ES2700294T3 - Anticuerpo anti-CD19 que tiene funciones ADCC y CDC y perfil de glicosilación mejorado - Google Patents

Abstract

Anticuerpo anti-CD19 modificado para comprender una región Fc de IgG1 humana variante, en el que: Phe243 está sustituido por Leu, Arg292 está sustituido por Pro, Tyr300 está sustituido por Leu, Val305 está sustituido por Leu, Lys326 está sustituido por Ala y Pro396 está sustituido por Leu, o en el que, Phe243 está sustituido por Leu, Arg292 está sustituido por Pro, Tyr300 está sustituido por Leu, Val305 está sustituido por Leu, Lys326 está sustituido por Ala, Pro396 está sustituido por Leu y Glu333 está sustituido por Ala, en el que la numeración de los residuos de aminoácidos en la región Fc es la de Kabat, y en el que el anticuerpo tiene actividad ADCC y CDC.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpo anti-CD19 que tiene funciones ADCC y CDC y perfil de glicosilación mejorado

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un anticuerpo anti-CD19 que tiene una región Fc variante que tiene algunas modificaciones de aminoácidos específicas relativos a una región Fc de tipo natural que confieren una o varias funciones efectoras útiles. La presente invención se refiere en particular a anticuerpos anti-CD19 quiméricos, humanizados o totalmente humanos que comprenden dicha región Fc variante. Se refiere ventajosamente a anticuerpos con un perfil de glicosilación interesante y valioso, especialmente un bajo nivel de fucosa y/o un alto nivel de oligomanosa y/o un mayor nivel de glicoforma sialilada. La presente invención también se refiere al uso de estos anticuerpos en el tratamiento, prevención o trato de una enfermedad o trastorno, tal como el cáncer, especialmente una enfermedad maligna de células B y una enfermedad auto-inmune.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

En los trastornos autoinmunes y/o trastornos inflamatorios, el sistema inmunitario desencadena una respuesta inflamatoria cuando no hay sustancias extrañas a combatir y el sistema inmunitario normalmente protector del cuerpo causa un daño a sus propios tejidos mediante un ataque así mismo por error. Existen muchos tipos de trastornos autoinmunes que afectan al cuerpo de diferentes maneras. Por ejemplo, el cerebro se ve afectado en los individuos con esclerosis múltiple, el intestino se ve afectado en individuos con la enfermedad de Crohn y la membrana sinovial, hueso y cartílago de distintas articulaciones se ven afectados en individuos con artritis reumatoide.

Las enfermedades malignas de células B constituyen un grupo importante de cáncer que incluye el linfoma no hodgkiniano de células B (NHL), leucemia linfocítica crónica de células B (B-CLL) y leucemia de células pilosas y leucemia linfocítica aguda de células B (B-ALL).

Actualmente, la terapia contra el cáncer puede implicar cirugía, quimioterapia, terapia hormonal y/o tratamiento con radiación para erradicar las células neoplásicas en un paciente. Recientemente, la terapia contra el cáncer también podría implicar una terapia biológica o inmunoterapia.

Existe una necesidad significativa de tratamientos alternativos para el cáncer, particularmente para el tratamiento del cáncer que ha demostrado ser refractario a los tratamientos estándar contra el cáncer, tales como cirugía, radioterapia, quimioterapia y terapia hormonal.

Una alternativa prometedora es la inmunoterapia, en la que las células cancerosas son específicamente reconocidas por anticuerpos específicos de antígeno de cáncer.

Los principales esfuerzos se han dirigido al aprovechamiento de la especificidad de la respuesta inmunitaria, por ejemplo, la tecnología de hibridomas ha permitido el desarrollo de anticuerpos monoclonales selectivos de tumores y en los últimos años, la Food and Drug Administration ha aprobado los primeros anticuerpos monoclonales para el tratamiento del cáncer: Rituxan ® (anti-CD20) para el linfoma no hodgkiniano y Herceptin [anti- (c-erb-2/HER-2)] para el cáncer de mama metastásico.

Rituxan® (nombre común es rituximab) es un anticuerpo monoclonal de ratón-humano quimérico para CD20 humano, una proteína que comprende cuatro dominios transmembrana de 35 kDa que se encuentran en la superficie de la mayoría de las células B en la sangre periférica y el tejido linfoide.

La terapia de anticuerpos (Rituxan®, Patente de Estados Unidos 5,736,137) fue aprobado por la Food and Drug Administration (FDA) de Estados Unidos para el tratamiento de un linfoma no hodgkiniano de células B positivo en CD20 recidivante o refractario, de grado bajo o folicular.

Además, las terapias de linfomas que emplean anticuerpos anti-CD20 radiomarcados se han descrito en las patentes de Estados Unidos 5,595,721, 5,843,398, 6,015,542, y 6,090,365.

En oncología, Rituxan®/MabThera® también están indicados en los Estados Unidos para el tratamiento de NHL de células B positivo en CD20 recidivante o refractario, de grado bajo o folicular como agente único, para el tratamiento de NHL, para NHL de células B positivo en CD20 folicular no tratado en combinación con ciclofosfamida, vincristina, prednisolona (CVP) de la quimioterapia, para el tratamiento de NHL de células B positivo en CD20 de grado bajo no progresivo (incluyendo la enfermedad estable) como agente único, después de quimioterapia de primera línea con CVP y para NHL positivo en CD20 de células B grandes difusas no tratado previamente en combinación con la quimioterapia estándar (CHOP) u otros regímenes de quimioterapia basados en antraciclina.

En oncología, Rituxan®/MabThera® está indicado en la UE para el tratamiento de pacientes con leucemia linfocítica crónica (CLL) no tratada previamente o recidivante/refractaria en combinación con quimioterapia, para el tratamiento de pacientes no tratados previamente con linfoma folicular en la fase III-IV en combinación con quimioterapia, como terapia de mantenimiento para los pacientes con linfoma folicular recidivante/refractario que responden a la terapia de inducción con quimioterapia con o sin Rituxan®/MabThera®, para el tratamiento de pacientes con linfoma no hodgkiniano (NHL) de células B grandes difusas positivas en CD20 en combinación con quimioterapia CHOP (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina, prednisolona) y como monoterapia para el tratamiento de pacientes con linfoma folicular en fase III-IV que son quimiorresistentes o están en su segunda o subsiguiente recaída después de la quimioterapia.

Además, en reumatología el Rituxan®/MabThera® en combinación con metotrexato está indicado para el tratamiento de pacientes adultos con artritis reumatoide activa grave que han tenido una respuesta inadecuada o intolerancia a otros fármacos anti-reumáticos modificadores de la enfermedad (DMARD), incluyendo uno o más terapias de inhibición de factores de necrosis tumoral (TNF). MabThera es conocido como Rituxan en Estados Unidos, Japón y Canadá.

El Alemtuzumab es otro anticuerpo que reconoce CD52 que está aprobado para su uso en una leucemia linfocítica crónica (CLL) con recaída, pero se asocia con toxicidad significativa debido a la expresión ubicua del antígeno diana en la mayoría de las células inmunes normales, incluyendo células T y células asesinas naturales (NK).

Sin embargo, ha aparecido alguna resistencia o recaídas al tratamiento con rituximab. La recaída puede aparecer a través de una variedad de mecanismos, algunos de los cuales conducen a la pérdida de expresión de CD20 y la resistencia a un tratamiento adicional con rituximab. La resistencia que puede aparecer puede conducir a la pérdida o la modulación de la expresión de CD20 y se caracteriza por la falta de eficacia del tratamiento con rituximab repetido o en algunos casos por la falta de eficacia del tratamiento primario con rituximab. La resistencia también se produce en los casos de linfoma que carecen constitutivamente de la expresión CD20, incluyendo algunos linfomas de células B, tales como linfomas plasmablástico. Por otra parte, los pacientes CD20+ no pueden responder a, o adquirir resistencia a la terapia con Rituxan®.

También, en condiciones de carga elevada de células B, el agotamiento de los mecanismos efectores del cuerpo, por ejemplo, la destrucción mediada por células NK puede conducir a disminuciones sustanciales en la eficacia inmunoterapéutica de este MAb. Además, el tratamiento con rituximab de pacientes con leucemia linfocítica crónica y los altos niveles de células B circulantes puede conducir a la eliminación de CD20 de las células, lo que les permite persistir y resistir a la depuración.

Sobre la base del éxito y las limitaciones de rituximab y alemtuzumab, en particular los fenómenos de resistencia y de recaída con la terapia con rituximab, se necesita identificación de anticuerpos alternativos que reconocen antígenos alternativos en células B.

CD19 es un miembro de la glicoproteína de 95 kDa de la superfamilia de inmunoglobulinas (Ig). CD19 se expresa en las células dendríticas foliculares y todas las células B desde su etapa temprana de precélulas B hasta el momento de la diferenciación de células plasmáticas. La expresión de la superficie de CD19 está estrechamente regulada durante el desarrollo de células B con niveles más altos observados en células más maduras y células B CD5+ (B-1). CD19 se expresa más tarde que CD20 a través de la etapa de plasmablasto de la diferenciación de células B. En consecuencia, la expresión de CD19 es relativamente alta en muchos tumores malignos pre-B y de leucemia linfoblástica B inmaduras y de células B en los que CD20 se expresa poco. Los plasmablastos CD19+ también pueden desempeñar un papel en la perpetuación de enfermedades autoinmunes.

CD19 se expresa en la superficie de células B como un complejo molecular múltiple con CD21, CD81 y CD225. Junto con este complejo, CD19 está implicado en la coseñalización con el receptor de células B y desempeña un papel en el control de la diferenciación, activación y proliferación de las células B linfoides (Sato et al., 1997).

CD19 está presente en los blastos de diferentes tipos de tumores malignos de células B humanas, incluyendo leucemia linfoblástica aguda (ALL) de pro-células B y pre-células B, ALL común (cALL) de los niños y adultos jóvenes, NHL, B-CLL y leucemia de células pilosas (HCL). No se desprende de las células malignas y se internaliza tras la unión de algunos anticuerpos (Press et al., 1989). La densidad del antígeno va de 10.000 a 30.000 moléculas por célula en las células B periféricas sanas, y de 7.000 a 30.000 moléculas por célula en células malignas de una variedad de cánceres linfoides (Olejniczak et al., 1983).

CD19 se expresa de manera más amplia y más temprana en el desarrollo de células B que CD20, que es reconocido por el MAb anticancerígeno comercializado Rituxan® y así podría tener aplicaciones en una amplia gama de tipos de cáncer, incluyendo linfoma no hodgkiniano y leucemia linfoblástica aguda, así como CLL.

CD19 ha sido un foco de desarrollo de la inmunoterapia durante más de 20 años, pero los ensayos clínicos iniciales con anticuerpos monoclonales para CD19 no dieron lugar a efectos duraderos a pesar de la demostración de respuestas en algunos pacientes, ya sea como agente único o en combinación con otros agentes terapéuticos (Hekman et al., 1991; Vlasved et al, 1995).

Varios anticuerpos específicos de CD19 han sido evaluados para el tratamiento de malignidades de linaje B in vitro, en modelos de ratón, y en ensayos clínicos. Estos han incluido anticuerpos anti-CD19 no modificados, conjugados anticuerpo-fármaco, y anticuerpos biespecíficos que reconocen CD19 y CD3 o CD16 para implicar funciones de los linfocitos efectores citotóxicos.

El término "anticuerpo monoclonal", tal como se utiliza aquí, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de origen natural o modificaciones alternativas posteriores a la traducción que pueden estar presentes en menores cantidades, tanto si produce a partir de hibridomas o de técnicas de ADN recombinante.

Los anticuerpos son proteínas, que exhiben especificidad de unión a un antígeno específico. Los anticuerpos nativos son usualmente glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulinas. Cada cadena pesada y ligera también tiene regularmente puentes disulfuro intracadena.

Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (V^h) seguido de un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (V^l) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada.

El término “variable” se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren ampliamente en la secuencia entre anticuerpos y son responsables de la especificidad de unión de cada anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a través de los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos denominados regiones determinantes de complementariedad (CDRs) en los dominios variables de cadena ligera y de cadena pesada.

Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se denominan las regiones marco (FR). Los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada uno cuatro regiones FR, adoptando en gran medida una configuración de lámina p, conectadas por tres CDR, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura la lámina p. Las CDR en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por las regiones FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos (Kabat et al., 1991).

Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero exhiben diversas funciones efectoras. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos de la región constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos o inmunoglobulinas se pueden asignar a diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgG, IgD, IgE e IgM, y varias de éstas pueden dividirse además en subclases (isotipos), por ejemplo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4; IgA1 e IgA2. Las regiones constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, 8, e g y m, respectivamente. De las diversas clases de inmunoglobulinas humanas, solamente IgG1, IgG2, IgG3 e IgM son conocidas para activar el complemento.

Las funciones efectoras inmunes que se han demostrado que contribuyen a la citotoxicidad mediada por anticuerpos incluyen la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC), la fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCP) y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).

La citotoxicidad también puede ser mediada a través de efectos antiproliferativos. El mecanismo de modulación por anticuerpos de la proliferación de células tumorales es poco conocido. Sin embargo, los avances en la comprensión de las interacciones de anticuerpos con receptores Fcg (FcgR) en células efectoras inmunes han permitido la ingeniería de anticuerpos con función efectora mejorada significativamente.

El mecanismo de acción de los MAb es complejo y parece variar para diferentes MAbs. Existen varios mecanismos por los cuales los MAb causan la muerte de células diana. Estos incluyen apoptosis, CDC, ADCC y la inhibición de la transducción de señales.

El más estudiado es ADCC, que está mediada por las células asesinas naturales (NK). Esto implica la unión de la porción Fab de un anticuerpo a un epítopo específico en una célula de cáncer y la posterior unión de la porción Fc del anticuerpo al receptor de Fc en las células NK. Esto desencadena la liberación de perforina, granzima que conduce a la degradación del ADN, induce la apoptosis y da lugar a la muerte celular. Entre los diferentes receptores para la porción Fc de MAbs, FcgRllla juega un papel importante en la ADCC.

La investigación anterior ha demostrado que un polimorfismo del gen de FcgRIlla codifica cualquiera de una fenilalanina (F) o una valina (V) en el aminoácido 158. La expresión de la isoforma de valina se correlaciona con el aumento de la afinidad y la unión a los MAb (Rowland et al., 1993 ; Sapra et al, 2002; Molhoj et al, 2007). Algunos estudios clínicos han apoyado este hallazgo, con una mayor respuesta clínica al rituximab en pacientes con linfoma no Hodgkiniano que muestran el polimorfismo V/V (Cartron et al., 2002, Bruenke et al., 2005, Hekmann et al., 1991, Bargou et al., 2008).

El documento WO1999051642 describe una región Fc de IgG humana variante que comprende una sustitución de aminoácido en las posiciones 270 o 329, o en dos o más de las posiciones 270, 322, 329, y 331. Estas modificaciones tienen por objeto aumentar las funciones efectoras de CDC y ADCC.

El documento WO2002080987 describe un procedimiento para tratar una enfermedad maligna de células B en un sujeto que comprende la administración de una inmunotoxina anti-CD19, más particularmente un anticuerpo monoclonal humanizado o humano. La enfermedad maligna de células B puede ser aquella que comprende células B que no expresan CD20.

El documento WO2007024249 se refiere a la modificación de una región Fc de IgG humana con el fin de conferir un incremento de función de célula efectora mediada por FcyR, especialmente ADCC. La región Fc comprende modificaciones específicas en varias posiciones de aminoácidos.

El documento WO2008022152 también se refiere a anticuerpos que reconocen CD19, en donde los anticuerpos comprenden modificaciones a los receptores de Fc y alteran la capacidad de los anticuerpos para mediar una o más funciones efectoras, incluyendo ADCC, ADCP y CDC. Se ilustran ensayos de ADCC.

Otras solicitudes de patente relacionadas con los anticuerpos anti-CD19 incluyen WO2009052431, WO2009054863, WO2008031056, WO2007076950, WO2007082715, WO2004106381, WO1996036360, WO1991013974, US 7.462.352, US20070166306 y WO2005092925.

El documento US20090098124 también se refiere al diseño de anticuerpos con cadenas pesadas variantes que contienen la región Fc de IgG2, 3 o 4, que tienen una o más modificaciones de aminoácidos. Se proponen una serie de mutaciones y grupo de mutaciones dentro de la región Fc. Uno de ellas es la sustitución en la posición 243 con leucina, en la posición 292 con prolina, en la posición 300 con leucina, en la posición 305 con isoleucina y en la posición 396 con leucina (MgFc88). Pueden introducirse mutaciones adicionales en las regiones Fc para proporcionar alteración de la función CDC y/o la unión a C1q. Las posiciones de aminoácidos a modificar se dice que son generalmente seleccionadas de las posiciones 270, 322, 326, 327, 329, 331, 333, y 334.

J.B. Stavenhagen et al. (Cancer Res 2007, 67 (18): 8.882-8.890) describen la optimización de Fc de anticuerpos terapéuticos. Los niveles más altos de ADCC se obtuvieron con el mutante 18 (F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L). Se describen anticuerpos monoclonales anti-CD20 y anti-CD32b que tienen esta Fc mutada.

A pesar de que CD19 es un antígeno específico de células B expresado en células de leucemia linfocítica crónica (LLC), hasta la fecha CD19 no ha sido reconocida de forma efectiva con anticuerpos monoclonales terapéuticos. Los autores describen XmAb5574, un nuevo anticuerpo monoclonal anti-CD19 diseñado con un dominio Fc modificado diseñado para potenciar la unión de FcgRIIIa. Demuestran que este anticuerpo media la ADCC potente, la citotoxicidad directa modesta y ADCP, pero no CDC (Awan et al., 2010).

Por otra parte, las glicoproteínas median muchas funciones esenciales en seres humanos, incluyendo catálisis, señalización, comunicación célula-célula y el reconocimiento y asociación molecular. Muchas glicoproteínas han sido explotadas con fines terapéuticos. El componente oligosacárido de la proteína puede afectar a propiedades relevantes para la eficacia de una glicoproteína terapéutica, incluyendo estabilidad física, resistencia al ataque de proteasa, interacciones con el sistema inmunitario, la farmacocinética y la actividad biológica específica. Tales propiedades pueden depender no sólo de la presencia o ausencia, sino también de las estructuras específicas, de oligosacáridos. Por ejemplo, ciertas estructuras de oligosacáridos median en la rápido depuración de la glicoproteína del torrente sanguíneo a través de interacciones, con proteínas de unión a carbohidratos específicos, mientras que otras pueden estar unidas por los anticuerpos y desencadenar reacciones inmunitarias no deseadas (Jenkins et al., 1996).

La mayoría de los anticuerpos terapéuticos existentes que han sido autorizados y desarrollados como agentes médicos son del isotipo IgG1 humano, el peso molecular del cual es -150 kDa. La IgG1 humana es una glicoproteína que lleva dos oligosacáridos de tipo complejo biantenarios ligados a N unidos a la región constante del anticuerpo (Fc), en la que la mayoría de los oligosacáridos están fucosilados en el núcleo, y ejerce funciones efectoras de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) a través de la interacción de Fc con cualquiera de los receptores de leucocitos (FcgRs) o complemento.

Recientemente, los anticuerpos terapéuticos han demostrado mejorar la supervivencia general, así como el tiempo de progresión de la enfermedad en una variedad de tumores malignos humanos, tales como los cánceres de mama, colon y hematológicos, y el análisis genético de polimorfismos FcyR de pacientes con cáncer ha demostrado que la ADCC es un importante mecanismo anti-neoplasmas responsable de la eficacia clínica. Sin embargo, se ha encontrado que la ADCC de anticuerpos terapéuticos con licencia existentes es inhibida fuertemente por el suero debido a la competición no específica de IgG por la unión de los agentes terapéuticos a FcgRIIIa en las células asesinas naturales, lo que conduce al requisito de una cantidad significativa de fármaco y muy altos costes asociados con tales terapias.

Se muestra que la ADCC mejorada de formas no fucosiladas de anticuerpos terapéuticos mediante la unión a FcgRIIIa mejorada es inhibida por los homólogos fucosilados. De hecho, los anticuerpos terapéuticos no fucosilados, sin incluir las formas fucosilados, exhiben la ADCC más fuerte y saturable in vitro y ex vivo entre dichas variantes de anticuerpos con unión a FcgRIIIa mejorada como los que contienen heterogeneidades de oligosacáridos naturales y mutaciones de aminoácidos artificiales, incluso en la presencia de IgG de plasma.

La inhibición de la glicosilación de una IgG1 humana, mediante el cultivo en presencia de tunicamicina, causa, por ejemplo, una disminución de 50 veces en la afinidad de este anticuerpo por el receptor de FcyRI presente en los monocitos y macrófagos (Leatherbarrow et al., 1990). La unión al receptor de FcgRIII también se ve afectada por la pérdida de carbohidratos en IgG, ya que se ha descrito que una IgG3 no glicosilada es incapaz de inducir la lisis de tipo ADCC a través del receptor de FcgRIII de las células NK (Lund et al., 1995). Sin embargo, más allá de la necesaria presencia de los residuos que contienen glicano, es más precisamente la heterogeneidad de su estructura que puede dar lugar a diferencias en la capacidad de iniciar funciones efectoras.

Se han realizado estudios para investigar la función del residuo de oligosacárido sobre las actividades biológicas de anticuerpos. Se ha demostrado que el ácido siálico de IgG no tiene ningún efecto sobre ADCC (Boyd et al., 1995). Varios informes han demostrado que los residuos de Gal mejoran ADCC (Kumpel et al., 1994). GlcNac bisectante, que es un residuo beta, 4-GlcNac transferido a un residuo de beta-manosa (Man) en el núcleo, se ha implicado en el residuo biológico de anticuerpos terapéuticos. (Lifely et al., 1995, Shield et al., 2002) han revelado el efecto de oligosacáridos fucosilados en funciones efectoras de anticuerpo; la IgG1 deficiente en Fuc ha demostrado una unión a FcgRIII 50 veces mayor y una mayor ADCC.

Actualmente, una amplia gama de proteínas recombinantes para aplicaciones terapéuticas (es decir, cáncer, enfermedades inflamatorias...) se compone de anticuerpos monoclonales glicosilados. Por razones terapéuticas y económicas, hay un gran interés en la obtención de actividad de anticuerpo específica más elevada. Una manera de obtener grandes incrementos de potencia, manteniendo al mismo tiempo un proceso de producción sencillo en la línea celular y potencialmente evitar efectos secundarios significativos, indeseables, es mejorar las funciones efectoras naturales mediadas por células de MAbs. En consecuencia, el diseño de oligosacáridos de IgG puede producir ADCC optimizada que se considera que es una función principal de algunos de los anticuerpos terapéuticos, aunque los anticuerpos tienen múltiples funciones terapéuticas (por ejemplo, unión a antígeno, inducción de apoptosis, y CDC).

En general, los anticuerpos quiméricos y humanizados se preparan utilizando técnicas de recombinación genética y son producidos usando células CHO como célula huésped. Con el fin de modificar la estructura de cadena de azúcar de los anticuerpos, se han intentado varios procedimientos, por ejemplo aplicación de un inhibidor contra una enzima relacionada con la modificación de una cadena de azúcar, la selección de un mutante, o la introducción de un gen que codifica una enzima relacionada con la modificación de una cadena de azúcar.

GLYCART BIOTECHNOLOGY AG (Zurich, CH) ha expresado la N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII), que cataliza la adición del residuo de GlcNAc bisectante al oligosacárido ligado a N, en una línea celular de ovario de hámster chino (CHO), y mostró una mayor ADCC de anticuerpo IgG1 producido (WO 99/54342; WO 03/011878; WO 2005/044859).

Mediante la eliminación o suplantación de la fucosa de la porción Fc del anticuerpo, KYOWA HAKKO KOGYO (Tokio, Japón) ha aumentado la unión de Fc y ha mejorado ADCC, y por lo tanto la eficacia del MAb (US 6.946.292).

Más recientemente, Laboratoire Franpais du fractionnement et des Biotechnologies (LFB) (Francia) mostró que la relación Fuc/Gal en oligosacárido de MAb debe ser igual o inferior a 0,6 para obtener anticuerpos con una alta ADCC (FR 2861080).

P.M. Cardarelli et al. (Cancer Immunol Immunother 2010, 59: 257-265) producen un anticuerpo anti-CD19 en células Ms-704PF CHO deficientes en el gen FUT8 que codifica alfa1,6-fucosiltransferasa. El anticuerpo en este documento no requiere fucosilación en el diseño de una línea celular deficientes de enzimas. Este documento considera mutaciones de aminoácidos.

John Lund et al. (Journal of Immunology, 1996, vol. 157, no. 11, pág. 4963-4969) describen que IgG3 quimérico humano aglicosilado retenía una importante capacidad de unirse a C1q humano y desencadenan la lisis mediada a través del conejillo de indias C.

Las funciones efectoras, tales como CDC y ADCC, son funciones efectoras que pueden ser importantes para la eficacia clínica de los MAb. Todas estas funciones efectoras están mediadas por la región Fc del anticuerpo y permiten a los autores intentar modificaciones de aminoácidos con más o menos éxito. La glicosilación, especialmente la fucosilación de la región Fc, tiene una influencia improtante en la eficacia de un anticuerpo. Esto ha permitido a los autores modificar las condiciones de producción de los anticuerpos en las células CHO con el fin de cambiar el perfil de glicosilación en un intento aquí de nuevo de mejorar algunas funciones efectoras, con más o menos éxito una vez más.

Un procedimiento de mejora de la ADCC del mAb quimérico anti-CD19 MAb 4G7 se describió en US 2007/0166306. El MAb 4G7 fue producido mediante el uso de la línea de células 293T de mamífero humano en presencia de una enzima beta (1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII), en condiciones eficaces para producir en el anticuerpo, un fragmento Fc caracteriza por oligosacáridos unidos a Asn297 que contienen (1) al menos 60% de oligosacáridos biselecionantes de N-acetilglucosamina y (2) sólo el 10% de oligosacáridos biseleccionantes de N-acetilglucosamina no fucosilados.

H.M. Horton et al. (Cancer Res 2008, 68 (19): 8.049-8.057) describen un anticuerpo anti-CD19 diseñado con Fc, que tienen las mutaciones S239D y I332E. Este dominio de Fc denominado en el presente documento Fc14 se comparó con el dominio de Fc de la presente invención llamado chR005-FC20 (F243L/R292P/Y300L/V305L/P396L). El dominio de Fc de la presente invención muestra ADCC en presencia de células efectoras de sangre entera mientras que no se detectó actividad ADCC significativa con Fc14 en las mismas condiciones en presencia de sangre entera que contiene inmunoglobulinas naturales circulantes.

Las células de mamífero son los huéspedes preferidos para la producción de glicoproteínas terapéuticas, debido a su capacidad para glicosilar proteínas en la forma más compatible para aplicaciones humanas (Jenkis et al., 1996). Las bacterias muy raramente glicosilan proteínas y como otro tipo de huéspedes comunes, tales como levaduras, hongos filamentosos, insectos y células vegetales producen patrones de glicosilación asociados con la rápida depuración del torrente sanguíneo.

Entre las células de mamífero, las células de ovario de hámster chino (CHO) se han utilizado más comúnmente durante las últimas dos décadas. Además de proporcionar patrones de glicosilación adecuados, estas células permiten la generación consistente de líneas celulares clonales altamente productivas y genéticamente estables. Pueden cultivarse a altas densidades en biorreactores simples utilizando medio libre de suero, y permitir el desarrollo de bioprocesos seguros y reproducibles. Otras células de animales de uso común incluyen células de riñón de hámster bebé (BHK), células de mieloma ratón NSO y SP2/0. La producción de animales transgénicos también se ha probado (Jenkins et al., 1996).

Puesto que la estructura de cadena de azúcar desempeña un papel notablemente importante en la función efectora de los anticuerpos y se observan diferencias en la estructura de cadena de azúcar de las glicoproteínas expresadas por las células huésped, ha sido un objetivo el desarrollo de una célula huésped que se puede utilizar para la producción de un anticuerpo que tiene mayor función efectora.

Con el fin de modificar la estructura de cadena de azúcar de la glicoproteína producida, se han intentado varios procedimientos, tales como (1) aplicación de un inhibidor contra una enzima relacionada con la modificación de una cadena de azúcar, (2) selección de un mutante de células, (3) introducción de un gen que codifica una enzima relacionada con la modificación de una cadena de azúcar, y similares. A continuación, se describen ejemplos específicos.

Los ejemplos de un inhibidor contra una enzima relacionada con la modificación de una cadena de azúcar incluye tunicamicina que inhibe selectivamente la formación de GlcNAc-PP-Dol que es la primera etapa de la formación de un oligosacárido en el núcleo que es un precursor de una cadena de azúcar unida a N-glicósido, castanoespermina y W-metil-1-desoxinojirimicina que son inhibidores de glucosidasa I, bromocondulitol que es un inhibidor de glucosidasa II, 1-desoxinojirimicina y 1,4-dioxi-1,4-imino-D-manitol que son inhibidores de manosidasa I, swainsonina que es un inhibidor de manosidasa II, swainsonina que es un inhibidor de manosidasa II y similares.

Los ejemplos de un inhibidor específico para una glicosiltransferasa incluyen derivados de desoxi de sustratos contra N-acetilglucosamina transferasa V (GnTV) y similares. También se sabe que 1-desoxinojirimicina inhibe la síntesis de una cadena de azúcar de tipo complejo y aumenta la ración de tipo de alta manosa y cadenas de azúcar de tipo híbrido (serie Glycobiology 2 - Destino de cadena de azúcar en Cell, editado por Katsutaka Nagai, Senichiro Hakomori y Akira Kobata, 1993).

Los mutantes de células con respecto a la actividad de una enzima relacionada con la modificación de una cadena de azúcar se seleccionan principalmente y se obtienen como una línea celular resitente a lectina. Por ejemplo, los mutantes de células CHO que tienen varias estructuras de cadena de azúcar se han obtenido como una línea celular resistente a lectina utilizando una lectina, tal como WGA (aglutinina de germen de trigo derivada de T.vulgaris), ConA (cocanavalina A derivada de C. ensiformis), RIC (una toxina derivada de R. communis), L-PHA (leucoaglutinina derivada de P. vulgaris), LCA (aglutinina de lentejas derivada de L. culinaris), PSA (lectina de guisante derivada de P. sativum) o similares (Genet et al. 1986).

Como ejemplo de la modificación de la estructura de cadena de azúcar de un producto obtenido mediante la introducción del gen de una enzima relacionada con la modificación de una cadena de azúcar en una célula huésped, se ha descrito que una proteína en la que se añade un número de ácido siálico al extremo no reductor de la cadena de azúcar se puede producir mediante la introducción de p-galactosidasa-a-5,6-sialiltransferasa de rata en la célula CHO. Los diferentes tipos de glicosiltransferasa que modifican glicoproteínas pueden ser también expresados en el sistema de huéspedes, tales como GnT III, o, alternativamente, b (1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa V (GnT V), p (1,4)-galactosil transferasa (GALT) y manosidasa II (Man II).

WO20070166306 se relaciona con el uso de líneas de células madre derivadas de embriones aviares, llamadas EBx®, para la producción de proteínas y más específicamente glicoproteínas, tales como anticuerpos, que están menos fucosiladas que con células CHO habituales.

Ramesh Jassal et al. generan sialilación de anticuerpo IgG3 anti NIP con mutación FA243 o mediante el uso de una línea celular CHO-K1 transfectada con a2,6-sialiltransferasa de rata. La IgG3 FA243 que tiene una silailación a2,6 y a2,3 restauró la lisis de células diana por el complemento.

John Lund et al. (Journal of Immunology, 1996, vol. 157, no. 11, pág. 4963-4969) describen que la IgG3 quimérica humana aglicosilada retenía una importante capacidad de unirse a C1q humano y desencadenar la lisis mediada a través de conejillo de indias C.

Los presentes inventores han evaluado el perfil de glicosilación de diversos anticuerpos quiméricos variantes de Fc de la subclase IgG1 humana dirigidos contra el antígeno CD19 producidos por células de ovario hámster chino CHO/DG44, (adquiridos por ECACC) no modificados y no tratados con inhibidores de la glicosilación. Mediante el análisis y la comparación de las estructuras de las cadenas de azúcar de los anticuerpos de variante chR005-1 FC0 y anticuerpos de variante chR005-1 FC20 optimizada producidos, la presente invención proporciona que una célula huésped CHO de tipo natural sin ninguna modificación expresa un perfil de glicosilación interesante y valioso, especialmente un bajo nivel de fucosa y/o un nivel alto de oligomanosa y/o un mayor nivel de glicoformas sialiladas.

CARACTERÍSTICAS DE LA PRESENTE INVENCIÓN

La presente invención proporciona anticuerpos anti-CD19 quiméricos, humanizados y humanos, proteínas de fusión de anticuerpo anti-CD19, y fragmentos de los mismos que se unen a un marcador de células B humanas.

Los enfoques actuales para optimizar la funcionalidad de anticuerpos terapéuticos (por ejemplo, ADCC, CDC) se han centrado en la modificación de aminoácidos o modificación del estado de glicosilación de la región Fc nativa. En cambio, la presente invención se basa en un enfoque combinado simultáneo relativo a la modificación de aminoácidos y la modificación de la glicosilación.

La presente invención se refiere al campo de la modificación de glicosilación de proteínas. Más en particular, la presente invención está dirigida a la modificación de la glicosilación de proteínas mediante el uso de una línea celular CHO de mamífero de tipo natural para proporcionar proteínas variantes después de la mutación de aminoácidos con propiedades terapéuticas mejoradas, tales como una ADCC eficaz, mientras que las moléculas parentales (anticuerpos quiméricos murinos o de tipo natural) no presentan de manera detectable esta función. Las moléculas de la presente invención todavía conservaban la función efectora de apoptosis conferida por el anticuerpo murino parental.

Más particularmente, la presente innovación se refiere a modificaciones de funcionalidad del anticuerpo en inmunoglobulina con regiones Fc de isotipo IgG1 para tener la capacidad para desencadenar la función efectora CDC.

Más en particular, las moléculas de la presente invención muestran la activación del complemento y la inducción eficiente de ADCC.

Las moléculas de la presente invención son particularmente útiles para el tratamiento de trastornos de células B, tales como, pero no limitadas a, tumores malignos de células B, para el tratamiento y prevención de enfermedades autoinmunes, y para el tratamiento y prevención de enfermedades de injerto contra huésped (GVHD), rechazo humoral, y trastorno linfoproliferativo post-trasplante en receptores de trasplantes humanos, para los pacientes refractarios al tratamiento con anticuerpo terapéutico existente, tal como, pero no limitado a, como anticuerpo antiCD20 o para el tratamiento de combinación con anticuerpo terapéutico existente, tal como, pero no limitado, como anticuerpos anti-CD20.

El presente trabajo tiene como objetivo la generación de anticuerpos anti-CD19 que tienen una región Fc modificada que supera estos inconvenientes. Los inventores han demostrado que las modificaciones de aminoácidos en la región Fc de estos anticuerpos anti-CD19 pueden tener consecuencias no sólo en las funciones efectoras, incluyendo ADCC y/o CDC, sino también directamente en el perfil de glicosilación del anticuerpo. En particular han demostrado que algunas modificaciones en la región Fc pueden conducir a un anticuerpo anti-CD19 que tiene un perfil de glicosilación interesante y valioso, especialmente un bajo nivel de fucosa y/o un alto nivel de oligomanosa y/o un mayor nivel de glicoformas sialiladas cuando el anticuerpo se produce o expresa en células de mamífero, incluyendo células de tipo natural de mamíferos, en particular células de roedores, especialmente las células CHO, tales como células CHO de tipo dhfr/_ (adquiridos mediante la colección ATCC).

Un primer objetivo de la presente invención es proporcionar una región Fc modificada que confiere un perfil de glicosilación interesante y valioso, especialmente un bajo nivel de fucosa y/o un alto nivel de oligomanosa y/o un mayor nivel de glicoformas sialiladas a un anticuerpo anti-CD19, incluyendo un anticuerpo producido o expresado en células de mamífero, especialmente células de roedores, tales como células CHO, preferiblemente células de tipo natural, tales como células CHO de tipo natural. Por definición, de tipo natural significa que las células no se han modificado o diseñado con el fin de modificar la maquinaria de glicosilación de las células nativas.

Un segundo objetivo de la presente invención es proporcionar una región Fc modificada que confiere función ADCC a un anticuerpo anti-CD19 que contiene esta región Fc.

Un tercer objetivo de la presente invención es proporcionar una región Fc modificada que confiere función CDC a un anticuerpo anti-CD19 que contiene esta región Fc.

Un cuarto objetivo de la presente invención es proporcionar una región Fc modificada que confiere funciones ADCC y CDC a un anticuerpo anti-CD19 que contiene esta región Fc.

Un quinto objetivo de la presente invención es proporcionar una región Fc modificada que confiere función ADCC y/o CDC a un anticuerpo anti-CD19 que contiene esta región Fc, y además un perfil de glicosilación interesante y valioso, especialmente un nivel bajo de fucosa y/o un alto nivel de oligomanosas y/o un mayor nivel de glicoformas sialiladas cuando se produce o expresa en células de mamíferos, en particular células de roedores, tales como células CHO, incluyendo del tipo natural.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Un primer objetivo de la presente invención es un anticuerpo anti-CD19 tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Los anticuerpos anti-CD19 recombinantes según la presente invención tienen un perfil de glicosilación interesante después de la producción en una célula de tipo natural, especialmente células de roedores, tal como en particular una CHO de tipo natural.

En particular, a partir de las células transfectadas, por ejemplo, CHO de tipo natural, la presente invención permite expresar una gran proporción de los anticuerpos recombinantes o fragmento de los mismos, que lleva una estructura de oligosacárido ligado a N común de un tipo biantenario que comprende cadenas largas con GlcNac terminal que están galactosiladas y no fucosiladas.

Una o más glicoformas están presentes en una población de anticuerpos anti-CD19 recombinante. Una glicoforma es una isoforma de una proteína que difiere sólo con respecto al número o tipo de glicano adjunto.

En una realización muy sorprendente y valiosa, los anticuerpos tienen un nivel de fucosa bajo. Esto significa que entre una población de anticuerpos anti-CD19 recombinantes producidos en estas células, por ejemplo CHO de tipo natural, en esta realización, la proporción de anticuerpos no fucosilados representan aproximadamente al menos 40%, preferiblemente aproximadamente al menos 60%, más preferiblemente aproximadamente al menos el 80% de los anticuerpos o superiores, por ejemplo, al menos 85%. Más en particular, la no fucosilación se refiere a la Fc. Como células CHO, se pueden mencionar CHO dhfr -/-, CHO/DG44 y CHO Easy C.

Un objetivo específico de la presente invención es un anticuerpo anti-CD19, tal como se reivindica, en el que el anticuerpo ha sido producido en células de roedores de tipo natural, preferiblemente células CHO de tipo natural. De acuerdo con una característica preferida, este anticuerpo tiene un bajo nivel de fucosa.

Otro objetivo de la presente invención es un anticuerpo anti-CD19, tal como se reivindica, que tiene un nivel de fucosa bajo.

De acuerdo con la presente invención, un bajo nivel de fucosa significa (1) una cantidad reducida de fucosa en un anticuerpo, especialmente en su Fc o (2) un alto número de anticuerpos en un grupo que tienen una cantidad reducida de fucosa y/o no fucosa, especialmente en su Fc.

En la presente descripción, se habla de una Fc o los dos Fc de un anticuerpo de acuerdo con la presente invención. Incluso si no se menciona cada vez, para cada realización, hay un caso preferido en el que el anticuerpo tiene dos Fc y cada uno de los Fc tiene una estructura similar (las mismas mutaciones) y un perfil de glicosilación similar.

En una realización, el anticuerpo de la presente invención tiene una Fc, preferiblemente dos Fc que no contienen (GlcNAc)2(Fuc)i (Man)3(GlcNAc)2 glicano.

En una realización, el anticuerpo de la presente invención tiene una Fc, preferiblemente dos Fc que no contienen (Gal)1(GlcNAc)2(Fuc)i (Man)3(GlcNAc)2 glicano.

En una realización, el anticuerpo de la presente invención tiene una Fc, preferiblemente dos Fc que no contienen (GlcNAc)2(Fuc)i (Man)3(GlcNAc)2 glicano ni (Gal)1(GlcNAc)2(Fuc)i (Man)3(GlcNAc)2 glicano.

En una realización, el anticuerpo de la presente invención comprende una Fc, preferiblemente dos Fc que contienen un (Man)5(GlcNAc)2 glicano. En una realización, el anticuerpo de la presente invención comprende una Fc, preferiblemente dos Fc que contienen un (Man)5(GlcNAc)2 glicano y no llevan (GlcNAc)2(Fuc)i (Man)3(GlcNAc) 2 glicano y/o, preferiblemente y, no llevan (Gal)1(GlcNAc)2(Fuc)i (Man)3(GlcNAc) 2 glicano.

En una realización, el anticuerpo comprende una Fc, preferiblemente dos Fc que contienen uno o dos de los siguientes glicanos:

-(Gal)1(GlcNAc)2(Fuc)i (NeuAc)i (Man)3(GlcNAc)2

-(Gal)2(GlcNAc)2(Fuc)i (NeuAc)i (Man)3(GlcNAc) 2

En una realización, el anticuerpo de la presente invención comprende una Fc, preferiblemente dos Fc que contienen un (Man)5(GlcNAc)2 glicano y no llevan (GlcNAc)2(Fuc)i (Man)3(GlcNAc)2 glicano y/o, preferiblemente y, no llevan (Gal)1(GlcNAc)2(Fuc) i (Man)3(GlcNAc)2 glicano, y uno o dos de los siguientes glicanos:

-(Gal)1(GlcNAc)2(Fuc)i (NeuAc)i (Man)3(GlcNAc) 2

-(Gal)2(GlcNAc)2(Fuc)i (NeuAc)i (Man)3(GlcNAc) 2

Otro objetivo de la presente invención es un anticuerpo anti-CD19 modificado para comprender una región Fc de IgG1 variante humana, tal como se define en la reivindicación 1, y en el que el anticuerpo tiene una Fc, preferiblemente dos Fc que no contienen (GlcNAc)2(Fuc)i (Man)3(GlcNAc)2 glicano y/o, preferiblemente y, no llevan (Gal)1(GlcNAc)2 (Fuc)i (Man)3(GlcNAc) 2 glicano. En una realización, el anticuerpo de la presente invención comprende una Fc, preferiblemente dos Fc que contienen un (Man)5(GlcNAc)2 glicano. En una realización, el anticuerpo comprende una Fc, preferiblemente dos Fc que contienen uno o dos de los siguientes glicanos:

-(Gal)1(GlcNAc)2(Fuc)i(NeuAc)1 (Man)3(GlcNAc)2

-(Gal)2(GlcNAc)2(Fuc)i(NeuAc)1 (Man)3(GlcNAc)2

En todavía realización muy sorprendente y valiosa, los anticuerpos tienen un alto nivel de oligomanosa. Esto significa que entre una población de anticuerpos anti-CD19 recombinantes producidos en estas células, por ejemplo CHO de tipo natural, la proporción de anticuerpos caracterizados por un mayor nivel de oligomanosas representan aproximadamente al menos 20%, preferiblemente aproximadamente al menos 30%, más preferiblemente aproximadamente al menos 40%, aún más preferiblemente aproximadamente al menos 50% de los anticuerpos o superior.

En todavía una realización muy sorprendente y valiosa, entre una población de anticuerpos recombinantes producidos en estas células, por ejemplo CHO de tipo natural, la proporción de anticuerpos caracterizados por un mayor nivel de glicoformas sialiladas representan aproximadamente al menos 1,5%, preferiblemente aproximadamente al menos 2,5%, más preferiblemente aproximadamente al menos el 5% de los anticuerpos o superior.

En una realización preferida, los anticuerpos de la presente invención combinan tres de estas características, especialmente bajo nivel de fucosa y alto nivel de oligomanosa y/o un mayor nivel de glicoformas sialiladas.

En particular, las células transfectadas de la presente invención, por ejemplo células CHO de tipo natural, permiten expresar una gran proporción de anticuerpos o fragmentos de los mismos, que lleva una estructura de oligosacárido ligado a N común de tipo biantenario que comprende cadenas largas con GlcNac terminal que están galactosiladas y no fucosiladas y que confieren una fuerte actividad ADCC a los anticuerpos.

En una realización, el anticuerpo anti-CD19 que tiene un perfil específico de glicosilación de acuerdo con la presente invención, especialmente un bajo nivel de fucosa y/o un alto nivel de oligomanosa y/o un mayor nivel de glicoformas sialiladas, se produce o expresa, o es como se produce o expresa, en células de mamífero, preferiblemente células de mamífero de tipo natural, preferiblemente de origen roedor, especialmente las células CHO.

En una realización, las células son células de roedores, en particular las células CHO.

En una realización, las células son células de roedores de tipo natural, especialmente células CHO de tipo natural. En una realización, el anticuerpo anti-CD19 es capaz de generar actividad CDC ADCC.

En una realización, este anticuerpo anti-CD19 es capaz de generar actividad CDC ADCC y presentar un perfil específico de glicosilación de acuerdo con la presente invención, especialmente un bajo nivel de fucosa y/o un alto nivel de oligomanosa y/o un mayor nivel de glicoformas sialiladas según la presente invención.

El anticuerpo de la presente invención puede comprender mutaciones adicionales en la región Fc.

En una realización, la región Fc comprende además una sustitución de aminoácido en la posición del aminoácido 333.

La región Fc de IgG humana es una región Fc de IgG1.

Los aminoácidos de la región Fc que están sustituidos de acuerdo con la presente invención pueden ser sustituidos por cualquier aminoácido, siendo la condición que todo el conjunto de aminoácidos sustituidos sea capaz de generar esta actividad CDC ADCC y/o conferir un perfil de glicosilación específico de acuerdo con la presente invención, especialmente un bajo nivel de fucosa y/o un alto nivel de oligomanosa y/o un mayor nivel de glicoformas sialiladas de acuerdo con la presente invención. A continuación, se proporcionan ejemplos de posibles sustituciones.

En una realización, Phe243 es sustituido por Leu.

En una realización, Arg292 es sustituido por Pro.

En una realización, Tyr300 es sustituido por Leu.

En una realización, Val305 es sustituido por Leu.

En una realización Lys326 es sustituido por Ala.

En una realización, Glu333 es sustituido por Ala.

En una realización, Pro396 es sustituido por Leu.

En una realización, el anticuerpo anti-CD19 comprende una región Fc en la que Phe243 es sustituido por Leu, Arg292 es sustituido por Pro, Tyr300 es sustituido por Leu, Val305 es sustituido por Leu, Lys326 es sustituido por Ala y Pro396 es sustituido por Leu.

En una realización, esta región Fc tiene la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID NO: 1 (Fc34). Un ácido nucleico que codifica esta región Fc se representa en la SEQ ID NO: 2.

En otra realización, el anticuerpo anti-CD19 comprende una región Fc en la que Phe243 es sustituido por Leu, Arg292 es sustituido por Pro, Tyr300 es sustituido por Leu, Val305 es sustituido por Leu, Lys326 es sustituido por Ala, Glu333 es sustituido por Ala y Pro396 es sustituido por Leu.

En otra realización, esta región Fc tiene la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID NO: 3 (Fc24). Un ácido nucleico que codifica esta región Fc se representa en la SEQ ID NO: 4

Las modificaciones y cambios pueden realizarse en la estructura de un polipéptido de la presente invención y todavía obtener una molécula que tiene características similares. Por ejemplo, ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos en una secuencia sin pérdida apreciable de actividad. Debido a que es la capacidad interactiva y la naturaleza de un polipéptido lo que define la actividad funcional biológica del polipéptido, ciertas sustituciones de secuencias de aminoácidos pueden realizarse en una secuencia de polipéptido (o, por supuesto, su secuencia de codificación de ADN subyacente) y sin embargo obtener un polipéptido con propiedades simimlares.

Al realizar tales cambios, se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático de los aminoácidos para conferir función biológica interactiva a un polipéptido se entiende generalmente en la técnica (Kyte et al. 1982). Se sabe que ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos que tienen un índice o valor hidropático similar y aún dar lugar a un polipéptido con actividad biológica similar. Cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático en base a sus características de hidrofobicidad y carga.

Se cree que el carácter hidropático relativo del aminoácido determina la estructura secundaria del polipéptido resultante, que a su vez define la interacción del polipéptido con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, anticuerpos, antígenos, y similares. Se sabe en la técnica que un aminoácido puede ser sustituido por otro aminoácido que tiene un índice hidropático similar y aún obtener un polipéptido biológicamente equivalente funcionalmente. En dichos cambios, es preferible la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos se encuentran dentro de 2, los que están dentro de 1 se prefieren particularmente, y aquellos dentro de 0,5 son incluso más particularmente preferidos.

La sustitución de aminoácidos similares también se puede realizar en base a la hidrofilicidad, particularmente cuando el péptido o polipéptido biológicamente funcionalmente equivalente creado de ese modo esta destinado a su uso en realizaciones inmunológicas. La patente de Estados Unidos 4.554.101, incorporada aquí por referencia, afirma que la mayor hidrofilicidad promedio local de un polipéptido, como se rige por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con su inmunogenicidad y antigenicidad, es decir, con una propiedad biológica del polipéptido.

Talomo se detalla en la patente US 4.554.101, los siguientes valores de hidrofilicidad se han asignado a los residuos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (3,0 ± 1); serina (0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); prolina (-0,5 ± 1); treonina (-0,4); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (­ 1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (­ 3,4). Se entiende que un aminoácido puede ser sustituido por otro que tenga un valor de hidrofilidad similar y aún obtener una proteína biológicamente equivalente y, en particular, un polipéptido inmunológicamente equivalente. En dichos cambios, la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de 2 son preferidos, los que están dentro de 1 se prefieren particularmente, y aquellos dentro de ± 0,5 son incluso más particularmente preferidos.

Tal como se ha indicado anteriormente, las sustituciones de aminoácidos se basan por lo tanto generalmente en la similitud relativa de los sustituyentes de cadena lateral de aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño, y similares.

Aminoácido Índice Aminoácido Índice

isoleucine L (+4,5) triptófano W (-0,9)

valina V (+4,2) tirosina Y (-1,3)

leucina L (+3,8) prolina P (-1,6)

fenilalanina (+2,8) histidina H (-3,2)

cisteína C (+2,5) glutamato E (-3,5)

metionina M (+1,9) glutamina Q (-3,5)

alanina A (+1,8) aspartato D (-3,5)

glicina G (-0,4) asparagina N (-3,5)

treonina T (-0,7) lisina K (-3,9)

serina S (-0,8) arginina R (-4,5)

La sustitución de aminoácidos puede ser elegidos o seleccionados de forma diferente. Las posibles sustituciones se han documentado en los documentos WO99/51642, WO2007024249 y WO2007106707.

La solicitud describe que Phe243 puede estar sustituido por un aminoácido elegido entre Leu, Trp, Tyr, Arg y Gin. Preferiblemente, Phe243 es sustituido por Leu.

La solicitud describe que Arg292 puede estar sustituido por un aminoácido seleccionado entre Gly y Pro. Preferiblemente, Arg292 es sustituido por Pro.

La solicitud describe que Tyr300 puede estar sustituido por un aminoácido seleccionado entre Lys, Phe, Leu y Ile. Preferiblemente, Tyr300 es sustituido por Leu.

La solicitud describe que Val305 puede estar sustituido por Leu o Ile. Preferiblemente, Val305 es sustituido por Leu. La solicitud describe que Lys326 puede estar sustituido por un aminoácido seleccionado entre Val, Glu, Ala, Gly, Asp, Met, Ser, Asn y Trp. Preferiblemente, Lys326 es sustituido por Ala.

La solicitud describe que Glu333 puede estar sustituido por un aminoácido seleccionado entre Val, Gly, Ala, Gln, Asp, Asn, Lys, Arg y Ser. Preferiblemente, Glu333 es sustituido por Ala.

Pro396 es sustituido por Leu.

En una realización, la presente invención se aplica a cualquier anticuerpo anti-CD19. Es decir, el anticuerpo anti-CD19 comprende regiones variables específicas para el antígeno CD19, o regiones variables que comprenden CDR específicas para el antígeno CD19, y la región Fc mutante de acuerdo con la presente invención. Las regiones variables pueden encontrarse en US20090098124, WO2002080987, WO2007024249, WO2008022152, WO2009052431, WO2009054863, WO2008031056, WO2007076950, WO2007082715, WO2004106381, WO1996036360, WO1991013974, US 7.462.352, US20070166306 y WO2005092925. La persona experta en la técnica puede referirse a estos documentos como fuente de regiones variables o CDR específicas para CD19. En una realización, el anticuerpo es específico para, o reconoce, un epítopo no de internalización del antígeno CD19. El solicitante ha desarrollado dos anticuerpos anti-CD19 murinos llamados mR005-1 y mR005-2, cuyas regiones variables de han sido secuenciadas y las CDRs identificadas. La presente invención incluye por tanto, como realizaciones preferidas, el uso de las regiones variables o las CDR derivadas de mR005-1 y mR005-2.

En una realización preferida, el anticuerpo anti-CD19 mR005-1 de la presente invención comprende las siguientes CDR:

En una realización preferida, el anticuerpo anti-CD19 mR005-2 de la presente invención comprende las siguientes CDR:

Por definición, estas CDRs incluyen variantes de CDR, por deleción, sustitución o adición de uno o más aminoácidos, cuya variante mantiene la especificidad de las CDR originales. El sistema de numeración común proporciona una definición de CDR que tiene las secuencias de aminoácidos más cortas o la definición mínima de CDR.

En una realización, el anticuerpo comprende las CDR de los anticuerpos mR005-1 o mR005-2 cuyas secuencias de aminoácidos de VH y VL se representan en la siguiente tabla, o más preferiblemente, el anticuerpo comprende las secuencias:

En una realización, el anticuerpo comprende las CDR cuya secuencia se representa en la SEQ ID NO: 16, 6, 13 y/o 8, 9, 10.

En una realización, el anticuerpo comprende las CDR cuya secuencia se representa en la SEQ ID NO: 5, 6, 7 y/o 8, 9, 10.

En una realización, el anticuerpo comprende las CDR cuya secuencia se representa en la SEQ ID NO: 11, 12, 13 y/o 14, 15, 10.

En una realización, el anticuerpo comprende las CDR cuya secuencia se representa en la SEQ ID NO: 28, 18, 25 y/o 20, 21, 22.

En una realización, el anticuerpo comprende las CDR cuya secuencia se representa en la SEQ ID NO: 17, 18, 19 y/o 20, 21, 22.

En una realización, el anticuerpo comprende las CDR cuya secuencia se representa en la SEQ ID NO: 23, 24, 25 y/o 26, 27, 22.

La presente invención comprende además cada una de estas realizaciones, en las que el anticuerpo comprende además una región Fc que tiene la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID NO: 1 o 3.

El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano completo, un anticuerpo biespecífico, un conjugado de anticuerpo y fármaco o un fragmento de anticuerpo. Un "anticuerpo humanizado" o "anticuerpo humanizado quimérico" se refiere a un anticuerpo derivado de un anticuerpo no humano, típicamente un anticuerpo murino, que conserva o retiene sustancialmente las propiedades de unión al antígeno del anticuerpo parental, pero que es menos inmunogénico en seres humanos. En una realización, el anticuerpo desencadena la muerte celular programada o apoptosis.

En una realización, el anticuerpo es para el uso para trastornos de células B positivas en CD19.

En una realización, el anticuerpo es para su uso en pacientes tratados con anticuerpos anti-CD20 refractarios o recidivantes.

En una realización, los anticuerpos de la presente invención tienen una región Fc que tiene un perfil específico de glicosilación de acuerdo con la presente invención, especialmente un bajo nivel de fucosa y/o un alto nivel de oligomanosa y/o un mayor nivel de glicoformas sialiladas y se han producido en células de mamífero roedor de tipo natural, preferiblemente células CHO de tipo natural. Por definición, en el presente estudio estas células no se han modificado o cultivado en condiciones específicas para alterar la glicosilación. Por ejemplo, estas células no se han modificado para ser deficientes en 1,6-fucosiltransferasa. La presente invención se basa por lo tanto en la producción de dichos anticuerpos anti-CD19 que tienen un perfil de glicosilación interesante y valioso, especialmente un bajo nivel de fucosa y/o un alto nivel de oligomanosa y/o un mayor nivel de glicoformas sialiladas debido las mutaciones en la región Fc.

La presente invención proporciona este anticuerpo anti-CD19 que después de la transfección y expresión en células de mamíferos, especialmente células de roedores, tales como células CHO, incluyendo de tipo natural, tienen un perfil de glicosilación muy interesante y en particular, tienen un perfil de glicosilación interesante y valioso, especialmente un bajo nivel de fucosa y/o un alto nivel de oligomanosa y/o un mayor nivel de glicoformas sialiladas. La presente invención proporciona a la persona experta en la técnica un procedimiento para producir un anticuerpo anti-CD19 en células de mamífero, sin la necesidad de diseñar estas células, por ejemplo para hacer que estas células sean deficientes en 1,6-fucosiltransferasa, o en presencia de agentes que son capaces de tener un impacto en el perfil de glucosilación, por ejemplo, el nivel de fucosa o para utilizar líneas celulares especiales con una función de glicosilación específica.

En una realización, el procedimiento comprende la combinación de una Fc, tal como se describe en el presente documento, con al menos una región variable para dar un anticuerpo anti-CD19.

En una realización, el anticuerpo se produce en células de mamíferos, en particular células de roedores, preferiblemente células CHO, preferiblemente de tipo natural, tales como células CHO DG44 de tipo natural (adquiridas por ATCC).

El procedimiento para producir el anticuerpo anti-CD19 es otro objetivo de la presente invención. Las células de mamíferos, preferiblemente células de roedores, tales como células CHO, preferiblemente células de tipo natural, se transfectan con uno o varios vectores de expresión. Preferiblemente, las células se co-transfectan con un vector de expresión para la cadena ligera y con un vector de expresión para la cadena pesada.

El vector de expresión para la cadena pesada contiene una secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 2, 4 que codifica la región Fc variante de acuerdo con la presente invención.

La transfección de células es también un objetivo de la presente invención. Como transfección que se puede realizar, se pueden mencionar, sin limitación, procedimientos de transfección estándar bien conocidos que la persona experta en la técnica puede llevar a cabo, tales como precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, electroporación, nucleofección (AMAXA Gmbh, GE), transfección mediada por liposomas (utilizando la tecnología de Lipofectin® o lipofectamine® por ejemplo) o microinyección.

El vector de expresión para la cadena pesada contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica la región Fc variante de acuerdo con la reivindicación 1. En una realización, esta secuencia de ácido nucleico también comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de anticuerpo que es específica para, o específicamente reconoce, un antígeno CD19. Preferiblemente, la región variable reconoce un epítopo o determinante de CD19 no internalizante.

Preferiblemente, el vector contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de R005-1 murino parental que reconoce un epítopo o determinante de CD19 no internalizante.

Preferiblemente, el vector contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de R005-2 murino parental que reconoce un epítopo o determinante de CD19 no internalizante.

El vector de expresión comprende una secuencia de ácido nucleico o secuencias de ácidos nucleicos que codifican la región variable que se desea. Diversas realizaciones de regiones variables que pueden expresarse por el vector se presentan a continuación.

En una primera realización, la región variable de VH comprende las CDR de VH CDR1, CDR2, y CDR3 de R005-1. En una realización, la región variable VH comprende R005-1 CDR cuya secuencia se representa en la SEQ ID NO: 16, 6, 13. En otra realización, la región variable VH comprende las CDR de R005-1 cuyas secuencias se representan en las SEQ ID NO: 5, 6, 7. En otra realización, la región variable VH comprende las CDR cuyas secuencias se representan en las SEQ ID NO: 11, 12, 13.

En una segunda realización, la región variable VH comprende las CDR de VH CDR1, CDR2, y CDR3 de R005-2. En una realización, la región variable VH comprende las CDR cuyas secuencias se representan en las SEQ ID NO: 28, 18, 25. En otra realización, la región variable VH comprende las CDR cuyas secuencias se representan en las SEQ ID NO: 17, 18, 19. En otra realización, la región variable VH comprende las CDR cuyas secuencias se representan en las ^s E^q ID NO: 23, 24, 25.

En una realización, la región variable VH (R005-1) tiene la secuencia de aminoácidos como se representa en la SEQ ID NO: 29. En otra realización, el vector comprende una secuencia de ácido nucleico como se representa en la SEQ ID NO: 30.

En otra realización, la región variable VH R005-2 tiene la secuencia de ácido nucleico como se representa en la SEQ ID NO: 33. En otra realización, el vector comprende la secuencia de ácido nucleico como se representa en la SEQ ID NO: 34.

En una realización, el vector comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico que codifica las CDR de acuerdo con las SEQ ID NO: 16, 6, 13, o 5, 6, 7, o 11, 12, 13 y un ácido nucleico que codifica una región Fc que tiene la secuencia de aminoácidos representada en las SEQ ID NO: 1 o 3.

En una realización, el vector comprende una secuencia de ácido nucleico como se representa en la SEQ ID NO: 30 y un ácido nucleico que codifica una región Fc que tiene la secuencia representada en las SEQ ID NO: 1 o 3.

En otra realización, el vector comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos como se representa en la SEQ ID NO: 29 y un ácido nucleico que codifica una región Fc que tiene la secuencia representada en las SEQ ID NO: 1 o 3.

En otra realización, el vector comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende las CDR de acuerdo con las SEQ ID NO: 18, 28, 25, o 17, 18, 19, o 23, 24, 25 y un ácido nucleico que codifica una región Fc que tiene la secuencia representada en las SEQ ID NO: 1 o 3.

En una realización, el vector comprende una secuencia de ácido nucleico como se representa en la SEQ ID NO: 34 y un ácido nucleico que codifica una región Fc que tiene la secuencia representada en las SEQ ID NO: 1 o 3.

En otra realización, el vector comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos como se representa en la SEQ ID NO: 33 y un ácido nucleico que codifica una región Fc que tiene la secuencia representada en las SEQ ID NO: 1 o 3.

El vector de expresión para la cadena ligera contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica una región Kappa o Lambda humana, preferiblemente una región kappa humana, y una región variable de anticuerpo que es específica para, o específicamente reconoce, un antígeno CD19. Preferiblemente, la región variable reconoce un epítopo o determinante de CD19 no internalizante.

El vector de expresión comprende una secuencia de ácido nucleico o secuencias de ácidos nucleicos que codifican la región variable que se desea. Diversas realizaciones de regiones variables que pueden expresarse por el vector se presentan a continuación.

En una primera realización, la región variable VL comprende las CDR de VL CDR1, CDR2, y CDR3 de R005-1. En una realización, la región variable VL comprende las CDR cuyas secuencias se representan en las SEQ ID NO: 8, 9, 10. En otra realización, el anticuerpo comprende las CDR cuyas secuencias se representan en las SEQ ID NO: 14, 15, 10. En una realización, la región variable tiene la secuencia de aminoácidos como se representa en la SEQ ID NO: 31. En otra realización, el vector comprende la secuencia de ácido nucleico como se representa en la SEQ ID NO: 32.

En una segunda realización, la región variable VL comprende las CDR de VL CDR1, CDR2, y CDR3 de R005-2. En una realización, la región variable VL comprende las CDR cuyas secuencias se representan en las SEQ ID NO: 20, 21, 22. En otra realización, el anticuerpo comprende las CDR cuyas secuencias se representan en las SEQ ID NO: 26, 27, 22. En una realización, la región variable tiene la secuencia de aminoácidos como se representa en la SEQ ID NO: 35. En otra realización, el vector comprende la secuencia de ácido nucleico como se representa en la SEQ ID NO: 36.

Los vectores de expresión comprenden estas secuencias de ácido nucleico y secuencias reguladoras que permiten la expresión de las primeras. En una realización, un vector único comprende las secuencias de ácido nucleico y es capaz de codificar VH y VL.

Preferiblemente, la presente invención comprende el uso de un único vector o un conjunto de vectores que comprenden (1) una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de anticuerpo que comprende las CDR de VH como se mencionaron anteriormente y una región Fc variante que comprende una sustitución de aminoácido en cada una de las las posiciones de aminoácidos 243, 292, 300, 305, 326 y 396, opcionalmente 333, y (2) una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de anticuerpo que comprende las CDR de VL como se mencionaron anteriormente y una región kappa humana.

Estos vectores son también objetivos de la presente invención, solos o como un conjunto de vectores.

Estos vectores son también objetivos de la presente invención, solos o como un conjunto de vectores. Como vectores que pueden utilizarse, se pueden mencionar, sin limitación: pcDNA3.3, pOptiVEC, pFUSE, pMCMVHE, pMONO, pSPORT1, pcDV1, pCDNA3, pCDNA1, pRc/CMV, pSEC.

En base a las sustituciones de aminoácidos específicos de acuerdo con la presente invención, la persona experta en la técnica es totalmente capaz de diseñar las secuencias de ácidos nucleicos con las mutaciones de codones que permiten que la secuencia codifique la región Fc variante de acuerdo con la presente invención, teniendo en cuenta la degeneración del código genético.

En una realización, la secuencia de ácido nucleico codifica una región Fc variante en la que Phe243 es sustituido por Leu, Arg292 es sustituido por Pro, Tyr300 es sustituido por Leu, Val305 es sustituido por Leu, Lys326 es sustituido por Ala y Pro396 es sustituido por Leu.

En una realización, la secuencia de ácido nucleico codifica una región Fc variante en la que Phe243 es sustituido por Leu, Arg292 es sustituido por Pro, Tyr300 es sustituido por Leu, Val305 es sustituido por Leu, Lys326 es sustituido por Ala, Glu333 es sustituido por Ala y Pro396 es sustituido por Leu.

En una realización, la secuencia de ácido nucleico comprende las CDR o regiones variables de acuerdo con la presente invención y un ácido nucleico que codifica una región Fc tiene la secuencia representada en la SEQ ID NO: 1 ó 3.

En una realización, la secuencia de ácido nucleico comprende las CDR de VH como se mencionaron anteriormente y un ácido nucleico que codifica una región Fc que tiene la secuencia representada en las SEQ ID NO: 1 o 3.

En una realización, el ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico como se representa en la SEQ ID NO: 30 y un ácido nucleico que codifica una región Fc que tiene la secuencia representada en las SEQ ID NO: 1 o 3. En otra realización, el ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico como se representa en la SEQ ID NO: 34 y un ácido nucleico que codifica una región Fc que tiene la secuencia representada en la SEQ ID NO: 1 o 3. En una realización, el ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico como se representa en la SEQ ID NO: 32 y un ácido nucleico que codifica una región kappa o lambda humana.

En otra realización, el ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico como se representa en la SEQ ID NO: 36 y un ácido nucleico que codifica una región kappa o lambda humano.

Otro objetivo de la presente invención es el uso de estos vectores de expresión o un conjunto de vectores de expresión que contienen la secuencia o secuencias de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención y secuencias reguladoras que permiten la expresión de las regiones VH y VL del anticuerpo anti-CD19 en células de mamíferos, en particular células CHO, preferiblemente del tipo natural.

Otro objetivo de la presente invención es una célula huésped que contiene un vector o un conjunto de vectores de la presente invención. La célula huésped puede ser una célula de mamífero, preferiblemente una célula de roedor, más preferiblemente células CHO. Aún más preferiblemente, la célula huésped puede ser una célula mamífero de tipo natural, preferiblemente una célula de roedor de tipo natural, más preferiblemente una célula CHO de tipo natural. La persona experta en la técnica posee la totalidad de los procedimientos para generar los anticuerpos de acuerdo con la presente invención, utilizando dicho vector o vectores y células, tales como células CHO.

Otro objetivo de la presente invención es una molécula o un polipéptido o un anticuerpo que comprende las CDR derivadas de R005-1 o R005-2 y tienen la propiedad de unirse específicamente al antígeno CD19. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano completo o un conjugado de anticuerpo y fármaco. Puede ser también un fragmento de anticuerpo.

El fragmento de anticuerpo puede ser una molécula que comprende o que consiste esencialmente en una o dos regiones VH y VL, en las que VH comprende las Cd R de SEQ ID NO: 16, 6, 13, o 5, 6, 7, o 11, 12, 13 y la VL comprende las CDR de SEQ ID NO: 8, 9, 10, o 14, 15, 10. Esta molécula o anticuerpo puede usarse para el reconocimiento del antígeno CD19 en el tratamiento de la enfermedad. El resto de la descripción se aplica totalmente a estas moléculas y anticuerpos, para su uso en terapia.

El fragmento de anticuerpo puede ser una molécula que comprende o que consiste esencialmente en una o dos regiones VH y VL, en el que la VH comprende las CDR de S^eQ ID NO: 28, 18, 25, o 17, 18, 19 o 23, 24, 25 y la VL comprende las CDR de SEQ ID NO: 20, 21, 22, o 26, 27, 22. Esta molécula o anticuerpo puede usarse para reconocer el antígeno CD19 en el tratamiento de la enfermedad. El resto de la descripción se aplica totalmente a estas moléculas y anticuerpos, para su uso en terapia.

Otro objetivo de la presente invención es por tanto una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que contiene uno, dos, preferiblemente todas las CDRs de acuerdo con las SEQ ID NO: 16, 6, 13, o 5, 6, 7, o 11, 12, 13. En una realización de la secuencia o vector, la región variable VH o VL comprende la secuencia de ácido nucleico como se representa en las SEQ ID NO: 30 o 32 o una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos como se representa en las SEQ ID NO: 29 o 31.

En una realización, la secuencia de ácido nucleico para la VH también codifica una región Fc, en particular, una región Fc mutada según la presente invención en la SEQ ID NO: 1 o 3.

Otro objetivo de la presente invención es por tanto una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que contiene una, dos, preferiblemente todas las CDRs de acuerdo con las SEQ ID NO: 28, 18, 25, o 17, 18, 19, o 23, 24, 25.

En una realización de la secuencia o el vector, la región variable VH o VL comprende la secuencia de ácido nucleico como se representa en las SEQ ID NO: 34 o 36 o una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos como se representa en las SEQ ID NO: 33 o 35.

En una realización, esta secuencia de ácido nucleico también codifica una región Kappa, en particular una región kappa humana.

Otro objetivo de la presente invención es un vector de expresión que contiene dicha secuencia de ácido nucleico y secuencias reguladoras para permitir la expresión del polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico. Aún otro objetivo es una célula huésped transfectada con dicho vector.

Otro objetivo de la presente invención es una composición que contiene un anticuerpo anti-CD19 de acuerdo con la presente invención y un vehículo.

En una realización, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo anti-CD19 de acuerdo con la presente invención y un vehículo o excipiente fisiológicamente aceptables.

En una realización, dicha composición comprende al menos otro anticuerpo. Este anticuerpo complementario u otro anticuerpo pueden ser un anticuerpo anti-CD19 o un anticuerpo dirigido contra otro antígeno tumoral. Este otro antígeno tumoral puede ser CD20, CD52, CD22, receptor de EGF, receptor de VEGF, miméticos de gangliósidos, GD3, CEA, HER-2.

En una realización la composición comprende un anticuerpo anti-CD20.

En una realización la composición comprende un anticuerpo anti-CD52.

Este otro antígeno tumoral puede ser en particular un anticuerpo monoclonal murino, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano completo.

En una realización particular, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo anti-CD19 de acuerdo con la presente invención y un anticuerpo anti-CD20. Entre los anticuerpos anti-CD20, se pueden mencionar, en particular, rituximab.

Otro objetivo de la presente invención es dicha composición farmacéutica que comprende al menos dos anticuerpos, incluyendo un anticuerpo anti-CD19 de acuerdo con la presente invención, y un vehículo o excipiente fisiológicamente aceptable, para una administración simultánea, separada o retardada. En este caso cada uno de los principios activos se condiciona por separado en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Otro objetivo de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-CD19 de acuerdo con la presente invención, como un medicamento anti-tumoral.

Aún otro objetivo de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-CD19 de acuerdo con la presente invención y al menos otro anticuerpo dirigido contra otro antígeno tumoral, tal como CD20, como un medicamento anti-tumoral.

Aún otro objetivo de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-CD19 de acuerdo con la presente invención y al menos un fármaco de quimioterapia. Este fármaco puede ser endoxan, ciclofosfamida, doxorubicina, alcaloides vinca, esteroides, platinos (Cisplatino, carboplatino, oxaliplatino), aracitina, bleomicina, etopósido, bendamustina... En una realización, el fármaco adicional es la doxorrubicina.

En una realización, la composición comprende ambos principios activos en la misma composición, con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Otro objetivo de la presente invención es dicha composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-CD19 de acuerdo con la presente invención y un fármaco adicional, y un vehículo o excipiente fisiológicamente aceptable, para una administración simultánea, separada o retardada. En este caso cada uno de los principios activos se condiciona por separado en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En una realización, estas composiciones son para usar en el tratamiento de linfomas de células B. En una realización, estas composiciones son para usar en el tratamiento del linfoma no Hodgkiniano de células B (NHL), leucemia linfocítica crónica de células B (B-CLL), y leucemia de células pilosas y leucemia linfocítica aguda de células B (B-ALL).

La descripción describe un procedimiento para el tratamiento de un paciente en necesidad del mismo, que comprende administrar un anticuerpo o una composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención. El procedimiento tiene por objetivo el tratamiento o la prevención del cáncer o una inflamación o una enfermedad autoinmune.

En algunas realizaciones, los anticuerpos de la presente invención se pueden administrar en combinación con una cantidad terapéuticamente o profilácticamente eficaz de uno o más agentes contra el cáncer, anticuerpos terapéuticos u otros agentes conocidos por los expertos en la técnica para el tratamiento y/o prevención del cáncer, inflamación y/o enfermedades autoinmunes.

En una realización, el procedimiento tiene como objetivo tratar o prevenir trastornos de células B, tales como, pero no limitado a, neoplasias malignas de células B. Las neoplasias malignas de células B incluyen NHL, B-CLL, leucemia de células pilosas y B-ALL.

En una realización, el procedimiento se aplica a pacientes refractarios o recidivadow tratados con anticuerpo anti-CD20.

En una realización, el procedimiento tiene como objetivo tratar o prevenir una enfermedad autoinmune, tal como esclerosis múltiple, artritis reumatoide y lupus eritematoso sistémico.

En una realización, el procedimiento se aplica a pacientes refractarios o recidivados tratados con anticuerpo anti-CD20.

En una realización, el procedimiento tiene como objetivo tratar o prevenir enfermedades de injerto contra huésped (GVHD), rechazo humoral, o trastorno linfoproliferativo post-trasplante en los receptores de trasplantes humanos. En una realización, el procedimiento se aplica a pacientes refractarios o recidivados tratados con anticuerpo anti-CD20. En una realización, el procedimiento comprende la administración al paciente de un anticuerpo anti-CD19 de acuerdo con la presente invención y un anticuerpo dirigido contra otro antígeno tumoral. Este otro antígeno tumoral puede ser CD20, CD52, CD22, receptor de EGF, receptor de VEGF, miméticos de gangliósidos GD3, CEA, HER-2. Este otro antígeno tumoral puede ser en particular un anticuerpo monoclonal murino, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano completo, un anticuerpo conjugado a fármaco. En una realización la composición comprende un anticuerpo anti-CD20. En otra realización la composición comprende un anticuerpo anti-CD52.

En otra realización, el procedimiento comprende la administración al paciente de un anticuerpo anti-CD19 de acuerdo con la presente invención, en el que el paciente es, ha sido o va a ser tratado con un fármaco de quimioterapia. Este fármaco puede ser, por ejemplo endoxan, ciclofosfamida, doxorubicina, alcaloides vinca, esteroides, platinos (Cisplatino, carboplatino, oxaliplatino), aracitina, bleomicina, etopósido, bendamustina.... En una realización, el fármaco adicional es la doxorrubicina. Preferiblemente, el paciente es tratado con el anticuerpo de acuerdo con la presente invención y el fármaco adicional. El anticuerpo y el fármaco se pueden administrar en la misma composición o en composiciones separadas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1: mapeo de epítopos de CD19. Se utilizó un lisado celular como fuente de antígeno CD19 probando diferentes combinaciones de MAbs utilizadas como MAb trazadores (MAb biotinilado) o como MAb captadores (MAb purificado), respectivamente.

Figura 2: Mayor nivel de apoptosis con el MAb murino anti-CD19 R005-1 en línea celular de linfoma de Burkitt. La línea celular de linfoma de Burkitt Raji se incubó con una concentración diferente de MAb durante 5 horas. Las células B fueron doble teñidas con anexina V-FITC y yoduro de propidio (PI), y se analizaron por citometría de flujo. Se muestra la media /- SD de dos experimentos independientes.

Figura 3: El MAb murino R005-1 es uno de los mejores inductores de la apoptosis en células primarias de B-CLL. Se aislaron células primarias B-CLL después de la centrifugación de Ficoll. 4x106 células se incubaron con MAbs de interés y los controles durante 24 horas a 37°C en medio completo. A continuación, se recogieron las células y se tiñeron con anexina-V FITC/yoduro de propidio. Se adquirieron 20.000 células en el citómetro LSRII (BD Bioscience, EE.UU.) y se realizó el análisis en software FlowJo. Las células apoptóticas se definieron como células anexina V+/PI\ Los datos representan la media /- SD de cinco experimentos independientes.

Figura 4: Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de los MAb murino R005-1 y R005-2, (A): V ^h(B): VL. Los aminoácidos se muestran como códigos de una letra.

Figura 5: Tinción comparativa entre R005-1 Fc0 quimérico nativo y MAb mR005-1 murino parental en las células PBMNC. Las líneas grises designaban histogramas citofluorométricos de IgG1 murino de isotipo negativo o MAb de control de IgG1 humana y las líneas negras mostraron histogramas citofluorométricos obtenidos de linfocitos de sangre periférica o monocitos a 5 mg/ml para 1.106 células/ml. Experimentos representativos de tres experimentos independientes.

Figura 6: Experimento de bloqueo cruzado entre R005-1 Fc0 quimérico nativo y MAb mR005-1 murino parental. Las células se pretrataron o no con el chR005-1 Fc0 nativo o con MAb de control hlgG1 (5 mg/ml) antes de la tinción con 10 ml/pocillo de mR005-1 conjugado a FITC en células de linfoma de Raji Burkitt. Las líneas grises designaban histogramas citofluorométricos de MAb de control de IgG1 de ratón de isotipo negativo y las líneas negras mostraron histogramas citofluorométricos obtenidos el mR005-1 conjugado a FITC. Los datos representan un experimento representativo de tres experimentos independientes.

Figura 7 : El marcado de células con MAb mR005-1 parental o chR005-1 Fc0 provocó una modulación a la baja del nivel de expresión de CD19. Se incubaron células B-CLL con MAbs biotinilados a 4°C durante 30 min. A T0, T3h y T24h, las células se tiñeron con estreptavidina-Alexa 488 nm (dilución final 1/1000) 30 min a 4°C y se fijaron en formaldehído al 1%. Se adquirieron 20.000 células en el citómetro LSRII (BD Bioscience, EE.UU.) y se realizó el análisis FlowJo. Los datos representan un experimento representativo de nueve experimentos independientes.

Figura 8: El MAb chR005-1 Fc0 muestra una actividad ADCC modesta en células de linfoma de Burkitt. Se incubaron células Raji cargadas con calceína-AM (1x105 células/ml) con MAb de interés durante 20 min a 4°C. Se añadieron células efectoras (PBMNC) en la relación E/T de 50:1 durante 4 horas a 37°C bajo condiciones de agitación. Después de la centrifugación, se recogieron los sobrenadantes y se midió la fluorescencia calceína-AM en un fluorómetro. El nivel de lisis de ADCC se calculó según la fórmula: (Liberación experimental - (liberación espontánea de diana efector)/(liberación máxima - liberación espontánea de diana) * 100. El valor de liberación máxima se obtuvo tratando las células diana con Triton X-100. Los datos representan la media /- SD de tres experimentos independientes.

Figura 9: El MAb chR005-1 Fc0 muestra una actividad ADCC modesta en células B-CLL primarias. Se aislaron células B-CLL primarias después de la centrifugación de Ficoll. Se incubaron 1x105 células/ml de células cargadas con calceína-AM con MAbs de interés durante 20 min a 4°C. Se añadieron células efectoras (PBMNC) en la relación E/T de 50:1 durante 4 horas a 37°C bajo condiciones de agitación. Después de la centrifugación, se recogieron los sobrenadantes y se midió la fluorescencia calceína-AM en un fluorómetro. El nivel de lisis de ADCC se calculó según la fórmula: (Liberación experimental -(liberación espontánea de diana efector)/(liberación máxima - liberación espontánea de diana) * 100. El valor de liberación máxima se obtuvo tratando las células diana con Triton X-100. Los datos representan la media /- SD de cinco experimentos independientes.

Figura 10: El chR005-1 Fc0 no desencadenó la actividad CDC en células de linfoma de Burkitt. Se incubaron células Raji (2.106 células/ml) con MAbs de interés durante 20 min a 4°C. A continuación, se añadieron 5 ml de complemento humano natural durante 4 horas a 37°C bajo condiciones de agitación. Después de la incubación, se recogieron los sobrenadantes y se midió la lactato deshidrogenasa (LDH) en un fluorómetro. El nivel de lisis de ADCC se calculó según la fórmula: (Liberación experimental -(liberación espontánea de diana)/(liberación máxima - liberación espontánea de diana) * 100, donde la diana sin comlemento natural representaba la liberación espontánea. El valor de liberación máxima se obtuvo tratando las células diana con Triton X-100. Los datos representan la media /- SD de tres experimentos independientes.

Figura 11: Las secuencias de aminoácidos y de ácido nucleico de MAb variante de Fc24 quimérico (SEQ ID NO: 3 y 4) o Fc34 (SEQ ID NO: 1 y 2). Los aminoácidos se muestran como códigos de una letra. Según la literatura, la numeración de aminoácidos de la región Fc se basa en la base de datos de Kabat®, (CH1: aa n° 118 a 215; Bisagra: aa n° 216 a 230; CH2: aa n° 231 a 340; CH3: aa n° 341 a 447).

Las variaciones entre los diferentes Fc usadas en la presente invención con respecto a Fc nativo (Fc0):

Figura 12: Actividad de ADCC aumentada con el MAb Fc24 chR005-1 o Fc34 chR005-1 en células de linfoma de Burkitt en presencia de PBMNC como células efectoras. Se incubaron células Raji cargadas con calceína-AM (1x105 células/ml) con MAb de interés durante 20 min a 4°C. Se añadieron células efectoras (PBMNC) en la relación E/T de 50:1 durante 4 horas a 37°C bajo condiciones de agitación. Después de la centrifugación, se recogieron los sobrenadantes y se midió la fluorescencia calceína-AM en un fluorómetro. El nivel de lisis de ADCC se calculó según la fórmula: (Liberación experimental -(liberación espontánea de diana efector)/(liberación máxima - liberación espontánea de diana) * 100. El valor de liberación máxima se obtuvo tratando las células diana con Triton X-100. Los datos representan la media /- SD de cuatro experimentos independientes.

Figura 13: El Fc24 chR005-1 medió la actividad de ADCC fuerte en células primarias de B-CLL. Se aislaron células B-CLL primarias después de la centrifugación de Ficoll. Se incubaron 1x105 células/ml de células Raji cargadas con calceína-AM con MAbs de interés durante 20 min a 4°C. Se añadieron células efectoras (PBMNC) en la relación E/T de 50:1 durante 4 horas a 37°C bajo condiciones de agitación. Después de la centrifugación, se recogieron los sobrenadantes y se midió la fluorescencia calceína-AM en un fluorómetro. El nivel de lisis de ADCC se calculó según la fórmula: (Liberación experimental -(liberación espontánea de diana efector)/(liberación máxima - liberación espontánea de diana) * 100. El valor de liberación máxima se obtuvo tratando las células diana con Triton X-100. Los datos representan la media /- SD de cinco experimentos independientes.

Figura 14: El MAb Fc24 chR005-1 o Fc34 chR005-1 indujo la actividad CDC MAb en células de linfoma de Burkitt. Se incubaron células Raji (2.106 células/ml) con MAbs de interés durante 20 min a 4°C. A continuación, se añadieron 5 ml de complemento humano natural durante 4 horas a 37°C bajo condiciones de agitación. Después de la incubación, se recogieron los sobrenadantes y se midió la lactato deshidrogenasa (LDH) en un fluorómetro. El nivel de lisis de CDC se calculó según la fórmula: (Liberación experimental - (liberación espontánea)/(liberación máxima - liberación espontánea) * 100, donde la diana sin complemento natural representaba la liberación espontánea. El valor de liberación máxima se obtuvo tratando las células diana con Triton X-100. Los datos representan la media /- SD de tres experimentos independientes.

Figura 15: El Fc24 chR005-2 también indujo la actividad CDC en células de linfoma de Burkitt. Se incubaron células Raji (2.106 células/ml) con MAbs de interés durante 20 min a 4°C. A continuación, se añadieron 5 ml de complemento humano natural durante 4 horas a 37°C bajo condiciones de agitación. Después de la incubación, se recogieron los sobrenadantes y se midió la lactato deshidrogenasa (LDH) en un fluorómetro. El nivel de lisis de CDC se calculó según la fórmula: (Liberación experimental -(liberación espontánea)/(liberación máxima - liberación espontánea) * 100, donde la diana sin complemento natural representaba la liberación espontánea. El valor de liberación máxima se obtuvo tratando las células diana con Triton X-100. Los datos representan la media /- SD de un experimento independiente.

Figura 16: El MAb Fc24 chR005-1 medió en la actividad de CDC fuerte en células primarias de B-CLL. Se incubaron células de B-CLL (2-106 células/ml) con MAbs de interés durante 20 min a 4°C. A continuación, se añadieron 5 ml de complemento humano natural durante 4 horas a 37°C bajo condiciones de agitación. Después de la incubación, se recogieron los sobrenadantes y se midió la lactato deshidrogenasa (LDH) en un fluorómetro. El nivel de lisis de CDC se calculó según la fórmula: (Liberación experimental -(liberación espontánea)/(liberación máxima - liberación espontánea) * 100, donde la diana sin complemento natural representaba la liberación espontánea. El valor de liberación máxima se obtuvo tratando las células diana con Triton X-100. Los datos representan la media /- SD de un experimento independiente.

Figura 17: La unión de C1q humano recombinante en MAb chR005-1 de tipo natural o mutante. La unión de C1q humano recombinante se evaluó mediante un ensayo de unión ELISA. El MAb murino parental mR005-1 se utilizó como control negativo y Rituximab como control positivo. Los datos representan la media /- SD de dos experimentos independientes.

Figura 18: La modificación de Fc24 o Fc34 de chR005-1 anti-CD19 no influyó en PCD en línea celular de linfoma de Burkitt. La línea celular Raji del linfoma de Burkitt se incubó con una concentración diferente de MAb durante 5 horas. Las células B fueron doble teñidas con anexina V-FITC y yoduro de propidio (PI) y se analizaron por citometría de flujo. Los datos representan la media /- SD de dos experimentos independientes.

Figura 19: La modificación de Fc24 o Fc34 de chR005-1 anti-CD19 no influyó en PCD en células primarias de B-CLL. Las células se incubaron con una concentración diferente de MAb durante 5 horas. Las células B fueron doble teñidas con anexina V-FITC y yoduro de propidio (PI) y se analizaron por citometría de flujo. Los datos representan la media /- SD de cuatro experimentos independientes.

Figura 20: El MAb mR005-1 combinado con anti-CD20 quimérico (rituximab) proporciaron sinergia en su efecto apoptótico en células de linfoma de Burkitt. Se incubaron células Daudi (4x104 células) con MAbs de interés en combinación o no, y los controles durante 5 horas a 37°C en medio completo. Las células B fueron doble teñidas con anexina V-FITC y yoduro de propidio (PI) y se analizaron por citometría de flujo. Los datos representan la media /-SD de tres experimentos independientes.

Figura 21: El MAb Fc24 chR005-1 o Fc34 chR005-1 combinados con anti-CD20 quimérico (Rituxan®) proporciaron sinergia en su efecto apoptótico en células de linfoma de Burkitt. Se incubaron células Daudi (4x104 células) con MAbs de interés en combinación o no, y los controles durante 5 horas a 37°C en medio completo. Las células B fueron doble teñidas con anexina V-FITC y yoduro de propidio (PI) y se analizaron por citometría de flujo. Los datos representan la media /- SD de dos experimentos independientes

Figura 22: El mR005-1 parental combinado con anti-CD20 quimérico (Rituximab®) proporciaron sinergia en su efecto apoptótico en células primarias de B-CLL. Se aislaron células primarias B-CLL después de la centrifugación de Ficoll. Se incubaron B-CLL (4x104 células) con MAbs de interés en combinación o no, y los controles durante 24 horas a 37°C en medio completo. Las células B fueron doble teñidas con anexina V-FITC y yoduro de propidio (PI), y se analizaron por citometría de flujo. Los datos representan la media /- SD de siete experimentos independientes.

Figura 23: El Fc24 chR005-1 o Fc34 chR005-1 combinados con anti-CD20 quimérico (Rituxan®) proporciaron sinergia en su efecto apoptótico en células primarias de B-CLL. Se aislaron células primarias B-CLL después de la centrifugación de Ficoll. Se incubaron B-CLL (4x104 células) con MAbs de interés en combinación o no, y los controles durante 24 horas a 37°C en medio completo. Las células B fueron doble teñidas con anexina V-FITC y yoduro de propidio (PI) y se analizaron por citometría de flujo. Los datos representan la media /- SD de cuatro experimentos independientes.

Figura 24: El MAb R005-1 murino desencadenó la apoptosis en células primarias de B-CLL refractarias de Rituxan®. Se aislaron células primarias de B-CLL después de la centrifugación de Ficoll. Se incubaron 4x106 células con MAbs de interés y los controles durante 24 horas a 37°C en medio completo. A continuación, se recogieron las células y se tiñeron con anexina-V FITC/yoduro de propidio. Las células apoptóticas se definieron como células anexina V+/PL. Los datos representan la media /- SD de dos experimentos independientes.

Figura 25: El MAb Fc24 chR005-1 o MAb Fc34 chR005-1 desencadenó la apoptosis en células primarias de B-CLL refractarias de Rituxan®. Se aislaron células primarias de B-CLL después de la centrifugación de Ficoll. Se incubaron B-CLL (4x106) con MAbs de interés en combinación o no, y los controles durante 24 horas a 37°C en medio completo. Las células B fueron doble teñidas con anexina V-FITC y yoduro de propidio (PI) y se analizaron por citometría de flujo. Los datos representan un experimento representativo.

Figura 26: Se observó un nivel similar de ADCC sea cual sea FcgRIIIA alotipos F/F o V/V. La tinción de linfocitos se realizó con el mAb no conjugado 3G8 o MEM-154. Para cada FcgRIIIA - polimorfismo 158 (VV o FF). Los datos representan la media /- SD de dos experimentos independientes.

Figura 27: Características generales del vector de expresión de cadena pesada o ligera de MAb iDD biotech. Las células CHO vacías fueron cotransfectadas con el vector de expresión pcDNA3.3-TOPO para la cadena ligera (Invitrogen) y con el vector de expresión pcDNA3.3 para la cadena pesada (Invitrogen) siguiendo el procedimiento de transfección transitoria establecido en nuestro laboratorio.

Figura 28: Perfil de glicosilación de la MAb Fc0 chR005-1. Se analizaron los oligosacáridos de anticuerpos liberados por digestión con PNGasa F mediante un espectrómetro Voyager DE PRO MALDI-TOF. El valor de m/z corresponde al ión de oligosacárido asociado sodio. La composición de azúcar de cada pico que se muestra está detallada en la Figura 32. La estructura de oligosacárido esquemática de cada pico principal se ilustra en el lado derecho de los gráficos: GlcNAc (círculos con relleno), manosa (cuadrados sin relleno), galactosa (rombos sin relleno) y fucosa (triángulos sin relleno).

Figura 29: Perfil de glicosilación de la MAb Fc24 chR005-1. Se analizaron los oligosacáridos de anticuerpos liberados por digestión con PNGasa F mediante un espectrómetro MS MALDI-TOF Reflex III. El valor de m/z corresponde al ión de oligosacárido asociado sodio. La composición de azúcar de cada pico que se muestra está detallada en la Figura 32. La estructura de oligosacárido esquemática de cada pico principal se ilustra en el lado derecho de los gráficos: GlcNAc (círculos con relleno), manosa (cuadrados sin relleno), galactosa (rombos sin relleno) y fucosa (triángulos sin relleno).

Figura 30: Perfil de glicosilación de la MAb Fc24 chR005-1. Se analizaron los oligosacáridos de anticuerpos liberados por digestión con PNGasa F mediante un espectrómetro MS MALDI-TOF Reflex III. El valor de m/z corresponde al ión de oligosacárido asociado sodio. La composición de azúcar de cada pico que se muestra está detallada en la Figura 32. La estructura de oligosacárido esquemática de cada pico principal se ilustra en el lado derecho de los gráficos: GlcNAc (círculos con relleno), manosa (cuadrados sin relleno), galactosa (rombos sin relleno) y fucosa (triángulos sin relleno).

Figura 31: Asignación de estructuras de carbohidratos por comparación con patrones de glicano después de electroforesis capilar con intensidades relativas de la detección de fluorescencia inducida por láser de los tipos de N-glicano entre el Fc0 chR005-1 parental y los MAb Fc24 o Fc34 chR005-1 optimizados expresados en células CHO de tipo natural.

Figura 32: Análisis de oligosacáridos de variantes de MAb anti-CD19. La comparación de las intensidades relativas de los tipos de N-glicano entre el Fc0 chR005-1 parental y los MAb Fc24 o Fc34 chR005-1 optimizados expresados en células CHO de tipo natural.

Figura 33: Perfiles de glicano según variantes de Fc. Los glicanos unidos a N de IgG de anticuerpos variantes de Fc chR005-1 se produjeron a partir de células CHO Easy C de tipo natural. La masa molecular son glicanos permetilados, detectados como [M Na]+ por espectrometría de masas Maldi (AB). El panel de MAb fue producido a partir de células CHO Easy C. Se observaron diferentes perfiles de glicosilación entre el panel de anticuerpos variantes de Fc. Un experimento representativo.

Figura 34: Actividad de MAb diferencial según variante de Fc.

A- Se incubaron células Raji (1x10⁵ células/ml) cargadas con calceína-AM con MAbs de interés durante 20 min a 4°C. Se añadieron células efectoras (PBMNC) en la relación E/T de 50:1 durante 4 horas a 37°C bajo condiciones de agitación. Después de la centrifugación, se recogieron los sobrenadantes y se midió la fluorescencia calceína-AM en un fluorómetro. El nivel de lisis de ADCC se calculó según la fórmula: (Liberación experimental - (liberación espontánea de diana efector)/(liberación máxima - liberación espontánea de diana) * 100. El valor de liberación máxima se obtuvo tratando las células diana con Triton X-100. Los datos representan la media /- SD de cinco experimentos independientes.

B- Se incubaron células Raji (2-10⁶ células/ml) con MAbs de interés durante 20 min a 4°C. A continuación, se añadieron 5 pl de complemento humano natural durante 4 horas a 37°C bajo condiciones de agitación. Después de la incubación, se recogieron los sobrenadantes y se midió la lactato deshidrogenasa (LDH) en un fluorómetro. El nivel de lisis de CDC se calculó según la fórmula: (Liberación experimental - (liberación espontánea de diana)/(liberación máxima - liberación espontánea de diana) * 100, donde la diana sin complemento natural representaba la liberación espontánea. El valor de liberación máxima se obtuvo tratando las células diana con Triton X-100. Los datos representan la media /- SD de tres experimentos independientes.

Figura 35: Actividad de MAb diferencial según variante de Fc.

A- Se incubaron células Raji (1x10⁵ células/ml) cargadas con calceína-AM con MAbs de interés durante 20 min a 4°C. Se añadieron células efectoras (PBMNC) en la relación E/T de 50:1 durante 4 horas a 37°C bajo condiciones de agitación. Después de la centrifugación, se recogieron los sobrenadantes y se midió la fluorescencia calceína-AM en un fluorómetro. El nivel de lisis de ADCC se calculó según la fórmula: (Liberación experimental - (liberación espontánea de diana efector)/(liberación máxima - liberación espontánea de diana) * 100. El valor de liberación máxima se obtuvo tratando las células diana con Triton X-100. Los datos representan la media /- SD de tres experimentos independientes.

B- Se incubaron células Raji (1x10⁵ células/ml) cargadas con calceína-AM con MAbs de interés durante 20 min a 4°C. Se añadieron 50 pl por pocillo de células efectoras de sangre entera durante 4 horas a 37°C bajo condiciones de agitación. Después de la centrifugación, se recogieron los sobrenadantes y se midió la fluorescencia calceína-AM en un fluorómetro. El nivel de lisis de ADCC se calculó según la fórmula: (Liberación experimental - (liberación espontánea de diana efector)/(liberación máxima - liberación espontánea de diana) * 100. El valor de liberación máxima se obtuvo tratando las células diana con Triton X-100. Un experimento representativo.

Figura 36: Actividad de MAb diferencial según variante de Fc. Se incubaron células Raji (1x10⁵ células/ml) cargadas con calceína-AM con MAbs de interés durante 20 min a 4°C. Se añadieron 50 pl por pocillo de células efectoras de sangre entera durante 4 horas a 37°C bajo condiciones de agitación. Después de la centrifugación, se recogieron los sobrenadantes y se midió la fluorescencia calceína-AM en un fluorómetro. El nivel de lisis de ADCC se calculó según la fórmula: (Liberación experimental -(liberación espontánea de diana efector)/(liberación máxima - liberación espontánea de diana) * 100. El valor de liberación máxima se obtuvo tratando las células diana con Triton X-100. Un experimento representativo.

Figura 37: Inhibición del crecimiento tumoral in vivo por el MAb Fc24 chR005-1 o MAB Fc34 chR005-1. Los ratones inyectados con células Raji por vía subcutánea fueron tratados mediante infusión intravenosa de MAb vez a la semana a partir del día 21 a 100 mg/kg con o sin leucocitos. Los tumores se midieron dos veces por semana.

Figura 38: Unión de suero humano con complemento en el MAb chR005-1 de tipo natural o mutante. La unión de suero con complemento humano a MAbs se evaluó mediante un ensayo de unión ELISA. Se recubrieron placas de 96 pocillos (Nunc) durante la noche a 4°C con concentraciones variables de MAb. Después del lavado, las placas se bloquearon con PBS - 5% de BSA durante 1 h, y se incubaron durante 1 hora con 2,5 pl de complemento humano natural (Sigma). A continuación, se añadieron 100 pl de una dilución 1/500 de Ab conjugado a peroxidasa con C1q anti-humano de oveja (Abd Serotec) y se incubaron durante 1 h. Las placas se revelaron con 100 pl por pocillo de sustrato TMB (Uptima Interchim). Después de la adición de H2SO4, el DO se midió a 450 nm/630 nm usando un lector de microplacas MRX II. Los datos representan la media /- SD de dos experimentos independientes.

Figura 39: El crecimiento de tumor establecido RL refractario de Rituxan se inhibió con el MAb chR005-1 optimizado con Fc24. Los ratones inyectados con células RL refractarias de Rituxan por vía subcutánea fueron tratados mediante infusión intravenosa de MAb vez a la semana a partir del día 20 a 100 mg/kg.

Figura 40: La combinación del MAb chR005-1 optimizado con Fc24 y el fármaco doxorubicina aumentó el nivel de inhibición del crecimiento de tumor establecido por Raji. Los ratones portadores de tumores de linfoma de Burkitt Sc establecido se trataron semanalmente. El grupo de control recibió vehículo (NaCI 0,9%) mientras que los grupos tratados recibieron uno de los siguientes: MAb Fc24 chR005-1 100 mg/kg, doxorrubicina 2 mg/kg, MAb Fc24 chR005-1 doxorubicina.

MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS

Células: La línea celular CHO dhfr -/- se obtuvo la línea celular para fines de investigación de la ATCC (American Type Culture Collection, EE.UU.). Las líneas celulares de Raji o Daudi de linfoma de Burkitt como las células Cem del linfoma T se obtuvieron de ECACC (Europena Collection of Cell Culture, Reino Unido). Las PBMNC humanas se purificaron de leucoféresis de donantes voluntarios sanos anónimos (Blood Center, Lyon Francia) utilizando el gradiente de densidad de Ficoll-Histopaque (Sigma, Saint Quentin Fallavier, Francia). Todos los pacientes con B-CLL incluidos en este estudio se han definido inmunofenotípicamente tal como se indica por los criterios del National Cancer Institute Working Group en 1996 (Hallek et al., 2008). Se obtuvo sangre de los pacientes después de consentimiento informado por escrito de conformidad con la Declaración de Helsinki.

Reactivos y anticuerpos: El control negativo quimérico IgG1 fue producido en iDD Biotech (Dardilly, Francia). Los MAb mR005-1 o mR005-2 murisno parentales se aislaron de la biblioteca de hibridoma de iDD biotech. El Fc0 chR005-1 de tipo natural (también llamado IgG1 nativa) y todos los anticuerpos modificados se generaron y produjeron por iDD biotech (Dardilly, Francia). La anexina-V marcada con FITC y yoduro de propidio (PI) se adquirieron de BD Biosciences (Pont de Claix, Francia) y Sigma (Saint Quentin Fallavier, Francia), respectivamente. El anticuerpode IgG RPE anti-humano con Fab'2 de cabra y el anticuerpo de Ig con FITC anti-ratón de cabra se adquirieron respectivamente por Sigma (Saint Quentin Fallavier, Francia) y MP Biomedical (Illkirch, Francia). El rituximab fue producido por Genentech y se adquirió comercialmente. Otros MAbs anti-CD19 4G7 (IgG1), BU12 (IgG1), HD37 (IgG1), B4 (IgG1) fueron adquiridos por Santa Cruz Biotechnology (California, EE.UU.), Abd Serotec (Düsselldorf, Alemania), Santa Cruz Biotechnology (California, EE.UU.), BioGenex (San Ramón, EE.UU.), respectivamente. La camptotecina utilizada como control positivo para ensayos de apoptosis fue adquirido por Sigma (Saint Quentin Fallavier, Francia).

Generación de anticuerpos murinos: Los ratones Balb/c fueron inmunizados con células que expresaban CD19, tales como células de leucemia linfoide crónica humana. Los MAb murinos se generaron usando técnicas de hibridoma estándar (Zola et al., 1987) y se cribaron inicialmente por su capacidad de unirse mediante citometría de flujo solo a la línea de células CD19 positivas. Los MAb purificados se produjeron después de la purificación ascítica y después purificados mediante el uso de proteína-A Sepharose (Pharmacia, Uppsala, Suecia).

La conversión de MAb murino a MAb quimérico nativo: El ADNc correspondiente a la región variable del hibridoma se obtuvo utilizando dos estrategias, la primera estrategia consiste en la utilización en la PCR de un grupo de cebadores generados relacionados con aminoácido N-terminal degenerados a partir de la secuenciación N-terminal y la segunda estrategia consiste en la utilización en la PCR de un conjunto de cebadores degenerados generados por la base de datos de cebadores IMGT® y cebadores específicos descritos previamente (Essono et al, 2003; Wang et al, 2000). La secuencia de la región variable N-terminal se determinó mediante degradación de Edman. La extracción de ARN total se llevó a cabo usando el kit de reactivo Tri de acuerdo con el protocolo descrito por el proveedor Sigma. Los fragmentos VL y VH amplificados se clonaron en el vector de clonación TOPO-TA (Invitrogen) para análisis de secuencias mediante el procedimiento de didesoxiterminación (Sanger et al., 1977). A continuación, se amplificaron construcciones de variantes de anticuerpos por PCR y se clonaron en el vector pcDNA3.3.

Construcción de variantes de anticuerpos: Las sustituciones en el dominio Fc se introdujeron usando el procedimiento "megacebador" de mutagénesis dirigida al sitio (Sarkar et al., 1990). Las posiciones se numeran de acuerdo con el índice de Kabat® (secuencias de aminoácidos de la región V Idéntica y segmentos de secuencias en anticuerpos de diferentes especificidades). Se analizaron las contribuciones relativas de los genes VH y VL, minigenes, y regiones determinantes de complementariedad para la unión de sitios de combinación a anticuerpo (Kabat et al., 1991). Las construcciones de cadena pesada y ligera se cotransfectaron en CHO DG44 (ATCC) adecuadas para el cribado de MAb. Los anticuerpos se purificaron usando cromatografía de afinidad de proteína A (GE Healthcare).

Competición ELISA de MAb CD19: Para los experimentos de ELISA de unión competitiva, se usó un lisado de células como fuente de antígeno CD19 probando diferentes MAbs de combinación como trazadores (MAb biotinilado) o como MAb captador (MAb purificado), respectivamente.

El análisis FACS de la unión de MAb a CD19 humano: La unión a CD19 humano de todos los MAb generados en el presente estudio se midieron con un FACScan (BD Biosciences, Pont de Claix, Francia) utilizando la Ig con FITC ant-ratón de cabra de Sigma (San Quentin Fallavier, Francia) para la detección de MAbs murinos y con la Ig con PE anti-humano de cabra de Sigma (Saint Quentin Fallavier, Francia) para la detección de MAbs quiméricos. Para los experimentos de unión de competición, las células se preincubaron con un exceso de MAb parental o un anticuerpo de control de isotipo IgG1 de ratón.

Microscopía confocal con rastreo láser usando anticuerpos biotinilados: La fluorescencia de las células se ha visualizado usando un microscopio confocal Inverted Zeiss Axiovert 100M LSM 510 Meta después del marcaje de células con MAbs biotinilados.

Análisis de glicosilación: La liberación de N-glicanos y permetilación se llevaron a cabo siguiendo procedimientos estándar (Ciucanu et al., 1984). El análisis de glicosilación de proteínas se determinó por espectrometría de masas (Morelle et al., 2007).

Afinidad del anticuerpo: La determinación de los valores de KD de anticuerpos se realizó tal como se ha descrito anteriormente (Benedict et al., 1997) mediante el uso del ensayo de unión analizado por citometría de flujo para detectar anticuerpo unido a la célula.

Evaluación de la apoptosis por citometría de flujo: La apoptosis de las células después de la incubación con anticuerpos se midió mediante la tinción de anexina V/PI seguido de análisis FACS. Se determinaron las células apoptóticas en la puerta que muestra una tinción positiva para anexina V y tinción negativa para yoduro de propidio.

Ensayo citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC): Las células primarias de B-CLL o líneas de células B (Raji) (células diana) se cargaron con colorante calceína-AM 12,5 pM (Sigma, Francia). A continuación, se preincubaron 5.000 células diana por pocillo con diferentes concentraciones de MAb de interés y controles durante 20 min a 4°C. A continuación, se añadieron células efectoras a las células diana en la relación E/T igual a 50:1. Se calculó la lisis de ADCC específica utilizando la fórmula anterior: (liberación experimental - (liberación espontánea de diana efector))/(liberación máxima - liberación espontánea de diana) * 100, donde las células diana y efectoras sin anticuerpo representaban liberación espontánea. El valor de liberación máxima se obtuvo tratando las células diana con Triton X-100.

Ensayo de citotoxicidad celular dependiente de complemento (CDC): Las células diana (50.000 células por pocillo), ya sean células primarias B-CLL o líneas de células B (líneas de células Ramos, Raji y Daudi) se incubaron con varias concentraciones de MAbs. A continuación, se añadió suero humano normal al cultivo y a continuación las células se incubaron 4 horas a 37°C bajo condiciones de agitación. Al final de la incubación, se midió la lactato deshidrogenasa presente en el sobrenadante se midió con el kit de ensayo de LDH (Promega, Francia). La fluorescencia se registró a la longitud de onda de excitación de 590 nm. La lisis de CDC específica se calculó utilizando la fórmula anterior: (liberación experimental - liberación espontánea de diana)/(liberación máxima -liberación espontánea de diana) * 100, donde las células diana y efectoras sin anticuerpo representaban la liberación espontánea. El valor de liberación máxima se obtuvo tratando las células diana con Triton X-100.

Ensayo de unión a complemento: La unión de C1q humano a MAbs se evaluó mediante un ensayo de unión ELISA. Las placas de 96 pocillos (Nunc) se recubrieron durante la noche a 4°C con concentraciones variables de MAb. Después del lavado, las placas se bloquearon con PBS-BSA al 5% durante 1 h y se incubaron durante 1 h con 0.2 pg/ml de C1q humano recombinante (Abd Serotec) o 2,5 pl de complemento humano natural (Sigma). A continuación, se añadieron 100 pl de una dilución 1/500 de Ab conjugado a peroxidasa anti-C1q humano de oveja (Abd Serotec) y se incubaron durante 1 h. Las placas se revelaron con 100 pl por pocillo de sustrato TMB (Uptima Interchim). Después de la adición de H2SO4, se midió la DO a 450 nm/630 nm utilizando un lector de microplacas MRX II.

Detección de polimorfismo VV o FF por citometría de flujo: El polimorfismo FcgRIIIA - 158 V/F se basó en la relación de fluorescencia MEM-154/3G8 tal como se ha descrito (Bottcher et al., 2005). Se incubaron muestras de sangre humana (50 pl) 15 min en la oscuridad a temperatura ambiente con 10 pg/ml de 3G8 no conjugado (Becton Dickinson, EE.UU.), MEM-154 (Abcam, EE.UU.) o con el MAb de control de isotipo. Se añaden 2 ml de un tampón de lisis de glóbulos rojos (BD Biosciences, EE.UU.) diluido a 1/10 durante 5 min. Después de los lavados, se añade Ig con FITC de cabra anti-ratón FITC de Sigma (Saint Quentin Fallavier, Francia) (100 pl diluidos a 1/800). Las células se incubaron otros 30 min a temperatura ambiente, a continuación se lavaron dos veces y se ensayaron usando un FACScan (BD Biosciences, Pont de Claix, Francia).

RESULTADOS

1. Mapeo de epítopos de CD19.

Mediante ELISA de competición, se determinó el mapeo de epítopos de CD19 mediante el uso de un panel de MAb anti-CD19 incluyendo el MAb mR005-1, mR005-2, 4G7, B4, BU12, HD37. Tal como se muestra en la Figura 1, se observó una fuerte competición utilizando como MAbs trazadores/captadores la combinación 4G7/mR005-1 y HD37/mR005-1 revelando que estos anticuerpos reconocían el mismo epítopo o un epítopo adyacente. Por el contrario, no se observó una competición significativa con los MAb mR005-2 o BU12.

2. El MAb mR005-1 murino parental desencadena la apoptosis en la línea celular de linfoma de Burkitt o en células primarias de B-CLL.

El MAb murino mR005-1 fue muy eficaz en la inducción de PCD que el MAb murino mR005-2 en la línea celular de Raji del linfoma de Burkitt (Figura 2). Es tentador sugerir que el efecto apoptótico superior del MAb mR005-1 podría estar relacionado con la especificidad fina de estas moléculas. Nuestros resultados también demostraron que el MAb mR005-1 fue más eficiente para desencadenar PCD que el rituximab.

3. La actividad biológica de Mab murino para desencadenar la apoptosis está vinculada al epítopo en CD19.

Se probó un panel de MAb murino contra CD19 humano para evaluar el potencial apoptótico de diversos clones. Se utilizó la estrategia con anexina-V/PI para determinar el nivel de apoptosis inducido por estos anticuerpos a las 24 horas después de la incubación. Se ha encontrado que mR005-1 es uno de los mejores MAbs como inductor de un proceso de apoptosis en células B-CLL aisladas de pacientes (Figura 3). Se observaron datos similares mediante el uso de la línea celular de linfoma de Burkitt (datos no mostrados). Nuestras observaciones presentadas aquí sugieren que el tratamiento de células tumorales B-CLL con MAb quiméricos derivados relacionados con MAb mR005-1, que son capaces de inducir una señal apoptótica, puede contribuir a su destrucción directa y eliminación.

4. Quimerización del MAb murino R005-1 y del MAb murino R005-2.

En comparación con la base de datos IMGT®, la secuencia de VL mR005-1 y la secuencia de VH de mR005-1 se validaron reconociendo al menos 96% y al menos 92%, respectivamente (Figura 4). También se validaron las secuencias de VL y VH de mR005-2 (99% y 98%, respectivamente). La autenticidad de las secuencias de VH y VL obtenidas por clonación de ADNc también se confirmaron mediante secuenciación de aminoácidos N-terminal del anticuerpo monoclonal de ratón diana. Las cadenas pesadas y ligeras se separaron antes de la secuenciación de aminoácidos mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones reductoras y los primeros 20 amino se secuenciaron por degradación de Edman. A continuación, las secuencias se clonaron en el vector de expresión de cadena ligera (VL de mR005-1 o VL de mR005-2) y en los vectores de expresión de MAb de cadena pesada (VH de mR005-2 o VH de mR005-2) que codifican también una región Fc nativa llamada FC0. La transfección transitoria en células CHO dhfrA se realizó mediante lipofección.

5. La autenticidad y la selección de las cadenas VH y VL de chR005-1 confirmados por análisis de citometría de flujo.

El MAb chR005-1 nativo quimérico Fc0 construido a partir de las secuencias VH1 y VL1 se comparó directamente con el MAb mR005-1 murino parental para la tinción y especificidad. Tal como se muestra en la Figura 5, se observó una tinción comparable en linfocitos de sangre periférica. La competición de unión celular entre el mR005-1 parental murino y el chR005-1 nativo FCc0 también se mostró en la Figura 6. El chR005-1 Fc0 bloqueó completamente la unión del MAb mR005-1 parental murino.

6. La inducción de la internalización de CD19 tras la unión de MAb no es un efecto general y podría estar relacionado con los diferentes MAb anti-CD19 usados.

Mediante una tinción indirecta en citometría de flujo, se determinó la presencia o no del anticuerpo desnudo en la superficie de células B-CLL después de la incubación a 4°C o a 37°C (Figura 7). Se observó un cambio significativo de la intensidad de fluorescencia en promedio geométrico con rituximab a 37°C durante un período de tiempo prolongado más allá de 3 o 24 horas. Un efecto similar se observó con el MAb mR005-1 murino parental, aunque se observó una modulación inferior de la intensidad de fluorescencia en promedio geométrico con el MAb quimérico chR005-1 Fc0 de tipo natural.

7. Caracterización de la actividad de citotoxicidad de chR005-1 Fc0 nativo.

En muchas aplicaciones, los anticuerpos quiméricos han demostrado una función efectora mejorada en la lisis de células tumorales mediada por complemento y en ensayos de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos en comparación con el anticuerpo monoclonal murino parental (Liu et al, 1987; Nishimura et al, 1987; Hamada et al., 1990). El mAb quimérico chR005-1 Fc0 nativo indujo una ADCC modesta contra la línea celular de linfoma de Burkitt (Figura 8) o en contra de células B-CLL ex vivo de pacientes (Figura 9). En un ensayo de citotoxicidad dependiente de complemento estándar, sólo rituximab utiltizado como control positivo destruyó las células Raji, mientras que el chR005-1 Fc0 no pudo desencadenar la citotoxicidad de las células (Figura 10).

8. Generación de variantes para el dominio C^h2 de IgG1 humana.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "cadena pesada" se utiliza para definir la cadena pesada de un anticuerpo IgG. En una IgG intacta, nativa, la cadena pesada comprende los dominios de inmunoglobulina VH, CH1, bisagra, CH2 y CH3. A lo largo de la presente memoria, la numeración de los residuos en una cadena pesada de IgG es la del índice EU (Kabat et al, 1991), que se incorpora expresamente aquí por referencias. El "índice EU como en Kabat" se refiere a la numeración del anticuerpo IgGI hmano en EU.

Hemos construido varias variantes incluyendo una, dos, tres, cuatro o cinco variantes de sustitución para mejorar la capacidad para mediar la función efectora, (Figura 11).

Fc34LPLLAL F243L/R292P/Y300L/V305L/K326A/P396L

Fc24 LPLLAAL F243L/R292P/Y300L/V305L/K326A/E333A/P396L

9. La variante Fc24 o Fc34 de chR005-1 desencadena de manera eficiente ADCC.

La actividad MAb para mediar ADCC del panel de variante de MAb se midió utilizando células diana Raji en primer lugar en ensayos basados en sangre entera (Figura 12). La potencia y eficacia de los MAb Fc24 o Fc34 de chR005-1 fue notablemente superior en comparación con chR005-1 FC0 parental.

La actividad de Fc24 chR005-1 también se evaluó mediante el uso de células B-CLL ex vivo de pacientes (Figura 13). De manera similar a las observaciones con ADCC en la línea celular Raji, la potencia y eficacia del MAb chR005-1 Fc20 fue notablemente superior en comparación con chR005-1 Fc0 parental.

10. Investigación en el panel de variantes de MAb a CDC utilizando linfoma de células B.

Tal como se muestra en la Figura 14, los seis mutantes Fc34 (F243L/R292P/Y300L/V305L/K326A/P396L) o los siete mutantes Fc24 (F243L/R292P/Y300L/V305L/K326A/E333A/P396L) generados a partir del chR005-1 Fc0 de tipo natural indujeron CDC utilizando la línea celular Raji.

Tal como se muestra en la Figura 15, los cinco mutantes Fc24 (F243L/R292P/Y300L/V305L/K326A/E333A/P396L) generados a partir del chR005-2 Fc0 de tipo natural también indujeron CDC utilizando la línea celular Raji.

Los seis mutantes Fc34 (F243L/R292P/Y300L/V305L/K326A/P396L) o los cinco mutantes Fc24 (F243L/R292P/Y300L/V305L/K326A/E333A/P396L) generados a partir del chR005-1 Fc0 de tipo natural también indujeron CDC cuando reconocieron B-CLL ex vivo (Figura 16).

11. Las variantes Fc24 o Fc34 de chR005-1 se unieron al complemento con una mayor eficiencia para la chR005-1 Fc34.

El complemento humano o el complemento natural presente en el suero (Figura 17) se unió a las variantes chR005-1 Fc24 o chR005-1 Fc34 lo que revela una mayor eficacia con la variante chR005-1 Fc34.

12. Variantes del MAb desencadenaron un nivel similar de apoptosis celular.

La actividad biológica sobre la muerte celular programada de MAb chR005-1 Fc24 o chR005-1 Fc34 fue probada en la línea celular positiva de CD19 Raji (Figura 18) o en B-CLL ex vivo (Figura 19). La modificación de MAb Fc no influyó en CD19 para desencadenar la apoptosis.

13. Los anticuerpos monoclonales pueden usarse en combinación.

La actividad MAb para mediar PCD solo o en combinación se comparó utilizando células diana Daudi. Se observó un nivel más alto de células apoptóticas en presencia de mR005-1 parental murino (Figura 20) o con la variante Fc24 o Fc34 de MAb chR005-1 (Figura 21), en combinación con rituximab demostró la viabilidad y el beneficio de la combinación de MAb.

La actividad de MAb para mediar PCD solo o en combinación se comparó usando en B-CLL ex vivo. Se observó un nivel más alto de células apoptóticas en presencia de mR005-1 parental murino (Figura 22) o con la variante Fc24 o Fc34 de MAb chR005-1 (Figura 23), en combinación con rituximab demostró la viabilidad y el beneficio de la combinación de MAb.

14. El MAb dirigido contra CD19 puede ser utilizado en pacientes con una enfermedad recurrente y refractariade rituximab.

Se trataron in vitro muestras de B-CLL ex vivo de pacientes con enfermedad recurrente y refractaria después del tratamiento con rituximab con el mR005-1 parental murino (Figura 24) o con MAb chR005-1 Fc24 o chR005-1 Fc34 (Figura 25). El mayor nivel de apoptosis observado con MAbs contra CD19 en comparación con rituximab demostró la viabilidad y la eficacia de utilizar MAbs dirigidos a otro antígeno distinto de CD20.

15. Ninguna influencia del polimorfismo Fc.

Se observó un nivel similar de ADCC sea cual sea FcgRIIIA alotipos F/F o V/V. La tinción de linfocitos se realizó con el mAb no conjugado 3G8 o MEM-154 (Figura 26).

16. Expresión de MAb.

Las células CHO dhfr -/-(adquiridas por la colección ATCC) fueron co-transfectadas con el vector de expresión pcDNA3.3 para la cadena ligera y con el vector de expresión pcDNA3.3 para la cadena pesada siguiendo el procedimiento de transfección transitoria establecido en nuestro laboratorio. Las características generales de este vector de expresión de MAb se muestran en la Figura 27. Las células CHO vacías fueron co-transfectadas con el vector de expresión pcDNA3.3- para la cadena ligera (Invitrogen) y con el vector de expresión pcDNA3.3 para la cadena pesada (Invitrogen) siguiendo el procedimiento de transfección transitoria establecida en nuestro laboratorio. Las características generales de este vector de expresión de MAb de investigación se muestran en la Figura 27. Al utilizar el vector pcDNA3.3, la expresión de estas cadenas de anticuerpos quiméricos en células de mamíferos fue controlada por promotor temprano inmediato/potenciador de CMV humano de longitud completa. La secreción de cadenas H y L fue permitida por la secuencia líder de IgH humana respectiva. Y en la región 3', una cola de PoliA de timidina quinasa del virus del Herpes Simplex permite la inducción y estabilización eficiente del ARNm. Las regiones codificantes de cadenas ligera y pesada de MAb anti-CD19 se introducen en el vector de expresión pcDNA3.3-TOPO en el sitio de clonación TOPO. Los transformantes se analizan para la orientación correcta y el marco de lectura, el vector de expresión puede ser transfectado en la línea celular CHO

17. Generación de MAb anti-CD19 chR005-1 poco fucosilados.

El núcleo de azúcar que se encuentra en la región Fc de IgG es un complejo biantenario [Asn297-GN-GN-M-(M-GN)2] donde GN es N-acetilglucosamina y M es manosa. Los oligosacáridos pueden contener cero (GO), una (G1) o dos (G2) galactosas (G). Las variaciones de los patrones de glicosilación de IgG pueden incluir fucosilación del núcleo (F). Tal como se muestra en la Figura 28 y 31, los tres picos principales en la muestra de chR005-1 F0 corresponden a masas de oligosacáridos fucosilados con (GlcNAc)2 (Fuc)1 (Man)3 (GlcNAc)2 (m/z 1836), (Gal)1 (GlcNAc)2 (Fuc)1 (Man)3 (GlcNAc)2 (m/z 2040) y (Gal)2 (GlcNAc)2 (Fuc)1 (Man)3 (GlcNAc)2 (m/z 2245). Por el contrario, tal como se muestra en la Figura 29-30, los dos picos G0F y G1F estaban presentes a niveles mucho menores en el anticuerpo chR005-1 Fc24 o chR005-1 Fc34 (7,2% o 5,2% y el 16,8% o 16,1%, respectivamente) en comparación a chR005-1 Fc0 nativo (28% o 38,3%, respectivamente). No se observó ningún impacto significativo en el pico de G2F. Se observó un mayor nivel de oligomanosas entre (Man)⁵(GlcNAc)² (m/z 1579), (Man)6(GlcNAc)2 (m/z 1784) (Man)⁷(GlcNAc)² (m/z 1988), (Man)8(GlcNAc)2 (m/z 2192) y (Man)9 (GlcNAc)2 (m/z 2396) (29,9% o 27,9% frente al 0%) como también un mayor nivel de glicoformas sialiladas (1,6 %% o 2,4% versus 0,8%). Incluyendo (Gal)1 (GlcNAc)2 (Fuc)1 (NeuAc)1 (Man)s (GlcNAc)2, (m/z 2401), (Gal)2 (GlcNAc)2 (Fuc)1 (NeuAc)1 (Man)a (GlcNAc)2 (m/z 2605) y (Gal)3 (GlcNAc)2 (Fuc)1(NeuAc)1 (Man)³(GlcNAc)², (m/z 2966) en el anticuerpo chR005-1 Fc24 o chR005-1 Fc34 en comparación con el chR005-1 Fc0 nativo.

Tal como se muestra en la Figura 32, los datos demostraron la acumulación de no fucosilados en el anticuerpo optimizado de MAb chR005-1 Fc24 o chR005-1 Fc34 en lugar de estructuras fucosilados en el anticuerpo nativo quimérico chR005-1 Fc0.

18. Determinación de la afinidad de unión de MAb.

Las propiedades de unión de los MAb mR005-1, chR005-1 Fc0, chR005-1 Fc24 y chR005-1 Fc34 se examinaron por análisis de citometría de flujo y estudios de equilibrio de unión en la línea celular Raji positiva de CD19. Por lo tanto, ni la quimerización ni optimización de MAb dio lu ar a cambios si nificativos en la afinidad de Mab:

19. Diferente perfil de glicano de acuerdo con la Fc variante

La figura 33 muestra el impacto de la variante de Fc en glicanos, tales como oligosacáridos fucosilados (m/z 1836, 2040, 2245), oligomanosas (m/z 1579, 1784, 1988, 2192, 2396) y/o glicoformas sialiladas (2401), 2605, 2966) en comparación con chR005-1 Fc0 nativo.

20. Actividad diferencial de MAb según la variante de Fc.

La Figura 34 muestra diferentes anticuerpos anti-CD19 en variantes de Fc y su capacidad para desencadenar CDC y/o ADCC con PBMNC aisladas. La presente invención proporcionó que sólo la variante chR005-1 Fc24 o chR005-1 FCc4 desencadenaron las actividades de ADCC y CDc de MAb.

21. La figura 35 muestra diferentes anticuerpos anti-CD19 en variantes de Fc (Fc14, chR005-1, Fc34) y su capacidad para desencadenar CDC y/o ADCC en presencia de sangre entera. Sólo el chR005-1 Fc34 desencadenó ADCC en presencia de inmunoglobulinas circulantes naturales.

22. La figura 36 muestra diferentes anticuerpos anti-CD19 en variantes de Fc (chR005-1 Fc24; Fc39) y su capacidad para desencadenar la ADCC en presencia de sangre entera a diferentes niveles según la Fc optimizada.

23. La invención incluye, que la ADCC mejorada con el chR005-1 FC34 no estaba limitada velocidades off de CD16A.

La Figura 37 muestra el efecto comparativo in vivo del MAb chR005-1 en la variante optimizada de Fc24 o Fc34 en la depuración de tumor en modelo de xenoinjerto de linfoma de Raji de ratón establecido con o sin inoculación de leucocitos humanos. La presente invención incluye que la ADCC mejorada con el chR005-1 Fc34 no estaba limitada en velocidades off de CD16A en comparación con el chR005-1 Fc24 que contenía además la modificación E333A.

24. Impacto de la sialilación de la capacidad de CDC.

La Figura 38 muestra que la modificación en la posición 243 que conduce a sialilación adicional no era suficiente para restaurar la lisis de células diana de reconocimiento por el complemento. La presente invención revela que sólo los MAb chR005-1 Fc24 o chR005-1 Fc34 que exhiben aproximadamente el mismo patrón de glicoforma sialilada de chR005-1 Fc20, pero con una secuencia de proteína diferente y un mayor nivel de complemento unido, indujo una lisis de células diana por el complemento.

25. Impacto del MAb anti-CD19 en linfoma folicular refractario de rituxan

La Figura 39 muestra que el crecimiento de tumor establecido RL refractario de Rituxan se inhibió con el MAb de chR005-1 optimizado con Fc24.

26. Influencia de la combinación MAb y fármaco

La Figura 40 muestra que la combinación del MAb chR005-1 optimizado con Fc24 y el fármaco doxorubicina aumentó el nivel de inhibición del crecimiento del tumor establecido Raji.

REFERENCIAS

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Anticuerpo anti-CD19 modificado para comprender una región Fc de IgG1 humana variante, en el que:

Phe243 está sustituido por Leu, Arg292 está sustituido por Pro, Tyr300 está sustituido por Leu, Val305 está sustituido por Leu, Lys326 está sustituido por Ala y Pro396 está sustituido por Leu,

o en el que,

Phe243 está sustituido por Leu, Arg292 está sustituido por Pro, Tyr300 está sustituido por Leu, Val305 está sustituido por Leu, Lys326 está sustituido por Ala, Pro396 está sustituido por Leu y Glu333 está sustituido por Ala, en el que la numeración de los residuos de aminoácidos en la región Fc es la de Kabat,

y en el que el anticuerpo tiene actividad ADCC y CDC.

2. Anticuerpo, según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo ha sido producido en células de roedores de tipo natural.

3. Anticuerpo, según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo ha sido producido en células CHO de tipo natural.

4. Anticuerpo, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que tiene una o dos Fc que no contienen (GlcNAc)2(Fuc)i (Man)3(GlcNAc)2 glicano o no contienen (Gal)1(GlcNAc)2(Fuc)i (Man)3 (GlcNAc)2 glicano.

5. Anticuerpo, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una o dos Fc que contienen un (Man)5(GlcNAc)2 glicano, o uno o dos de los siguientes glicanos:

-(Gal)1(GlcNAc)2(Fuc)i (NeuAc)i (Man)3(GlcNAc)2

-(Gal)2(GlcNAc)2(Fuc)i (NeuAc)i (Man)3(GlcNAc)2

6. Anticuerpo, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo comprende las CDR de los anticuerpos mR005-1 o mR005-2, cuyas secuencias de aminoácidos de VH y VL se representan en la siguiente tabla:

7. Anticuerpo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 29 y un dominio VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 31; o un dominio VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 33 y un dominio VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 35.

8. Anticuerpo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el anticuerpo es un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado.

9. Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, y un vehículo o excipiente fisiológicamente aceptable.

10. Composición, según la reivindicación 9, que comprende además un anticuerpo dirigido contra un antígeno tumoral que es diferente de CD19.

11. Composición, según la reivindicación 9 o 10, para usar en un método de tratamiento de un cáncer o una enfermedad autoinmune.

12. Composición, según la reivindicación 10, para usar en el tratamiento de un cáncer en pacientes tratados con anticuerpo CD20 refractarios o recidivantes.

13. Vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena VH de anticuerpo que contiene las CDR de VH de los anticuerpos mR005-1 o mR005-2, cuya secuencia de ácido nucleico de VH se presenta en la SEQ ID NO: 30 o SEQ ID NO: 34, o la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 30 o SEQ ID NO: 34, en el que la secuencia de ácido nucleico para VH también codifica una región Fc de IgG1 humana variante en la que Phe243 está sustituido por Leu, Arg292 está sustituido por Pro, Tyr300 está sustituido por Leu, Val305 está sustituido por Leu o Ile, Lys326 está sustituido por Ala y Pro396 está sustituido por Leu, o Phe243 está sustituido por Leu, Arg292 está sustituido por Pro, Tyr300 está sustituido por Leu, Val305 está sustituido por Leu o Ile, Lys326 está sustituido por Ala, Pro396 está sustituido por Leu y Glu333 está sustituido por Ala, o también codifica la región Fc de SEQ ID NO: 1 o 3.

14. Célula huésped que contiene un vector, según la reivindicación 13, y un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena VL de anticuerpo que contiene las CDR de VL de los anticuerpos mR005-1 o mR005-2, cuya secuencia de ácido nucleico de VL se presenta en la SEQ ID NO: 32 o SEQ ID NO: 36, o la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 32 o SEQ ID NO: 36, y una región kappa humana, siendo la célula huésped una célula CHO de tipo natural.