CN116731161A - 工程化IgG和IgA嵌合的“四叶草型X抗体” - Google Patents

工程化IgG和IgA嵌合的“四叶草型X抗体” Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种包含针对各种靶标抗原的抗体可变区序列的四叶草型X构型抗体分子，其同时具有IgG抗体Fc区和IgA抗体Fc区，保留了IgG Fc区和IgA Fc区与其各自受体的结合能力并显示出联合的IgG分子和IgA分子的效应子功能。本发明还涉及包含所述X构型抗体分子的药物组合物，治疗方法以及其在疾病治疗中的用途。

Description

工程化IgG和IgA嵌合的“四叶草型X抗体”
技术领域
本发明涉及抗体工程领域，具体涉及一种兼容针对各种靶标抗原的抗体可变区序列的四叶草型X构型抗体分子，其同时具有IgG抗体Fc区和IgA抗体Fc区，保留了IgG Fc区和IgA Fc区与其各自受体的结合能力并显示出联合的IgG分子和IgA分子的效应子功能。本发明还涉及包含所述X构型抗体分子的药物组合物，以及其在疾病治疗中的用途。
背景技术
针对肿瘤抗原的治疗性单克隆抗体已成为癌症临床治疗的有效方式。目前，大多数临床使用的抗癌单克隆抗体为IgG类抗体，该类抗体通过其Fc区与Fcγ受体(FcγR)结合，募集相应的效应细胞，通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)效应、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、诱导癌细胞凋亡、补体依赖性细胞毒性(CDC)等途径来杀伤携带抗原的肿瘤细胞，从而达到治疗的目的。然而，在实际临床应用中，仍存在受试者对IgG类抗体不响应、低响应、对抗体产生抗性等诸多问题。因此，仍然需要开发通过其他作用机制发挥作用的抗体，为无法从当前免疫治疗中受益的癌症患者提供其他治疗途径。
嗜中性粒细胞是人体血液循环中最丰富的细胞毒性免疫细胞，在血液淋巴细胞中占比高达50％-70％。嗜中性粒细胞表面具有IgA-Fc受体FcαRI(CD89)，可以通过与IgA类抗体相互识别而被募集，通过称为trogoptosis的独特机制杀死抗体调理的癌细胞。IgA还可以激活肿瘤微环境中最丰富的巨噬细胞，通过吞噬作用杀死肿瘤。IgA通过与中性粒细胞和巨噬细胞上的受体FcαRI(CD89)结合，可以在体外和多种动物模型中有效杀死肿瘤细胞。此外，据报道，与通过IgG抗体的FcγR介导的激活相比，通过IgA抗体的FcαRI依赖性激活中性粒细胞或未分级的白细胞能更有效杀死肿瘤细胞。
但是，开发IgA类抗体作为有效的免疫治疗方式却受到其本身某些特征的限制：(1)由于NK细胞不表达受体FcαRI，因此IgA不能激活NK细胞；(2)由于IgA不与C1q结合，因此不能诱导CDC作用；(3)由于IgA不能与FcRn结合，因此具有短的半衰期。
为了克服IgG和IgA抗体存在的问题，现有技术进行了许多尝试，例如WilliamKelton等人开发了包含嵌合Fc区的IgGA分子，该嵌合Fc区包含IgG抗体的CH2结构域和IgA抗体的CH3结构域，然而，IgGA分子不结合FcgRIIIa，并且也不以pH依赖性方式结合FcRn。需要对IgGA分子进行进一步的改造以保留治疗应用所需的全部IgG Fc结合活性谱。NielsHeemskerk等人构建了一种称为TrisomAb的双特异性分子，其中双特异性抗体的一个臂靶向FcαRI而另一个臂靶向肿瘤相关抗原，虽然TrisomAb可以有效募集NK细胞、巨噬细胞，但是TrisomAb的抗原结合效价仅为1，小于常规抗体的2价抗原结合效价，因此TrisomAb较低的抗原结合效价抵消了由IgA介导的肿瘤杀伤能力。
因此，在肿瘤的免疫治疗中，仍然迫切需要可以克服IgG和IgA抗体目前存在的局限性，能够为癌症患者提供高效治疗作用的新的抗体分子。本申请提供的X构型抗体满足了这种需求。
发明概述
本发明构建了一种兼容针对各种靶标抗原的抗体可变区序列的四叶草型X构型抗体分子，其同时具有IgG抗体Fc区和IgA抗体Fc区，保留了IgG Fc区和IgA Fc区与其各自受体的结合能力并显示出联合的IgG分子和IgA分子的效应子功能，由此募集更多种类和数量的效应子细胞，从而发挥更大的生物学功能。由于X构型抗体分子对抗体的抗原识别没有限制，因此，可以构建针对本领域已知或者将来获得的靶向任何抗原的抗体的具有图1B所示结构的X构型抗体分子。
需要指出的是，本发明中X构型抗体嵌合轻链的设计并非对天然抗体重链的简单模仿，即并非简单地将抗体轻链通过天然抗体铰链区与Fc相连。后续实施例证明，简单地将抗体轻链通过天然抗体铰链区与Fc相连而成的嵌合轻链将无法与重链一起组装成为X构型抗体分子。抗体Fab轻链与Fc之间的连接序列(包括接头和铰链区)的选择和设计对X构型抗体能否形成，以及X构型抗体各结构部分能否正常发挥功能起决定性作用。
在一个方面，本发明提供一种新型的IgG和IgA嵌合型“四叶草型X抗体”(简称为X构型抗体，或X-body)分子，所述分子包括：(1)两个抗体Fab；(2)一个IgA型抗体Fc结构域；和(3)一个IgG型抗体Fc结构域，通过2条包含IgA Fc结构域的轻链与2条包含IgG Fc结构域的重链相互作用，或者通过2条包含IgG Fc结构域的轻链与2条包含IgA Fc结构域的重链相互作用，组装形成如图1B所示的X构型抗体分子，该分子同时保留了针对特定抗原靶标的亲和力、IgA型抗体Fc结构域与其受体的结合能力、IgG型抗体Fc结构域与其受体的结合能力，因而X构型抗体分子在识别靶标抗原的同时，可以同时募集更多的例如NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞等效应细胞，从而更高效地激活相应的效应细胞，发挥杀伤作用。
在一个实施方案中，本申请提供了一种X构型抗体分子，其包括2条相同的抗体(嵌合)重链和2条相同的抗体(嵌合)轻链，所述X构型分子的抗体重链和轻链依次包含如下结构：
(1)抗体重链从N端至C端依次包含抗体的重链可变区(VH)-CH1-连接序列-IgG Fc序列，抗体轻链从N端至C端依次包含抗体的轻链可变区(VL)-轻链恒定区(CL)-连接序列-IgA Fc序列；或者
(2)抗体重链从N端至C端依次包含抗体的重链可变区(VH)-CH1-连接序列-IgA Fc序列，抗体轻链从N端至C端依次包含抗体的轻链可变区(VL)-轻链恒定区(CL)-连接序列-IgG Fc序列；
其中，VH与VL识别相同的靶标抗原，VH-CH1与VL-CL组装形成相应的Fab，由此X构型抗体分子一共形成2个具有相同抗原结合位点的Fab；
其中两条相同的IgG Fc序列同二聚化形成IgG Fc区；两条相同的IgA Fc序列同二聚化形成IgA Fc区。
在一个实施方案中，抗体的可变区(VH和VL)来源于任何识别抗原的抗体分子。在一个实施方案中，抗体可变区来源于识别任何抗原的不同物种的抗体，所述物种是哺乳动物，例如常规用于生产抗体的哺乳动物，例如是啮齿类、犬、骆驼、马、牛、羊等等。在一个实施方案中，抗体可变区来源于动物抗体、人源化抗体、嵌合抗体、人抗体。
在一个具体实施方案中，所述VH和VL来源于同一抗体分子。在一个实施方案中，所述抗体可变区识别肿瘤细胞表达的特异性抗原或其表位。在一个具体的实施方案中，所述抗体可变区识别相较于正常细胞，表达异常的细胞因子。在一个具体的实施方案中，所述抗体可变区例如识别CD20、CD19、Her2等肿瘤表达特异性分子。
在一个实施方案中，所述连接序列包含接头。在另一个实施方案中，所述连接序列包含铰链区。在再一个的实施方案中，所述连接序列包含接头和铰链区。在一个实施方案中，所述铰链区和与其连接的Fc多肽序列同源或者异源。
在一个实施方案中，IgG Fc序列可以来源自提供重链可变区的抗体，或者可以选自现有技术中已知的任何IgG类抗体的Fc序列，例如共有或者胚系IgG Fc序列。在一个实施方案中，IgG Fc序列可以是来自不同IgG亚类的Fc序列，例如来自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的Fc序列。在一个的实施方案中，IgG Fc序列可以包含突变/修饰，例如现有技术中已知的增强ADCC、ADCP、CDC效应子功能的那些修饰。在另一个实施方案中，IgG Fc序列可以由来自不同IgG分子的Fc序列嵌合而成，例如CH2和CH3来源于不同的IgG Fc序列，或Fc序列中的部分氨基酸序列与剩余的其他序列不同源。在一个实施方案中，IgG Fc序列包含IgG1的Fc序列。在一个实施方案中，IgG Fc序列包含含有C末端赖氨酸的IgG1的Fc序列。在另一个实施方案中，IgG Fc序列包含IgG2的Fc序列。在一个实施方案中，IgG Fc序列包含含有C末端赖氨酸的IgG2的Fc序列。在另一个实施方案中，IgG Fc序列包含IgG3的Fc序列。在一个实施方案中，IgG Fc序列包含含有C末端赖氨酸的IgG3的Fc序列。在一个实施方案中，IgG Fc序列包含IgG4的Fc序列。在一个实施方案中，IgG Fc序列包含含有C末端赖氨酸的IgG4的Fc序列。在再一个实施方案中，IgG Fc序列包含由来自IgG1 Fc序列、IgG2的Fc序列、IgG3 Fc序列、IgG4的Fc序列的一个或者多个序列嵌合而成的序列。在再一个实施方案中，IgG Fc包含增加与FcRn亲和力的突变，例如YTE突变。
在一个实施方案中，IgG Fc序列包含SEQ ID NO:21所示的Fc序列，或者包含与SEQID NO:21所示Fc序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的Fc序列。
在一个实施方案中，IgA Fc序列可以来源自提供重链可变区的抗体，或者选自现有技术中已知的任何IgA类抗体的Fc序列，例如共有或者胚系IgA Fc序列。在一个实施方案中，IgA Fc可以是IgA1亚类的Fc序列或者是IgA2亚类的Fc序列。在一个实施方案中，所述IgA Fc序列可以包含突变/修饰，例如现有技术中已知的增强ADCC、ADCP、CDC效应子功能的那些修饰。在另一个实施方案中，IgA Fc序列可以由来自不同IgA分子的Fc序列嵌合而成，例如CH2和CH3来源于不同的IgA Fc序列，或Fc序列中的部分氨基酸序列与剩余的其他序列不同源。在一个实施方案中，IgA Fc序列包含IgA1的Fc序列。在另一个实施方案中，IgA Fc序列包含IgA2的Fc序列。在再一个实施方案中，IgA Fc序列包含IgA1 Fc序列与IgA2的Fc序列嵌合的序列。
在一个实施方案中，IgA Fc序列包含SEQ ID NO:22中所示的Fc序列，或者包含与SEQ ID NO:22所示Fc序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的Fc序列。
在一个具体实施方案中，X构型抗体中的CH1和/或CL可以与和其连接的Fc序列同源或者异源。在另一个实施方案中，X构型抗体中的CH1和/或CL可以与和其连接的VH和/或VL同源或者异源。在一个实施方案中，X构型抗体中的CH1和/或CL可以来源于现有技术中已知的常用CH1、CL，例如通用CH1、CL。
在一个实施方案中，本发明提供一种X构型抗体分子，其包含2条相同的抗体(嵌合)重链和2条相同的抗体(嵌合)轻链，所述抗体重链从N端至C端依次包含VH-CH1-IgG铰链区-IgG1 Fc序列，抗体轻链从N端至C端依次包含VL-CL-IgA1/IgA2铰链区-IgA1/IgA2 Fc序列，其中VH与VL形成2个Fab，IgG1 Fc序列同二聚化形成IgG1 Fc区，IgA1/IgA2 Fc序列同二聚化形成IgA1/IgA2 Fc区。
在一个实施方案中，所述抗体重链的IgG铰链区和与其连接的IgG Fc序列分别来自相同的IgG亚类。在一个实施方案中，所述抗体重链的IgG铰链区和与其连接的IgG Fc序列分别来自不同IgG亚类的免疫球蛋白，例如当Fc序列来源于IgG1时，铰链区可以来源于IgG2，IgG3，或IgG4。在一个实施方案中，所述抗体轻链的铰链区和与其连接的Fc序列分别来自相同的IgA亚类。在一个实施方案中，所述抗体轻链的铰链区和与其连接的Fc序列分别来自不同的IgA亚类，例如当铰链区来源于IgA1时，Fc区来源于IgA2，或者当铰链区来源于IgA2时，Fc区来源于IgA1。
在进一步的实施方案中，所述抗体轻链和/或重链可以包含接头。
在另一个实施方案中，所述抗体轻链从N端至C端依次包含VL-CL-接头-IgA1铰链区-IgA1 Fc序列、VL-CL-接头-IgA2铰链区-IgA2 Fc序列、VL-CL-接头-IgA2铰链区-IgA1Fc序列，或者VL-CL-接头-IgA1铰链区-IgA2 Fc序列。
在一个具体实施方案中，X构型抗体中的CH1和/或CL可以与和其连接的Fc序列同源或者异源。在另一个实施方案中，X构型抗体中的CH1和/或CL可以与和其连接的VH和/或VL同源或者异源。在一个实施方案中，X构型抗体中的CH1和/或CL可以来源于现有技术中已知的常用CH1、CL，例如通用CH1、CL。
在一个实施方案中，本发明提供一种X构型抗体分子，其包含2条相同的抗体(嵌合)重链和2条相同的抗体(嵌合)轻链，所述抗体重链从N端至C端依次包含VH-CH1-IgG铰链区-IgG2Fc序列，抗体轻链从N端至C端依次包含VL-CL-IgA1/IgA2铰链区-IgA1/IgA2 Fc序列，其中VH与VL形成2个Fab，IgG1 Fc序列同二聚化形成IgG1 Fc区，IgA1/IgA2 Fc序列同二聚化形成IgA1/IgA2 Fc区。
在一个实施方案中，所述抗体重链的IgG铰链区和与其连接的IgG Fc序列分别来自相同的IgG亚类。在一个实施方案中，所述抗体重链的IgG铰链区和与其连接的IgG Fc序列分别来自不同IgG亚类的免疫球蛋白，例如当Fc序列来源于IgG2时，铰链区可以来源于IgG1，IgG3，或IgG4。在一个实施方案中，所述抗体轻链的铰链区和与其连接的Fc序列分别来自相同的IgA亚类。在一个实施方案中，所述抗体轻链的铰链区和与其连接的Fc序列分别来自不同的IgA亚类，例如当铰链区来源于IgA1时，Fc区来源于IgA2，或者当铰链区来源于IgA2时，Fc区来源于IgA1。
在进一步的实施方案中，所述抗体轻链和/或重链可以包含接头。
在另一个实施方案中，所述抗体轻链从N端至C端依次包含VL-CL-接头-IgA1铰链区-IgA1 Fc序列、VL-CL-接头-IgA2铰链区-IgA2 Fc序列、VL-CL-接头-IgA2铰链区-IgA1Fc序列，或者VL-CL-接头-IgA1铰链区-IgA2 Fc序列。
在一个具体实施方案中，X构型抗体中的CH1和/或CL可以与和其连接的Fc序列同源或者异源。在另一个实施方案中，X构型抗体中的CH1和/或CL可以与和其连接的VH和/或VL同源或者异源。在一个实施方案中，X构型抗体中的CH1和/或CL可以来源于现有技术中已知的常用CH1、CL，例如通用CH1、CL。
在一个实施方案中，本发明提供一种X构型抗体分子，其包含2条相同的抗体(嵌合)重链和2条相同的抗体(嵌合)轻链，所述抗体重链从N端至C端依次包含VH-CH1-IgG铰链区-IgG3Fc序列，抗体轻链从N端至C端依次包含VL-CL-IgA1/IgA2铰链区-IgA1/IgA2 Fc序列，其中VH与VL形成2个Fab，IgG3 Fc序列同二聚化形成IgG3 Fc区，IgA1/IgA2 Fc序列同二聚化形成IgA1/IgA2 Fc区。
在一个实施方案中，所述抗体重链的IgG铰链区和与其连接的IgG Fc序列分别来自相同的IgG亚类。在一个实施方案中，所述抗体重链的IgG铰链区和与其连接的IgG Fc序列分别来自不同IgG亚类的免疫球蛋白，例如当Fc序列来源于IgG3时，铰链区可以来源于IgG1，IgG2，或IgG4。在一个实施方案中，所述抗体轻链的铰链区和与其连接的Fc序列分别来自相同的IgA亚类。在一个实施方案中，所述抗体轻链的铰链区和与其连接的Fc序列分别来自不同的IgA亚类，例如当铰链区来源于IgA1时，Fc区来源于IgA2，或者当铰链区来源于IgA2时，Fc区来源于IgA1。
在进一步的实施方案中，所述抗体轻链和/或重链可以包含接头。
在另一个实施方案中，所述抗体轻链从N端至C端依次包含VL-CL-接头-IgA1铰链区-IgA1 Fc序列、VL-CL-接头-IgA2铰链区-IgA2 Fc序列、VL-CL-接头-IgA2铰链区-IgA1Fc序列，或者VL-CL-接头-IgA1铰链区-IgA2 Fc序列。
在一个具体实施方案中，X构型抗体中的CH1和/或CL可以与和其连接的Fc序列同源或者异源。在另一个实施方案中，X构型抗体中的CH1和/或CL可以与和其连接的VH和/或VL同源或者异源。在一个实施方案中，X构型抗体中的CH1和/或CL可以来源于现有技术中已知的常用CH1、CL，例如通用CH1、CL。
在一个实施方案中，本发明提供一种X构型抗体分子，其包含2条相同的抗体(嵌合)重链和2条相同的抗体(嵌合)轻链，所述抗体重链从N端至C端依次包含VH-CH1-IgG铰链区-IgG4Fc序列，抗体轻链从N端至C端依次包含VL-CL-IgA1/IgA2铰链区-IgA1/IgA2 Fc序列，其中VH与VL形成2个Fab，IgG4 Fc序列同二聚化形成IgG4 Fc区，IgA1/IgA2 Fc序列同二聚化形成IgA1/IgA2 Fc区。
在一个实施方案中，所述抗体重链的IgG铰链区和与其连接的IgG Fc序列分别来自相同的IgG亚类。在一个实施方案中，所述抗体重链的IgG铰链区和与其连接的IgG Fc序列分别来自不同IgG亚类的免疫球蛋白，例如当Fc序列来源于IgG4时，铰链区可以来源于IgG1，IgG3，或IgG2。在一个实施方案中，所述抗体轻链的铰链区和与其连接的Fc序列分别来自相同的IgA亚类。在一个实施方案中，所述抗体轻链的铰链区和与其连接的Fc序列分别来自不同的IgA亚类，例如当铰链区来源于IgA1时，Fc区来源于IgA2，或者当铰链区来源于IgA2时，Fc区来源于IgA1。
在进一步的实施方案中，所述抗体轻链和/或重链可以包含接头。
在另一个实施方案中，所述抗体轻链从N端至C端依次包含VL-CL-接头-IgA1铰链区-IgA1 Fc序列、VL-CL-接头-IgA2铰链区-IgA2 Fc序列、VL-CL-接头-IgA2铰链区-IgA1Fc序列，或者VL-CL-接头-IgA1铰链区-IgA2 Fc序列。
在一个具体实施方案中，X构型抗体中的CH1和/或CL可以与和其连接的Fc序列同源或者异源。在另一个实施方案中，X构型抗体中的CH1和/或CL可以与和其连接的VH和/或VL同源或者异源。在一个实施方案中，X构型抗体中的CH1和/或CL可以来源于现有技术中已知的常用CH1、CL，例如通用CH1、CL。
在一个具体的实施方案中，本发明提供一种X构型抗体分子，其包含2条相同的抗体(嵌合)重链和2条相同的抗体(嵌合)轻链，所述抗体重链从N端至C端依次包含VH-CH1-IgG1铰链区-IgG1 Fc序列，抗体轻链从N端至C端依次包含VL-CL-接头-IgA2铰链区-IgA1Fc序列，其中VH与VL形成2个Fab，IgG1 Fc序列同二聚化形成IgG1 Fc区，IgA1 Fc序列同二聚化形成IgA1 Fc区。
在一个实施方案中，本发明提供一种靶向CD20的X构型抗体分子，其具有上述实施方案任一所述的分子结构。
在一个具体的实施方案中，本发明提供一种靶向CD20的X构型抗体分子，其中所述分子重链包含SEQ ID NO:21所示的Fc序列，或者包含与SEQ ID NO:21所示Fc序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的Fc序列；轻链包含SEQ ID NO:22所示的Fc序列，或者包含与SEQ ID NO:22所示Fc序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的Fc序列。
在一个具体的实施方案中，本发明提供一种靶向CD20的X构型抗体分子，其中所述分子重链包含SEQ ID NO:19或20所示的铰链区，轻链包含SEQ ID NO:17或18所示的铰链区。
在一个具体的实施方案中，本发明提供一种靶向CD20的X构型抗体分子，其中所述分子轻链包含选自G4S、(G4S)2、(G4S)3、(G4S)4、(G4S)6、(G4S)8、或218接头的接头序列。
在一个具体的实施方案中，本发明提供一种靶向CD20的X构型抗体分子，其中所述分子包含2条相同的抗体(嵌合)重链和2条相同的抗体(嵌合)轻链，所述抗体重链包含SEQID NO:1所示的序列,并且抗体轻链包含SEQ ID NO:2所示的序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种靶向CD19的X构型抗体分子，其具有上述实施方案任一所述的分子结构。
在一个具体的实施方案中，本发明提供一种靶向CD19的X构型抗体分子，其中所述分子重链包含SEQ ID NO:21所示的Fc序列，或者包含与SEQ ID NO:21所示Fc序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的Fc序列；轻链包含SEQ ID NO:22所示的Fc序列，或者包含与SEQ ID NO:22所示Fc序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的Fc序列。
在一个具体的实施方案中，本发明提供一种靶向CD19的X构型抗体分子，其中所述分子重链包含SEQ ID NO:19或20所示的铰链区，轻链包含SEQ ID NO:17或18所示的铰链区。
在一个具体的实施方案中，本发明提供一种靶向CD19的X构型抗体分子，其中所述分子轻链包含选自G4S、(G4S)2、(G4S)3、(G4S)4、(G4S)6、(G4S)8、或218接头的接头序列。
在一个具体的实施方案中，本发明提供一种靶向CD19的X构型抗体分子，其中所述分子包含2条相同的抗体(嵌合)重链和2条相同的抗体(嵌合)轻链，所述抗体重链包含SEQID NO:3所示的序列,并且抗体轻链包含SEQ ID NO:4所示的序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种靶向Her2的X构型抗体分子，其具有上述实施方案任一所述的分子结构。
在一个具体的实施方案中，本发明提供一种靶向Her2的X构型抗体分子，其中所述分子重链包含SEQ ID NO:21所示的Fc序列，或者包含与SEQ ID NO:21所示Fc序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的Fc序列；轻链包含SEQ ID NO:22所示的Fc序列，或者包含与SEQ ID NO:22所示Fc序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的Fc序列。
在一个具体的实施方案中，本发明提供一种靶向Her2的X构型抗体分子，其中所述分子重链包含SEQ ID NO:19或20所示的铰链区，轻链包含SEQ ID NO:17或18所示的铰链区。
在一个具体的实施方案中，本发明提供一种靶向Her2的X构型抗体分子，其中所述分子轻链包含选自G4S、(G4S)2、(G4S)3、(G4S)4、(G4S)6、(G4S)8、或218接头的接头序列。
在一个具体的实施方案中，本发明提供一种靶向Her2的X构型抗体分子，其中所述分子包含2条相同的抗体(嵌合)重链和2条相同的抗体(嵌合)轻链，所述抗体重链包含SEQID NO:5所示的序列,并且抗体轻链包含SEQ ID NO:6所示的序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种X构型抗体分子，其包含2条相同的抗体(嵌合)重链和2条相同的抗体(嵌合)轻链，所述抗体重链从N端至C端依次包含VH-CH1-IgA1/IgA2铰链区-IgA1/IgA2 Fc序列，抗体轻链从N端至C端依次包含VL-CL-IgG铰链区-IgG1 Fc序列，其中VH与VL形成2个Fab，IgG1 Fc序列同二聚化形成IgG1 Fc区，IgA1/IgA2 Fc序列同二聚化形成IgA1/IgA2 Fc区。
在一个实施方案中，所述抗体轻链的IgG铰链区和与其连接的IgG Fc序列来自相同的IgG亚类。在一个实施方案中，所述抗体轻链的IgG铰链区和与其连接的IgG Fc序列分别来自不同IgG亚类的免疫球蛋白，例如当Fc序列来源于IgG1时，铰链区可以来源于IgG4，IgG3，或IgG2。在一个实施方案中，所述抗体重链的铰链区和与其连接的Fc序列来自相同的IgA亚类。在一个实施方案中，所述抗体重链的铰链区和与其连接的Fc序列分别来自不同的IgA亚类，例如当铰链区来源于IgA1时，Fc区来源于IgA2，或者当铰链区来源于IgA2时，Fc区来源于IgA1。
在进一步的实施方案中，所述抗体轻链和/或重链可以包含接头。
在另一个实施方案中，所述抗体轻链从N端至C端依次包含VL-CL-接头-IgG1铰链区-IgG1 Fc序列。在一个实施方案中，所述抗体轻链的IgG铰链区和与其连接的IgG Fc序列分别来自不同IgG亚类的免疫球蛋白，例如当Fc序列来源于IgG1时，铰链区可以来源于IgG4，IgG3，或IgG2。
在一个具体实施方案中，X构型抗体中的CH1和/或CL可以与和其连接的Fc序列同源或者异源。在另一个实施方案中，X构型抗体中的CH1和/或CL可以与和其连接的VH和/或VL同源或者异源。在一个实施方案中，X构型抗体中的CH1和/或CL可以来源于现有技术中已知的常用CH1、CL，例如通用CH1、CL。
在一个实施方案中，本发明提供一种X构型抗体分子，其中所述分子包含2条相同的抗体(嵌合)重链和2条相同的抗体(嵌合)轻链，所述抗体重链从N端至C端依次包含VH-CH1-IgA1/IgA2铰链区-IgA1/IgA2 Fc序列，抗体轻链从N端至C端依次包含VL-CL-IgG铰链区-IgG2Fc序列，其中VH与VL形成2个Fab，IgG2 Fc序列同二聚化形成IgG2 Fc区，IgA1/IgA2Fc序列同二聚化形成IgA1/IgA2 Fc区。
在一个实施方案中，所述抗体轻链的IgG铰链区和与其连接的IgG Fc序列来自相同的IgG亚类。在一个实施方案中，所述抗体轻链的IgG铰链区和与其连接的IgG Fc序列分别来自不同IgG亚类的免疫球蛋白，例如当Fc序列来源于IgG2时，铰链区可以来源于IgG4，IgG3，或IgG1。在一个实施方案中，所述抗体重链的铰链区和与其连接的Fc序列来自相同的IgA亚类。在一个实施方案中，所述抗体重链的铰链区和与其连接的Fc序列分别来自不同的IgA亚类，例如当铰链区来源于IgA1时，Fc区来源于IgA2，或者当铰链区来源于IgA2时，Fc区来源于IgA1。
在进一步的实施方案中，所述抗体轻链和/或重链可以包含接头。
在另一个实施方案中，所述抗体轻链从N端至C端依次包含VL-CL-接头-IgG2铰链区-IgG2 Fc序列。在一个实施方案中，所述抗体轻链的IgG铰链区和与其连接的IgG Fc序列分别来自不同IgG亚类的免疫球蛋白，例如当Fc序列来源于IgG2时，铰链区可以来源于IgG4，IgG3，或IgG1。
在一个具体实施方案中，X构型抗体中的CH1和/或CL可以与和其连接的Fc序列同源或者异源。在另一个实施方案中，X构型抗体中的CH1和/或CL可以与和其连接的VH和/或VL同源或者异源。在一个实施方案中，X构型抗体中的CH1和/或CL可以来源于现有技术中已知的常用CH1、CL，例如通用CH1、CL。
在一个实施方案中，本发明提供一种X构型抗体分子，其包含2条相同的抗体(嵌合)重链和2条相同的抗体(嵌合)轻链，所述抗体重链从N端至C端依次包含VH-CH1-IgA1/IgA2铰链区-IgA1/IgA2 Fc序列，抗体轻链从N端至C端依次包含VL-CL-IgG铰链区-IgG3Fc序列，其中VH与VL形成2个Fab，IgG3 Fc序列同二聚化形成IgG3 Fc区，IgA1/IgA2 Fc序列同二聚化形成IgA1/IgA2 Fc区。
在一个实施方案中，所述抗体轻链的IgG铰链区和与其连接的IgG Fc序列分别来自相同的IgG亚类。在一个实施方案中，所述抗体轻链的IgG铰链区和与其连接的IgG Fc序列分别来自不同IgG亚类的免疫球蛋白，例如当Fc序列来源于IgG3时，铰链区可以来源于IgG4，IgG2，或IgG1。在一个实施方案中，所述抗体重链的铰链区和与其连接的Fc序列分别来自相同的IgA亚类。在一个实施方案中，所述抗体重链的铰链区和与其连接的Fc序列分别来自不同的IgA亚类，例如当铰链区来源于IgA1时，Fc区来源于IgA2，或者当铰链区来源于IgA2时，Fc区来源于IgA1。
在进一步的实施方案中，所述抗体轻链和/或重链可以包含接头。
在另一个实施方案中，所述抗体轻链从N端至C端依次包含VL-CL-接头-IgG3铰链区-IgG3 Fc序列。在一个实施方案中，所述抗体轻链的IgG铰链区和与其连接的IgG Fc序列分别来自不同IgG亚类的免疫球蛋白，例如当Fc序列来源于IgG3时，铰链区可以来源于IgG4，IgG2，或IgG1。
在一个具体实施方案中，X构型抗体中的CH1和/或CL可以与和其连接的Fc序列同源或者异源。在另一个实施方案中，X构型抗体中的CH1和/或CL可以与和其连接的VH和/或VL同源或者异源。在一个实施方案中，X构型抗体中的CH1和/或CL可以来源于现有技术中已知的常用CH1、CL，例如通用CH1、CL。
在一个实施方案中，本发明提供一种X构型抗体分子，其包含2条相同的抗体(嵌合)重链和2条相同的抗体(嵌合)轻链，所述抗体重链从N端至C端依次包含VH-CH1-IgA1/IgA2铰链区-IgA1/IgA2 Fc序列，抗体轻链从N端至C端依次包含VL-CL-IgG铰链区-IgG4Fc序列，其中VH与VL形成2个Fab，IgG4 Fc序列同二聚化形成IgG4 Fc区，IgA1/IgA2 Fc序列同二聚化形成IgA1/IgA2 Fc区。
在一个实施方案中，所述抗体轻链的IgG铰链区和与其连接的IgG Fc序列来自相同的IgG亚类。在一个实施方案中，所述抗体轻链的IgG铰链区和与其连接的IgG Fc序列分别来自不同IgG亚类的免疫球蛋白，例如当Fc序列来源于IgG4时，铰链区可以来源于IgG2，IgG3，或IgG1。在一个实施方案中，所述抗体重链的铰链区和与其连接的Fc序列来自相同的IgA亚类。在一个实施方案中，所述抗体重链的铰链区和与其连接的Fc序列分别来自不同的IgA亚类，例如当铰链区来源于IgA1时，Fc区来源于IgA2，或者当铰链区来源于IgA2时，Fc区来源于IgA1。
在进一步的实施方案中，所述抗体轻链和/或重链可以包含接头。
在另一个实施方案中，所述抗体轻链从N端至C端依次包含VL-CL-接头-IgG4铰链区-IgG4 Fc序列。在一个实施方案中，所述抗体轻链的IgG铰链区和与其连接的IgG Fc序列分别来自不同IgG亚类的免疫球蛋白，例如当Fc序列来源于IgG4时，铰链区可以来源于IgG2，IgG3，或IgG1。
在一个具体实施方案中，X构型抗体中的CH1和/或CL可以与和其连接的Fc序列同源或者异源。在另一个实施方案中，X构型抗体中的CH1和/或CL可以与和其连接的VH和/或VL同源或者异源。在一个实施方案中，X构型抗体中的CH1和/或CL可以来源于现有技术中已知的常用CH1、CL，例如通用CH1、CL。
在一个具体的实施方案中，本发明提供一种X构型抗体分子，其包含2条相同的抗体(嵌合)重链和2条相同的抗体(嵌合)轻链，所述抗体重链从N端至C端依次包含VH-CH1-IgA1铰链区-IgA1 Fc序列，抗体轻链从N端至C端依次包含VL-CL-接头-IgG1铰链区-IgG1Fc序列，其中VH与VL形成2个Fab，IgG1 Fc序列同二聚化形成IgG1 Fc区，IgA1 Fc序列同二聚化形成IgA1 Fc区。
在一个具体实施方案中，X构型抗体中的CH1和/或CL可以与和其连接的Fc序列同源或者异源。在另一个实施方案中，X构型抗体中的CH1和/或CL可以与和其连接的VH和/或VL同源或者异源。在一个实施方案中，X构型抗体中的CH1和/或CL可以来源于现有技术中已知的常用CH1、CL，例如通用CH1、CL。
在一个具体的实施方案中，本发明提供一种靶向Her2的X构型抗体分子，其中所述分子重链包含SEQ ID NO:22所示的Fc序列，或者包含与SEQ ID NO:22所示Fc序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的Fc序列；轻链包含SEQ ID NO:21所示的Fc序列，或者包含与SEQ ID NO:21所示Fc序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的Fc序列。
在一个具体的实施方案中，本发明提供一种靶向Her2的X构型抗体分子，其中所述分子重链包含SEQ ID NO:17或18所示的铰链区，轻链包含SEQ ID NO:19或20所示的铰链区。在更具体的实施方案中，本发明提供一种靶向Her2的X构型抗体分子，其包含2条相同的抗体(嵌合)重链和2条相同的抗体(嵌合)轻链，所述抗体重链包含SEQ ID NO:7所示的序列,并且抗体轻链包含SEQ ID NO:8所示的序列。
在前述任一个实施方案中，所述接头选自(G4S)n，其中n是等于或大于1的整数，例如，n是1、2、3、4、5、6、7、8、9的整数；218接头；GGGSG；GGSGG；GSGGG；SGGGG；GGTGS；GTSPGG；GNGGGS；G4S-GGSGG-G4S-SGGGG；GGG；DGGGS；TGEKP；GGRR；EGKSSGSGSESKVD；KESGSVSSEQLAQFRSLD；GGRRGGGS；LRQRDGERP；LRQKDGGGSERP；和GSTSGSGKPGSGEGSTKG等能够提供柔性的接头。
在一个实施方案中，接头选自(G4S)2、(G4S)3、(G4S)4、(G4S)6、(G4S)8、或218接头序列。
在一个实施方案中，铰链区来源于各种类别的免疫球蛋白，来源于免疫球蛋白的共有铰链区或者来源于胚系抗体分子的铰链区。在一个实施方案中，铰链区来源于IgG类抗体或其亚类、IgA类抗体或其亚类。在一个实施方案中，铰链区来源于例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2分子包含的铰链区。在一个具体实施方案中，铰链区是包含“CPPC”的IgG铰链区序列(例如，氨基酸序列“EPKSCDKTHTCPPCP”或“EPKSSDKTHTCPPCP”)；IgA铰链区序列VPSTPPTPSPSTPPTPSPS，VPPPPP。在一个实施方案中，所述铰链区包含一个或者多个不影响其柔性的氨基酸突变。在一个实施方案中，所述铰链区和与其连接的Fc多肽序列同源或者异源。
在一个实施方案中，铰链区来自IgG1，例如如SEQ ID NO:1所包含的铰链区。在另一个实施方案中，铰链区来自IgA1，例如包含如SEQ ID NO:17所示序列的铰链区。在一个实施方案中，铰链区来自IgA2，例如包含如SEQ ID NO:18所示序列的铰链区。
在前述任一个实施方案中，CH1结构域可以与重链可变区和/或Fc序列同源或者异源。
第二个方面，本发明提供一种制备识别具体靶标的X构型抗体分子的方法，其中所述X构型抗体分子包含2条相同的抗体重链和2条相同的抗体轻链，所述X构型分子的抗体重链和轻链依次包含如下结构：
(1)抗体重链从N端至C端依次包含抗体的重链可变区(VH)-CH1-连接序列-IgG Fc序列，抗体轻链从N端至C端依次包含抗体的轻链可变区(VL)-轻链恒定区(CL)-连接序列-IgA Fc序列；或者
(2)抗体重链从N端至C端依次包含抗体的重链可变区(VH)-CH1-连接序列-IgA Fc序列，抗体轻链从N端至C端依次包含抗体的轻链可变区(VL)-轻链恒定区(CL)-连接序列-IgG Fc序列；
其中，VH与VL识别相同的靶标抗原，VH-CH1与VL-CL组装形成相应的Fab，由此X构型抗体分子一共形成2个具有相同抗原结合位点的Fab；
其中两条相同的IgG Fc序列同二聚化形成IgG Fc区；两条相同的IgA Fc序列同二聚化形成IgA Fc区。
在一个实施方案中，本发明提供一种制备识别具体靶标的X构型抗体分子的方法，包括：
1.获得识别具体靶标的抗体的重链可变区和轻链可变区的编码序列或氨基酸序列；
2.构建结构为VH-CH1-连接序列-IgG Fc的X构型抗体重链序列和结构为VL-CL-连接序列-IgA Fc序列的X构型抗体轻链序列；或者构建结构为VH-CH1-连接序列-IgA Fc序列的X构型抗体重链序列和结构为VL-CL-连接序列-IgG Fc序列的X构型抗体轻链序列；
3.在合适条件下表达步骤2获得的抗体重链和轻链序列，其中两条重链多肽和两条轻链多肽以四聚体的形式组装成X构型抗体，其中，VH-CH1与VL-CL组装形成相应的Fab，两条相同的IgG Fc序列同二聚化形成IgG Fc区；两条相同的IgA Fc序列同二聚化形成IgAFc区，由此获得相应的X构型抗体分子；
4.任选地，纯化所述X构型抗体分子。
可以通过本领域已知的任何方法构建上述方法步骤2中公开的X构型抗体重链和轻链序列。例如首先获得各个结构域的编码序列，通过分子生物学方法构建相应的X构型抗体重链和轻链序列编码序列，或者直接合成X构型抗体重链和轻链序列编码序列。
在上述方法的步骤2中，任选地，所述方法还包括将编码X构型抗体重链和轻链的编码序列转染合适的宿主细胞，并在适合同时表达抗体重链和轻链的条件下表达相应的抗体重链和轻链分子。
在前述任一个实施方案中，抗体的可变区(VH和VL)来源于任何识别抗原的抗体分子。在一个实施方案中，抗体可变区可以来源于不同的物种，例如常规用于生产抗体的哺乳动物，例如是啮齿类、犬、骆驼、马、牛、羊等等。在一个实施方案中，抗体可变区来源于动物抗体、人源化抗体、嵌合抗体、人抗体。在一个具体实施方案中，所述VH和VL来源于同一抗体分子。
在前述任一个实施方案中，所述连接序列包含接头。在另一个实施方案中，所述连接序列包含铰链区。在再一个的实施方案中，所述连接序列包含接头和铰链区。在一个实施方案中，所述铰链区和与其连接的Fc多肽序列同源或者异源。
在前述任一个实施方案中，所述IgG Fc序列可以来源自提供重链可变区的抗体，或者可以选自现有技术中已知的任何IgG类抗体的Fc序列，例如共有或者胚系IgG Fc序列。
在前述任一个实施方案中，所述IgA Fc序列可以来源自提供重链可变区的抗体，或者选自现有技术中已知的任何IgA类抗体的Fc序列，例如共有或者胚系IgA Fc序列。
在前述任一个实施方案中，所述CH1和/或CL与相应的抗体可变区(VH和VL)同源。在另一个实施方案中，X构型抗体中的CH1和/或CL与相应的VH和/或VL异源。在一个实施方案中，X构型抗体中的CH1和/或CL可以来源于现有技术中已知的常用CH1、CL，例如通用CH1、CL。
第三方面，本发明提供了一种改造单克隆抗体为X构型抗体分子的方法，其中获得的X构型抗体分子包含2条相同的抗体重链和2条相同的抗体轻链，所述X构型分子的抗体重链和轻链依次包含如下结构：
(1)抗体重链从N端至C端依次包含抗体的重链可变区(VH)-CH1-连接序列-IgG Fc序列，抗体轻链从N端至C端依次包含抗体的轻链可变区(VL)-轻链恒定区(CL)-连接序列-IgA Fc序列；或者
(2)抗体重链从N端至C端依次包含抗体的重链可变区(VH)-CH1-连接序列-IgA Fc序列，抗体轻链从N端至C端依次包含抗体的轻链可变区(VL)-轻链恒定区(CL)-连接序列-IgG Fc序列；
其中，VH与VL识别相同的靶标抗原，VH-CH1与VL-CL组装形成相应的Fab，由此X构型抗体分子一共形成2个具有相同抗原结合位点的Fab；
其中两条相同的IgG Fc序列同二聚化形成IgG Fc区；两条相同的IgA Fc序列同二聚化形成IgA Fc区。
在一个具体实施方案中，所述单克隆抗体可以是识别任何抗原的抗体分子。
在一个具体实施方案中，所述连接序列包含接头。在另一个实施方案中，所述连接序列包含铰链区。在再一个的实施方案中，所述连接序列包含接头和铰链区。在一个实施方案中，所述铰链区和与其连接的Fc多肽序列同源或者异源。
在一个具体实施方案中，所述IgG Fc序列来源于所述单克隆抗体，或者可以选自现有技术中已知的任何IgG类抗体的Fc序列，例如共有或者胚系IgG Fc序列。
在一个具体实施方案中，所述IgA Fc序列可以来源所述单克隆抗体，或者选自现有技术中已知的任何IgA类抗体的Fc序列，例如共有或者胚系IgA Fc序列。
在一个具体实施方案中，所述单克隆抗体提供X构型抗体中的CH1和/或CL。在另一个实施方案中，X构型抗体中的CH1和/或CL可以与相应的VH和/或VL同源或者异源。在一个实施方案中，X构型抗体中的CH1和/或CL可以来源于现有技术中已知的常用CH1、CL，例如通用CH1、CL。
在一个实施方案中，本发明提供了一种改造单克隆抗体为具有如上述任一实施方案所述结构的X构型抗体分子的方法，其中
A.当所述单克隆抗体是IgG类分子时，所述方法包括
(1)将所述单克隆抗体的轻链序列改造成结构为VL-CL-连接序列-IgA Fc序列的X构型抗体轻链序列，其中VL和CL来源于所述单克隆抗体，或者VL来源于所述单克隆抗体，CL来源于现有技术常用序列；
(2)表达所述单克隆抗体的重链和步骤(1)获得的X构型抗体轻链，并在合适的条件下组装成X构型抗体，其中两条重链多肽和两条嵌合轻链多肽以四聚体的形式组装成X构型抗体，其中，VH-CH1与VL-CL组装形成相应的Fab，两条重链所包含的相同IgG Fc序列同二聚化形成IgG Fc区；两条X构型抗体轻链所包含的相同IgA Fc序列同二聚化形成IgA Fc区，由此获得相应的X构型抗体分子；
(3)任选地，纯化所述X构型抗体分子。
或者，所述方法包括：
(1)用IgA Fc序列替换抗体重链的Fc序列从而将所述单克隆抗体的重链序列改造成结构为VH-CH1-连接序列-IgAFc序列的X构型抗体重链序列，将所述单克隆抗体的轻链序列改造成结构为VL-CL-连接序列-IgG Fc序列的X构型抗体轻链序列；
(2)表达步骤(1)获得的X构型抗体重链和X构型抗体轻链，并在合适的条件下组装成X构型抗体，其中两条重链多肽和两条轻链多肽以四聚体的形式组装成X构型抗体，其中，VH-CH1与VL-CL组装形成相应的Fab，两条X构型抗体轻链所包含的相同IgG Fc序列同二聚化形成IgG Fc区；两条X构型抗体重链所包含的相同IgA Fc序列同二聚化形成IgA Fc区，由此获得相应的X构型抗体分子；
(3)任选地，纯化所述X构型抗体分子。
B.当所述单克隆抗体是IgA类分子时，所述方法包括：
(1)将所述单克隆抗体的轻链序列改造成结构为VL-CL-连接序列-IgG Fc序列的X构型抗体轻链序列；
(2)表达所述单克隆抗体的重链和步骤(1)获得的X构型抗体轻链，并在合适的条件下组装成X构型抗体，其中两条重链多肽和两条嵌合轻链多肽以四聚体的形式组装成X构型抗体，其中，VH-CH1与VL-CL组装形成相应的Fab，两条重链所包含的相同IgA Fc序列同二聚化形成IgA Fc区；两条X构型抗体轻链所包含的相同IgG Fc序列同二聚化形成IgG Fc区，由此获得相应的X构型抗体分子；
(3)任选地，纯化所述X构型抗体分子。
或者，所述方法包括：
(1)用IgG Fc序列替换抗体重链的Fc序列从而将所述单克隆抗体的重链序列改造成结构为VH-CH1-连接序列-IgG Fc序列的X构型抗体重链序列，将所述单克隆抗体的轻链序列改造成结构为VL-CL-连接序列-IgA Fc序列的X构型抗体轻链序列；
(2)表达步骤(1)获得的X构型抗体重链和X构型抗体轻链，并在合适的条件下组装成X构型抗体，其中两条重链多肽和两条轻链多肽以四聚体的形式组装成X构型抗体，其中，VH-CH1与VL-CL组装形成相应的Fab，两条X构型抗体轻链所包含的相同IgA Fc序列同二聚化形成IgA Fc区；两条X构型抗体重链所包含的相同IgG Fc序列同二聚化形成IgG Fc区，由此获得相应的X构型抗体分子；
(3)任选地，纯化所述X构型抗体分子，
C.当所述单克隆抗体是其他类免疫球蛋白分子是，所述方法包括：
(1)将所述单克隆抗体的轻链序列改造成结构为VL-CL-连接序列-IgA Fc序列的X构型抗体轻链序列，将所述单克隆抗体的重链序列改造成VH-CH1-连接序列-IgG Fc序列的X构型抗体重链序列，或者
将所述单克隆抗体的轻链序列改造成结构为VL-CL-连接序列-IgG Fc序列的X构型抗体轻链序列，将所述单克隆抗体的重链序列改造成VH-CH1-连接序列-IgA Fc序列的X构型抗体重链序列；
(2)表达步骤(1)获得的所述X构型抗体重链和X构型抗体轻链，并在合适的条件下组装成X构型抗体，其中两条重链多肽和两条嵌合轻链多肽以四聚体的形式组装成X构型抗体，其中，VH-CH1与VL-CL组装形成相应的Fab，两条重链所包含的相同Fc序列同二聚化；两条X构型抗体轻链所包含的相同Fc序列同二聚化，由此获得相应的X构型抗体分子；
(3)任选地，纯化所述X构型抗体分子。
在一个具体实施方案中，所述方法还包括首先获得待改造单克隆抗体的重链编码序列和轻链编码序列。
可以通过本领域已知的任何方法获得所述X构型抗体重/轻链序列。例如首先获得各个结构域的编码序列，通过分子生物学方法构建相应的X构型抗体重/轻链序列编码序列，或者直接合成X构型抗体重/轻链序列编码序列。
在上述方法的步骤(2)中，任选地，将编码所述X构型抗体重链和编码所述X构型抗体轻链的序列转染合适的宿主细胞，并在适合同时表达抗体重链和轻链的条件下表达相应的抗体重链和轻链分子。
在一个具体实施方案中，所述方法还包括首先获得待改造单克隆抗体的重链编码序列和轻链编码序列。
可以通过本领域已知的任何方法获得所述X构型抗体重链的X构型抗体轻链序列。例如首先获得各个结构域的编码序列，通过分子生物学方法构建相应的X构型抗体重链和X构型抗体轻链序列编码序列，或者直接合成X构型抗体重链和X构型抗体轻链序列编码序列。
在上述方法的步骤2中，任选地，将编码所述X构型抗体重链和编码所述X构型抗体轻链的序列转染合适的宿主细胞，并在适合同时表达抗体重链和轻链的条件下表达相应的抗体重链和轻链分子。
在一个实施方案中，抗体的可变区(VH和VL)来源于任何识别抗原的抗体分子。
在前述任一个实施方案中，所述连接序列包含接头，例如现有技术已知的任何接头。在另一个实施方案中，所述连接序列包含铰链区。在再一个的实施方案中，所述连接序列包含接头和铰链区。在一个实施方案中，所述铰链区和与其连接的Fc多肽序列同源或者异源。
在一个实施方案中，X构型抗体的IgG Fc序列可以来源于所述单克隆抗体，或者可以选自现有技术中已知的任何IgG类抗体的Fc序列，例如共有或者胚系IgG Fc序列。
在一个实施方案中，X构型抗体的IgA Fc序列可以来源于所述单克隆抗体，或者选自现有技术中已知的任何IgA类抗体的Fc序列，例如共有或者胚系IgA Fc序列。
在一个具体实施方案中，所述单克隆抗体提供X构型抗体中的CH1和/或CL。在另一个实施方案中，X构型抗体中的CH1和/或CL可以与相应的VH和/或VL同源或者异源。在一个实施方案中，X构型抗体中的CH1和/或CL可以来源于现有技术中已知的常用CH1、CL，例如通用CH1、CL。
第四方面，本发明提供了一种衍生的X构型抗体分子，其包括2条相同的抗体重链和2条相同的抗体轻链，所述X构型分子的抗体重链和轻链分别包含如下结构：
抗体重链从N端至C端依次包含抗体的重链可变区(VH)-CH1-连接序列-IgG Fc序列；和
抗体轻链从N端至C端依次包含SIRPα胞外区-抗体的轻链可变区(VL)-轻链恒定区(CL)-连接序列-IgA Fc序列，
其中，一条重链的VH和CH1与一条轻链的VL和CL分别相互作用组装形成相应的Fab，由此衍生的X构型抗体分子一共形成2个具有相同抗原结合位点的Fab；
其中两条相同的IgG Fc序列同二聚化形成IgG Fc区；两条相同的IgA Fc序列同二聚化形成IgA Fc区。
在一个实施方案中，抗体的可变区(VH和VL)来源于任何识别抗原的抗体分子。在一个实施方案中，抗体可变区来源于识别任何抗原的不同物种的抗体，所述物种是哺乳动物，例如常规用于生产抗体的哺乳动物，例如是啮齿类、犬、骆驼、马、牛、羊等等。在一个实施方案中，抗体可变区来源于动物抗体、人源化抗体、嵌合抗体、人抗体。
在一个实施方案中，所述连接序列包含接头。在另一个实施方案中，所述连接序列包含铰链区。在再一个的实施方案中，所述连接序列包含接头和铰链区。在一个实施方案中，所述铰链区和与其连接的Fc多肽序列同源或者异源。
在一个实施方案中，SIRPα胞外区和抗体的轻链可变区(VL)之间包含接头。在一个具体的实施方案中，所述接头可以是本申请提到的任一接头序列。
在一个实施方案中，所述IgG Fc序列选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc序列，所述IgA Fc选自IgA1 Fc序列或IgA2 Fc序列，优选地，所述IgG Fc是IgG1的Fc序列，所述IgA Fc是IgA1 Fc序列。
在一个实施方案中，IgG Fc序列包含SEQ ID NO:21所示的Fc序列，或者包含与SEQID NO:21所示Fc序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的Fc序列。
在一个实施方案中，IgA Fc序列包含SEQ ID NO:22中所示的Fc序列，或者包含与SEQ ID NO:22所示Fc序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的Fc序列。
在一个具体的实施方案中，所述分子轻链的连接序列包含选自G4S、(G4S)2、(G4S)3、(G4S)4、(G4S)6、(G4S)8、或218接头的接头序列。
在一个具体的实施方案中，所述铰链区选自SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19或SEQ ID NO:20。
第五方面，本发明提供了一种制备衍生的X构型抗体分子的方法，包括：
(1)获得衍生的X构型抗体分子的重链可变区和轻链可变区的编码序列或氨基酸序列，
(2)构建如第四方面任一所述的衍生的X构型抗体分子的相应X构型抗体重链序列和轻链序列，
(3)在合适条件下表达步骤2获得的抗体重链和轻链序列，其中两条重链多肽和两条轻链多肽以四聚体的形式组装成X构型抗体，其中，VH-CH1与VL-CL组装形成相应的Fab，两条相同的IgG Fc序列同二聚化形成IgG Fc区；两条相同的IgA Fc序列同二聚化形成IgAFc区，由此获得相应的衍生的X构型抗体分子；
(4)任选地，纯化所述衍生的X构型抗体分子。
第六方面，本发明提供了一种将抗体改造为如第四方面所述的任一衍生的X构型抗体分子的方法，包括：
(1)将所述单克隆抗体的轻链序列改造成结构为SIRPα胞外区-抗体的轻链可变区(VL)-轻链恒定区(CL)-连接序列-IgA Fc序列；
(2)在合适的条件下表达抗体重链和步骤(1)获得的X构型抗体轻链，其中两条重链多肽和两条嵌合轻链多肽以四聚体的形式组装成X构型抗体，其中，VH-CH1与VL-CL组装形成相应的Fab，两条重链所包含的相同Fc序列同二聚化；两条衍生的X构型抗体轻链所包含的相同Fc序列同二聚化，由此获得相应的X构型抗体分子；
(3)任选地，纯化所述衍生的X构型抗体分子。
第七方面，本发明提供了编码本申请X构型抗体分子、衍生的X构型抗体分子的核酸、包含所述核酸的载体、包含所述核酸或载体的宿主细胞。
第八方面，本发明提供了包含本申请X构型抗体分子和可药用载体的药物组合物，或者包含本申请衍生的X构型抗体分子和可药用载体的药物组合物。
在一个实施方案中，所述药物组合物还包含其他治疗剂。
第九方面，本发明提供了本申请X构型抗体分子在制备用于治疗疾病的药物中的用途，本申请衍生的X构型抗体分子在制备用于治疗疾病的药物中的用途，以及提供了本申请药物组合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途。
在一个实施方案，所述疾病可以是可以利用抗体进行治疗的任何疾病。在另一个实施方案中，所述疾病是癌症。
第十方面，本发明提供了治疗疾病的方法，包括将治疗有效量的本发明的X构型抗体分子、治疗有效量的本发明衍生的X构型抗体分子或者治疗有效量的本发明的药物组合物施用给有需要的受试者。
在一个实施方案，所述疾病可以是可以利用抗体进行治疗的任何疾病。在另一个实施方案中，所述疾病是癌症。
在某些实施方案中，本文所述的方法和用途还包括向所述个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如化疗剂、放疗剂或者生物大分子药物。在一个实施方案中，该生物大分子药物例如是各种单克隆抗体药。
上述联合疗法包括组合给药(其中两种以上治疗剂被包含在相同或分开的制剂中)和分别给药，其中，本发明的抗体分子的给药可以发生在另外的治疗剂和/或佐剂的给药前、同时和/或之后。
本发明的构建的X构型抗体具有如下优势：
-以高亲和力结合抗原分子；
-与受体FcαRI(CD89)结合，有效募集嗜中性粒细胞做为效应细胞，杀伤肿瘤细胞；
-与受体FcγR结合，有效募集NK细胞和巨噬细胞做为效应细胞，杀伤肿瘤细胞；
-与受体FcRn结合，实现较长的抗体半衰期。
附图简述
图1.X构型抗体的结构示意图。(A)X构型抗体的重链和轻链结构示意图。(B)X构型抗体的四级结构组装方式。(C)X构型抗体在消除癌细胞过程中所发挥的功能。
图2.X构型Rituximab抗体的表达纯化。(A)X构型Rituximab抗体的重链和轻链结构示意图。(B)X构型Rituximab抗体样品的非还原性SDS-PAGE电泳结果。“亲和层析”代表经Protein A亲和层析纯化得到的样品，“分子筛层析”代表在此基础上再经分子筛层析纯化得到的样品。(C)X构型Rituximab抗体样品的还原性SDS-PAGE电泳结果，所用样品与B图中“分子筛层析”泳道所用样品相同。(D)分子筛层析纯化过程中的紫外光(UV280)吸收峰形图。主峰位置在大约11.5ml处，对应分子量约为200kD。
图3.X构型Rituximab抗体的负染电镜二维重构结果。利用总计9201个嵌合抗体颗粒图像进行二维重构，将嵌合抗体颗粒分成了15类，代表不同角度和不同构象下的X构型Rituximab抗体。
图4.接头的长度和序列对X构型抗体的可组装性的影响。当嵌合轻链包含3×G4S序列(A)，218接头(B),4×G4S序列(C),6×G4S序列(D)，或8×G4S序列(E)时，分别对应的X构型Rituximab抗体分子筛层析纯化峰形图。其中D图与图2D系同一数据。
图5.X构型Rituximab抗体的肿瘤细胞杀伤作用。(A)以嗜中性粒细胞作为效应细胞，X构型抗体，IgA型以及IgG型Rituximab抗体在不同浓度下，对Ramos细胞(CD20+)的ADCC杀伤效果。(B)以NK细胞作为效应细胞，上述三种构型抗体对Ramos细胞的ADCC杀伤效果。(C)以巨噬细胞作为效应细胞，上述三种构型抗体对Ramos细胞的ADCP杀伤效果。
图6.X构型Rituximab抗体在人源化FcαRI转基因小鼠体内的肿瘤抑制活性。(A)治疗前(第二日)和治疗后24小时(第三日)的Eg7-hCD20-Luc肿瘤细胞的生物发光成像(BLI)。(B)对A面板中生物发光信号的量化。(C)治疗对癌细胞的抑制。肿瘤大小变化(％)＝(治疗后总计数-治疗前总计数)/治疗前总计数×100％。
图7.X构型抗鼠CD19抗体的表达纯化和动物体内活性。(A)X构型抗鼠CD19抗体的非还原SDS-PAGE电泳结果。“亲和层析”代表经Protein A亲和层析纯化得到的样品，“分子筛层析”代表在此基础上再经分子筛层析纯化得到的样品。(B)分子筛层析纯化过程中的OD280峰形图。(C)IgA型和X构型抗鼠CD19抗体，在人源化FcαRI转基因小鼠中，对小鼠B细胞的清除能力。
图8.X构型和反式X构型Trastuzumab抗体的表达纯化。(A)X构型Trastuzumab抗体(Trastuzumab X-body)的重链和轻链结构示意图。(B)X构型Trastuzumab抗体的非还原性SDS-PAGE电泳结果和分子筛层析OD280峰形图。(C)反式X构型Trastuzumab抗体(Trastuzumab RX-body)的重链和轻链结构示意图。(D)反式X构型Trastuzumab抗体的非还原性SDS-PAGE电泳结果和分子筛层析OD280峰形图。电泳样品均为先后经Protein A亲和层析和分子筛层析纯化最终得到的样品。(E)不含有接头的Trastuzumab抗体的重链和嵌合轻链结构示意图，及其非还原性SDS-PAGE电泳结果(F)。
图9.X构型Trastuzumab抗体的肿瘤细胞杀伤作用。图中表示以嗜中性粒细胞作为效应细胞时，X构型抗体，IgA型以及IgG型Trastuzumab抗体在不同浓度下，对SKBR3细胞(Her2+)的ADCC杀伤效果。
图10.X构型Trastuzumab抗体在人源化FcαRI转基因小鼠体内的肿瘤抑制活性。(A)MC38-hHer2细胞肿瘤体积变化曲线。(B)MC38-hHer2荷瘤小鼠生存时间曲线。(C)MB49-hHer2细胞肿瘤体积变化曲线。(D)MB49-hHer2细胞荷瘤小鼠生存时间曲线。
发明详述
I.定义
除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用的方式完整地并入。此外，本文中所述的材料、方法和例子仅是说明性的并且不意在是限制性的。本发明的其他特征、目的和优点将从本说明书及附图并且从后附的权利要求书中显而易见。
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值。
如本文中所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。
术语“抗体”在本文中以最广意义使用，指包含抗原结合位点的蛋白质，涵盖各种结构的天然抗体和人工抗体，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、单链抗体、完整抗体和抗体片段。术语“抗体重链”在本文中以最广意义使用，涵盖各种天然抗体的重链，也包括经过人工修饰或者基因工程化的重链，例如嵌合重链；重链缀合物；重链衍生物等。术语“抗体轻链”在本文中以最广意义使用，涵盖各种天然抗体的轻链，也包括经过人工修饰或者基因工程化的轻链，例如嵌合轻链；轻链缀合物；轻链衍生物等。
术语“全抗体”、“完整抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可以互换使用，通常包含至少两条全长重链(H)和两条全长轻链(L)，但在某些情况下可包括较少的链，例如骆驼中天然存在的抗体可仅包含重链。免疫球蛋白重链包含重链可变区(VH，也称作重链可变结构域)和重链恒定区(CH，也称作重链恒定结构域)，轻链包含轻链可变区(VL，也称作轻链可变结构域)和轻链恒定区(CL，也称作轻链恒定结构域)。
根据免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸序列可以将免疫球蛋白划分为5个类别，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中某些类别可以进一步划分成亚类，例如IgG可以分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4亚类，IgA可以分为IgA1和IgA2亚类。根据免疫球蛋白轻链恒定结构域的氨基酸序列，可以将免疫球蛋白划分成两种类型之一，即κ和λ。
IgG类免疫球蛋白基本上是由二硫键键合的两条轻链和两条重链组成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。IgG的重链恒定区包含三个结构域：CH1、CH2和CH3，其中CH1与CH2之间通过铰链区连结。通常CH2和CH3结构域组成IgG免疫球蛋白的Fc区，通过与其受体(FcγR)的相互作用介导各种效应子功能。
IgA类免疫球蛋白可以作为单体、二聚体形式或分泌形式产生，其包含两个亚类：IgA1和IgA2。IgA1和IgA2以相似的亲和力与其受体CD89结合。人类IgA1和IgA2的序列具有90％的同一性，差别主要在于铰链区：IgA1的铰链区较长，具有多个糖基化位点。IgA的重链恒定区包含三个结构域：CH1、CH2和CH3，其中CH1与CH2之间通过铰链区连结。IgA通过与受体CD89结合介导多种效应子功能，例如通过嗜中性粒细胞介导的ADCC、通过巨噬细胞介导的ADCP等。
在一些实施方案中，IgA抗体可以是单体的。在一些实施方案中，IgA重链恒定区包含IgA1的三个结构域CH1、CH2和CH3，在另一些实施方案中，IgA重链恒定区包含IgA2的三个结构域CH1、CH2和CH3。在其他实施方案中，IgA重链恒定区包含嵌合序列，例如铰链区来自于IgA2，CH1、CH2和CH3来自于IgA1。
术语“铰链区”指连接免疫球蛋白CH1的C端和CH2结构域的N端的连续的氨基酸序列。该区富含脯氨酸，不形成α螺旋，因此易伸展弯曲，能改变“Y”形两臂之间的距离，有利于抗体的抗原结合部位与抗原表位间的互补性结合和有利于两臂同时结合两个抗原表位。也有利于暴露免疫球蛋白分子的效应子结合位点。
术语“可变区”或“可变结构域”(重链可变区VH、轻链可变区VL)指参与抗体与抗原结合的抗体重或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个互补决定区。在一些情况下，单个VH或VL结构域可以足以给予抗原结合特异性。
五类免疫球蛋白及其亚类的铰链区不尽相同，其中IgG、IgA和IgD重链CH1与CH2之间存在铰链区，而IgM和IgE重链无铰链区。
术语“Fc多肽序列”、“Fc序列”和“Fc片段”在本文中可以互换使用，指一条免疫球蛋白重链的C端多肽片段。天然免疫球蛋白的“Fc多肽序列”包含两个或三个恒定结构域，即CH2结构域、CH3结构域和可选的CH4结构域。例如，在天然抗体中，IgG、IgA和IgD类免疫球蛋白的Fc多肽序列包含一条重链的CH2结构域和CH3结构域；IgM和IgE类免疫球蛋白的Fc多肽序列包含一条重链的CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域。Fc序列可以包括野生型Fc序列和变体Fc序列，可来自多种抗体类别(例如IgG、IgA、IgE、IgD、IgM)以及亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。
Fc多肽序列的C端赖氨酸(EU编号系统的残基447)可以例如在生产或纯化抗体期间去除，或通过重组改造编码抗体重链的核酸来去除。因此，完整抗体的组合物可以包括所有K447残基均被去除了的抗体群体、未去除K447残基的抗体群体、及包含带K447残基和不带K447残基的抗体的混合物的抗体群体。除非本文中另外说明，否则Fc多肽序列或重链恒定区中的氨基酸残基编号根据如Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInteres,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述的EU编号体系(也称作EU索引)进行编号。
术语“Fc结构域”和“Fc区”在本文中可以互换使用，是指由两条Fc多肽序列组成的结构，通常两条Fc多肽序列之间通过二硫键、非肽键的键和/或力(例如范德瓦尔斯力、疏水力、亲水力)相互作用形成Fc区。
抗体的Fc结构域介导几种重要的效应子功能，术语“效应子功能”指随免疫球蛋白同种型变动的归因于免疫球蛋白Fc区的那些生物学活性。免疫球蛋白效应子功能的例子包括：C1q结合和补体依赖的细胞毒性(CDC)、Fc受体结合作用、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌。除非另有说明，否则本文所述的X型嵌合抗体中使用的Fc结构域保留至少一种或多种或全部与其原始供体抗体中的Fc结构域所具有的功能特性相同的功能特性。
在某些实施方案中，可以将一个或多个其它氨基酸修饰引入本文公开的Fc结构域和/或Fc多肽序列中，由此产生相应的变体，以改变抗体效应子功能。例如Fc结构域和/或Fc多肽序列包含具有提高ADCC的一个或多个氨基酸置换，例如，在Fc多肽序列的位置298、333和/或334处的置换(EU编号)。
术语“效应细胞”指表达一种或者多种FcR并行使效应子功能的细胞，例如可以通过活化不同的表达Fc受体的效应子细胞而介导ADCC。介导ADCC功能的细胞例如是NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、外周血单个核细胞、单核细胞、细胞毒T细胞。效应细胞可以来源于天然环境，例如血液。
“Fc受体”或“FcR”指结合抗体Fc结构域的分子。在一些实施方案中，FcR是天然人FcR。在一些实施方案中，FcR是重组FcR。在一个具体实施方案中，本申请公开的X型抗体分子的FcR包含结合IgG的Fc区的受体(FcγR)，和结合IgA的Fc区的受体(FcαRI(CD89))。FcγR，包括FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)，具有不同的细胞表达谱，例如FcγRIIIA(CD16A)在巨噬细胞、单核细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)等细胞上均有表达。FcαRI组成型表达于多种髓系细胞，例如嗜中性粒细胞、巨噬细胞、Kuppfer细胞、单核细胞、粒细胞等。
术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指是细胞介导的免疫反应，其中某些细胞毒性细胞表面上存在的Fc受体识别靶细胞上结合的抗体，使得细胞毒性细胞可以特异性结合携带抗原的靶细胞，并激活免疫系统的效应细胞从而裂解靶细胞的作用。ADCC作用可以由例如自然杀伤细胞(NK)、巨噬细胞、噬中性粒细胞和嗜酸性粒细胞(嗜酸性球)介导。
术语“抗体依赖性细胞吞噬”或“ADCP”指一种细胞反应，其中通过结合靶细胞的抗体与巨噬细胞表面的相应受体结合，诱导激活巨噬细胞，从而使靶细胞内化和被吞噬体酸化降解。例如ADCP可以通过IgGFc区与其FcγR结合而介导，也可以通过IgAFc区与其FcαR结合而介导。
术语“依赖补体的细胞毒性”或“CDC”指补体参与的细胞毒性作用，其中结合靶标的抗体的Fc效应子结构域活化一系列补体级联反应，在靶细胞膜中形成孔洞，从而导致靶细胞死亡。
术语“接头”或“肽接头”等在本申请中可以互换使用，指包含一个或者多个连续氨基酸的肽，所述氨基酸例如是小氨基酸残基或亲水氨基酸残基(例如，甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺等)。接头通常包含长度为5-50个氨基酸，例如，10、15、20、25、30个氨基酸长度。本领域技术人员可以理解许多常用的肽接头可以用于本发明的实施方案中。
接头的一个示例是氨基酸序列(G4S)n，其中n是等于或大于1的整数，例如，n是1、2、3、4、5、6、7、8、9的整数，在本申请中，(G4S)n有时也描述为n×G4S，例如(G4S)6，也称作6×G4S，表示序列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：15)。接头的其他示例可以在序列中包含氨基酸的变换，例如GGGSG、GGSGG、GSGGG或SGGGG，还可以包括含有G或S以外的氨基酸残基的肽，例如GGTGS、GTSPGG、GNGGGS等，包括不同肽序列的混合物，例如G4S-GGSGG-G4S-SGGGG等。接头例如还可以是如下氨基酸序列：GGG、DGGGS、TGEKP、GGRR、EGKSSGSGSESKVD、KESGSVSSEQLAQFRSLD、GGRRGGGS、LRQRDGERP、LRQKDGGGSERP、和GSTSGSGKPGSGEGSTKG。
本申请另一接头示例是GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:16)，在本申请中也称为“218接头”。
术语“柔性连接肽”、“连接序列”或“连接肽”在本申请中可以互换使用，指包含接头和铰链区的一个或者多个的氨基酸序列。
在一个实施方案中，连接序列包含接头，例如上文所述的接头序列。
在另一个实施方案中，连接序列包含抗体铰链区，铰链区例如是包含“CPPC”的IgG铰链区序列(例如，氨基酸序列“EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:19)”或“EPKSSDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:20)”)、IgA铰链区序列VPSTPPTPSPSTPPTPSPS，VPPPPP。
在再一个实施方案中，连接序列包含接头和抗体铰链区。
或者，可以使用计算机程序模拟蛋白和肽的三维结构，或通过噬菌体展示方法，来合理地设计合适的可以用于本发明抗体分子连接各结构域的连接序列。
术语“连接的”、“融合至”、“融合的”或“融合”或其他类似表述可以互换使用。这些术语是指通过任何方式(包括化学缀合或重组手段)将两个或者两个以上的元件或组分通过肽键直接连接或经由接头连接在一起，典型地，将两个或者两个以上的元件或组分框内连接在一起。
如本文所用，术语“结合”或“特异性结合”意指结合作用对抗原是选择性的并且可以与不想要的或非特异的相互作用区别。抗原结合位点与特定抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域已知的常规结合测定法测定。
“亲和力”或“结合亲和力”指反映结合对子的成员之间相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶物Y的亲和力可以通常由解离常数(KD)代表，解离常数是解离速率常数和缔合速率常数(分别是kdis和kon)的比例。亲和力可以由本领域已知的常见方法测量。
氨基酸序列的“同一性百分数(％)”是指将候选序列与本说明书中所示的具体氨基酸序列进行比对并且如有必要的话为达到最大序列同一性百分数而引入空位后，并且不考虑任何保守置换作为序列同一性的一部分时，候选序列中与本说明书中所示的具体氨基酸序列的氨基酸残基相同的氨基酸残基百分数。在一些实施方案中，本发明考虑本发明抗体分子的变体，所述变体相对于在本文中具体公开的抗体分子及其序列而言具有相当程度的同一性，例如同一性为至少80％,85％,90％,95％,97％,98％或99％或更高。所述变体可以包含保守性修饰。
对于多肽序列，“保守性修饰”包括对多肽序列的置换、缺失或添加，它们导致某个氨基酸置换为化学上相似的氨基酸。提供功能上相似氨基酸的保守性置换表是本领域熟知的。这类保守性修饰的变体相对于本发明的多态性变体、物种间同源物和等位基因而言是附加的并且不排斥它们。以下8组含有互为保守替换的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参阅例如，Creighton,Proteins(1984))。在一些实施方案中，术语“保守序列修饰”用于指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。
术语“宿主细胞”指已经向其中引入外源多核苷酸的细胞，包括这类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，这包括原代转化的细胞和从其衍生的子代。宿主细胞是可以用来产生本发明抗体分子的任何类型的细胞系统，包括真核细胞，例如，哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞；和原核细胞，例如，大肠杆菌细胞。宿主细胞包括培养的细胞，也包括转基因动物、转基因植物或培养的植物组织或动物组织内部的细胞。
术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，其包含有效连接要表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其它元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中。表达载体包括本领域已知的所有那些，包括被掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸的或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
术语“个体”或“受试者”可互换地使用，是指哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如，奶牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。特别地，个体是人。
术语“治疗”指意欲改变正在接受治疗的个体中疾病之天然过程的临床介入。想要的治疗效果包括但不限于防止疾病出现或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低病情进展速率、改善或缓和疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体分子用来延缓疾病发展或用来减慢疾病的进展。
术语“抗肿瘤作用”或抑瘤作用指可以通过多种手段展示的生物学效果，包括但不限于例如，肿瘤体积减少、肿瘤细胞数目减少、肿瘤细胞增殖减少或肿瘤细胞存活减少。术语“肿瘤”和“癌症”在本文中互换地使用，涵盖实体瘤和液体肿瘤。
II.免疫缀合物和免疫衍生物
本发明还涉及本发明的X构型抗体与其他物质融合的分子(“免疫衍生物”，也称为“衍生的X构型抗体分子”)。在一些实施方案中，其它物质例如是受体分子、受体配体、细胞膜表面分子、其他抗体片段。在一个实施方案中，其他物质是SIRPα分子，例如是SIRPα胞外结构域。在一个实施方案中，所述物质可以融合在抗体重链或者轻链的N端或者C端。在一个具体实施方案中，所述物质融合在抗体轻链的N端。在再一个实施方案中，所述物质通过连接序列与抗体末端链接。在一个具体的实施方案中，所述连接序列包含接头。
在一些实施方案中，所述免疫衍生物用于预防或治疗肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤为癌症。在一些实施方案中，所述免疫衍生物用于预防或治疗感染，例如慢性感染，例如细菌感染、病毒感染、真菌感染、原生动物感染等。
本发明还涉及本发明的X构型抗体与其他物质缀合的分子(“免疫缀合物”)。在一些实施方案中，其它物质是例如治疗剂(如细胞毒性剂)。细胞毒性剂包括任何对细胞有害的药剂。适合于形成免疫缀合物的细胞毒性剂(例如化疗剂)的例子是本领域中已知的。例如，细胞毒性剂包括但不限于：放射性同位素；生长抑制剂；毒素如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物起源的酶促活性毒素，包括其片段和/或变体；和已知的各种抗肿瘤或抗癌剂。
III.药物组合物和试剂盒
在一个方面，本发明提供了组合物，例如，药物组合物，所述组合物包含与可药用载体配制在一起的本文所述的X构型抗体分子、衍生的X构型抗体分子、免疫衍生物、免疫缀合物。如本文所用，“可药用载体”包括生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。本发明的药物组合物适于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、直肠、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或输注)。在一些实施方案中，本发明X构型抗体分子是药物组合物中的唯一活性成分。在另一些实施方案中，药物组合物可以包含本文所述的抗体分子与一种以上治疗剂。
本发明的组合物可以处于多种形式。这些形式例如包括液体、半固体和固体剂型，如液态溶液剂(例如，可注射用溶液剂和可输注溶液剂)、分散体剂或混悬剂、脂质体剂和栓剂。优选的形式取决于预期的施用模式和治疗用途。本文中考虑各种剂量施用方案，包括但不限于，经不同时间点单次或多次施用，推注施用和脉冲输注。
本发明的药物组合物可以包含“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明所述的X构型抗体分子。“治疗有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需治疗结果的量。可以根据多种因素如疾病状态、个体的年龄、性别和重量等变动治疗有效量。治疗有效量是任何有毒或有害作用不及治疗有益作用的量。相对于未治疗的受试者，“治疗有效量”优选地抑制可度量参数(例如肿瘤生长率)至少约20％、更优选地至少约40％、甚至更优选地至少约60％和仍更优选地至少约80％。可以在预示人肿瘤中的功效的动物模型系统中评价本发明的X构型抗体分子抑制可度量参数(例如，肿瘤体积)的能力。
“预防有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需预防结果的量。通常，由于预防性剂量在受试者中在疾病较早阶段之前或在疾病较早阶段使用，故预防有效量小于治疗有效量。
包含本文所述X构型抗体分子的试剂盒也处于本发明的范围内。试剂盒可以包含一个或多个其他要素，例如包括：使用说明书；其他试剂，例如标记物或用于偶联的试剂；可药用载体；和用于施用至受试者的装置或其他材料。在一个实施方案中，本发明提供了包含本文所述抗体分子和使用说明书的治疗试剂盒、预防试剂盒、诊断试剂盒。
IV.本发明分子的用途和方法
由于本申请提供的X构型抗体可以包括针对任意靶标的抗原结合位点(VH/VL)，因此本申请的X构型抗体具有广泛的治疗用途，视其所针对的具体靶标，本领域技术人员将明了该具体X构型抗体所适用的具体疾病，例如，本申请X构型抗体可以用于治疗炎性疾病，细菌、真菌、病毒等病原体引起的感染，肿瘤，自身免疫性疾病。
在一个方面中，本申请提供了一种治疗疾病的方法，包括将本文公开的X构型抗体施用给受试者，优选地，所述受试者是哺乳动物，更优选地是人。在一个实施方案中，所述方法还包括向受试者施用有效量的至少一种另外的治疗剂。在治疗中，本文公开的X构型抗体可以单独使用或与其它药剂联合使用。例如，本文中报道的X构型抗体可以与至少一种另外的治疗剂共同施用。
在一个实施方案中，本发明提供一种治疗癌症的方法，包括将本文公开的X构型抗体施用给受试者。在一个实施方案中，所述癌症可以是目前免疫靶向治疗的任何癌症，例如骨癌、肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、淋巴瘤，例如B细胞淋巴瘤(例如霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤[NHL]、前体B细胞淋巴母细胞白血病/淋巴瘤、成熟B细胞肿瘤、B细胞慢性淋巴性白血病/小淋巴性淋巴瘤、B细胞前淋巴性白血病、淋巴浆细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、皮肤滤泡中心淋巴瘤、边缘区域B细胞淋巴瘤、毛状细胞白血病、弥漫性大型B细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、浆细胞瘤、浆细胞骨髓瘤、移植后淋巴增生病症、华氏(Waldenstrom’s)巨球蛋白血症及间变性大细胞淋巴瘤)、多发性骨髓瘤、黑素瘤、肾细胞癌、胰脏癌、头和颈癌、前列腺癌、恶性胶质瘤、骨肉瘤、结肠直肠癌、卵巢癌、子宫癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、滑液肉瘤、甲状腺癌、鳞状细胞癌、髓母细胞瘤、垂体腺瘤、星形细胞瘤等各种癌症。
在另一方面，本发明提供了X构型抗体与其他药物的联用。本发明X构型抗体与其他药物的联用可以产生治疗疾病的加和效应、协同效应等。其他药物可以是现有技术中常用的治疗特定疾病的一线药物、二线药物。例如可以是化疗剂、细胞毒性剂、抗体、小分子药物等。在一个具体的实施方案中，药物联用可以是本发明的X构型抗体和针对其他靶标的抗体分子联用。联用的分子可以在使用本申请的X构型抗体的同时、之前或者之后施用给受试者。
在一个具体的实施方案中，本发明公开了X构型抗体与抗CD47抗体的联用。
在再一方面中，本发明提供X构型抗体在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，所述药物用于治疗癌症
在一个方面，本发明提供了体外或体内检测生物样品，例如血清、精液或尿或组织活检样品(例如，来自过度增生性或癌性病灶)中存在相关抗原的诊断方法。该诊断方法包括：(i)在允许相互作用发生的条件下使样品(和任选地，对照样品)与如本文所述的抗体分子接触或向受试者施用所述抗体分子和(ii)检测所述抗体分子和样品(和任选地，对照样品)之间复合物的形成。复合物的形成表示存在相关抗原，并且可以显示本文所述治疗和/或预防的适用性或需求。
V.本发明示例性X抗体分子的序列
表A本发明示例X抗体分子抗体的CDR的氨基酸序列(基于Kabat编号规则)
实施例
以下是本发明的方法和组合物的实例，以辅助对本发明的理解。应理解，不应当以任何方式将实施例解释成限制本发明的保护范围。根据本申请说明书公开的内容，在不脱离本申请发明实质的前提下，本领域技术人员可以进行多种修改。
除非明确指明，否则本发明的实施将采用本领域技术内的常规化学、生物化学、有机化学、分子生物学、微生物学、重组DNA技术、遗传学、免疫学和细胞生物学的方法。
实施例1.构建X构型抗体并对其进行表达和纯化
作为本申请X构型抗体的示例，本实施例以已知抗CD20抗体Rituximab(利妥昔单抗)为基础进行构建，IgA Fc序列以IgA1的Fc序列作为基础进行构建。本实施例所述的X构型Rituximab抗体嵌合轻链的Fab与Fc之间的连接序列(包括接头和铰链区)为经过优化后的序列，连接序列的设计与选取的相关数据由后续实施例所述。
1.构建编码X构型Rituximab抗体的重链和嵌合轻链的基因
根据现有技术公开的内容，获得编码Rituximab的重链和轻链的基因序列信息，以及人IgA1恒定区CH2+CH3结构域(Fc多肽序列)的编码基因信息。在编码Rituximab轻链的基因序列和人IgA1恒定区CH2+CH3结构域的基因信息基础之上，设计编码本申请X构型Rituximab抗体嵌合轻链的基因序列。
在构建嵌合轻链时，需要在轻链恒定区和IgA1 Fc多肽序列之间加入接头序列。如后续实施例所验证的，发明人发现接头对于X构型抗体的组装至关重要，但在一定的长度范围内，其具体的序列的组成对嵌合轻链的表达和功能影响较小，可以根据实际情况进行选择。示例性的接头序列例如3×G4S-8×G4S序列，218接头等。本实施例选择了序列为6×G4S的接头，即(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS,SEQ ID NO：15)进行说明。另一方面，鉴于抗体的柔性铰链区除有助于避免空间位阻的影响以外，往往还具有提供二硫键等重要功能，因此往往不可或缺。如后续实施例所验证的，天然IgA1的铰链区(VPSTPPTPSPSTPPTPSPS，SEQ ID NO:17)虽然不影响X构型抗体分子的组装，但对抗体分子与FcγR的结合有显著影响。因此发明人在本实施例中将IgA1的铰链区替换成了IgA2的铰链区(VPPPPP，SEQ ID NO:18)。由此在本实施例中，发明人构建了结构为Rituximab轻链(VL+CL)-6×G4S接头-IgA2铰链区-IgA1 Fc的嵌合轻链(图2A)。
根据获得的编码基因信息，分别合成X构型Rituximab抗体重链基因和嵌合轻链基因(委托苏州金唯智生物科技有限公司合成)。之后利用Clon II(诺唯赞，货号：C112-01)重组反应体系，根据厂家说明书，将获得的基因编码序列分别连接到哺乳动物细胞表达载体pTT5(NovoPro，货号：V001466)中，获得包含编码Rituximab重链的基因的质粒和包含编码Rituximab嵌合轻链的基因的相应质粒。
对获得的质粒中的编码基因进行测序验证，由此确认获得了序列正确的编码基因。所述基因编码的X构型Rituximab抗体的重链氨基酸序列如下所示：
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:1)
本实施例使用的IgG1 Fc多肽序列是：
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO:21)。
所编码的嵌合轻链氨基酸序列如下所示：
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGVTFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAAYPESKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGK(SEQ ID NO:2)。
本实施例使用的IgA1 Fc多肽序列是：
CCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGVTFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAAYPESKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGK(SEQ IDNO：22)。
2.表达X构型Rituximab抗体
将HEK293F细胞(Thermo Fisher Scientific，货号R79007)传代培养于FreeStyleTM培养基(GibcoTM，货号：12338-018)中。转染前一天用新鲜的FreeStyleTM培养基将细胞密度调整为5-7.5×105个细胞/ml。转染当天细胞生长至1-1.5×106个细胞/ml。
取转染HEK293F细胞终体积1/20的FreeStyleTM培养基作为转染缓冲液，每ml转染缓冲液中加入20μg的质量比1:1的上述制备的分别包含重链和嵌合轻链的编码基因序列的重组质粒，混匀，每ml转染缓冲液中再加入60μg聚乙烯亚胺(PEI；Polysciences，货号：23966-1)，混匀，室温孵育20分钟，然后将PEI/DNA混合物轻柔倒入HEK293F细胞悬浮液中混匀，置于摇床培养，培养条件为8％CO2、36.5℃、120rpm。
本申请的抗体重链基因和嵌合轻链基因经HEK293F细胞表达，产生相应的重链多肽和嵌合轻链多肽。本领域已知天然IgG Fc序列不与IgA Fc序列发生相互作用。由于每条重链多肽的C端包含相同的IgG Fc序列，因此在两条IgG Fc序列的相互作用下，促使两条重链多肽链IgG Fc序列同二聚化形成IgG Fc区；同样地，由于每条嵌合轻链多肽的C端包含相同的IgA Fc序列，因此在两条IgA Fc序列的相互作用下，促使两条嵌合轻链多肽链IgA Fc序列同二聚化形成IgA Fc区；同时，位于一条重链N端的VH和CH1也与位于一条嵌合轻链N端的针对相同靶标的相应轻链(VL和CL)相互作用，组装形成相应的Fab，由此形成如图1B所示的由四条多肽链组成的完整的四叶草型X构型抗体。完整的四叶草型X构型抗体同时具有两个抗体Fab，一个IgA型抗体Fc区，和一个IgG型抗体Fc区。
3.纯化X构型Rituximab抗体
培养表达X构型Rituximab抗体的HEK293F细胞5天，然后收集培养物，以4000转/分钟离心30分钟，收集细胞培养物上清液，并用0.45μM滤膜过滤。将过滤后的上清液与PBS缓冲液以体积比1:1混匀，进行Protein A(GE Healthcare，货号：17528004)亲和层析。抗体结合于亲和层析柱后，用PBS缓冲液冲洗约10个柱体积，然后用0.1M glycine-HCl pH 3.0缓冲液洗脱抗体，收集洗脱液并立即用1M Tris-HCl pH 8.0缓冲液调节洗脱液的pH至7.4。
利用AKTA蛋白纯化仪(GE Healthcare，型号：pure)，将上述pH7.4的经Protein A亲和层析纯化的抗体洗脱液透析到PBS缓冲溶液中，按照厂商提供的说明书，进行分子大小排阻层析(Superdex 200increase 10/300GL分子筛层析柱；GE Healthcare，货号：28990944)，以进一步纯化抗体。采用凝胶电泳方法对每次获得的抗体进行检测验证。
纯化结果如图2所示，经Protein A亲和层析纯化后的X构型Rituximab抗体，以及继续经分子筛纯化后的X构型Rituximab抗体在非还原型SDS-PAGE检测中其主条带位于约200kD处(图2B箭头指示)，且经过分子筛层析之后，抗体纯度得到极大提高。理论上X构型Rituximab抗体的重链和嵌合轻链多肽的分子量分别为约49kD，考虑到多肽的糖基化，二者理论分子量均为约50kD，因此相应的四聚体分子的理论分子量应为约200kD。可见，图2B的非还原型PAGE结果初步证明本实施例表达的X构型Rituximab抗体形成了图1B中所示的四叶草X构型抗体。图2C的结果表明在还原型SDS-PAGE(采用巯基乙醇或DTT等还原剂并进行加热方法处理样品以使样品还原)检测中，解聚的四叶草X构型Rituximab抗体的每条多肽链均位于约50kD处(图2C箭头指示)，与理论值相一致。
图2D示出了在Superdex 200 increase 10/300GL分子筛层析纯化过程中的紫外光(UV280)吸收峰形图。其中X构型Rituximab抗体主峰位置在大约11.5ml处，对应分子量约为200kD，进一步证实了本实施例表达的X构型Rituximab抗体形成了期望的四叶草X构型。主峰组分在非还原和还原SDS-PAGE中，条带分别位于约200kD和约50kD处，均与理论值相符。
实施例2.X构型抗体的结构影像鉴定
首先用辉光放电清洁系统(PELCO Products Inc，型号：easiGlowTM)处理带有碳支持膜的300目铜网(EMS，货号：FCF300-Cu-50)。然后在碳支持膜上加3.5μl纯化的X构型Rituximab抗体溶液，一分钟后用滤纸吸干。再用三小滴1％(w/v)醋酸双氧铀依次清洁碳支持膜，并将膜风干。用配备有Ceta CCD相机的透射电子显微镜(Thermo FisherScientific，型号：Talos F200C)拍摄显微照片，照片像素大小为用EPU软件(ThermoFisher Scientific)以-1.5～-2.5μm的欠焦范围将显微照片记录下来，总共记录200张图像。
对收集到的图像数据用CTFFIND4软件进行CTF评估，然后使用Relion-3.0软件中的Lanplacian功能做无参考高斯自动拾取。初始共拾取了33,580个颗粒，经过三轮二维重构分类和舍弃，最终将其中的9,102个嵌合抗体颗粒分为15类，代表不同角度和不同构象下的X构型Rituximab抗体(图3)。嵌合抗体颗粒的图像直观显示本专利所述的X构型抗体形成了图1B中所示的四叶草X构型。
实施例3.不同长度和序列的接头对X构型抗体的影响
本实施例讨论了X构型抗体的嵌合轻链中不同长度和序列的接头对形成X构型抗体的影响，以分析适用于X构型抗体的嵌合轻链的接头。需要指出的是，如后续实施例所验证的，一定长度的接头是X构型抗体的组装所必需的元件。
按照实施例1中所述的方法，分别构建了包含不同接头的嵌合轻链序列，并由此获得接头不同的X构型Rituximab抗体，所述接头除实施例1中公开的6×G4S接头以外，还包括3×G4S、4×G4S、8×G4S和218接头。依次通过Protein A亲和层析、分子筛层析对所获得的各种抗体进行纯化，并鉴定所述X构型抗体的聚合状态。
结果如图4所示，包含上述不同接头的X构型抗体，在分子筛层析中的主峰位置均在大约11.5ml处，对应分子量约为200kD，与实施例1中所述的含有6×G4S接头的X构型Rituximab抗体一致。结合实施例2所提供的结构影像证据，上述分子筛层析结果表明，受到测试的接头序列均能使相应抗体主要以四叶草X构型方式组装。
在此受到测试的X构型抗体嵌合轻链中使用的接头，长度涵盖从15到40个氨基酸残基的范围；序列上既包含只有甘氨酸和丝氨酸的G4S序列，又包含拥有多种氨基酸残基的218接头。因此表明现有技术中通常采用的，长度适当，且具有一定柔性的无特定高级结构的多肽序列均可以适用于本申请的X构型抗体。当将所述柔性接头构建在本申请X构型抗体轻链和相应Fc序列之间时，其有利于促进抗体轻链与相应VH组装成Fab，促进相应Fc序列形成同二聚体，且不会对相应结构域的生物功能产生不利影响。
实施例4.X构型抗体对抗原和相应受体的识别和结合
本实施例利用表面等离子共振(SPR)技术检测了X构型抗体针对抗原(CD20)，和针对相应各个受体的结合情况。
首先将anti-His tag抗体通过氨基偶联试剂(Cytiva，货号：BR-1000-50)固定于Series S CM5芯片(Cytiva，货号：29-1049-88)上，然后将芯片安装到表面等离子共振仪(GE Healthcare，型号：Biacore T200)上。将带有His tag的抗原(CD20)或不同Fc受体用PBS缓冲液稀释至浓度400nM，并以10μl/min的流速流过芯片60s，进行进样捕获。其中F1通道为参比通道，不捕获任何抗原或受体，F2，F3，F4分别用于捕获抗原或不同的Fc受体。将X构型抗体，或用作对照的IgG或IgA形式的抗体溶于PBS缓冲液(通常为pH 7.4，仅在测定抗体与FcRn亲和力常数时用pH 6.0的PBS缓冲液)，并配置2倍系列稀释的溶液梯度，端浓度分别为500nM到15.625nM(500nM，250nM，125nM，……，15.625nM)。以30μl/min的流速进样，将上述不同种类和不同浓度抗体作为流动相分别依次流经F1，F2，F3，F4通道，结合120s，解离240s。然后用10mM Glycine-HCl(pH 1.5)再生缓冲液以流速30μl/min洗脱抗体30s，对芯片进行再生。抗体进样和芯片再生循环交替进行。利用仪器配套软件BiacoreT200Evaluation Software通过建立稳态结合模型或动力学分析，对所有的结合响应曲线进行拟合，得到对应的结合常数Ka和解离常数Kd，通过计算得到亲和力常数KD(KD＝Kd/Ka)。
本测试中采用的IgG对照是Rituximab抗体分子。IgA对照是发明人根据Rituximab的信息，将Rituximab的抗体F(ab)2序列与IgA的Fc区融合构建而成，其抗体重链序列如下：
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVVPSTPPTPSPSTPPTPSPSCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGVTFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAAYPESKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGK(SEQ ID NO:9)。
轻链序列如下：
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:10)。
SPR检测结果如下表1所示，X构型抗体保留了与抗原CD20，受体FcαRI(CD89)，FcRn以及各种FcγR的结合能力。X构型抗体针对各个测试分子的亲和力与对应的对照IgA型抗体或IgG型抗体相当，无数量级差异，甚至在一些指标上同时优于两种天然抗体。
表1.测定的X构型Rituximab抗体的亲和力
ND:不可检测
这些结果表明本申请构建的X构型抗体的各个结构部分(Fab、IgG Fc结构域、IgAFc结构域)均维持了野生型天然抗体相应结构的功能，具有发挥进一步生理功能的潜力。例如，本申请构建的X构型抗体保留了与抗原结合的亲和力，同时保留了IgG Fc区与相应受体(FcγRIII、FcγRII、FcγRI)以及与FcRn的结合能力，保留了IgA Fc区与相应受体(CD89)的结合能力。
实施例5.X构型Rituximab抗体的肿瘤细胞杀伤作用
Rituximab是一种特异性靶向CD20抗原的重组单克隆抗体，其通过多种效应功能发挥作用。Ramos细胞(ATCC目录号：CRL-1596)作为人B淋巴细胞瘤细胞，其细胞表面天然具有CD20分子，因此可作为Rituximab抗体的靶细胞，用于检测Rituximab的效应功能。
1.以嗜中性粒细胞作为效应细胞的肿瘤细胞杀伤效果
IgA抗体基于其Fc结构域与受体FcαRI(CD89)的结合，可以募集嗜中性粒细胞，从而发挥肿瘤杀伤作用。
在含有10％胎牛血清(FBS；GibcoTM，货号：16000-044)的RPMI-1640培养基(GibcoTM，货号：11875-085)中培养Ramos肿瘤细胞。用MACSxpress全血嗜中性粒细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，货号：130-104-434)，按照厂商提供的说明书，从人血液中分离嗜中性粒细胞，并对其进行计数。用含有10％FBS的RPMI-1640培养基，将分离得到的细胞数为2.5×105的嗜中性粒细胞与细胞数为104的Ramos肿瘤细胞混合在96孔培养皿中。向细胞中分别加入在含有10％FBS的RPMI-1640培养基中配置的X构型Rituximab抗体、Rituximab抗体或IgA型Rituximab抗体至终浓度分别为100，10，1，0.1，0.01μg/ml。用含有10％FBS的RPMI-1640培养基调整体系体积为200μl。将上述各体系一式三份，在37℃，5％CO2的条件下共孵育4小时。之后取上清液，用非放射性细胞毒性检测试剂盒(Promega，货号：G1780)，按照厂家说明，定量检测乳酸脱氢酶(LDH)的释放。LDH是一种稳定的胞质酶，细胞裂解时可以释放出来，其量与死亡的细胞数量成比例，因此用以分析Ramos细胞的裂解程度。用试剂盒提供的裂解液裂解相应数量的Ramos细胞所释放的LDH做为100％对照。
测试结果如图5A所示，嗜中性粒细胞作为效应细胞对Ramos细胞的ADCC杀伤效果随抗体浓度升高而提高，证明该杀伤效果具有抗体剂量依赖性。X构型Rituximab抗体所介导的对Ramos细胞的杀伤效果在各个浓度下均远高于IgG型Rituximab抗体，大约是后者的二到三倍；同时也高于IgA型Rituximab抗体。这些结果证明X构型抗体能够有效募集嗜中性粒细胞作为效应细胞杀伤肿瘤细胞。
2.以NK细胞作为效应细胞的肿瘤细胞杀伤效果
IgG抗体基于其Fc结构域与受体FcγR的结合，可以募集NK细胞，从而发挥ADCC作用。
用Ficoll-Paque Plus试剂(GE Healthcare，货号：17-1440-02)，按照厂商提供的说明书，从人血中分离人外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，再用EasySepTM人NK细胞分离试剂盒(STEMCELLTMTechnologies，货号:19855)，按照厂商提供的说明书，从PBMC中分离NK细胞，并对其进行计数。
用含有10％FBS的RPMI-1640培养基，将分离得到的细胞数为5×104的NK细胞与细胞数为104的Ramos肿瘤细胞混合在96孔培养皿中。并用本实施例第1节中所述方法检测X构型、IgG型或IgA型Rituximab抗体所介导的对Ramos细胞的ADCC杀伤效果。
测试结果如图5B所示，NK细胞作为效应细胞对Ramos细胞的ADCC杀伤效果总体随抗体浓度升高而提高，证明该杀伤效果是由抗体所介导的，并具有抗体剂量依赖性。X构型Rituximab抗体所介导的对Ramos细胞的ADCC杀伤效果在各个浓度下均高于IgG型Rituximab抗体和IgA型Rituximab抗体。这些结果证明X构型抗体同样能够有效募集NK细胞作为效应细胞杀伤肿瘤细胞。
3.以巨噬细胞作为效应细胞的肿瘤细胞杀伤效果
用本实施例第2节中所述的方法从人血中分离PBMC，再用CD14MicroBeads(Miltenyi Biotec，货号：130-050-201)，按照厂商提供的说明书，从PBMC中分离出CD14+单核细胞。将分离获得的CD14+单核细胞培养在含有20％FBS的RPMI-1640培养基中，添加巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)至终浓度50ng/ml，在37℃，5％CO2诱导2周后形成巨噬细胞。
将获得的巨噬细胞用绿色荧光染料CSFE(Biolegend,货号：423801)按照厂家说明书进行标记，同时用红色荧光染料PKH26(Sigma Aldrich，货号：mini26)按照厂家说明书标记Ramos细胞。将标记后的细胞数为5×104的巨噬细胞与细胞数为104的Ramos细胞混合，并且按本实施例5.1节中所述浓度分别加入X构型、IgG型或IgA型Rituximab抗体，在含有10％FBS的RPMI-1640培养基中，37℃，5％CO2培养4小时后用流式细胞仪(BD Biosciences，型号：LSR Fortessa)检测PKH26/CSFE红绿荧光双阳性细胞比例，用于表征巨噬细胞对Ramos细胞的ADCP吞噬杀伤作用。
测试结果如图5C所示，巨噬细胞作为效应细胞对Ramos细胞的ADCP吞噬杀伤效果总体随抗体浓度升高而提高，证明该杀伤效果是抗体剂量依赖性的。由于巨噬细胞同时拥有FcαRI和FcγR，因此无论X构型、IgG型或IgA型Rituximab抗体均对巨噬细胞有较强的募集作用。相较而言，IgG型Rituximab抗体介导的ADCP效果较X构型或IgA型Rituximab抗体弱，而X构型抗体在多数情况下所介导的ADCP效果略强于IgA型抗体。这些结果证明X构型抗体能够同时基于IgG Fc结构域和IgA Fc结构域与相应受体的相互作用而有效募集更多的巨噬细胞作为效应细胞，从而引发较强的ADCP作用，以杀伤肿瘤细胞。
实施例6.X构型Rituximab抗体在动物体内的肿瘤抑制活性
本实施例在动物水平证明了在抑制血液肿瘤方面，X构型抗体的活性优于IgG型和IgA型抗体。
在人源化FcαRI转基因小鼠(南模生物，货号：NM-KI-200063)体内，单核细胞(包括巨噬细胞)和粒细胞(包括嗜中性粒细胞)表面表达有人源化FcαRI受体，可与带有人IgAFc的抗体结合，作为效应细胞杀灭靶细胞。Eg7细胞系(ATCC，货号：CRL-2113)是一种小鼠T淋巴瘤细胞系。在Eg7细胞系的基础上，用慢病毒将人源CD20基因和荧光素酶(luciferase)报告基因分别导入，获得Eg7-hCD20-Luc细胞。该细胞在表面高度表达人CD20抗原的同时，在胞内表达荧光素酶，因此可氧化荧光素(luciferin)发出荧光，使细胞可视化。
将处于对数生长期的Eg7-hCD20-Luc细胞消化计数，然后向人源化FcαRI转基因小鼠的腹膜，按大约3×106个/只的细胞量进行接种注射。48小时后(第二日)，以每组3只，将小鼠随机分为4组，即接受PBS的负对照组，接受本申请X构型Rituximab抗体的实验组，接受IgG型Rituximab抗体或IgA型Rituximab抗体的阳性对照组。通过向小鼠腹腔注射100μL浓度为0.025g/mL的荧光素(Promega，货号：P1041)使肿瘤可视化，并用小动物活体光学三维成像系统(PerkinElmer，型号：IVIS Spectrum)记录肿瘤图像。此后，分别向小鼠腹腔注射PBS，或按10mg/kg的剂量向小鼠腹腔注射X构型Rituximab抗体或IgG型或IgA型Rituximab抗体。24小时后(第三日)，再次使用小动物活体光学三维成像系统记录肿瘤图像，并在后续按照动物福利及伦理要求，对小鼠进行处死。
肿瘤图像显示，与治疗前(第二日)相比，治疗后(第三日)，注射PBS的对照组小鼠体内肿瘤细胞进一步大幅增值(图6)。注射IgG或IgA型Rituximab抗体能显著迟滞肿瘤的生长，小鼠体内的肿瘤有小幅缩小(图6)。而注射X构型Rituximab抗体则能够大幅缩小小鼠体内的肿瘤，肿瘤缩减程度在70％以上(图6C)。这些结果证明，X构型抗体能够在小鼠体内发挥抑制血液肿瘤的作用，而且效果优于IgG型和IgA型抗体。
实施例7.X构型抗鼠CD19抗体的表达，纯化及动物体内活性
本实施例以已知抗鼠CD19(Anti-mCD19)抗体为例，一方面验证了X构型抗体构建方法的通用性，另一方面验证了X构型抗体在动物体内的活性。
1.构建编码X构型抗鼠CD19抗体的重链和嵌合轻链的基因
根据已公开的鼠源抗鼠CD19抗体Fab区轻链和重链序列，按照实施例1中所述方法，设计依次包含鼠源抗鼠CD19抗体的轻链序列-6×G4S接头-IgA2铰链区-IgA1 Fc序列的X构型抗鼠CD19抗体的嵌合轻链的基因序列，即将序列2(SEQ ID NO:2)中的Rituximab的VL-CL序列替换为鼠源抗鼠CD19的VL-CL序列。除此以外，再设计依次包含鼠源抗鼠CD19抗体的重链可变区序列-CH1-铰链区-人IgG1 Fc序列的基因序列，即将序列1(SEQ ID NO:1)中的Rituximab的VH序列替换为鼠源抗鼠CD19的VH序列，作为X构型抗鼠CD19抗体的嵌合重链基因序列。
分别合成上述的X构型抗鼠CD19抗体的嵌合重链基因和嵌合轻链基因(委托苏州金唯智生物科技有限公司合成)。按照施例1中所述方法，分别构建到哺乳动物细胞表达质粒中。对获得的质粒中的编码基因进行测序验证，由此确认获得了序列正确的编码基因。所述基因编码的X构型抗鼠CD19抗体的嵌合重链氨基酸序列如下所示：
EVQLQQSGAELVRPGTSVKLSCKVSGDTITFYYMHFVKQRPGQGLEWIGRIDPEDESTKYSEKFKNKATLTADTSSNTAYLKLSSLTSEDTATYFCIYGGYYFDYWGQGVMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:3)
所编码的嵌合轻链氨基酸序列如下所示：
DIQMTQSPASLSTSLGETVTIQCQASEDIYSGLAWYQQKPGKSPQLLIYGASDLQDGVPSRFSGSGSGTQYSLKITSMQTEDEGVYFCQQGLTYPRTFGGGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGVTFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAAYPESKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGK(SEQ ID NO:4)。
2.表达和纯化X构型抗鼠CD19抗体
按照实施例1中所述的方法，表达和纯化X构型抗鼠CD19抗体。经Protein A亲和层析纯化后的X构型抗鼠CD19抗体，以及继续经分子筛纯化后的X构型抗鼠CD19抗体在非还原型SDS-PAGE检测中其主条带位于约200kD处(图7A箭头指示)，且经过分子筛层析之后，抗体纯度得到极大提高。在Superdex 200increase 10/300GL分子筛层析纯化过程中，X构型抗鼠CD19抗体的紫外光(UV280)吸收主峰位置在大约11.5ml处，对应分子量约为200kD。上述数据证明本实施例表达的X构型抗鼠CD19抗体同样以四聚体形式存在，即形成了期望的四叶草X构型。
3.X构型抗鼠CD19抗体在动物体内的靶细胞清除活性
在人源化FcαRI转基因小鼠(南模生物，货号：NM-KI-200063)体内，单核细胞(包括巨噬细胞)和粒细胞(包括嗜中性粒细胞)表面表达有人源化FcαRI受体，可与带有人IgA Fc的抗体结合，作为效应细胞杀灭靶细胞。另一方面，CD19是由B细胞表达的一种表面CD分子，除浆细胞外的所有B细胞系，恶性B细胞都会表达该分子。因此，本实施例检测了所述带有人源IgA Fc的X构型抗鼠CD19抗体的生物学活性，即，介导人源化FcαRI转基因小鼠体内清除B细胞的活性。
将人源化FcαRI转基因小鼠随机分组，每组5只进行实验。分别按8mg/kg的用量，向小鼠腹腔注射X构型抗鼠CD19抗体或阳性对照IgA型抗鼠CD19抗体，阴性对照为PBS溶液。分别于注射后43hr，91hr，115hr，165hr，213hr及285hr尾静脉采血。分别根据厂商的说明，用带有FITC荧光标签的鼠CD45抗体(Biolegend，货号：157607)标记所采血液样本中的淋巴细胞，用带有APC荧光标签的鼠CD19抗体(Biolegend，货号：115511)标记所采血液样本中的B细胞，再用流式细胞仪(BD Biosciences，型号：LSR Fortessa)分析B细胞占所有淋巴细胞的百分比。
阳性对照IgA型抗鼠CD19抗体的氨基酸序列如下：
抗小鼠CD19 IgA 抗体重链序列：
EVQLQQSGAELVRPGTSVKLSCKVSGDTITFYYMHFVKQRPGQGLEWIGRIDPEDESTKYSEKFKNKATLTADTSSNTAYLKLSSLTSEDTATYFCIYGGYYFDYWGQGVMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVVPSTPPTPSPSTPPTPSPSCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGVTFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAAYPESKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGK(SEQ ID NO:11)
抗小鼠CD19 IgA抗体轻链序列：
DIQMTQSPASLSTSLGETVTIQCQASEDIYSGLAWYQQKPGKSPQLLIYGASDLQDGVPSRFSGSGSGTQYSLKITSMQTEDEGVYFCQQGLTYPRTFGGGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:12)。
结果如图7C所示，阴性对照组的FcαRI转基因小鼠外周血中的B细胞数量稳定约占所有淋巴细胞数量的60％，不随时间变化。注射有X构型或IgA型抗鼠CD19抗体的转基因小鼠在43hr时，外周血中的B细胞数量均降至仅占所有淋巴细胞数量的约5％，这证明所注射的两种抗体均能在体内有效清除其所靶向的细胞。至91hr时，注射过抗体的两组小鼠外周血中的B细胞占比均略有回升至约10％。此后，注射有IgA型抗鼠CD19抗体的转基因小鼠外周血中的B细胞占比迅速回升，至165hr时已回升至将近60％，基本达到对照组水平，并在此后维持基本恒定。而注射有X构型抗鼠CD19抗体的转基因小鼠外周血中的B细胞占比则一直回升缓慢，至165hr时占比低于30％，直到285hr时占比仍显著低于阴性对照组和注射IgA型抗体组。这些结果证明相较于IgA型抗体，X构型抗体能够更为长效地发挥作用，反映出X构型抗体具有更长的半衰期。由于人IgG型抗体的Fc端与小鼠FcRn受体之间存在交叉反应，因此在小鼠体内该型抗体可维持较长的半衰期。X构型抗体在小鼠体内具有更长的半衰期这一现象证明其所拥有的IgG Fc在动物体内能够发挥应有的作用。
综上，人源化FcαRI转基因小鼠B细胞清除实验表明，本申请构建的X构型抗体的各个部分(包括IgA Fc区，IgG Fc区以及Fab端)在动物体内均能正常行使功能。可见，即便针对不同种来源的抗体可变区，本实施例构建的X构型抗体依然能够保留其识别靶标的功能，并且鉴于同时发挥正常功能的IgG Fc结构域、IgA Fc结构域的联合作用，因此可以募集更多的效应细胞，从而更有效的对表达靶标抗原的肿瘤细胞发挥杀伤作用。
实施例8.X构型和反式X构型Trastuzumab抗体的表达、纯化及其功能表征
本实施例以已知抗Her2抗体Trastuzumab(曲妥珠单抗)为例，一方面进一步验证了X构型抗体构建方法的通用性，另一方面还验证接在抗体轻重链上的不同免疫球蛋白类别的Fc结构域对X构型抗体的组装和生物学功能的影响。本实施例还证明了如果嵌合轻链不使用接头，而是简单地将Fab轻链通过铰链区与Fc连接将难以与重链组装成X构型抗体。
1.X构型Trastuzumab抗体的表达、纯化和功能表征
本节以已知抗Her2抗体Trastuzumab(曲妥珠单抗)为基础，使用与前述实施例相同的构建方案，进一步验证了X构型抗体构建方法的通用性
1.1.构建编码X构型Trastuzumab抗体的重链和嵌合轻链的基因
根据已公开的IgG型Trastuzumab抗体轻链和重链序列，按照实施例1中所述方法，设计依次包含Trastuzumab抗体的轻链序列-6×G4S接头-IgA2铰链区-IgA1 Fc序列的X构型Trastuzumab抗体的嵌合轻链(图8A)，即将序列2(SEQ ID NO:2)中的Rituximab的VL-CL序列替换为Trastuzumab的VL-CL序列。再设计依次包含Trastuzumab抗体的重链可变区序列-CH1-铰链区-人IgG1 Fc序列的基因序列，即将序列1(SEQ ID NO:1)中的Rituximab的VH序列替换为Trastuzumab的VH序列，作为X构型Trastuzumab抗体的嵌合重链基因序列。
分别合成X构型Trastuzumab抗体的重链基因和嵌合轻链基因(委托苏州金唯智生物科技有限公司合成)。按照实施例1中所述方法，分别构建到哺乳动物细胞表达质粒中。对获得的质粒中的编码基因进行测序验证，由此确认获得了序列正确的编码基因。所述基因编码的X构型Trastuzumab抗体的重链氨基酸序列如下所示：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:5)。
所编码的嵌合轻链氨基酸序列如下所示：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGVTFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAAYPESKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGK(SEQ ID NO:6)。
此外，实验室构建了用作对照的包含Trastuzumab的抗原识别位点的IgA型抗体，其中抗人Her2 IgA抗体重链序列如SEQ ID NO:7所示，抗人Her2 IgA抗体轻链序列如下所示：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:14)。
1.2.表达和纯化X构型Trastuzumab抗体
按照实施例1中所述的方法，表达和纯化X构型Trastuzumab抗体。经Protein A亲和层析纯化以及继续经分子筛纯化后的X构型Trastuzumab抗体在非还原型SDS-PAGE检测中其条带位于约200kD处(图8B箭头指示)，且纯度较高。在Superdex 200increase 10/300GL分子筛层析纯化过程中，X构型Trastuzumab抗体的紫外光(UV280)吸收主峰位置在大约11.5ml处，对应分子量约为200kD。数据证明本实施例表达的X构型Trastuzumab抗体同样以四聚体形式存在，即形成了期望的四叶草X构型。
1.3.X构型Trastuzumab抗体对抗原和相应受体的识别和结合
按照实施例4中所述的方法，利用SPR技术检测X构型Trastuzumab抗体针对抗原(Her2)、受体FcαRI(CD89)、以及IgG Fc的重要受体FcγRIIIa(F158型)的结合情况。
结果如下表2所示，X构型Trastuzumab抗体与抗原Her2的亲和力与作为对照的IgA型抗体或IgG型抗体相比，均处于同一水平。X构型Trastuzumab抗体与CD89的亲和力与IgA型抗体相当，与FcγRIIIa的亲和力与IgG型抗体相当。这些结果表明本实施例中构建表达纯化的X构型Trastuzumab抗体的各个结构部分(Fab、IgG Fc结构域、IgA Fc结构域)均维持了野生型天然抗体相应结构的功能。可见，本实施例构建的针对另一个不同靶标的X构型抗体不仅能够保留其识别靶标的功能，而且鉴于同时发挥正常功能的IgG Fc结构域、IgA Fc结构域的联合作用，因此可以募集更多的效应细胞，从而更有效的对表达靶标抗原的肿瘤细胞发挥杀伤作用。
表2.测定的X构型Trastuzumab抗体的亲和力
ND:不可检测
2.反式X构型Trastuzumab抗体的表达、纯化及其功能表征
为了验证接在抗体轻重链上的不同免疫球蛋白类别的Fc结构域对X构型抗体的组装和生物学功能是否有影响，本节构建了在抗体重链上嵌合IgA Fc多肽，而在抗体轻链上嵌合IgG Fc多肽的X构型抗体分子。仅仅是出于与前述实施例中构建的在抗体重链上嵌合IgG Fc多肽，而在抗体轻链上嵌合IgA Fc多肽的X构型抗体分子相区别的目的，将本实施例中构建的抗体称为反式X构型抗体(RX-body)，其实际上依然具有如图1B所述的X构型。因此，不能将表述“反式X构型”中的限定词“反式”解释为是对抗体的总体构型结构的否定。
本实施例以Trastuzumab抗体为基础构建了重链含有IgA Fc多肽，轻链含有IgGFc多肽的X构型抗体，并验证了其可组装性和功能。
2.1.构建编码反式X构型Trastuzumab抗体的重链和嵌合轻链的基因
根据已公开的IgG型Trastuzumab抗体轻链和重链序列，设计IgA1型Trastuzumab抗体重链基因序列。该基因序列中依次包含Trastuzumab抗体的VH-CH1-IgA1铰链区-IgA1Fc序列(图8C)。另一方面，设计依次包含Trastuzumab抗体的轻链序列-6×G4S接头-IgG1铰链区-IgG1 Fc序列的反式X构型Trastuzumab抗体的嵌合轻链的基因序列(图8C)。
分别合成上述反式X构型Trastuzumab抗体的重链基因和嵌合轻链基因(委托苏州金唯智生物科技有限公司合成)。按照实施例1中所述方法，分别构建到哺乳动物细胞表达质粒中。对获得的质粒中的编码基因进行测序验证，由此确认获得了序列正确的编码基因。所述基因编码的反式X构型Trastuzumab抗体的重链氨基酸序列如下所示：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVVPSTPPTPSPSTPPTPSPSCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGVTFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAAYPESKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGK(SEQ ID NO：7)
所编码的嵌合轻链氨基酸序列如下所示：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：8)。
2.2.表达和纯化反式X构型Trastuzumab抗体
反式X构型Trastuzumab抗体的表达和纯化方法如实施例1中所述。经Protein A亲和层析纯化以及继续经分子筛纯化后的反式X构型Trastuzumab抗体在非还原型SDS-PAGE检测中其主要条带位于约200kD处(图8D箭头指示)。在Superdex 200increase 10/300GL分子筛层析纯化过程中，反式X构型Trastuzumab抗体的紫外光(UV280)吸收主峰位置在大约11.5ml处，对应分子量约为200kD。数据证明本实施例表达的反式X构型Trastuzumab抗体同样可以四聚体形式组装，即形成期望的四叶草X构型。
与本实施例所述X构型Trastuzumab抗体相比(图8B)，分子筛层析峰形图显示，经Protein A亲和层析纯化的反式X构型Trastuzumab抗体中存在较多的高聚组分(图8D)。这可能是由于本实施例中的反式X构型抗体采用含有多个天然糖基化位点的IgA1铰链区在空间位阻上影响了抗体组装所引起的，因此在组装效率上比采用IgA2铰链区进行组装低。
2.3.反式X构型Trastuzumab抗体对抗原和相应受体的识别和结合
按照实施例4中所述的方法，利用SPR技术检测反式X构型Trastuzumab抗体针对抗原(Her2)，受体FcαRI(CD89)，以及IgG Fc的重要受体FcγRIIIa(F158型)的结合情况。
结果如下表3所示，反式X构型Trastuzumab抗体与抗原Her2的亲和力与本实施例所述对照IgA型抗体或IgG型抗体相比，均处于同一水平。与IgA型抗体相比，反式X构型Trastuzumab抗体表现出了与CD89较高亲和能力。但与IgG型抗体相比，反式X构型Trastuzumab抗体虽然表现出了与FcγRIIIa的亲和力，但亲和力较低，仅略高于IgG型抗体的十分之一。
表3.测定的反式X构型Trastuzumab抗体的亲和力
ND:不可检测
天然IgA1的铰链区(VPSTPPTPSPSTPPTPSPS，SEQ ID NO:17)含有多个糖基化位点，而天然IgA2的铰链区(VPPPPP，SEQ ID NO:18)缺乏糖基化位点。反式X构型Trastuzumab抗体所表现出的较低的受体亲和力可能是由于IgA1铰链区的位点糖基化在空间位阻上影响了抗体与受体的相互作用，然而用于结合抗原的Fab区由于与IgA1铰链区距离较远，因此未受到影响。
综上，在抗体重链上嵌合IgA Fc多肽，而在抗体轻链上嵌合IgG Fc多肽的构建方式同样可以形成主要以X构型存在的抗体分子。IgA1铰链区对Fab和IgA Fc结构域的功能没有影响，但显著影响IgG Fc结构域与FcγR的结合，证明抗体铰链区的选择与抗体分子的各个结构部分能否有效发挥功能密切相关。因此，当需要FcγR参与相应功能时，优选IgA2铰链区，即使是在使用IgA1 Fc的情况下；当应用于不希望FcγR参与的特定场景时，则优选IgA1铰链区。
3.不含有接头难以形成X构型抗体
前述实施例证明嵌合轻链中一定长度范围内的接头对X构型抗体的形成影响较小。本节则证明该一定长度的接头是X构型抗体的组装所必需的元件。
3.1.构建编码不含有接头的Trastuzumab抗体的嵌合轻链的基因
设计依次包含Trastuzumab抗体的轻链序列-IgG1铰链区-IgG1 Fc序列的嵌合轻链的基因序列(图8E)，即在上述反式X构型Trastuzumab抗体嵌合轻链的基础上去除接头。
合成上述不含有接头的Trastuzumab抗体的嵌合轻链的基因(委托苏州金唯智生物科技有限公司合成)。按照实施例1中所述方法，构建到哺乳动物细胞表达质粒中。对获得的质粒中的编码基因进行测序验证，由此确认获得了序列正确的编码基因。所述基因编码的嵌合轻链氨基酸序列如下所示：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：23)。
3.2.表达和纯化不含有接头的Trastuzumab抗体
按照实施例1中所述方法，表达和纯化由SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：23组成的不含有接头的Trastuzumab抗体。经Protein A亲和层析纯化后，不含有接头的Trastuzumab抗体在非还原型SDS-PAGE检测中没有明显主带，尤其在约200kD处(图8F箭头指示)没有明显条带(图8F)。这一结果证明不含有接头的Trastuzumab抗体不能以四聚体形式组装，即形成期望的四叶草X构型。与反式X构型Trastuzumab抗体相比，不含有接头的Trastuzumab抗体仅仅是在嵌合轻链中缺少了接头部分，却导致无法形成X构型，这表明接头是X构型抗体正确组装所不可或缺的元件。
综合本实施例全部数据可见，嵌合轻链的设计不能简单地将抗体Fab轻链通过抗体铰链区与Fc相连。抗体轻链与Fc之间的接头的存在与否对于X构型抗体能否形成起决定性作用。抗体铰链区的选择则对X构型抗体各结构部分能否正常发挥功能至关重要。
实施例9.X构型Trastuzumab抗体以嗜中性粒细胞作为效应细胞的肿瘤细胞杀伤效果
Trastuzumab是一种特异性靶向Her2抗原的重组单克隆抗体，其通过多种效应功能发挥作用。SKBR3细胞(ATCC目录号：HTB-30)作为人乳腺癌细胞，其细胞表面天然具有Her2分子，因此可作为Trastuzumab抗体的靶细胞，用于检测Trastuzumab的效应功能。
本实施例所用X构型Trastuzumab抗体为实施例8中第1部分所述X构型Trastuzumab抗体，用作对照的IgG型和IgA型Trastuzumab抗体亦为实施例8中所述用作对照的IgG型和IgA型Trastuzumab抗体。实验方法参照实施例5中所述的以嗜中性粒细胞作为效应细胞时X构型Rituximab抗体的肿瘤细胞杀伤作用的检测方法，唯一不同是培养SKBR3细胞所用培养基为McCoy's 5a培养基(GibcoTM，货号：16600-082)。
测试结果如图9所示，嗜中性粒细胞作为效应细胞对SKBR3细胞的ADCC杀伤效果随抗体浓度升高而提高，证明该杀伤效果具有抗体剂量依赖性。X构型Trastuzumab抗体所介导的对SKBR3细胞的杀伤效果在各个浓度下均高于IgG型Trastuzumab抗体，同时在多数浓度下也高于IgA型Trastuzumab抗体。这些结果证明X构型抗体能够有效募集嗜中性粒细胞作为效应细胞杀伤肿瘤细胞。
实施例10.X构型Trastuzumab抗体在动物体内的肿瘤抑制活性
本实施例在动物水平证明了在抑制实体肿瘤方面，X构型抗体的活性优于IgG型和IgA型抗体。
1.X构型Trastuzumab抗体对MC38-hHer2肿瘤的抑制作用
在人源化FcαRI转基因小鼠(南模生物，货号：NM-KI-200063)体内，单核细胞(包括巨噬细胞)和粒细胞(包括嗜中性粒细胞)表面表达有人源化FcαRI受体，可与带有人IgA Fc的抗体结合，作为效应细胞杀灭靶细胞。另一方面，MC38-hHer2细胞系是细胞表面高度表达人Her2抗原的稳定转染细胞系。该细胞系是发明人根据常规方法，在鼠源MC38细胞系(CelloncoTM，货号：IOC-ZP093)的基础上，用慢病毒将人源Her2基因导入而获得的细胞系。本实施例采用与实施例9中相同的抗体进行实验。
将处于对数生长期的MC38-hHer2细胞消化计数，将约11周龄人源化FcαRI转基因小鼠背部剃毛后，皮下接种MC38-hHer2细胞约5×105个/只。肿瘤接种1周后，开始观测肿瘤大小，待肿瘤尺寸长至约50mm3时(约10天)，将小鼠随机分为4组，每组5只。分别给小鼠腹腔注射X构型Trastuzumab抗体或IgG型或IgA型Trastuzumab抗体，或作为负对照的PBS。抗体给药浓度为10mg/kg，每三天注射1次，共注射3次，并每三天测量小鼠负荷肿瘤大小，肿瘤体积计算公式为：长度×宽度2×0.5。待小鼠负荷肿瘤大小超过2000mm3时，按照动物福利及伦理要求，对小鼠进行处死。
肿瘤尺寸测量结果显示，相较于注射PBS，注射X构型Trastuzumab抗体能显著(统计学显著性)迟滞肿瘤的生长(图10A)。同时，X构型Trastuzumab抗体的肿瘤抑制活性还显著(统计学显著性)高于IgG和IgA型Trastuzumab抗体(图10A)。对应的小鼠生存曲线同样显示，相较于注射IgG或IgA型Trastuzumab抗体的荷瘤小鼠，注射X构型Trastuzumab抗体的荷瘤小鼠拥有显著(统计学显著性)较长的生存时间(图10B)。
2.X构型Trastuzumab抗体对MB49-hHer2恶性肿瘤的抑制作用
MB49-hHer2细胞系是细胞表面高度表达人Her2抗原的稳定转染细胞系。该细胞系是发明人根据常规方法，在鼠源恶性肿瘤MB49细胞系(Merck，货号：SCC148)的基础上，用慢病毒将人源Her2基因导入而获得的细胞系。
按照上述检测X构型Trastuzumab抗体对MC38-hHer2肿瘤的抑制作用的方法，发明人在人源化FcαRI转基因小鼠(南模生物，货号：NM-KI-200063)体内，检测了X构型Trastuzumab抗体对MB49-hHer2恶性肿瘤的抑制作用。结果显示相较于注射PBS，注射X构型Trastuzumab抗体能够显著(统计学显著性)迟滞肿瘤的生长(图10C)。同时，X构型Trastuzumab抗体能够比IgG和IgA型Trastuzumab抗体更好地延缓肿瘤的生长，尤其是X构型Trastuzumab抗体的肿瘤抑制效果显著(统计学显著性)优于IgA型Trastuzumab抗体。小鼠生存曲线同样显示，相较于注射PBS或IgG、IgA型Trastuzumab抗体，注射X构型Trastuzumab抗体的荷瘤小鼠拥有更长的中位生存时间(图10D)。
综上，这些结果证明X构型抗体拥有优于其他类型抗体的实体肿瘤抑制活性。

Claims (21)

1.一种X构型抗体分子，其包括2条相同的抗体重链和2条相同的抗体轻链，所述抗体重链和抗体轻链分别包含如下结构：
(1)抗体重链从N端至C端依次包含抗体的重链可变区(VH)-CH1-连接序列-IgG Fc序列，抗体轻链从N端至C端依次包含抗体的轻链可变区(VL)-轻链恒定区(CL)-连接序列-IgAFc序列；或者
(2)抗体重链从N端至C端依次包含抗体的重链可变区(VH)-CH1-连接序列-IgA Fc序列，抗体轻链从N端至C端依次包含抗体的轻链可变区(VL)-轻链恒定区(CL)-连接序列-IgGFc序列；
其中，一条重链的VH和CH1与一条轻链的VL和CL分别相互作用组装形成相应的Fab，由此X构型抗体分子一共形成2个具有相同抗原结合位点的Fab；
其中两条相同的IgG Fc序列同二聚化形成IgG Fc区；两条相同的IgA Fc序列同二聚化形成IgA Fc区。
2.权利要求1的X构型抗体分子，其中所述IgG Fc序列选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类中任一的Fc序列，任选地，所述IgG Fc序列包含修饰；任选地，所述IgG Fc序列的CH2和CH3可以来自相同的Fc序列、不同的Fc序列或者不同亚类的Fc序列；
其中所述IgA Fc序列选自IgA亚类的任一序列，任选地，所述IgA Fc序列包含修饰；任选地，所述IgA Fc序列的CH2和CH3可以来自相同的Fc序列、不同的Fc序列或者不同亚类的Fc序列。
3.权利要求1-2中任一的X构型抗体分子，其中所述IgG Fc序列是IgG1的Fc序列。
4.权利要求3的X构型抗体分子，其中所述IgG Fc包含SEQ ID NO:21所示的Fc序列，或者包含与SEQ ID NO:21所示Fc序列具有至少90％同一性的Fc序列。
5.权利要求1-4中任一项的X构型抗体分子，其中所述IgA Fc选自IgA1 Fc序列或IgA2Fc序列。
6.权利要求5的X构型抗体分子，其中所述IgA Fc包含SEQ ID NO:22所示的Fc序列，或者包含与SEQ ID NO:22所示Fc序列具有至少90％同一性的Fc序列。
7.权利要求1-6中任一项的X构型抗体分子，其中所述连接序列包含铰链区和/或接头，任选地，重链包含的连接序列和轻链包含的连接序列相同或者不同。
8.权利要求7的X构型抗体分子，其中所述铰链区和与其连接的Fc多肽序列同源或者异源。
9.权利要求7的X构型抗体分子，其中所述接头选自(G4S)n或218序列，其中n是等于或大于1的整数。
10.权利要求7或8的X构型抗体分子，其中所述铰链区选自SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20。
11.权利要求1-10中任一项的X构型抗体分子，其中所述CH1和/或CL可以和与其连接的VH和/或VL同源或者异源，或者所述CH1和/或CL可以和与其连接的Fc序列同源或者异源，或者所述CH1和/或CL是已知的常用CH1、CL。
12.权利要求1-11中任一项的X构型抗体分子，其中
(1)抗体VH包含SEQ ID NO:44中所示的3个重链CDR，抗体VL包含SEQ ID NO:45中所示的3个轻链CDR；
(2)抗体VH包含SEQ ID NO:46中所示的3个重链CDR，抗体VL包含SEQ ID NO:47中所示的3个轻链CDR；或
(3)抗体VH包含SEQ ID NO:48中所示的3个重链CDR，抗体VL包含SEQ ID NO:49中所示的3个轻链CDR。
13.权利要求1-12中任一项的X构型抗体分子，其中
(1)抗体VH包含SEQ ID NO:26、27、28所示的3个重链CDR，抗体VL包含SEQ ID NO:29、30、31所示的3个轻链CDR；
(2)抗体VH包含SEQ ID NO:32、33、34所示的3个重链CDR，抗体VL包含SEQ ID NO:35、36、37所示的3个轻链CDR；或
(3)抗体VH包含SEQ ID NO:38、39、40所示的3个重链CDR，抗体VL包含SEQ ID NO:41、42、43所示的3个轻链CDR。
14.权利要求1-13中任一项的X构型抗体分子，其中
(1)抗体VH包含SEQ ID NO:44所示的序列或者与SEQ ID NO:44具有至少90％同一性的序列，抗体VL包含SEQ ID NO:45所示的序列或者与SEQ ID NO:45具有至少90％同一性的序列；
(2)抗体VH包含SEQ ID NO:46所示的序列或者与SEQ ID NO:46具有至少90％同一性的序列，抗体VL包含SEQ ID NO:47所示的序列或者与SEQ ID NO:47具有至少90％同一性的序列；或
(3)抗体VH包含SEQ ID NO:48所示的序列或者与SEQ ID NO:48具有至少90％同一性的序列，抗体VL包含SEQ ID NO:49所示的序列或者与SEQ ID NO:49具有至少90％同一性的序列。
15.权利要求1-14中任一项的X构型抗体分子，其中
(1)所述抗体重链包含SEQ ID NO:1所示的序列或者与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的序列,抗体轻链包含SEQ ID NO:2所示的序列或者与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的序列；
(2)所述抗体重链包含SEQ ID NO:3所示的序列或者与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性的序列,抗体轻链包含SEQ ID NO:4所示的序列或者与SEQ ID NO:4具有至少90％同一性的序列；
(3)所述抗体重链包含SEQ ID NO:5所示的序列或者与SEQ ID NO:5具有至少90％同一性的序列,抗体轻链包含SEQ ID NO:6所示的序列或者与SEQ ID NO:6具有至少90％同一性的序列；或
(4)所述抗体重链包含SEQ ID NO:7所示的序列或者与SEQ ID NO:7具有至少90％同一性的序列,抗体轻链包含SEQ ID NO:8所示的序列或者与SEQ ID NO:8具有至少90％同一性的序列。
16.一种制备如权利要求1-15中任一项所述的X构型抗体分子的方法，包括：
(1)获得所述抗体分子的重链可变区和轻链可变区的编码序列或氨基酸序列，
(2)构建如权利要求1-12中任一项的X构型抗体分子的相应X构型抗体重链序列和轻链序列，
(3)在合适条件下表达步骤2获得的抗体重链和轻链序列，其中两条重链多肽和两条轻链多肽以四聚体的形式组装成X构型抗体，其中，VH-CH1与VL-CL组装形成相应的Fab，两条相同的IgG Fc序列同二聚化形成IgG Fc区；两条相同的IgA Fc序列同二聚化形成IgA Fc区，由此获得相应的X构型抗体分子；
(4)任选地，纯化所述X构型抗体分子。
17.一种将单克隆抗体改造为如权利要求1-15中任一项所述的X构型抗体分子的方法，包括：
(1)将所述单克隆抗体的轻链序列改造成结构为VL-CL-连接序列-IgA Fc序列的X构型抗体轻链序列，或者
将所述单克隆抗体的轻链序列改造成结构为VL-CL-连接序列-IgG Fc序列的X构型抗体轻链序列，将单克隆抗体的重链序列改造成结构为VH-CH1-连接序列-IgA Fc序列的X构型抗体重链序列；
(2)在合适的条件下表达步骤(1)获得的X构型抗体轻链和重链，其中两条重链多肽和两条嵌合轻链多肽以四聚体的形式组装成X构型抗体，其中，VH-CH1与VL-CL组装形成相应的Fab，两条重链所包含的相同Fc序列同二聚化；两条X构型抗体轻链所包含的相同Fc序列同二聚化，由此获得相应的X构型抗体分子；
(3)任选地，纯化所述X构型抗体分子。
18.一种药物组合物，其包含权利要求1-15中任一项的X构型抗体分子和可药用载体。
19.一种治疗疾病的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的权利要求1-15中任一项的X构型抗体分子，或者施用有效量的权利要求18所述的药物组合物。
20.权利要求1-15中任一项的X构型抗体分子在制备用于治疗受试者的疾病中的用途。
21.权利要求19的方法或者权利要求21的用途，其中所述疾病是癌症。
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