本发明的第4目的旨在提供给含有此Fc区的抗-CD19抗体赋予ADCC和CDC功能的修饰的Fc区。
本发明的第5目的旨在提供给含有此Fc区的抗-CD19抗体赋予ADCC和/或CDC功能,且此外,当在哺乳动物细胞,尤其是啮齿动物细胞,诸如CHO细胞,包括野生型中产生的或表达时赋予感兴趣的和有价值的糖基化特征,尤其低岩藻糖水平和/或高寡甘露糖水平和/或更高水平的唾液酸化的糖型的修饰的Fc区。
【发明详述】
本发明的第1对象是抗-CD19抗体,其被修饰为包含变体人IgG1Fc区,其中此变体区在人IgG1Fc区的各氨基酸第243,292,300,305,326,396或243,292,300,305,326,333,396位包含氨基酸取代。Fc区内的氨基酸残基根据的编号系统编号。
本发明的重组抗-CD19抗体在野生型细胞,尤其啮齿动物细胞,诸如尤其是野生型CHO中产生之后具有感兴趣的糖基化特征。
尤其是,自转染的细胞,例如野生型CHO,本发明允许表达大比例的重组抗体或其片段,携带包含具有半乳糖基化及非-岩藻糖基化的末端GlcNac的长链的双触角-型的常见的N-联寡糖结构。
一种或更多糖型存在于重组抗-CD19抗体群。糖型是仅关于附接的聚糖的数或类型不同的蛋白的同种型。
在非常令人惊讶的和有价值的实施方式中,抗体具有低岩藻糖水平。此是指在这些细胞,例如野生型CHO中产生的重组抗-CD19抗体群之中,在此实施方式中,非-岩藻糖基化的抗体的比例占抗体的大致至少40%,优选大致至少60%,更优选大致至少80%或更高,例如至少85%。更具体而言,非-岩藻糖基化关乎Fc。
作为CHO细胞,提及的可为CHOdhfr-/-,CHO/DG44和CHOEasyC。
本发明的特定对象是抗-CD19抗体,其被修饰为包含变体人IgG1Fc区,其中此变体区在人IgG1Fc区的各氨基酸第243,292,300,305,326,396或243,292,300,305,326,333,396位包含氨基酸取代,且其中抗体已在野生型啮齿动物细胞,优选野生型CHO细胞中产生。根据优选的特征,此抗体具有低水平的岩藻糖。
本发明的另一对象是抗-CD19抗体,其被修饰为包含变体人IgG1Fc区,其中此变体区在人IgG1Fc区的各氨基酸第243,292,300,305,326,396或243,292,300,305,326,333,396位包含氨基酸取代,具有低岩藻糖水平。
根据本发明,低水平的岩藻糖是指(1)在一抗体,尤其在其Fc中减少的量的岩藻糖或(2)尤其在它们的Fc中具有减少的量的岩藻糖和/或无岩藻糖的组中的大量的抗体。
在本说明书中,说到本发明的Fc或2个Fc的抗体。即便不每次提及,有对于每实施方式优选的情况,其中抗体具有2个Fc和各Fc之一具有类似结构(相同的突变)和类似糖基化特征。
在一实施方式中,本发明的抗体具有Fc,优选2个不带有(GlcNAc)2(Fuc)1+(Man)3(GlcNAc)2聚糖的Fc。
在一实施方式中,本发明的抗体具有Fc,优选2个不带有(Gal)1(GlcNAc)2(Fuc)1+(Man)3(GlcNAc)2聚糖的Fc。
在一实施方式中,本发明的抗体具有Fc,优选2个不带有(GlcNAc)2(Fuc)1+(Man)3(GlcNAc)2聚糖和不带有(Gal)1(GlcNAc)2(Fuc)1+(Man)3(GlcNAc)2聚糖的Fc。
在一实施方式中,本发明的抗体包含Fc,优选2个带有(Man)5(GlcNAc)2聚糖的Fc。在一实施方式中,本发明的抗体包含Fc,优选2个带有(Man)5(GlcNAc)2聚糖的Fc和无(GlcNAc)2(Fuc)1+(Man)3(GlcNAc)2聚糖和/或,优选及,无(Gal)1(GlcNAc)2(Fuc)1+(Man)3(GlcNAc)2聚糖的Fc。
在一实施方式中,抗体包含Fc,优选2个带有以下聚糖之1种或2种的Fc:
●(Gal)1(GlcNAc)2(Fuc)1(NeuAc)1+(Man)3(GlcNAc)2
●(Gal)2(GlcNAc)2(Fuc)1(NeuAc)1+(Man)3(GlcNAc)2
在一实施方式中,本发明的抗体包含Fc,优选2个带有(Man)5(GlcNAc)2聚糖的Fc和无(GlcNAc)2(Fuc)1+(Man)3(GlcNAc)2聚糖和/或,优选及,无(Gal)1(GlcNAc)2(Fuc)1+(Man)3(GlcNAc)2聚糖,及1个或2个以下聚糖的Fc:
●(Gal)1(GlcNAc)2(Fuc)1(NeuAc)1+(Man)3(GlcNAc)2
●(Gal)2(GlcNAc)2(Fuc)1(NeuAc)1+(Man)3(GlcNAc)2
本发明的另一对象是抗-CD19抗体,抗-CD19抗体,其被修饰为包含变体人IgG1Fc区,其中此变体区在人IgG1Fc区的各氨基酸第243,292,300,305,326,396或243,292,300,305,326,333,396位包含氨基酸取代,且其中抗体具有Fc,优选2个不带有(GlcNAc)2(Fuc)1+(Man)3(GlcNAc)2聚糖的Fc和/或,优选及,不带有(Gal)1(GlcNAc)2(Fuc)1+(Man)3(GlcNAc)2聚糖的Fc。在一实施方式中,本发明的抗体包含Fc,优选2个带有(Man)5(GlcNAc)2聚糖的Fc。在一实施方式中,抗体包含Fc,优选2个带有以下聚糖之1种或2种的Fc:
●(Gal)1(GlcNAc)2(Fuc)1(NeuAc)1+(Man)3(GlcNAc)2
●(Gal)2(GlcNAc)2(Fuc)1(NeuAc)1+(Man)3(GlcNAc)2
在仍非常令人惊讶的和有价值的实施方式中,抗体具有高寡甘露糖水平。此是指在这些细胞,例如野生型CHO中产生的重组抗-CD19抗体群之中,特征为更高水平的寡甘露糖的抗体的比例占抗体的大致至少20%,优选大致至少30%,更优选大致至少40%,仍更优选大致至少50%或更高。
在仍非常令人惊讶的和有价值的实施方式中,在这些细胞,例如野生型CHO中产生的重组抗体群之中,特征为更高水平的唾液酸化的糖型的抗体的比例占抗体的大致至少1.5%,优选大致至少2.5%,更优选大致至少5%或更高。
在优选的实施方式中,本发明的抗体组合这些特征,尤其低岩藻糖水平和高寡甘露糖水平和/或更高水平的唾液酸化的糖型的3种。
尤其是,本发明的转染的细胞,例如野生型CHO细胞允许表达大比例的抗体或其片段,携带包含具有半乳糖基化及非-岩藻糖基化的末端GlcNac的长链及给抗体赋予强ADCC活性的双触角-型的常见的N-联寡糖结构。
在一实施方式中,抗-CD19抗体具有本发明的特定糖基化特征,尤其低岩藻糖水平和/或高寡甘露糖水平和/或更高水平的唾液酸化的糖型,所述抗体是在哺乳动物细胞,优选野生型哺乳动物细胞,优选啮齿动物来源,尤其CHO细胞中产生或表达的,或要产生的或表达的。
本发明也具有作为根据本发明的对象抗体组(或抗体组合物),其中其包含抗-CD19抗体,其被修饰为包含变体人IgG1Fc区,其中此变体区在人IgG1Fc区的各氨基酸第243,292,300,305,326,396或243,292,300,305,326,333,396位包含氨基酸取代。根据特征,抗体组已在野生型啮齿动物细胞,优选野生型CHO细胞中产生。根据另一特征,抗体组具有低水平的岩藻糖。根据再一特征,抗体组已在野生型啮齿动物细胞,优选野生型CHO细胞中产生。
在第1实施方式中,此组包含少于或等于15%的该抗-CD19抗体,其包含Fc,优选2个带有(GlcNAc)2(Fuc)1+(Man)3(GlcNAc)2聚糖的Fc和/或,优选及,该抗体的少于或等于20%,其包含Fc,优选2个带有(Gal)1(GlcNAc)2(Fuc)1+(Man)3(GlcNAc)2聚糖的Fc。糖型百分率以数%表达。
在另一实施方式中,抗体组包含抗体的至少15,20,30,40或50%,其包含Fc,优选2个带有(Man)5(GlcNAc)2聚糖的Fc。在一实施方式中,值是至少15%。
在另一实施方式中,组包含少于或等于15%的该抗-CD19抗体,其包含Fc,优选2个带有(GlcNAc)2(Fuc)1+(Man)3(GlcNAc)2聚糖的Fc和/或,优选及,该抗体的少于或等于20%,其包含Fc,优选2个带有(Gal)1(GlcNAc)2(Fuc)1+(Man)3(GlcNAc)2聚糖的Fc,及抗体的至少15,20,30,40或50%,其包含Fc,优选2个带有(Man)5(GlcNAc)2聚糖的Fc。在优选的实施方式中抗体组包含全部这些特征。在一实施方式中,寡甘露糖的值是至少15%。
在另一实施方式中,抗体组包含:
●抗体的少于1.5或1%,其包含Fc,优选2个带有(Gal)1(GlcNAc)2(Fuc)1(NeuAc)1+(Man)3(GlcNAc)2的Fc(典型为0.1~1.5%),和/或优选,
●抗体的少于2或1.5%,其包含Fc,优选2个带有(Gal)2(GlcNAc)2(Fuc)1(NeuAc)1+(Man)3(GlcNAc)2的Fc(典型为0.1~2)。
在再一实施方式中,组包含少于或等于15%的该抗-CD19抗体,其包含Fc,优选2个带有(GlcNAc)2(Fuc)1+(Man)3(GlcNAc)2聚糖的Fc和/或,优选及,该抗体的少于或等于20%,其包含Fc,优选2个带有(Gal)1(GlcNAc)2(Fuc)1+(Man)3(GlcNAc)2聚糖的Fc,及抗体的至少15,20,30,40或50%,其包含Fc,优选2个带有(Man)5(GlcNAc)2聚糖的Fc,及还是
●抗体的少于1.5或1%,其包含Fc,优选2个带有(Gal)1(GlcNAc)2(Fuc)1(NeuAc)1+(Man)3(GlcNAc)2的Fc,和/或,优选
●抗体的少于2或1.5%,其包含Fc,优选2个带有(Gal)2(GlcNAc)2(Fuc)1(NeuAc)1+(Man)3(GlcNAc)2的Fc。在优选的实施方式中,抗体组包含全部这些特征。在一实施方式中,寡甘露糖的值是至少15%。
本发明的另一对象是根据本发明的抗体组(或抗体组合物),其中其包含抗-CD19抗体,其被修饰为包含变体人IgG1Fc区,其中此变体区在人IgG1Fc区的各氨基酸第243,292,300,305,326,396或243,292,300,305,326,333,396位包含氨基酸取代,且其中组包含少于或等于15%的该抗-CD19抗体,其包含Fc,优选2个带有(GlcNAc)2(Fuc)1+(Man)3(GlcNAc)2聚糖的Fc和/或,优选及,该抗体的少于或等于20%,其包含Fc,优选2个带有(Gal)1(GlcNAc)2(Fuc)1+(Man)3(GlcNAc)2聚糖的Fc。
在另一实施方式中,抗体组包含至少20,30,40或50%的抗体,其包含Fc,优选2个带有(Man)5(GlcNAc)2聚糖的Fc。在一实施方式中,值是至少15%。
在另一实施方式中,组包含少于或等于15%的该抗-CD19抗体,其包含Fc,优选2个带有(GlcNAc)2(Fuc)1+(Man)3(GlcNAc)2聚糖的Fc和/或,优选及,该抗体的少于或等于20%,其包含Fc,优选2个带有(Gal)1(GlcNAc)2(Fuc)1+(Man)3(GlcNAc)2聚糖的Fc,及抗体的至少15,20,30,40或50%,其包含Fc,优选2个带有(Man)5(GlcNAc)2聚糖的Fc。在优选的实施方式中,抗体组包含全部这些特征。在一实施方式中,寡甘露糖的值是至少15%。
在另一实施方式中,抗体组包含:
●抗体的少于1.5或1%,其包含Fc,优选2个带有(Gal)1(GlcNAc)2(Fuc)1(NeuAc)1+(Man)3(GlcNAc)2的Fc,和/或,优选
●抗体的少于2或1.5%,其包含Fc,优选2个带有(Gal)2(GlcNAc)2(Fuc)1(NeuAc)1+(Man)3(GlcNAc)2的Fc。
在再一实施方式中,组包含少于或等于15%的该抗-CD19抗体,其包含Fc,优选2个带有(GlcNAc)2(Fuc)1+(Man)3(GlcNAc)2聚糖的Fc和/或,优选及,该抗体的少于或等于20%,其包含Fc,优选2个带有(Gal)1(GlcNAc)2(Fuc)1+(Man)3(GlcNAc)2聚糖的Fc,及抗体的至少15,20,30,40或50%,其包含Fc,优选2个带有(Man)5(GlcNAc)2聚糖的Fc,及还是
●抗体的少于1.5或1%,其包含Fc,优选2个带有(Gal)1(GlcNAc)2(Fuc)1(NeuAc)1+(Man)3(GlcNAc)2的Fc,和/或,优选
●抗体的少于2或1.5%,其包含Fc,优选2个带有(Gal)2(GlcNAc)2(Fuc)1(NeuAc)1+(Man)3(GlcNAc)2的Fc。在优选的实施方式中,抗体组包含全部这些特征。在一实施方式中,寡甘露糖的值是至少15%。
在一实施方式中,细胞是啮齿动物细胞,尤其是CHO细胞。
在一实施方式中,细胞是野生型啮齿动物细胞,尤其野生型CHO细胞。
在一实施方式中,抗-CD19抗体能产生CDC或CDC+ADCC活性。
在一实施方式中,此抗-CD19抗体能产生CDC或CDC+ADCC活性及呈现本发明的特定糖基化特征,尤其本发明的低岩藻糖水平和/或高寡甘露糖水平和/或更高水平的唾液酸化的糖型。
本发明的抗体可在Fc区中包含补充性突变。
在一实施方式中,Fc区还在氨基酸第333位包含氨基酸取代。
人IgGFc区可为IgG亚-类的区。其可为IgG1,IgG2,IgG3或IgG4的Fc区。在优选的实施方式中,Fc区是IgG1Fc区。
根据本发明取代的Fc区的氨基酸可被任何氨基酸取代,条件是取代的氨基酸的全体组能产生此CDC或CDC+ADCC活性和/或赋予本发明的特定糖基化特征,尤其本发明的低岩藻糖水平和/或高寡甘露糖水平和/或更高水平的唾液酸化的糖型。可能的取代的例给出如下。
在一实施方式中,Phe243被Leu取代。
在一实施方式中,Arg292被Pro取代。
在一实施方式中,Tyr300被Leu取代。
在一实施方式中,Val305被Leu取代。
在一实施方式中,Lys326被Ala取代。
在一实施方式中,Glu333被Ala取代。
在一实施方式中,Pro396被Leu取代。
在一实施方式中,抗-CD19抗体包含Fc区,其中Phe243被Leu取代,Arg292被Pro取代,Tyr300被Leu取代,Val305被Leu取代,Lys326被Ala取代和Pro396被Leu取代。
在一实施方式中,此Fc区具有示于SEQIDNO:1的氨基酸序列(Fc34)。编码此Fc区的核酸示于SEQIDNO:2。
在另一实施方式中,抗-CD19抗体包含Fc区其中,Phe243被Leu取代,Arg292被Pro取代,Tyr300被Leu取代,Val305被Leu取代,Lys326被Ala取代,Glu333被Ala取代,及Pro396被Leu取代。
在另一实施方式中,此Fc区具有示于SEQIDNO:3的氨基酸序列(Fc24)。编码此Fc区的核酸示于SEQIDNO:4。
可在本发明的多肽的结构中制造修饰和变化,而仍获得具有如特征的分子。例如,无可同意的活性损失地,序列中的特定氨基酸可用其他氨基酸代替。因为其是多肽的相互作用能力和性质,定义多肽的生物学功能活性,可在多肽序列(或,当然,其成为基础的编码序列的DNA)中制造特定氨基酸序列取代和然而获得具有类似性质的多肽。
在制造该变化中,可考虑氨基酸的亲水性指数。本领域通常明白给多肽赋予相互作用生物学功能的亲水性氨基酸指数的重要性(Kyteetal.1982)。已知,特定氨基酸可用具有类似亲水性指数或分值的其他氨基酸代替,而仍导致具有类似生物学活性的多肽。各氨基酸已基于其疏水性和荷电特征分配亲水性指数。
认为,氨基酸的相对亲水性表征确定得到的多肽的二级结构,其进而限定多肽与其他分子,例如,酶,底物,受体,抗体,抗原,等的相互作用。如为本领域所知,氨基酸可由具有类似亲水性指数的另一氨基酸取代,和仍获得以生物学方式功能性地相当的多肽。在该变化中,优选其亲水性指数在±2之内的氨基酸的取代,特别优选在±1之内的那些,及甚至更特别优选在±0.5之内的那些。
也可基于亲水性制造类似氨基酸的取代,特别当由此创建的生物学功能性地相当的肽或多肽旨在免疫学实施方式中使用。美国专利4,554,101,通过引用在本文合并,说到多肽的最大局部平均亲水性,如由其相邻氨基酸的亲水性管理的,与其免疫原性和抗原性,即与多肽的生物学性质关联。
如在美国专利4,554,101中细节化,以下亲水性值已分配给氨基酸残基:精氨酸(+3.0);赖氨酸(+3.0);天冬氨酸(+3.0±1);谷氨酸(+3.0±1);丝氨酸(+0.3);天冬酰胺(+0.2);谷氨酰胺(+0.2);甘氨酸(0);脯氨酸(-0.5±1);苏氨酸(-0.4);丙氨酸(-0.5);组氨酸(-0.5);半胱氨酸(-1.0);甲硫氨酸(-1.3);缬氨酸(-1.5);亮氨酸(-1.8);异亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2.3);苯丙氨酸(-2.5);色氨酸(-3.4)。需知,氨基酸可用具有类似亲水性值的另一氨基酸代替,而仍获得生物学相当体,且尤其是,免疫学相当体,多肽。在该变化中,优选其亲水性值在±2之内的氨基酸的取代,特别优选在±1之内的那些,及甚至更特别优选在±0.5之内的那些。
如上所述,氨基酸取代通常因此基于氨基酸侧链取代基的相对相似性,例如,它们的疏水性,亲水性,电荷,尺寸,等。
氨基酸 | 指数 | 氨基酸 | 指数 |
异亮氨酸L | (+4,5) | 色氨酸W | (-0,9) |
缬氨酸V | (+4,2) | 酪氨酸Y | (-1,3) |
亮氨酸L | (+3,8) | 脯氨酸P | (-1,6) |
苯丙氨酸 | (+2,8) | 组氨酸H | (-3,2) |
半胱氨酸C | (+2,5) | 谷氨酸E | (-3,5) |
甲硫氨酸M | (+1,9) | 谷氨酰胺Q | (-3,5) |
丙氨酸A | (+1,8) | 天冬氨酸D | (-3,5) |
甘氨酸G | (-0,4) | 天冬酰胺N | (-3,5) |
苏氨酸T | (-0,7) | 赖氨酸K | (-3,9) |
丝氨酸S | (-0,8) | 精氨酸R | (-4,5) |
氨基酸取代可不同地选择或选择。可能的取代已记载于WO99/51642,WO2007024249和WO2007106707。
在一实施方式中,Phe243被选自下列的氨基酸取代:Leu,Trp,Tyr,Arg和Gln。优选地,Phe243被Leu取代。
在一实施方式中,Arg292被选自下列的氨基酸取代:Gly和Pro。优选地,Arg292被Pro取代。
在一实施方式中,Tyr300被选自下列的氨基酸取代:Lys,Phe,Leu和Ile。优选地,Tyr300被Leu取代。
在一实施方式中,Val305在Leu和Ile之中取代。优选地,Val305被Leu取代。
在一实施方式中,Lys326被选自下列的氨基酸取代:Val,Glu,Ala,Gly,Asp,Met,Ser,Asn和Trp。优选地,Lys326被Ala取代。
在一实施方式中,Glu333被选自下列的氨基酸取代:Val,Gly,Ala,Gln,Asp,Asn,Lys,Arg和Ser。优选地,Glu333被Ala取代。
在一实施方式中,Pro396被Leu取代。
在一实施方式中,本发明应用到任何抗-CD19抗体。就是说,抗-CD19抗体包含特异于CD19抗原的可变区,或包含特异于CD19抗原的CDR的可变区,及本发明的突变Fc区。可变区可见于US20090098124,WO2002080987,WO2007024249,WO2008022152,WO2009052431,WO2009054863,WO2008031056,WO2007076950,WO2007082715,WO2004106381,WO1996036360,WO1991013974,US7,462,352,US20070166306和WO2005092925。本领域技术人员可参考这些文献作为特异于CD19的可变区或CDR的源。
在一实施方式中,抗体特异于,或识别,CD19抗原上的非-内化表位。申请人开发了被称为mR005-1和mR005-2的2种鼠抗-CD19抗体,其可变区已被测序和鉴定CDR。本发明由此包括作为优选的实施方式使用源于mR005-1和mR005-2的可变区或CDR。
在优选的实施方式中,本发明的抗-CD19抗体mR005-1包含以下CDR:
在优选的实施方式中,本发明的抗-CD19抗体mR005-2包含以下CDR:
通过定义,这些CDR包括变体CDR,通过缺失,取代或添加一个或更多氨基酸,其变体保持原CDR的特异性。常见的编号系统提供用于具有最短的氨基酸序列或最小CDR定义的CDR定义。
在一实施方式中,抗体包含其VH和VL氨基酸序列以下表所示的抗体mR005-1或mR005-2的CDR,或更优选,抗体包含那些序列:
氨基酸序列VH | 氨基酸序列VL | |
mR005-1 | SEQ ID NO:29 | SEQ ID NO:31 |
mR005-2 | SEQ ID NO:33 | SEQ ID NO:35 |
在一实施方式中,抗体包含CDR,其序列示于SEQIDNO:16,6,13和/或8,9,10。
在一实施方式中,抗体包含CDR,其序列示于SEQIDNO:5,6,7和/或8,9,10。
在一实施方式中,抗体包含CDR,其序列示于SEQIDNO:11,12,13和/或14,15,10。
在一实施方式中,抗体包含CDR,其序列示于SEQIDNO:28,18,25和/或20,21,22。
在一实施方式中,抗体包含CDR,其序列示于SEQIDNO:17,18,19和/或20,21,22。
在一实施方式中,抗体包含CDR,其序列示于SEQIDNO:23,24,25和/或26,27,22。
本发明还包含这些实施方式之每一个,其中抗体还包含Fc区,其具有示于SEQIDNO:1或3的氨基酸序列。
抗体可为单克隆抗体,嵌合抗体,人源化的抗体,全人抗体,双特异性酸抗体,抗体药物缀合物或抗体片段。“人源化的抗体”或“嵌合人源化的抗体”应是指源于非人抗体,一般鼠抗体的抗体,其保留或基本上保留了亲本抗体的抗原-结合性质,但其在人中具有更少免疫原性。
在一实施方式中,抗体引发程序性细胞死亡或凋亡。
在一实施方式中,抗体用于CD19阳性B细胞病症。
在一实施方式中,抗体用于难治性或复发抗-CD20抗体治疗的患者。
在一实施方式中,本发明的抗体具有具有本发明的特定糖基化特征,尤其低岩藻糖水平和/或高寡甘露糖水平和/或更高水平的唾液酸化的糖型的Fc区及已在野生型啮齿动物哺乳动物细胞,优选野生型CHO细胞中产生。通过定义,在本研究中,这些细胞未修饰或在特定条件培养,以改变糖基化。例如,这些细胞未修饰为在1,6-岩藻糖基转移酶缺陷。本发明由此基于具有感兴趣的和有价值的糖基化特征,尤其归因于Fc区的突变的低岩藻糖水平和/或高寡甘露糖水平和/或更高水平的唾液酸化的糖型的该抗-CD19抗体的产生。
本发明提供此抗-CD19抗体,其在哺乳动物细胞,尤其啮齿动物细胞,诸如CHO细胞,包括野生型中转染和表达之后,具有非常感兴趣的糖基化特征和尤其是具有感兴趣的和有价值的糖基化特征,尤其低岩藻糖水平和/或高寡甘露糖水平和/或更高水平的唾液酸化的糖型。
本发明提供本领域技术人员,无需加工这些细胞,例如致使这些细胞在1,6-岩藻糖基转移酶缺陷,或在能冲击糖基化特征,例如岩藻糖水平的剂的存在下或使用具有特定糖基化功能的特定细胞系而在哺乳动物细胞中产生抗-CD19抗体的方法。
在一实施方式中,方法包括将本文公开的Fc与至少可变区组合来给出抗-CD19抗体。
在一实施方式中,抗体在哺乳动物细胞,尤其是啮齿动物细胞,优选CHO细胞,优选野生型,诸如野生型DG44CHO细胞(由ATCC购买的)上产生。
产生抗-CD19抗体的方法是本发明的另一目的。将哺乳动物细胞,优选啮齿动物细胞诸如CHO细胞,优选野生型细胞用一种或几种表达载体转染。优选地,将细胞用轻链用表达载体及用重链用表达载体共转染。
重链用表达载体含有核酸序列SEQIDNO:2,4,其编码本发明的变体Fc区。
细胞转染也是本发明的目的。作为可实施的转染,可无限制地提及标准转染过程,可实施本领域技术人员良好知道的,诸如磷酸钙沉淀,DEAE-葡聚糖介导的转染,电穿孔,核转染(AMAXAGmbh,GE),脂质体-介导的转染(使用或阳离子脂质体技术例如)或微注射。
重链用表达载体含有编码本发明的在各氨基酸第243,292,300,305,326和396位,任选地第333位包含氨基酸取代的变体Fc区的核酸序列。在一实施方式中,此核酸序列也包含编码特异于,或特异性识别,CD19抗原的抗体可变区的核酸序列。优选地,可变区识别非内化CD19表位或决定子。
优选地,载体含有编码识别非内化CD19表位或决定子的亲本鼠R005-1的可变区的核酸序列。
优选地,载体含有编码识别非内化CD19表位或决定子的亲本鼠R005-2的可变区的核酸序列。
表达载体包含编码需要的可变区的核酸序列。以下提供可由载体表达的可变区的各种实施方式。
在第1实施方式中,可变区VH包含R005-1的VHCDRCDR1,CDR2和CDR3。
在一实施方式中,可变区VH包含R005-1CDR,其序列示于SEQIDNO:16,6,13。在另一实施方式中,可变区VH包含CDR,其序列示于SEQIDNO:5,6,7。在另一实施方式中,可变区VH包含CDR,其序列示于SEQIDNO:11,12,13。
在第2实施方式中,可变区VH包含R005-2的VHCDRCDR1,CDR2和CDR3。
在一实施方式中,可变区VH包含CDR,其序列示于SEQIDNO:28,18,25。在另一实施方式中,可变区VH包含CDR,其序列示于SEQIDNO:17,18,19。在另一实施方式中,可变区VH包含CDR,其序列示于SEQIDNO:23,24,25。
在一实施方式中,可变区VH(R005-1)具有示于SEQIDNO:29的氨基酸序列。在另一实施方式中,载体包含示于SEQIDNO:30的核酸序列。
在另一实施方式中,可变区VHR005-2具有示于SEQIDNO:33的核酸序列。在另一实施方式中,载体包含示于SEQIDNO:34的核酸序列。
在一实施方式中,载体包含包含编码根据SEQIDNO:16,6,13或5,6,7或11,12,13的CDR的核酸和编码具有示于SEQIDNO:1或3的氨基酸序列的Fc区的核酸的核酸序列。
在一实施方式中,载体包含示于SEQIDNO:30的核酸序列,和编码具有示于SEQIDNO:1或3的序列的Fc区的核酸。
在另一实施方式中,载体包含编码示于SEQIDNO:29的氨基酸序列的核酸序列和编码具有示于SEQIDNO:1或3的序列的Fc区的核酸。
在另一实施方式中,载体包含包含根据SEQIDNO:18,28,25或17,18,19或23,24,25的CDR的核酸序列和编码具有示于SEQIDNO:1或3的序列的Fc区的核酸。
在一实施方式中,载体包含示于SEQIDNO:34的核酸序列和编码具有示于SEQIDNO:1或3的序列的Fc区的核酸。
在另一实施方式中,载体包含编码示于SEQIDNO:33的氨基酸序列的核酸序列和编码具有示于SEQIDNO:1或3的序列的Fc区的核酸。
轻链用表达载体含有编码人κ或λ区,优选人κ区,及特异于,或特异性识别,CD19抗原的抗体可变区的核酸序列。优选地,可变区识别非内化CD19表位或决定子。
表达载体包含编码需要的可变区的核酸序列。以下提供可由载体表达的可变区的各种实施方式。
在第1实施方式中可变区VL包含R005-1的VLCDRCDR1,CDR2和CDR3。
在一实施方式中,可变区VL包含CDR,其序列示于SEQIDNO:8,9,10。在另一实施方式中,抗体包含CDR,其序列示于SEQIDNO:14,15,10。在一实施方式中,可变区具有示于SEQIDNO:31的氨基酸序列。在另一实施方式中,载体包含示于SEQIDNO:32的核酸序列。
在第2实施方式中,可变区VL包含R005-2的VLCDRCDR1,CDR2和CDR3。
在一实施方式中,可变区VL包含CDR,其序列示于SEQIDNO:20,21,22。在另一实施方式中,抗体包含CDR,其序列示于SEQIDNO:26,27,22。在一实施方式中,可变区具有示于SEQIDNO:35的氨基酸序列。在另一实施方式中,载体包含示于SEQIDNO:36的核酸序列。
表达载体包含这些核酸序列和允许前者表达的调控序列。在一实施方式中,独特载体包含两种核酸序列和能编码VH和VL。
优选地,本发明包含使用一个单载体或一组载体,其包含(1)编码包含上述VHCDR和在各氨基酸第243,292,300,305,326和396位,任选地第333位包含氨基酸取代的变体Fc区的抗体可变区的核酸序列,及(2)编码包含上述VLCDR和人κ区的抗体可变区的核酸序列。
这些载体也是本发明的目的,单独或作为一组载体。
这些载体也是本发明的目的,单独或作为一组载体。作为可使用的载体,可无限制地提及:pcDNA3.3,pOptiVEC,pFUSE,pMCMVHE,pMONO,pSPORT1,pcDV1,pCDNA3,pCDNA1,pRc/CMV,pSEC。
基于本发明的特定氨基酸取代,本领域技术人员完全能考虑到遗传密码的简并性而设计允许序列编码本发明的变体Fc区的密码子突变的核酸序列。
在一实施方式中,序列编码变体Fc区,其中Phe243被选自下列的氨基酸取代:Leu,Trp,Tyr,Arg和Gln。优选地,Phe243被Leu取代。
在一实施方式中,核酸序列编码变体Fc区,其中Arg292被选自下列的氨基酸取代:Gly和Pro。优选地,Arg292被Pro取代。
在一实施方式中,核酸序列编码变体Fc区,其中Tyr300被选自下列的氨基酸取代:Lys,Phe,Leu和Ile。优选地,Tyr300被Leu取代。
在一实施方式中,核酸序列编码在Ile和Leu之中的变体Fc区。优选地,Val305被Leu取代。
在一实施方式中,核酸序列编码变体Fc区,其中Lys326被选自下列的氨基酸取代:Val,Glu,Ala,Gly,Asp,Met,Ser,Asn和Trp。优选地,Lys326被Ala取代。
在一实施方式中,核酸序列编码变体Fc区,其中Glu333被选自下列的氨基酸取代:Val,Gly,Ala,Gln,Asp,Asn,Lys,Arg和Ser。优选地,Glu333被Ala取代。
在一实施方式中,核酸序列编码变体Fc区,其中Pro396被Leu取代。
在一实施方式中,核酸序列编码变体Fc区,其中Phe243被Leu取代,Arg292被Pro取代,Tyr300被Leu取代,Val305被Leu取代,Lys326被Ala取代和Pro396被Leu取代。
在一实施方式中,核酸序列编码变体Fc区,其中Phe243被Leu取代,Arg292被Pro取代,Tyr300被Leu取代,Val305被Leu取代,Lys326被Ala取代,Glu333被Ala取代,及Pro396被Leu取代。
在一实施方式中,核酸序列包含本发明的CDR或可变区和编码具有示于SEQIDNO:1或3的序列的Fc区的核酸。
在一实施方式中,核酸序列包含上述VHCDR和编码具有示于SEQIDNO:1或3的序列的Fc区的核酸。
在一实施方式中,核酸包含示于SEQIDNO:30的核酸序列和编码具有示于SEQIDNO:1或3的序列的Fc区的核酸。
在另一实施方式中,核酸包含示于SEQIDNO:34的核酸序列和编码具有示于SEQIDNO:1或3的序列的Fc区的核酸。
在一实施方式中,核酸包含示于SEQIDNO:32的核酸序列,及编码人κ或λ区的核酸。
在另一实施方式中,核酸包含示于SEQIDNO:36的核酸序列,及编码人κ或λ区的核酸。
本发明的另一目的是含有本发明的核酸序列和允许抗-CD19抗体的VH和VL区在哺乳动物细胞,尤其是CHO细胞,优选野生型中表达的调控序列的这些表达载体或一组表达载体的用途。
本发明的另一对象是含有本发明的载体或一组载体的宿主细胞。宿主细胞可为哺乳动物细胞,优选啮齿动物细胞,更优选CHO细胞。仍更优选,宿主细胞可为野生型哺乳动物细胞,优选野生型啮齿动物细胞,最优选野生型CHO细胞。
本领域技术人员完全拥有使用该载体和细胞诸如CHO细胞产生本发明的抗体的方法。
本发明的另一目的是包含源于R005-1或R005-2的CDR及具有特异性地与CD19抗原结合的性质的分子或多肽或抗体。抗体可为单克隆抗体,嵌合抗体,人源化的抗体,全人抗体或抗体药物缀合物。其也可为抗体片段。
抗体片段可为分子包含1个或2个VH和VL区或基本上由其组成,其中VH包含SEQIDNO:16,6,13或5,6,7或11,12,13的CDR和VL包含SEQIDNO:8,9,10或14,15,10的CDR。此分子或抗体可用于在疾病治疗中靶向CD19抗原。余下说明书完全应用到这些分子和抗体,为它们在治疗中使用。
抗体片段可为分子包含1个或2个VH和VL区或基本上由其组成,其中VH包含SEQIDNO:28,18,25或17,18,19或23,24,25的CDR和VL包含SEQIDNO:20,21,22或26,27,22的CDR。此分子或抗体可用于在疾病治疗中靶向CD19抗原。余下说明书完全应用到这些分子和抗体,为它们在治疗中使用。
本发明的另一目的由此是编码含有根据SEQIDNO:16,6,13或5,6,7或11,12,13的1个,2个,优选全部CDR的多肽的核酸序列。
在序列或载体的一实施方式中,可变区VH或VL包含示于SEQIDNO:30或32的核酸序列或编码示于SEQIDNO:29或31的氨基酸序列的核酸序列。
在一实施方式中,用于VH的核酸序列也编码Fc区,尤其是示于SEQIDNO:1或3的本发明的突变的Fc区。
本发明的另一目的由此是编码含有根据SEQIDNO:28,18,25或17,18,19或23,24,25的1个,2个,优选全部CDR的多肽或氨基酸序列的核酸序列。
在序列或载体的一实施方式中,可变区VH或VL包含示于SEQIDNO:34或36的核酸序列或编码示于SEQIDNO:33或35的氨基酸序列的核酸序列。
在一实施方式中,此核酸序列也编码κ区,尤其是人κ区。
本发明的另一目的是含有该核酸序列和允许由核酸序列编码的多肽表达的调控序列的表达载体。再一目的是用该载体转染的宿主细胞。
本发明的另一目的是含有本发明的抗-CD19抗体和媒质的组合物。
在一实施方式中,本发明关乎含有本发明的抗-CD19抗体和生理学可接受的媒质或赋形剂的药物组合物。
在一实施方式中,所述组合物包含至少一种其他抗体。此补充性或其他抗体可为抗-CD19抗体或针对另一肿瘤抗原的抗体。此其他肿瘤抗原可为CD20,CD52,CD22,EGF受体,VEGF受体,模拟神经节苷脂GD3,CEA,HER-2。
在一实施方式中,组合物包含抗-CD20抗体。
在一实施方式中,组合物包含抗-CD52抗体。
此其他肿瘤抗原可尤其是鼠单克隆抗体,嵌合抗体,人源化的抗体,全人抗体。
在特定实施方式中,药物组合物包含本发明的抗-CD19抗体和抗-CD20抗体。在抗-CD20抗体之中,可尤其是提及利妥昔单抗。
本发明的另一目的是该药物组合物,其包含至少2种抗体,包括本发明的抗-CD19抗体,及生理学可接受的媒质或赋形剂,用于同时,分离的或延迟的施用。在此情况中,各有效成分之一在药学可接受的媒质中独立地调节。
本发明的另一目的是药物组合物,其包含本发明的抗-CD19抗体,作为抗-肿瘤药物。
本发明的再一目的是药物组合物,其包含本发明的抗-CD19抗体和至少一种针对另一肿瘤抗原,诸如CD20的其他抗体,作为抗-肿瘤药物。
本发明的再一目的是药物组合物,其包含本发明的抗-CD19抗体和至少一种化学治疗药物。此药物可为安道生,环磷酰胺,多柔比星,长春花生物碱,甾,铂(顺铂,卡铂,奥沙利铂),阿糖胞苷,博来霉素,依托泊苷,苯达莫司汀…在一实施方式中,另外的药物是多柔比星。
在一实施方式中,组合物在相同的组合物中,随药学可接受的媒质包含两种有效成分。
本发明的另一目的是该药物组合物,其包含本发明的抗-CD19抗体和另外的药物,及生理学可接受的媒质或赋形剂,用于同时,分离的或延迟的施用。在此情况中,各有效成分之一在药学可接受的媒质中独立地调节。
在一实施方式中,这些组合物用于治疗B细胞淋巴瘤。在一实施方式中,这些组合物用于治疗B细胞非-霍奇金氏淋巴瘤(NHL),B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL),及毛细胞白血病和B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)。
本发明的再一目的是治疗有需求的患者的方法,包括施用本发明的抗体或药物组合物。方法旨在治疗或预防癌或发炎或自身免疫疾病。
在一些实施方式中,本发明的抗体可组合治疗或预防性地有效量的一种或更多抗-癌剂,治疗性抗体或本领域技术人员知道用于治疗及/或防止癌,发炎及/或自身免疫疾病的其他剂施用。
在一实施方式中,方法旨在治疗或预防B细胞病症,诸如但不限于,B细胞恶性肿瘤。B细胞恶性肿瘤包括NHL,B-CLL,毛细胞白血病和B-ALL。
在一实施方式中,方法应用于用抗-CD20抗体治疗的难治性或复发的患者。
在一实施方式中,方法旨在治疗或预防自身免疫疾病,诸如多发性硬化,类风湿性关节炎和SLE。
在一实施方式中,方法应用于难治性或复发的用抗-CD20抗体治疗的患者。
在一实施方式中,方法旨在治疗或预防人移植受者中的移植物-抗宿主疾病(GVHD),体液拒绝或移植后淋巴组织增生性病症。在一实施方式中,方法应用于难治性或复发的用抗-CD20抗体治疗的患者。
在一实施方式中,方法包括给患者施用本发明的抗-CD19抗体和针对另一肿瘤抗原的抗体。此其他肿瘤抗原可为CD20,CD52,CD22,EGF受体,VEGF受体,模拟神经节苷脂GD3,CEA,HER-2,此其他肿瘤抗原可为尤其是鼠单克隆抗体,嵌合抗体,人源化的抗体,全人抗体,药物-缀合抗体。在一实施方式中,组合物包含抗-CD20抗体。在另一实施方式中,组合物包含抗-CD52抗体。
在另一实施方式中,方法包括给患者施用本发明的抗-CD19抗体,其中患者是,已或会用化学治疗药物治疗。此药物可为例如安道生,环磷酰胺,多柔比星,长春花生物碱,甾,铂(顺铂,卡铂,奥沙利铂),阿糖胞苷,博来霉素,依托泊苷,苯达莫司汀…。在一实施方式中,另外的药物是多柔比星。优选地,患者用本发明的抗体和另外的药物二者治疗。抗体和药物可在相同的组合物中或在分离的组合物中施用。
【附图说明】
图1:CD19表位标位。通过测试分别用作示踪物(生物素化的MAb)或用作捕集器MAb(纯化的MAb)的不同组合MAb来将细胞裂解物用作CD19抗原源。
图2:在Burkitt氏淋巴瘤细胞系中用鼠MAb抗-CD19R005-1的更高水平的凋亡。将Burkitt氏淋巴瘤细胞系Raji与不同MAb浓度温育5小时。B细胞用膜联蛋白V-FITC和碘化丙锭(PI)双-染色,及由流式细胞术分析。平均值+/-SD自2个独立实验显示。
图3:鼠MAbR005-1是在原代B-CLL细胞中凋亡的最佳诱导物之一。在ficoll离心之后分离原代B-CLL细胞。将4×106细胞与感兴趣的MAb和对照于37℃在完全培养基中温育24小时。然后收获细胞,及用膜联蛋白-VFITC/碘化丙锭染色。在LSRII细胞计数器(BDbioscience,USA)上获取20000细胞和用FlowJo软件进行分析。凋亡细胞定义为膜联蛋白V+/PI-细胞。数据表示5个独立实验的平均值+/-SD。
图4:鼠MAbR005-1和R005-2MAb,(A):VH(B):VL的核苷酸和氨基酸序列。氨基酸显示为单字母代码。
氨基酸序列VH | 核酸序列VH | 氨基酸序列VL | 核酸序列VL | |
mR005-1 | SEQ ID NO:29 | SEQ ID NO:30 | SEQ ID NO:31 | SEQ ID NO:32 |
mR005-2 | SEQ ID NO:33 | SEQ ID NO:34 | SEQ ID NO:35 | SEQ ID NO:36 |
图5:在PBMNC细胞上天然嵌合R005-1Fc0和鼠亲本mR005-1MAb之间的比较性染色。灰线指定阴性同种型鼠IgG1或人IgG1对照MAb的细胞荧光测定直方图,黑线显示以对于1.106细胞/ml的5μg/ml获得的外周血淋巴细胞或单核细胞的细胞荧光测定直方图。3个独立实验中的代表性的实验。
图6:天然嵌合R005-1Fc0和鼠亲本mR005-1MAb之间的交叉阻断实验。在RajiBurkitt氏淋巴瘤细胞上,用10μl/孔的FITC缀合的mR005-1染色之前,细胞预处理或不用天然chR005-1Fc0或用hIgG1对照MAb(5μg/ml)预处理。灰线指定阴性同种型小鼠IgG1对照MAb的细胞荧光测定直方图,黑线显示用FITC缀合的mR005-1获得的细胞荧光测定直方图。数据表示3个独立实验的1个代表性的实验。
图7:用亲本mR005-1或chR005-1Fc0MAb标记细胞引发CD19表达水平的下调。将B-CLL细胞与生物素化的MAb于4℃温育30min。在T0,T3h和T24h,细胞用链霉亲和素-Alexa488nm(最终稀释1/1000)于4℃染色30min及在甲醛1%中固定。然后在LSRII细胞计数器(BDbioscience,USA)上获取20000细胞,进行FlowJo分析。数据表示9个独立实验的1个代表性的实验。
图8:chR005-1Fc0MAb显示在Burkitt氏淋巴瘤细胞上不大的ADCC活性。将钙黄绿素-AM装载的Raji细胞(1×105细胞/ml)与感兴趣的MAb于4℃温育20min。在振摇条件下,以比E/T50:1于37℃添加效应细胞(PBMNC)4小时。在离心之后,收获上清液及在荧光计上测量钙黄绿素-AM荧光。根据下式计算ADCC裂解水平:(实验释放-(靶+效应子自发释放)/(最大释放-靶自发释放)*100。通过用TritonX-100处理靶细胞来获得最大释放值。数据表示3个独立实验的平均值+/-SD。
图9:chR005-1Fc0mab显示在原代B-CLL细胞上不大的ADCC活性。在ficoll离心之后分离原代B-CLL细胞。将1×105细胞/ml钙黄绿素-AM装载的细胞与感兴趣的MAb于4℃温育20min。在振摇条件下以比E/T50:1于37℃添加效应细胞(PBMNC)4小时。在离心之后,收获上清液及在荧光计上测量钙黄绿素-AM荧光。根据下式计算ADCC裂解水平:(实验释放-(靶+效应子自发释放))/(最大释放-靶自发释放)*100。通过用TritonX-100处理靶细胞来获得最大释放值。数据表示5个独立实验的平均值+/-SD。
图10:chR005-1Fc0在Burkitt氏淋巴瘤细胞上未引发CDC活性。将Raji细胞(2×106细胞/ml)与感兴趣的MAb于4℃温育20min。然后于37℃在振摇条件下添加5μl的天然的人补体4小时。在温育之后,收获上清液及在荧光计上测量乳酸脱氢酶(LDH)。根据下式计算CDC裂解水平:(实验释放-靶自发释放)/(最大释放-靶自发释放)*100,其中无天然的补体的靶表示自发释放。通过用TritonX-100处理靶细胞来获得最大释放值。数据表示3个独立实验的平均值+/-SD。
图11:嵌合Fc24(SEQIDNO:3和4)或Fc34(SEQIDNO:1和2)变体MAb的氨基酸和核酸序列。氨基酸显示为单字母代码。根据文献,Fc区的氨基酸编号基于数据库,(CH1:aan°118~215;铰链:aan°216~230;CH2:aan°231~340;CH3:aan°341~447)。
在本发明中使用的各种Fc关于天然Fc(Fc0)之间的变异:
突变名 | 关于Fc0的突变 |
Fc34 | F243L/R292P/Y300L/V305L/K326A/P396L |
Fc24 | F243L/R292P/Y300L/V305L/K326A/E333A/P396L |
Fc39 | F243L/R292P/Y300L/V305I/K326A/E333A/P396L |
Fc18 | F243L |
Fc28 | Y300L/V305L |
Fc19 | F243L/R292P/P396L |
Fc29 | F243L/R292P/V305L/P396L |
Fc30 | F243L/R292P/Y300L/P396L |
Fc20 | F243L/R292P/Y300L/V305L/P396L |
Fc23 | F243L/R292P/Y300L/V305L/E333A/P396L |
Fc6 | E333A |
Fc7 | K326A/E333A |
Fc9 | K326A |
图12:用chR005-1Fc24或chR005-1Fc34MAb,在Burkitt氏淋巴瘤细胞上,在PBMNC作为效应细胞的存在下的增强的ADCC活性。将钙黄绿素-AM装载的Raji细胞(1×105细胞/ml)与感兴趣的MAb于4℃温育20min。在振摇条件下以比E/T50:1于37℃添加效应细胞(PBMNC)4小时。在离心之后,收获上清液及在荧光计上测量钙黄绿素-AM荧光。根据下式计算ADCC裂解水平:(实验释放-(靶+效应子自发释放))/(最大释放-靶自发释放)*100。通过用TritonX-100处理靶细胞来获得最大释放值。数据表示4个独立实验的平均值+/-SD。
图13:在原代B-CLL细胞上chR005-1Fc24介导的强ADCC活性。在ficoll离心之后分离原代B-CLL细胞。将(1×105细胞/ml)钙黄绿素-AM装载的Raji细胞与感兴趣的MAb于4℃温育20min。在振摇条件下以比E/T50:1于37℃添加效应细胞(PBMNC)4小时。在离心之后,收获上清液及在荧光计上测量钙黄绿素-AM荧光。根据下式计算ADCC裂解水平:(实验释放-(靶+效应子自发释放))/(最大释放-靶自发释放)*100。通过用TritonX-100处理靶细胞来获得最大释放值。数据表示5个独立实验的平均值+/-SD。
图14:在Burkitt氏淋巴瘤细胞上chR005-1Fc24或chR005-1Fc34MAb诱导的CDC活性。将Raji细胞(2×106细胞/ml)与感兴趣的MAb于4℃温育20min。然后在振摇条件下于37℃添加5μl的天然的人补体4小时。在温育之后,收获上清液及在荧光计上测量乳酸脱氢酶(LDH)。根据下式计算CDC裂解水平:(实验释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)*100,其中无天然的补体的靶表示自发释放。通过用TritonX-100处理靶细胞来获得最大释放值。数据表示3个独立实验的平均值+/-SD。
图15:chR005-2Fc24在Burkitt氏淋巴瘤细胞上也诱导CDC活性。将Raji细胞(2×106细胞/ml)与感兴趣的MAb于4℃温育20min。然后在振摇条件下于37℃添加5μl的天然的人补体4小时。在温育之后,收获上清液及在荧光计上测量乳酸脱氢酶(LDH)。根据下式计算CDC裂解水平:(实验释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)*100,其中无天然的补体的靶表示自发释放。通过用TritonX-100处理靶细胞来获得最大释放值。数据表示1个独立实验的平均值+/-SD。
图16:在原代B-CLL细胞上chR005-1Fc24MAb介导的强CDC活性。将B-CLL细胞(2-106细胞/ml)与感兴趣的MAb于4℃温育20min。然后在振摇条件下于37℃添加5μl的天然的人补体4小时。在温育之后,收获上清液及在荧光计上测量乳酸脱氢酶(LDH)。根据下式计算CDC裂解水平:(实验释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)*100,其中无天然的补体的靶表示自发释放。通过用TritonX-100处理靶细胞来获得最大释放值。数据表示1个独立实验的平均值+/-SD。
图17:重组人C1q结合到chR005-1野生型或突变MAb。由ELISA结合测定评定人重组C1q的结合。将鼠亲本MAbmR005-1用作阴性对照和利妥昔单抗作为阳性对照。数据表示2个独立实验的平均值+/-SD。
图18:在Burkitt氏淋巴瘤细胞系中抗-CD19chR005-1的Fc24或Fc34加工未影响PCD。将Burkitt氏淋巴瘤细胞系Raji与不同MAb浓度温育5小时。将B细胞用膜联蛋白V-FITC和碘化丙锭(PI)双-染色,及由流式细胞术分析。数据表示2个独立实验的平均值+/-SD。
图19:在原代B-CLL细胞中抗-CD19chR005-1的chR005-1Fc24或Fc34加工未影响PCD。将细胞与不同MAb浓度温育5小时。将B细胞用膜联蛋白V-FITC和碘化丙锭(PI)双-染色,及由流式细胞术分析。数据表示4个独立实验的平均值+/-SD。
图20:mR005-1MAb与嵌合抗-CD20(利妥昔单抗)组合而在Burkitt氏淋巴瘤细胞中协同它们的凋亡效应。将Daudi细胞(4×104细胞)与感兴趣的MAb组合或不组合,及对照在完全培养基中于37℃温育5小时。将B细胞用膜联蛋白V-FITC和碘化丙锭(PI)双-染色,及由流式细胞术分析。数据表示3个独立实验的平均值+/-SD。
图21:与嵌合抗-CD20()组合的chR005-1Fc24或chR005-1Fc34MAb在Burkitt氏淋巴瘤细胞中协同它们的凋亡效应。将Daudi细胞(4×104细胞)与感兴趣的MAb组合或不组合及对照于37℃在完全培养基中温育5小时。将B细胞用膜联蛋白V-FITC和碘化丙锭(PI)双-染色,及由流式细胞术分析。数据表示2个独立实验的平均值+/-SD。
图22:与嵌合抗-CD20(利妥昔单抗)组合的亲本mR005-1在原代B-CLL细胞中协同它们的凋亡效应。在ficoll离心之后分离原代B-CLL细胞。将B-CLL(4×104细胞)与感兴趣的MAb组合或不组合及对照于37℃在完全培养基中温育24小时。将B细胞用膜联蛋白V-FITC和碘化丙锭(PI)双-染色,及由流式细胞术分析。数据表示7个独立实验的平均值+/-SD。
图23:与嵌合抗-CD20()组合的chR005-1Fc24或chR005-1Fc34在原代B-CLL细胞中协同它们的凋亡效应。在ficoll离心之后分离原代B-CLL。将B-CLL(4×104细胞)与感兴趣的MAb组合或不组合及对照于37℃在完全培养基中温育24小时。将B细胞用膜联蛋白V-FITC和碘化丙锭(PI)双-染色,及由流式细胞术分析。数据表示4个独立实验的平均值+/-SD。
图24:鼠MAbR005-1在难治性原代B-CLL细胞中引发凋亡。在ficoll离心之后分离原代B-CLL细胞。将4×106细胞与感兴趣的MAb和对照于37℃在完全培养基中温育24小时。然后收获细胞及用膜联蛋白-VFITC/碘化丙锭染色。凋亡细胞定义为膜联蛋白V+/PI-细胞。数据表示2个独立实验的平均值+/-SD。
图25:MAbchR005-1Fc24或MAbchR005-1Fc34在难治性原代B-CLL细胞中引发凋亡。在ficoll离心之后分离原代B-CLL。将B-CLL(4×104细胞)与感兴趣的MAb组合或不组合及对照于37℃在完全培养基中温育24小时。将B细胞用膜联蛋白V-FITC和碘化丙锭(PI)双-染色,及由流式细胞术分析。数据表示1个代表性的实验。
图26:无论任何FcγRIIIA同种异型F/F或V/V均观察到类似水平的ADCC。用MAb未缀合的3G8或MEM-154实施淋巴细胞染色。对于各FcγRIIIA-158多态性(VV或FF)。数据表示2个独立实验的平均值+/-SD。
图27:iDD生物技术MAb重或轻链表达载体的一般特征。将空CHO细胞用pcDNA3.3-TOPO轻链用表达载体(Invitrogen)及用pcDNA3.3重链用表达载体(Invitrogen)根据在我们的实验室中建立的瞬时转染过程共转染。
图28:MAbchR005-1Fc0的糖基化特征。由PNG酶F消化释放的抗体寡糖通过使用MALDI-TOFVoyagerDEPRO分光计分析。m/z值对应于钠-关联的寡糖离子。各峰的糖组成详细显示于图32。各主要峰的示意寡糖结构在表的右侧例证:GlcNAc(闭合圆形),甘露糖(空心矩形),半乳糖(菱形)和岩藻糖(空心三角形)。
图29:MAbchR005-1Fc24的糖基化特征。由PNG酶F消化释放的抗体Fc寡糖通过使用MALDI-TOFMS分光计反射III分析。m/z值对应于钠-关联的寡糖离子。各峰的糖组成详细显示于图32。各主要峰的示意寡糖结构在表的右侧例证:GlcNAc(闭合圆形),甘露糖(空心矩形),半乳糖(菱形)和岩藻糖(空心三角形)。
图30:MAbchR005-1Fc24的糖基化特征。由PNG酶F消化释放的抗体Fc寡糖通过使用MALDI-TOFMS分光计反射III分析。m/z值对应于钠-关联的寡糖离子。各峰的糖组成详细显示于图32。各主要峰的示意寡糖结构在表的右侧例证:GlcNAc(闭合圆形),甘露糖(空心矩形),半乳糖(菱形)和岩藻糖(空心三角形)。
图31:在野生型CHO细胞中表达通过亲本chR005-1Fc0和优化的chR005-1Fc24或Fc34MAb之间的N-聚糖类型的用激光-诱导的荧光检测相对强度的毛细管电泳的由与聚糖标准物比较的碳水化合物结构的分配。
图32:变体MAb抗-CD19的寡糖分析。在野生型CHO细胞中表达N-聚糖类型亲本chR005-1Fc0和优化的chR005-1Fc24或Fc34MAb之间的相对强度的比较。
图33:聚糖特征协和Fc变体。自野生型CHOEasyC细胞产生的chR005-1Fc变体抗体的IgGN-联聚糖。分子质量是过甲基化的聚糖,由Maldi质量光谱法检测为[M+Na]+(A-B)。从CHOEasyC细胞产生MAb组。在Fc变体抗体组之中观察不同糖基化特征。1个代表性的实验。
图34:根据Fc变体的差异MAb活性
A-将钙黄绿素-AM装载的Raji细胞(1×105细胞/mL)与感兴趣的MAb于4℃温育20min。在振摇条件下以比E/T50:1于37℃添加效应细胞(PBMNC)4小时。在离心之后,收获上清液及在荧光计上测量钙黄绿素-AM荧光。根据下式计算ADCC裂解水平:[(实验释放-(靶+效应子自发释放))/(最大释放-靶自发释放)*100]。通过用TritonX-100处理靶细胞来获得最大释放值。数据表示5个独立实验的平均值+/-SD。
B-将Raji细胞(2-106细胞/ml)与感兴趣的MAb于4℃温育20min。然后于37℃在振摇条件下添加5μl/孔的天然的人补体4小时。在温育之后,收获上清液及在荧光计上测量乳酸脱氢酶(LDH)。根据下式计算CDC裂解水平:(实验释放-靶自发释放)/(最大释放-靶自发释放)*100,其中无天然的补体的靶表示自发释放。通过用TritonX-100处理靶细胞来获得最大释放值。数据表示3个独立实验的平均值+/-SD。
图35:根据Fc变体的差异MAb活性
A-将钙黄绿素-AM装载的Raji细胞(1×105细胞/mL)与感兴趣的MAb于4℃温育20min。在振摇条件下以比E/T50:1于37℃添加效应细胞(PBMNC)4小时。在离心之后,收获上清液及在荧光计上测量钙黄绿素-AM荧光。根据下式计算ADCC裂解水平:[(实验释放-(靶+效应子自发释放))/(最大释放-靶自发释放)*100]。通过用TritonX-100处理靶细胞来获得最大释放值。数据表示3个独立实验的平均值+/-SD。
B-将钙黄绿素-AM装载的Raji细胞(1×105细胞/mL)与感兴趣的MAb于4℃温育20min。于37℃在振摇条件下添加50μl/孔的来自全血的效应细胞4小时。在离心之后,收获上清液及在荧光计上测量钙黄绿素-AM荧光。根据下式计算ADCC裂解水平:[(实验释放-(靶+效应子自发释放))/(最大释放-靶自发释放)*100]。通过用TritonX-100处理靶细胞来获得最大释放值。1个代表性的实验。
图36:根据Fc变体的差异MAb活性。将钙黄绿素-AM装载的Raji细胞(1×105细胞/mL)与感兴趣的MAb于4℃温育20min。于37℃在振摇条件下添加50μl/孔的来自全血的效应细胞4小时。在离心之后,收获上清液及在荧光计上测量钙黄绿素-AM荧光。根据下式计算ADCC裂解水平:[(实验释放-(靶+效应子自发释放))/(最大释放-靶自发释放)*100]。通过用TritonX-100处理靶细胞来获得最大释放值。1个代表性的实验。
图37:由chR005-1MAbFc24或chR005-1MabFc34的体内肿瘤生长的抑制。将用Raji细胞皮下注射的小鼠由在第21天起始以100mg/kg用或不用白细胞一周一次静脉内MAb输注来治疗。一周两次测量肿瘤。
图38:结合到chR005-1野生型或突变MAb的互补人血清。由ELISA结合测定评定人互补血清结合到MAb。将96-孔板(Nunc)于4℃用改变的MAb浓度包被过夜。在洗涤之后,板用PBS-5%BSA阻断1h,及与2.5μl的天然的人补体(Sigma)温育1h。然后,添加100μl的1/500稀释的缀合了绵羊抗-人C1q过氧化物酶的Ab(AbdSerotec)及温育1h。板用100μl/孔的TMB底物(UptimaInterchim)显影。在H2S04添加之后,在450nm/630nm处使用MRXII酶标仪测量OD。数据表示2个独立实验的平均值+/-SD。
图39:Rituxan难治性RL建立的肿瘤的生长用Fc24优化的chR005-1MAb抑制。将难治性RituxanRL细胞皮下注射的小鼠由在第20天起始以100mg/kg一周一次静脉内MAb输注治疗。
图40:Fc24优化的chR005-1MAb和药物多柔比星的组合增加生长抑制Raji建立的肿瘤的水平。每周治疗带有建立的SCBurkitt氏淋巴瘤肿瘤的小鼠。对照组接收媒质(NaCl0.9%),而处理的组接收以下之一:chR005-1Fc24MAb100mg/kg,多柔比星2mg/kg,chR005-1Fc24MAb+多柔比星。
【实施例】
【材料与方法】
细胞:为研究目的自ATCC(美国典型培养物保藏中心,USA)获得CHOdhfr-/-细胞系。从ECACC(欧洲动物细胞保藏中心,UK)得到作为T淋巴瘤Cem细胞的Burkitt氏淋巴瘤Raji或Daudi细胞系。人PBMNC使用Ficoll-Histopaque密度梯度(Sigma,SaintQuentinFallavier,法国)纯化自隐名的健康自愿者供体的白细胞去除术(BloodCenter,Lyon法国)。在此研究中募集的全部B-CLL患者已在免疫表型上定义为在1996年NationalCancerInstituteWorkingGroup发布的标准(Hallek等人,2008)。在根据DeclarationofHelsinki书面知情同意之后从患者得到血。
试剂和抗体:在iDD生物技术(Dardilly,法国)生产IgG1嵌合阴性对照。鼠亲本MAbmR005-1或mR005-2从iDD生物技术杂交瘤库分离。由iDD生物技术(Dardilly,法国)产生及产生野生型chR005-1Fc0(也被称为天然IgG1)和全部修饰的抗体。FITC标记的膜联蛋白-V和碘化丙锭(PI)分别购自BDBiosciences(PontofClaix,法国)和Sigma(SaintQuentinFallavier,法国)。山羊Fab’2抗-人RPEIgG抗体和山羊抗-小鼠FITCIg抗体分别购自Sigma(SaintQuentinFallavier,法国)和MPBiomedical(Illkirch,法国)。利妥昔单抗由Genentech产生及商业上购买。其他MAb抗-CD194G7(IgG1),Bu12(IgG1),HD37(IgG1),B4(IgG1)分别购自SantaCruz生物技术(California,USA),AbdSerotec(Düsselldorf,德国),SantaCruz生物技术(California,USA),Biogenex(SanRamon,USA)。为凋亡测定作为阳性对照使用的喜树碱购自Sigma(SaintQuentinFallavier,法国)。
鼠抗体产生:将Balb/c小鼠用CD19表达细胞诸如人慢性淋巴样白血病细胞免疫。鼠MAb通过使用标准杂交瘤技术产生(Zola等人,1987)及就它们由流式细胞术仅结合CD19阳性细胞系的能力起初筛选。纯化的MAb通过腹水纯化产生,然后通过使用蛋白-A琼脂糖纯化(Pharmacia,Uppsala,Sweden)。
鼠MAb转变为天然嵌合MAb:对应于杂交瘤的可变区的cDNA通过使用2种方法获得,第1方法由变质N-术语氨基酸相关的引物组产生的PCR中利用组成,由于N-末端测序;及第2方法由由引物数据库产生的变质引物组的PCR中利用和之前描述的特异性引物组成(Essono等人,2003;Wang等人,2000)。N-端可变区的序列通过Edman降解测定。总RNA提取使用Tri试剂试剂盒根据由提供商Sigma描述的流程实施。扩增的VL和VH片段克隆进TOPO-TA克隆载体(Invitrogen)用于通过双脱氧终止方法来序列分析(Sanger等人,1977)。然后由PCR扩增抗体变体构建体及克隆进载体pcDNA3.3。
抗体变体的构建:通过使用定点诱变的"巨引物"方法导入在Fc结构域中的取代(Sarkar等人,1990)。位置编号根据指标(不同特异性的抗体中序列的相同V区氨基酸序列和段)。分析为抗体-组合位点的结合的VH和VL基因,小基因和互补性-测定区的相对贡献(Kabat等人,1991)。重和轻链构建体共转染进适合MAb筛选的CHODG44(ATCC)。抗体通过使用蛋白A亲和层析(GEHealthcare)纯化。
CD19MAbELISA竞争:对于竞争结合ELISA实验,将细胞裂解物通过测试分别作为示踪物(生物素化的MAb)或作为捕集器MAb(纯化的MAb)使用的不同组合MAb来用作CD19抗原源。
结合到人CD19的MAb的FACS分析:结合到本研究中产生的全部MAb的人CD19用FACScan(BDBiosciences,PontofClaix,法国)通过使用自Sigma的山羊抗-小鼠FITCIg(SaintQuentinFallavier,法国)测量而用于鼠MAb的检测,及用自Sigma的山羊抗-人PEIg(SaintQuentinFallavier,法国)测量而用于嵌合MAb的检测。对于竞争结合实验,将细胞与用过量的亲本MAb或小鼠IgG1同种型对照抗体预温育。
通过使用生物素化的抗体的激光扫描共聚焦显微镜检:细胞荧光已通过使用倒置的ZeissAxiovert100MLSM510Meta共聚焦显微镜,通过用生物素化的MAb细胞标记来可视化。
糖基化分析:N-聚糖&过甲基化的释放根据标准过程实施(Ciucanu等人,1984)。蛋白糖基化的分析通过质量光谱法测定(Morelle等人,2007)。
抗体亲和性:如之前描述通过使用由流式细胞术分析的结合测定来实施抗体KD值的确定(Benedict等人,1997)以检测结合细胞的抗体。
由流式细胞术的凋亡评定:通过使用膜联蛋白V/PI染色之后是FACS分析来测量在与抗体温育之后细胞的凋亡。在显示对于膜联蛋白V的阳性染色和对于碘化丙锭的阴性染色的选通中测定凋亡细胞。
抗体依赖性细胞细胞毒性测定(ADCC):原代B-CLL细胞或B-细胞系(Raji)(靶细胞)装载12.5μM钙黄绿素-AM染料(Sigma,法国)。将5000靶细胞/孔与不同浓度的感兴趣的MAb和对照于+4℃预温育20min。效应细胞然后以等于50:1的比E/T添加到靶细胞。特定ADCC裂解通过使用以上式计算:(实验释放-(自发释放靶+效应子))/(最大释放-自发释放靶)*100,其中无抗体的靶和效应细胞表示自发释放。通过用TritonX-100处理靶细胞来获得最大释放值。
补体依赖性细胞毒性测定(CDC):将靶细胞(50000细胞/孔),即原代B-CLL细胞或B-细胞系(Ramos,Raji和Daudi细胞系)与各种MAb浓度温育。然后,人正常血清添加到培养物,然后细胞于+37℃在振摇条件下温育4小时。在温育结束时,用LDH检定试剂盒(Promega,法国)测量存在于上清液中的乳酸脱氢酶。在590nm处激发波长记录荧光。特定CDC裂解通过使用以上式计算:(实验释放-靶自发释放)/(最大释放-靶自发释放)*100,其中无抗体的靶和效应细胞表示自发释放。通过用TritonX-100处理靶细胞来获得最大释放值。
补体结合测定:由ELISA结合测定评定人C1q与MAb的结合。96-孔板(Nunc)于4℃用改变MAb浓度包被过夜。在洗涤之后,板用PBS-5%BSA阻断1h,及与0.2μg/ml的重组人C1q(AbdSerotec)或2.5μl的天然的人补体(Sigma)温育1h。然后,添加100μl的1/500稀释的缀合了绵羊抗-人C1q过氧化物酶的Ab(AbdSerotec)及温育1h。板用100μl/孔的TMB底物(UptimaInterchim)显影。在H2S04添加之后,在450nm/630nm处使用MRXII酶标仪测量OD。
由流式细胞术检测VV或FF多态性:如述,FcγRIIIA-158V/F多态性基于MEM-154/3G8荧光比(等人,2005)。人血样品(50μl)在暗处,于室温,与10μg/ml的未缀合的3G8(BectonDickinson,USA),MEM-154(Abcam,USA)或与同种型对照MAb温育15min。在5min期间添加2ml的1/10稀释的红血裂解缓冲剂(BDbioscience,USA)。在洗涤之后,添加来自Sigma(SaintQuentinFallavier,法国)的山羊抗-小鼠FITCIg(稀释到1/800的100μl)。细胞还于室温温育30min,然后洗涤两次,及通过使用FACScan(BDBiosciences,PontofClaix,法国)检定。
【结果】
1.CD19表位标位。
由ELISA竞争,我们通过使用MAb组抗-CD19测定了CD19表位标位,包括MAbmR005-1,mR005-2,4G7,B4,Bu12,HD37。如显示于图1,通过作为示踪物/捕集器MAb使用组合4G7/mR005-1和HD37/mR005-1观察强竞争而揭示,这些抗体识别的相同的表位或相邻表位。相反,用mR005-2或BU12MAb未观察到显著竞争。
2.亲本鼠MAbmR005-1在Burkitt氏淋巴瘤细胞中系或在原发性B-CLL细胞中引发凋亡。
相比鼠MAbmR005-2,鼠MAbmR005-1在Burkitt氏淋巴瘤Raji细胞系中诱导PCD中高度有效(图2)。其在提示,mR005-1MAb的更优凋亡效应可涉及这些分子的精细特异性。我们的结果也展示,mR005-1MAb对于引发PCD相比利妥昔单抗更有效。
3.引发凋亡的鼠MAb生物学活性与CD19上的表位关联。
测试一组针对人CD19的鼠MAb,以评价各克隆的凋亡潜力。我们使用了膜联蛋白-V/PI法来测定在温育后24小时由这些抗体诱导的凋亡的水平。我们发现,mR005-1是作为自患者分离的B-CLL细胞中的凋亡过程的诱导物的最佳MAb之一(图3)。通过使用Burkitt氏淋巴瘤细胞系观察到类似数据(数据未显示)。本文呈现的我们的观察提示,用与mR005-1MAb相关的衍生的嵌合MAb处理B-CLL肿瘤细胞,其能诱导凋亡性信号,可贡献于它们的直接杀伤及消除。
4.鼠MAbR005-1及鼠MAbR005-2的嵌合。
相比数据库,VLmR005-1的序列和VHmR005-1的序列被确认分别识别至少96%和至少92%(图4)。也确认了VLmR005-2和VHmR005-2的序列(99%和98%,分别)。也由靶小鼠单克隆抗体的N-端氨基酸测序确认由cDNA克隆获得的VH和VL序列的真实性。在由聚丙烯酰胺凝胶电泳在还原性条件下氨基酸测序之前分离重和轻链,由Edman降解测序头20个氨基酸。然后在轻链表达载体(VLmR005-1或VLmR005-2)中及在重MAb表达载体(VHmR005-2或VHmR005-2)中克隆序列,其也编码命名为Fc0的天然Fc区。实施对CHOdhfr-/-细胞通过脂转染的瞬时转染。
5.VH和VLchR005-1链的真实性和选择由流式细胞术分析确认。
将自VH1和VL1序列构建的天然嵌合MAbchR005-1Fc0与亲本鼠MAbmR005-1就染色及特异性直接比较。如显示于图5,在外周血淋巴细胞观察到可比较的染色。鼠亲本mR005-1和天然chR005-1Fc0之间的细胞结合竞争也显示于图6。chR005-1Fc0完全阻断鼠亲本mR005-1MAb结合。
6.MAb结合后CD19内化的诱导不是一般效应,且可涉及使用的不同MAb抗-CD19。
由在流式细胞术中间接染色,测定于4℃或于37℃温育后在B-CLL细胞表面裸露的抗体的存在与否(图7)。与利妥昔单抗于37℃经超过3或24小时的延长的时期观察到几何平均荧光强度的显著移位。用亲本鼠MAbmR005-1注意到类似效应,尽管用野生型嵌合MAbchR005-1Fc0观察到几何平均荧光强度的更低调节。
7.天然chR005-1Fc0细胞毒性活性的表征。
在许多应用中,相比亲本鼠单克隆抗体,嵌合抗体在补体-介导的肿瘤细胞裂解中及在抗体-依赖性细胞毒性测定中展示了改善的效应子功能(Liu等人,1987;Nishimura等人,1987;Hamada等人,1990)。天然嵌合MAbchR005-1Fc0针对Burkitt氏淋巴瘤细胞系(图8)或针对自患者的离体B-CLL细胞(图9)诱导不大的ADCC。在标准细胞毒性测定中,补体依赖性,仅作为阳性对照使用的利妥昔单抗杀Raji细胞,然而chR005-1Fc0在引发细胞细胞毒性中失效(图10)。
8.人IgG1CH2结构域的变体的产生。
如本文所用,术语"重链"用于限定IgG抗体的重链。在完整的,天然的IgG中,重链包含免疫球蛋白结构域VH,CH1,铰链,CH2和CH3。贯穿本说明书,IgG重链中残基的编号是EU指标(Kabatetal,1991),明白地通过引用并入本文。"Kabat中的EU指标"指称人IgGlEU抗体的编号。
我们构建了几种变体,包括单,双,3,4或5取代变体,以增强介导效应子功能的能力(图11)。
Fc34LPLLALF243L/R292P/Y300L/V305L/K326A/P396L
Fc24LPLLAALF243L/R292P/Y300L/V305L/K326A/E333A/P396L
9.Fc24或Fc34变体chR005-1有效引发ADCC。
通过首先在基于全血的测定中使用Raji靶细胞来测量介导自MAb变体组的ADCC的MAb活性(图12)。chR005-1Fc24或Fc34MAb的效力和功效相比亲本chR005-1Fc0显著地更高。
也通过使用来自患者的离体B-CLL细胞评定chR005-1Fc24的活性(图13)。类似于用在Raji细胞系上的ADCC的观察,chR005-1Fc20MAb的效力和功效相比亲本chR005-1Fc0显著地更高。
10.调查使用B细胞淋巴瘤的至CDC的MAb变体组。
如显示于图14,自野生型chR005-1Fc0产生的6个突变Fc34(F243L/R292P/Y300L/V305L/K326A/P396L)或7个突变Fc24(F243L/R292P/Y300L/V305L/K326A/E333A/P396L)使用Raji细胞系诱导CDC。
如显示于图15,自野生型chR005-2Fc0产生的5个突变Fc24(F243L/R292P/Y300L/V305L/K326A/E333A/P396L)也使用Raji细胞系诱导CDC。
自野生型chR005-1Fc0产生的6个突变Fc34(F243L/R292P/Y300L/V305L/K326A/P396L)或5个突变Fc24(F243L/R292P/Y300L/V305L/K326A/E333A/P396L)也在靶向离体B-CLL时诱导CDC(图16)。
11.变体chR005-1Fc24或Fc34以对chR005-1Fc34更高有效性结合补体。
存在于血清中的人或天然的补体(图17)结合变体chR005-1Fc24或chR005-1Fc34,揭示用chR005-1Fc34变体的更高功效。
12.MAb变体引发了类似水平的细胞凋亡。
在RajiCD19阳性细胞系(图18)或在离体B-CLL(图19)上测试对chR005-1Fc24或chR005-1Fc34MAb的程序性细胞死亡的生物学活性。FcMAb加工未影响CD19引发的凋亡。
13.单克隆抗体可用于组合。
通过使用Daudi靶细胞比较单独或组合介导PCD的MAb活性。鼠亲本mR005-1的存在下(图20)或用变体Fc24或Fc34chR005-1MAb(图21)观察到更高水平的凋亡细胞,与利妥昔单抗组合展示MAb组合的可行性和益处。
通过使用离体B-CLL比较单独或组合介导PCD的MAb活性。在鼠亲本mR005-1的存在下(图22)或用变体Fc24或Fc34chR005-1MAb(图23)观察到更高水平的凋亡细胞,与利妥昔单抗组合展示MAb组合的可行性和益处。
14.针对CD19的MAb可用于患利妥昔单抗复发的和难治性疾病的患者。
用鼠亲本mR005-1(图24)或用MAbchR005-1Fc24或chR005-1Fc34(图25)体外处理来自患利妥昔单抗治疗后复发的和难治性疾病的患者的离体B-CLL样品。用针对CD19的MAb相比用利妥昔单抗观察的更高水平的凋亡展示使用针对CD20之外的另一抗原的MAb的可行性和功效。
15.无Fc多态性的影响。
无论任何FcγRIIIA同种异型F/F或V/V均观察到类似水平的ADCC。用MAb未缀合的3G8或MEM-154实施淋巴细胞染色(图26)。
16.MAb表达。
将空CHOdhfr-/-细胞(由ATCCcollection购买的)用pcDNA3.3轻链用表达载体及用pcDNA3.3重链用表达载体通过在我们的实验室中建立的瞬时转染过程共转染。此MAb表达载体的一般特征显示于图27。将空CHO细胞用pcDNA3.3-轻链用表达载体(Invitrogen)及用pcDNA3.3重链用表达载体(Invitrogen)通过在我们的实验室中建立的瞬时转染过程共转染。此研究MAb表达载体的一般特征显示于图27。通过使用pcDNA3.3载体,由全长人CMV立即早期启动子/增强子控制这些嵌合抗体链在哺乳动物细胞中的表达。由相应人IgH前导序列致使H和L链的分泌。且在3’区中,单纯疱疹病毒胸苷激酶多聚A尾允许mRNA的有效诱导和稳定。将MAb抗-CD19的轻和重链的编码区在TOPO克隆位点中导入表达载体pcDNA3.3-TOPO。分析转化体的正确取向和阅读框,可将表达载体转染进CHO细胞系。
17.低岩藻糖基化的抗-CD19MAbchR005-1的产生。
IgG的Fc区中发现的糖核心是双-触角复合物[Asn297-GN-GN-M-(M-GN)2],其中GN是N-乙酰葡萄糖胺,及M是甘露糖。寡糖可含有0(G0),1(G1)或2(G2)个半乳糖(G)。IgG糖基化模式的变异可包括核心岩藻糖基化(F)。如显示于图28和31,chR005-1Fc0样品中的3个主要峰对应于用(GlcNAc)2(Fuc)1+(Man)3(GlcNAc)2(m/z1836),(Gal)1(GlcNAc)2(Fuc)1+(Man)3(GlcNAc)2(m/z2040)和(Gal)2(GlcNAc)2(Fuc)1+(Man)3(GlcNAc)2(m/z2245)的岩藻糖基化的寡糖的质量。相反,如显示于图29~30,相比天然chR005-1Fc0,2个峰G0F和G1F在chR005-1Fc24或chR005-1Fc34抗体(分别7.2%或5.2%和16.8%或16.1%)中以更低得多水平存在,(分别28%或38,3%)。未观察到对峰G2F的显著冲击。观察到(Man)5(GlcNAc)2(m/z1579),(Man)6(GlcNAc)2(m/z1784)(Man)7(GlcNAc)2(m/z1988),(Man)8(GlcNAc)2(m/z2192)和(Man)9(GlcNAc)2(m/z2396)之间的更高水平的寡甘露糖(29.9%或27.9%对比0%),也观察到更高水平的唾液酸化的糖型(1.6%%或2.4%对比0.8%)。将(Gal)1(GlcNAc)2(Fuc)1(NeuAc)1+(Man)3(GlcNAc)2。(m/z2401),(Gal)2(GlcNAc)2(Fuc)1(NeuAc)1+(Man)3(GlcNAc)2。(m/z2605)和(Gal)3(GlcNAc)2(Fuc)1(NeuAc)1+(Man)3(GlcNAc)2。(m/z2966)包括在chR005-1Fc24或chR005-1Fc34抗体中与天然chR005-1Fc0相比。
如显示于图32,数据展示,代替天然嵌合chR005-1Fc0抗体中的岩藻糖基化的结构,来自MAbchR005-1Fc24或chR005-1Fc34的优化的抗体中非-岩藻糖基化的蓄积。
18.结合MAb亲和性的确定。
由流式细胞术分析及对CD19阳性Raji细胞系的结合平衡研究检查MAbmR005-1,chR005-1Fc0,chR005-1Fc24和chR005-1Fc34的结合性质。因此嵌合或MAb优化均不导致MAb亲和性的显著变化:
MAb | KD nM |
mR005-1 | 2,82 |
chR005-1 Fc0 | 1,83 |
chR005-1 Fc24 | 1,26 |
chR005-1 Fc34 | 2,63 |
19.根据Fc变体的不同聚糖特征
图33显示相比天然chR005-1Fc0,Fc变体对聚糖诸如岩藻糖基化的寡糖(m/z1836,2040,2245),寡甘露糖(m/z1579,1784,1988,2192,2396)和/或唾液酸化的糖型(2401,2605,2966)的影响。
20.根据Fc变体的差异MAb活性。
图34显示不同Fc变体抗-CD19抗体和它们的用分离的PBMNC引发CDC及/或ADCC的能力。本发明提供,仅chR005-1Fc24或chR005-1Fc34变体引发ADCC和CDCMAb活性。
21.图35显示不同Fc变体抗-CD19抗体(Fc14,chR005-1,Fc34)和它们的在全血存在下引发CDC及/或ADCC的能力。仅chR005-1Fc34在天然的循环免疫球蛋白的存在下引发ADCC。
22.图36显示不同Fc变体抗-CD19抗体(chR005-1Fc24;Fc39)和它们的在全血存在下,以根据优化的Fc的不同水平引发ADCC的能力。
23.本发明包括,用chR005-1Fc34的改善的ADCC未限于CD16A解离速率。
图37显示chR005-1MAbFc24或Fc34优化的变体对在有或无人白细胞接种的建立的小鼠Raji淋巴瘤异种移植物模型中的肿瘤清除的体内比较性效应。本发明包括,相比还含有E333A修饰的chR005-1Fc24,用chR005-1Fc34的改善的ADCC未限于CD16A解离速率。
24.唾液酸化对CDC能力的影响。
图38显示在第243位的导致另外的唾液酸化的修饰对于恢复由补体识别靶细胞裂解不是足够充分的。本发明揭示,呈现约相同的chR005-1Fc20唾液酸化的糖型模式但具有不同蛋白序列和更高水平的结合的补体的仅chR005-1Fc24或chR005-1Fc34MAb诱导由补体的靶细胞裂解。
25.MAb抗-CD19对Rituxan难治性滤泡淋巴瘤的影响。
图39显示,用Fc24优化的chR005-1MAb抑制Rituxan难治性RL建立的肿瘤的生长。
26.MAb和药物组合的影响
图40显示,Fc24优化的chR005-1MAb和药物多柔比星组合增加了生长抑制Raji建立的肿瘤的水平。
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本说明书还包括下列内容:
1.抗-CD19抗体,其被修饰为包含变体人IgGFc区,优选IgG1Fc区,其中此变体区在人IgGFc区的各第243,292,300,305,326和396氨基酸位和任选地第333氨基酸位包含氨基酸取代,其中Fc区中氨基酸残基的编号是的编号。
2.实施方式1的抗体,其中所述抗体已在野生型啮齿动物细胞,优选野生型CHO细胞中产生。
3.前述实施方式之任一项的抗体,其具有Fc,优选2个不带有(GlcNAc)2(Fuc)1+(Man)3(GlcNAc)2聚糖的Fc。
1.前述实施方式之任一项的抗体,其具有Fc,优选2个不带有(Gal)1(GlcNAc)2(Fuc)1+(Man)3(GlcNAc)2聚糖的Fc。
2.前述实施方式之任一项的抗体,其包含Fc,优选2个带有(Man)5(GlcNAc)2聚糖的Fc。
3.前述实施方式之任一项的抗体,其包含Fc,优选2个带有以下聚糖之1种或2种的Fc:
●(Gal)1(GlcNAc)2(Fuc)1(NeuAc)1+(Man)3(GlcNAc)2,
●(Gal)2(GlcNAc)2(Fuc)1(NeuAc)1+(Man)3(GlcNAc)2。
4.前述实施方式之任一项的抗体,其是ADCC+和CDC+。
5.前述实施方式之任一项的抗体,其中抗体识别CD19抗原上的非-内化表位,优选包含其VH和VL氨基酸序列以下表所示的抗体mR005-1或mR005-2的CDR的抗体,或更优选,包含那些序列的抗体:
6.前述实施方式之任一项的抗体,其包含Fc区,其中Phe243被Leu取代,Arg292被Pro取代,Tyr300被Leu取代,Val305被Leu取代,Lys326被Ala取代和Pro396被Leu取代,且可能是Glu333被Ala取代。
7.前述实施方式之任一项的抗体,其中所述抗体是嵌合抗体,人源化的抗体,全人抗体,双特异性抗体,抗体药物缀合物或抗体片段。
8.前述实施方式之任一项的抗体,其引发程序性细胞死亡。
9.前述实施方式之任一项的抗体,用于治疗癌的方法。
10.前述实施方式之任一项的抗体,用于治疗难治性或复发抗-CD20抗体治疗的患者的癌的方法。
11.前述实施方式之任一项的抗体组,其中其包含:
该抗体的少于或等于15%,其包含Fc,优选2个带有(GlcNAc)2(Fuc)1+(Man)3(GlcNAc)2聚糖的Fc,和/或
该抗体的少于或等于20%,其包含Fc,优选2个带有(Gal)1(GlcNAc)2(Fuc)1+(Man)3(GlcNAc)2聚糖的Fc。
12.实施方式15的抗体组,其中其包含抗体的至少15,20,30,40或50%,其包含Fc,优选2个带有(Man)5(GlcNAc)2聚糖的Fc。
13.实施方式15或16的抗体组,其中其包含:
●抗体的少于1.5或1%,其包含Fc,优选2个带有(Gal)1(GlcNAc)2(Fuc)1(NeuAc)1+(Man)3(GlcNAc)2的Fc,和/或
●抗体的少于2或1.5%,其包含Fc,优选2个带有(Gal)2(GlcNAc)2(Fuc)1(NeuAc)1+(Man)3(GlcNAc)2的Fc。
14.药物组合物,其包含前述实施方式之任一项的抗体,及生理学可接受的媒质或赋形剂,且可能包含针对不同于CD19的肿瘤抗原的抗体,优选针对CD20的抗体。
15.实施方式16的组合物,用于治疗癌或自身免疫疾病的方法。
16.实施方式10的组合物,其用作抗-肿瘤药物或用作用于治疗难治性或复发抗-CD20抗体治疗的患者的癌的抗-肿瘤治疗。
17.实施方式14,15或16的组合物,其包含另一抗-癌剂。
18.核酸序列,其编码变体Fc区,其中Phe243被Leu取代,Arg292被Pro取代,Tyr300被Leu取代,Val305被Leu取代,Lys326被Ala取代和Pro396被Leu取代,且可能是Glu333被Ala取代。
19.表达载体,
其包含编码含有VH核酸序列如SEQIDNO:30或SEQIDNO:34所示的抗体mR005-1或mR005-2的VHCDR的多肽的核酸序列,或更优选,
核酸序列包含SEQIDNO:30或SEQIDNO:34,及在SEQIDNO:1,3所示的各第243,292,300,305,326和396氨基酸位,及任选地第333氨基酸位包含氨基酸取代的人Fc区。
20.表达载体,
其包含编码含有VL核酸序列如SEQIDNO:32或SEQIDNO:36所示的抗体mR005-1或mR005-2的VLCDR的多肽的核酸序列,或更优选,
核酸序列包含SEQIDNO:32或SEQIDNO:36,及人κ区。
21.宿主细胞,其含有实施方式13和/或14的载体,宿主细胞优选是野生型CHO细胞。
Claims (17)
1.特异性结合CD19抗原上的表位的抗体,其中所述抗体包含:
VH结构域,其包含:
CDR1,其包含选自下列的序列:SEQIDNO:5、11及16;
CDR2,其包含选自下列的序列:SEQIDNO:6及12;及
CDR3,其包含选自下列的序列:SEQIDNO:7及13;及
VL结构域,其包含:
CDR1,其包含选自下列的序列:SEQIDNO:8及14;
CDR2,其包含选自下列的序列:SEQIDNO:9及15;及
CDR3,其包含选自下列的序列:SEQIDNO:10。
2.权利要求1的抗体,其中
所述VH结构域包含:
CDR1,其包含SEQIDNO:16的序列;
CDR2,其包含SEQIDNO:6的序列;及
CDR3,其包含SEQIDNO:13的序列;及
所述VL结构域包含:
CDR1,其包含SEQIDNO:8的序列;
CDR2,其包含SEQIDNO:9的序列;及
CDR3,其包含SEQIDNO:10的序列。
3.权利要求1的抗体,其中
所述VH结构域包含:
CDR1,其包含SEQIDNO:5的序列;
CDR2,其包含SEQIDNO:6的序列;及
CDR3,其包含SEQIDNO:7的序列;及
所述VL结构域包含:
CDR1,其包含SEQIDNO:8的序列;
CDR2,其包含SEQIDNO:9的序列;及
CDR3,其包含SEQIDNO:10的序列。
4.权利要求1的抗体,其中
所述VH结构域包含:
CDR1,其包含SEQIDNO:11的序列;
CDR2,其包含SEQIDNO:12的序列;及
CDR3,其包含SEQIDNO:13的序列;及
所述VL结构域包含:
CDR1,其包含SEQIDNO:14的序列;
CDR2,其包含SEQIDNO:15的序列;及
CDR3,其包含SEQIDNO:10的序列。
5.特异性结合CD19抗原上的表位的抗体,其中所述抗体包含:
VH结构域,其包含:
CDR1,其包含选自下列的序列:SEQIDNO:17、23及28;
CDR2,其包含选自下列的序列:SEQIDNO:18及24;及
CDR3,其包含选自下列的序列:SEQIDNO:19及25;及
VL结构域,其包含:
CDR1,其包含选自下列的序列:SEQIDNO:20及26;
CDR2,其包含选自下列的序列:SEQIDNO:21及27;及
CDR3,其包含选自下列的序列:SEQIDNO:22。
6.权利要求5的抗体,其中
所述VH结构域包含:
CDR1,其包含SEQIDNO:28的序列;
CDR2,其包含SEQIDNO:18的序列;及
CDR3,其包含SEQIDNO:25的序列;及
所述VL结构域包含:
CDR1,其包含SEQIDNO:20的序列;
CDR2,其包含SEQIDNO:21的序列;及
CDR3,其包含SEQIDNO:22的序列。
7.权利要求5的抗体,其中
所述VH结构域包含:
CDR1,其包含SEQIDNO:17的序列;
CDR2,其包含SEQIDNO:18的序列;及
CDR3,其包含SEQIDNO:19的序列;及
所述VL结构域包含:
CDR1,其包含SEQIDNO:20的序列;
CDR2,其包含SEQIDNO:21的序列;及
CDR3,其包含SEQIDNO:22的序列。
8.权利要求5的抗体,其中
所述VH结构域包含:
CDR1,其包含SEQIDNO:23的序列;
CDR2,其包含SEQIDNO:24的序列;及
CDR3,其包含SEQIDNO:25的序列;及
所述VL结构域包含:
CDR1,其包含SEQIDNO:26的序列;
CDR2,其包含SEQIDNO:27的序列;及
CDR3,其包含SEQIDNO:22的序列。
9.特异性结合CD19抗原上的表位的抗体,其中所述抗体包含:
VH结构域,其包含选自下列的序列:SEQIDNO:29及33;及
VL结构域,其包含选自下列的序列:SEQIDNO:31及35。
10.权利要求9的抗体,其中
所述VH结构域包含SEQIDNO:29的序列;及
所述VL结构域包含SEQIDNO:31的序列。
11.权利要求9的抗体,其中
所述VH结构域包含SEQIDNO:33的序列;及
所述VL结构域包含SEQIDNO:35的序列。
12.药物组合物,其包含:
前述权利要求之任一项的抗体,及
生理学可接受的媒质或赋形剂。
13.权利要求12的组合物,其中所述组合物还包含针对不同于CD19的肿瘤抗原的抗体。
14.权利要求13的组合物,其中所述组合物还包含针对选自下列的肿瘤抗原的抗体:CD20、CD52、CD22、EGF受体、VEGF受体、模拟神经节苷脂GD3、CEA和HER2。
15.权利要求12的组合物,其中所述组合物还包含针对CD20的抗体。
16.权利要求12的组合物,其中所述组合物还包含化学治疗药物。
17.权利要求16的组合物,其中所述化学治疗药物选自:安道生,环磷酰胺,多柔比星,长春花生物碱,甾,铂,阿糖胞苷,博来霉素,依托泊苷和苯达莫司汀。
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