CN104395511A

CN104395511A - 纺前染色蛋白纤维及其制造方法

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Publication number: CN104395511A
Application number: CN201380034158.4A
Authority: CN
Inventors: 石川瑞季; 关山和秀
Original assignee: Spiber Inc
Current assignee: Sibabo Intellectual Property Management Contract Co
Priority date: 2012-06-28
Filing date: 2013-04-26
Publication date: 2015-03-04
Anticipated expiration: 2033-04-26
Also published as: US20150141618A1; JPWO2014002605A1; EP2868782A4; EP2868782B1; JP5407006B1; JP5407009B1; EP2868782A1; CN104395511B; WO2014002605A1; JP2014029054A; US9689089B2

Abstract

本发明的纺前染色蛋白纤维为当将蛋白纤维记为100质量％时蚕丝蛋白为0～100质量％、蛛丝蛋白来源的多肽为100～0质量％的纺前染色蛋白纤维，其中，所述纺前染色蛋白纤维含有纺前染色色素。该纤维是如下得到的：通过将纺前染色色素预先溶解或分散在纺丝液所用的溶剂中或者溶解或分散在二甲基亚砜中制成着色液，在所述着色液中加入纺丝液所需量的溶剂，在所述溶剂中加入蛋白粉体并溶解，制成纺丝液(6)，进行湿式纺丝或干湿式纺丝。由此，提供成本低、纺前染色色素均匀分散在纤维内且能够表现出鲜艳的色调的纺前染色蛋白纤维及其制造方法。

Description

纺前染色蛋白纤维及其制造方法

技术领域

本发明涉及在纺丝工序之前添加了纺前染色色素的纺前染色蛋白纤维及其制造方法。

背景技术

蛋白纤维已知有属于再生蚕丝纤维(silk fiber)的丝蛋白纤维、人工蛛丝纤维等。关于这些纤维的纺前染色纤维也已提出了几种。例如专利文献1中提出了，在六氟异丙醇(HFIP)溶剂中加入蚕丝蛋白(silk fibroin)和血红素、然后挤出到甲醇凝固液中进行纺丝、冷拉伸。作为人工蛛丝纤维，例如专利文献2的实施例6中记载了将Sudan Red，Nile Red(均为颜料)添加到纺丝液中、实施例7中记载了将Green Fluorescent Protein(绿色荧光蛋白，GFP)添加到纺丝液中。

但是，颜料在纺丝液中的分散性存在问题，GFP存在成本高的问题。当在纺丝液中的分散性或溶解性差时，存在纺丝工序时不仅会发生断头、而且难以获得均匀组成的纺前染色纤维的问题。此外，还存在难以表现出鲜艳的颜色的问题。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO2008/004356号公报

专利文献3：WO2011/113592号公报

发明内容

发明所要解决的课题

本发明为了解决上述以往的问题，提供一种成本低、纺前染色色素均匀分散在纤维内、且能够表现出鲜艳的色调的纺前染色蛋白纤维及其制造方法。

用于解决课题的手段

本发明的纺前染色蛋白纤维的特征在于，其为当将蛋白纤维记为100质量％时蚕丝蛋白为0～100质量％、蛛丝蛋白来源的多肽为100～0质量％的纺前染色蛋白纤维，其中，所述纺前染色蛋白纤维含有纺前染色色素。

本发明的纺前染色蛋白纤维的制造方法的特征在于，其为当将蛋白纤维记为100质量％时蚕丝蛋白为0～100质量％、蛛丝蛋白来源的多肽为100～0质量％的纺前染色蛋白纤维的制造方法，其中，将纺前染色色素预先溶解或分散到纺丝液所用的溶剂中或者溶解或分散到二甲基亚砜中制成着色液，在所述着色液中加入纺丝液所需量的溶剂，在所述溶剂中加入蛋白粉体并溶解，制成纺丝液，进行湿式纺丝或干湿式纺丝。

发明效果

本发明通过制成在纺丝液中添加纺前染色色素而得到的纺前染色蛋白纤维，能够提供成本低、纺前染色色素均匀分散在纤维内且能够表现出鲜艳的色调的纺前染色蛋白纤维及其制造方法。利用蚕丝蛋白与蛛丝蛋白来源的多肽的混合比例，也能够制成甚至表现出金属光泽的鲜艳的具有反射性的纤维。

附图说明

图1为表示本发明的一个实施例的制造工序的说明图。

图2A-B为表示本发明的另一实施例的制造工序的说明图、图2A表示纺丝工序、图2B表示拉伸工序。

图3为表示本发明的另一实施例的制造工序的说明图。

图4A为家蚕茧丝的示意截面图、图4B为表示家蚕茧丝的结构的示意说明图。

具体实施方式

(1)纺前染色色素

本发明的纤维为将纺前染色色素(以下也称为着色剂)添加到纺丝液中进行纺丝而得到的纺前染色蛋白纤维。着色剂优选选自染料和颜料中的至少一种。染料有表现出各种色调的染料，易于溶解或分散于纺丝液。本发明的纺丝工序中，由于不会受到染料变质那样的高热，因此很多染料均可使用。另外，颜料有耐候性高的优点。进一步优选的着色剂优选选自纤维用酸性染料、纤维用碱性染料、纤维用荧光染料、纤维用直接染料、纤维用分散染料、植物色素、食品用天然色素和炭黑中的至少一种着色剂。这些着色剂在纺丝液中的分散性良好并难以产生异物。其中，酸性染料和植物色素与单独的蚕丝蛋白、单独的蛛丝蛋白来源的多肽、蚕丝蛋白与蛛丝蛋白来源的多肽的混合组成的适应性均良好，表现出鲜亮的色调。利用蚕丝蛋白与蛛丝蛋白来源的多肽的混合比例，能够制成甚至表现出金属光泽这样的鲜艳的具有反射性的纤维。荧光染料对于单独的蛛丝蛋白来源的多肽的纺前染色纤维是有用的，表现出强的荧光色。着色剂的存在量相对于蛋白纤维100质量％优选为0.1～2质量％。当在上述范围内时，均匀分散性高。本发明的着色剂不包括血红素、Sudan Red、Nile Red(均为颜料)、Green Fluorescent Protein(GFP，绿色荧光蛋白)。颜料在纺丝液中的分散性方面存在问题，GFP存在成本高的问题。

(1a)酸性染料：酸性染料是用于对蚕丝、羊毛、尼龙纤维进行染色的染料。是含有磺酸基、羧基等酸性基团的色素酸的钠盐。用D-SO₃Na、D-COONa的通式表示。

(1b)碱性染料：碱性染料是用于对蚕丝、羊毛进行染色的染料。芳香族环上取代的-NH₂，-NHR，-NR(R是碳数为1-3的烷基)与盐酸等酸成分形成盐，通式用D-NH₃ ⁺Cl^-表示。更好地染色丙烯酸系合成纤维且日光坚牢度高的阳离子染料也是碱性染料。当应用于本发明时，可见纺丝液的粘度上升。

(1c)荧光染料：荧光染料具有吸收紫外线并发射比其波长长的蓝紫色的光的性质。是用于消除纤维的黄变使其看起来发白的染料。由于当将荧光染料应用于本发明的单独的蛛丝蛋白来源的多肽的纺前染色纤维时表现出强的荧光色，因此适合用于夜间穿用的外套、标记、商品标签等。

(1d)直接染料：直接染料是用于对蚕丝、羊毛进行染色的染料。是含有磺酸基的色素酸的钠盐，用D-SO₃Na的通式表示。

(1e)分散染料：分散染料是用于以在分散剂(表面活性剂)作用下在水中分散成微粒状的状态进行染色的染料。蒽醌系的化合物占大部分。分子量较小。当应用于本发明时，可见在凝固浴中脱落。

(1f)植物色素：有红花黄色素、栀子花黄色素、栀子花蓝色素、红辣椒色素、胭脂树色素、β-胡萝卜素色素、可可色素、花青素系色素等。因对人体安全，也作为食品用天然色素而得到认可。当用于本发明的纺前染色纤维时，可用于手术用缝合线等。

(1g)食品用天然色素：除了上述植物色素外，还有焦糖色素、红曲霉色素、紫胶色素、胭脂虫色素、植物碳色素等。与植物色素同样地可用于手术用缝合线等。

(1h)炭黑：炭黑对于将蛋白纤维着色成黑色是有用的。黑色纺前染色蛋白纤维适于人工毛发。

(2)使着色剂溶解或分散的溶液

作为使着色剂溶解或分散的溶液，优选二甲基亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、六氟异丙醇(HFIP)、六氟丙酮(HFA)等。其中，从成本、操作性的容易性出发，优选DMSO或DMF。DMSO的熔点为18.4℃、沸点为189℃、DMF的熔点为－61℃、沸点为153℃，与以往方法中使用的六氟异丙醇(HFIP)的沸点为59℃、六氟丙酮(HFAc)的沸点为－26.5℃相比，沸点远远地高。另外，DMSO和DMF由于在通常的产业领域中也用于丙烯酸纤维的聚合、用作纺丝液并用作聚酰亚胺的聚合溶剂，因此是成本低、安全性也得到确认的物质。当在DMSO或DMF中加入无机盐时，溶质的溶解度进一步提高。作为无机盐，为选自碱金属卤化物(例如LiCl、LiBr等)、碱土类金属卤化物(例如CaCl₂)、碱土类金属硝酸盐(例如Ca(NO₃)₂等)、硫氰酸钠(例如NaSCN等)中的至少一种。当将溶解成分记为100质量％时，无机盐的比例优选为0.1～20质量％的范围。当加有无机盐时，在最终得到的纺前染色蛋白纤维内也会微量地残留。将着色剂预先溶解或分散于上述溶液。接着，与纺丝液混合或加入纺丝液所用的溶剂、然后加入具有纤维形成能力的蛋白粉体，制成纺丝液。

(3)蚕丝蛋白

蚕丝是从家蚕(Bombyx mori)的幼虫即蚕所结的茧获得的纤维，如图4A的家蚕茧丝的示意截面图所示，茧丝40以2根丝蛋白41被外侧的丝胶(sericin)42被覆的形式而形成为1根。更详细而言，如图4B所示的家蚕茧丝的结构那样，丝蛋白41由大量原纤43构成，丝蛋白41的外侧被4层丝胶42被覆，构成1根茧丝44。为了实用，通过煮丝(scouring)将外侧的丝胶42溶解除去，制成蚕丝长丝而用于衣料用途。蚕丝的比重为1.33。另外通常，纤度为平均3.3deci tex，纤维长为1300～1500m左右。将纤度平均是由于茧的外层部粗、越向内侧越细，作为整体为不均匀的纤度。本发明中使用的蚕丝蛋白优选是以天然或家蚕的茧或者二手、废弃的丝布料为原料，对除去了包覆蚕丝蛋白的丝胶、其他脂肪成分等的蚕丝蛋白进行精制，制成蚕丝蛋白冻干粉而得到的。

(4)蛛丝蛋白来源的多肽

本发明的蛋白纤维可以是蛛丝蛋白来源的多肽。蛛丝蛋白来源的多肽可以是天然型蛛丝蛋白来源或类似的多肽，没有特别限定。所述多肽从强韧性优异的观点出发，优选为由蜘蛛的大壶状腺产生的大吐丝管拖丝蛋白来源的多肽。作为所述大吐丝管拖丝蛋白，可列举出Nephila clavipes来源的大壶状腺丝蛋白(spidroin)MaSp1、MaSp2、Araneus diadematus来源的ADF3、ADF4等。

上述重组蛛丝蛋白也可以是由蜘蛛的小壶状腺产生的小吐丝管拖丝蛋白来源的重组蛛丝蛋白。作为上述小吐丝管拖丝蛋白，可列举出Nephilaclavipes来源的小壶状腺丝蛋白(spidroin)MaSp1、MaSp2。

另外，上述重组蛛丝蛋白还可以是由蜘蛛的鞭状腺(flagelliform gland)产生的横丝蛋白来源的重组蛛丝蛋白。作为上述横丝蛋白，可列举出例如Nephila clavipes来源的鞭毛状蚕丝蛋白(flagelliform silk protein)等。

作为所述大吐丝管拖丝蛋白来源的多肽，可列举出包含2个以上、优选4个以上、更优选6个以上的式1：REP1-REP2(1)所示的氨基酸序列单元的多肽。需要说明的是，所述大吐丝管拖丝蛋白来源的多肽中，式(1)：REP1-REP2(1)所示的氨基酸序列单元可以相同也可以不同。上述式(1)中，REP1是指聚丙氨酸。

上述REP1中，连续排列的丙氨酸优选为2个残基以上、更优选为3个残基以上、进一步优选为4残基以上、特别优选为5个残基以上。另外上述REP1中，连续排列的丙氨酸优选为20个残基以下、更优选为16个残基以下、进一步优选为14个残基以下、特别优选为12个残基以下。上述式(1)中，REP2为由2～200个残基的氨基酸构成的氨基酸序列，且上述氨基酸序列中所含的甘氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸和丙氨酸的总残基数相对于氨基酸残基数整体为40％以上、优选为50％以上、更优选为60％以上。

大吐丝管拖丝中，上述REP1相当于纤维内形成结晶β折叠的结晶区域，上述REP2相当于纤维内更具有柔软性且大部分缺乏整齐排列结构的无定型区域。并且，上述[REP1-REP2]相当于由结晶区域和无定型区域构成的重复区域(反复序列)，其为拖丝蛋白的特征性序列。

作为包含2个以上的上述式1：REP1-REP2(1)所示的氨基酸序列单元的多肽，可列举出例如具有序列号2、序列号3和序列号4中的任一个所示的氨基酸序列的ADF3来源的重组蛛丝蛋白。序列号2所示的氨基酸序列是在N末端添加有由起始密码子、His10标签和HRV3C蛋白酶(人鼻病毒3C蛋白酶)识别位点构成的氨基酸序列(序列号为5)的ADF3的氨基酸序列中发生下述变异而成的多肽：第1～13号的反复区域增加至约2倍，并且翻译在第1154号氨基酸残基处终止。序列号3所示的氨基酸序列是在从NCBI数据库获得的ADF3的部分氨基酸序列(NCBI的Genebank的登录号：AAC47010、GI：1263287)的氨基酸序列的N末端添加有由起始密码子、His10标签和HRV3C蛋白酶(人鼻病毒3C蛋白酶)识别位点构成的氨基酸序列(序列号为5)的氨基酸序列。序列号3所示的氨基酸序列是在N末端添加有由起始密码子、His10标签和HRV3C蛋白酶(人鼻病毒3C蛋白酶)识别位点构成的氨基酸序列(序列号为5)的ADF3的氨基酸序列中第1～13号的反复区域增加至约2倍而成的氨基酸序列。另外，作为含有2个以上的上述式1：REP1-REP2(1)所示的氨基酸序列单元的多肽，可以使用在序列号1、序列号2、序列号3和序列号4中的任一个所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被替换、缺失、插入和/或添加而成的氨基酸序列构成，且具有由结晶区域和无定型区域构成的重复区域的多肽。

本发明中，“1个或多个”是指例如1～40个、1～35个、1～30个、1～25个、1～20个、1～15个、1～10个、或1个或数个。另外，本发明中，“1个或数个”是指1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个或1个。

作为上述小吐丝管拖丝蛋白来源的重组蛛丝蛋白，可列举出含有式2：REP3(2)所示的氨基酸序列的多肽。上述式2中，REP3是指由(Gly-Gly-Z)m(Gly-Ala)l(A)r构成的氨基酸序列，Z是指任意一个氨基酸，但特别优选为选自Ala、Tyr和Gln中的一个氨基酸。另外，m优选为1～4、l优选为0～4、r优选为1～6。

蛛丝中，小吐丝管拖丝从蜘蛛网的中心以螺旋状卷绕，用作网的增强材料，或用作将捕获的猎物包裹的丝。已知与大吐丝管拖丝相比，拉伸强度差，但伸缩性高。考虑这是由于，在小吐丝管拖丝中，大量的结晶区域由甘氨酸和丙氨酸交替连接的区域形成，与结晶区域仅由丙氨酸形成的大吐丝管拖丝相比，结晶区域的氢键更易于变弱。

作为上述横丝蛋白来源的重组蛛丝蛋白，可列举出包含式3：REP4(3)所示的氨基酸序列的多肽。上述式3中，REP4是指由(Gly-Pro-Gly-Gly-X)n构成的氨基酸序列，X是指任意一个氨基酸，但特别优选为选自Ala、Ser、Tyr和Val中的一个氨基酸。另外，n表示至少为4以上的数字，优选为10以上、更优选为20以上。

蛛丝中，横丝不具有结晶区域，具有由无定形区域构成的重复区域是一大特征。推测在大吐丝管拖丝等中，由于具有由结晶区域和无定形区域构成的重复区域，因此同时具有高的应力和伸缩性。另一方面，横丝虽然与大吐丝管拖丝相比应力差，但具有高的伸缩性。考虑这是由于，横丝的大部分由无定形区域构成。

(5)蚕丝蛋白与蛛丝蛋白来源的多肽的混合比例

本发明的蛋白纤维可以是单独的蚕丝蛋白、单独的蛛丝蛋白来源的多肽、蚕丝蛋白与蛛丝蛋白来源的多肽的混合组成中的任一种。混合组成时，可以以蚕丝蛋白为0～100质量％、蛛丝蛋白来源的多肽为0～100质量％的范围混合。当在上述范围时有优选的可纺性，两成分不会剥离且亲和性良好，形成复合纤维，形成应力高且具有适当的断裂伸长率的蛋白纤维。

(6)纺丝液(胶浆液)

作为所述蚕丝蛋白冻干粉和蛛丝蛋白来源的多肽冻干粉的溶剂，只要是能够溶解多肽的溶剂，则任何溶剂均可。例如有六氟异丙醇(HFIP)、六氟丙酮(HFA)、尿素、胍、月桂基硫酸钠(SDS)、含有溴化锂、氯化钙、硫氰酸锂等的水溶液、在二甲基亚砜(DMSO)、DMSO中加入了无机盐而成的溶剂、在N,N-二甲基甲酰胺：DMF中加入了无机盐而成的溶剂等。其中，从成本、操作性出发，优选二甲基亚砜(DMSO)、在DMSO中加入无机盐而成的溶剂、在N,N-二甲基甲酰胺：DMF中加入无机盐而成的溶剂。蛋白的浓度优选为4.2～15.8质量％。作为无机盐，为选自碱金属卤化物(例如LiCl、LiBr等)、碱土类金属卤化物(例如CaCl₂)、碱土类金属硝酸盐(例如Ca(NO₃)₂等)、硫氰酸钠(例如NaSCN等)中的至少一种。当将溶解成分记为100质量％时，无机盐的比例优选为0.1～20质量％的范围。除去杂质和泡，制成溶液粘度为2500～15000cP(厘泊)的纺丝液(胶浆液)。

(7)纺丝工序

纺丝采用湿式纺丝。由此，除去使聚合物溶解的溶剂(也称为脱溶剂)，得到未拉伸丝。湿式纺丝中使用的凝固液只要是能够脱溶剂的溶液，则可以是任何凝固液。当溶剂为HFIP时，凝固液优选使用甲醇、乙醇、2-丙醇等碳数为1～5的低级醇。凝固液的温度优选为0～30℃。当为上述范围时，纺丝稳定。通过将所述纺丝液挤出到凝固液中，得到未拉伸丝。当使用具有直径为0.57mm的喷嘴的注射器泵时，挤出速度优选每孔为0.2～5.0ml/h。当为该范围时，纺丝稳定。进一步优选的挤出速度为每孔为0.25～3ml/h。凝固液槽的长度优选为200～500mm、未拉伸丝的牵引速度优选为1～20m/分钟、滞留时间优选为0.05～3min。当为该范围时，脱溶剂可高效地进行。可以在凝固液中进行拉伸(前拉伸)，但考虑到低级醇的蒸发，优选将凝固液维持在低温，以未拉伸丝的状态进行牵引。凝固液槽可以设为多段，可以使其拉伸。

(8)拉伸工序

拉伸工序优选将未拉伸丝在拉伸温度为160℃～230℃的干热下拉伸1.05～4倍。本发明通过上述这样的高温干热加热，分子高度取向，得到高强度的拉伸丝。优选的拉伸温度为160℃～180℃。优选的拉伸倍率为1.05～1.5倍。关于干热，作为一个例子使用电管状炉或干热板。

(8a)连续拉伸工序

从纺丝到拉伸可以为连续工序，也可以分为任意的工序实施。图1为表示本发明的一个实施例的制造工序的说明图。图1表示连续工序。纺丝拉伸装置10包括挤出工序1、未拉伸丝制造工序2、干热拉伸工序3。纺丝液6贮藏在贮存槽7并从齿轮泵8挤出到纺丝头9。在实验室规模中，可以将纺丝液充填到滚筒中，用注射泵从喷嘴挤出。被挤出的纺丝液具有空隙13地或直接供给至凝固液槽12的凝固液11内，将溶剂除去。接着，供给至干热拉伸装置17，在丝道18内进行拉伸，制成卷丝体4。拉伸由供给夹持辊15与牵引夹持辊16的速度比决定。14a～14f为导丝器。

(8b)分离的拉伸工序

图2A-B为将本发明的另一实施例的制造工序分离的例子的说明图。图2A表示纺丝工序20、图2B表示干热拉伸工序30。各工序中，还可以将丝卷取或不卷取地留存在容器中。纺丝工序20中，将纺丝液22预先加入微型注射器21内，用注射泵使其沿箭头P方向移动，将纺丝液22从喷嘴23挤出，供给至凝固液槽24内的凝固液25中，制成未拉伸丝的卷丝体26。然后，在干热拉伸工序30中，将未拉伸丝从卷丝体26拉出，供给至干热拉伸装置29，在丝道31内进行拉伸。拉伸由供给夹持辊27与牵引夹持辊28的速度比决定。接着，将拉伸丝卷取成卷丝体32。由此，得到本发明的丝蛋白纤维的拉伸丝。

(8c)热水浴拉伸工序

本发明方法中，在干热加热拉伸之前也可以预先进行热水浴拉伸。通过热水浴拉伸，能够进一步促进分子取向。热水浴拉伸对于蚕丝蛋白与蛛丝蛋白的混合(复合)也是有用的。热水浴拉伸的条件优选为30～90℃、拉伸倍率优选为1.05～6倍。图3表示热水浴拉伸的工序。直至凝固工序与图2A相同。经过了凝固工序的未拉伸丝33a从夹持辊36通过进入到热水浴槽34内的热水浴35中，由夹持辊37进行拉伸，由此制成拉伸丝33b并卷绕成卷丝体38。39为热水浴拉伸工序。经过了热水浴拉伸工序39的拉伸丝通过图2B所示的干热拉伸工序30拉伸。

本发明的纺前染色纤维的单纤维直径优选为5～200μm的范围。当为所述范围时，能够稳定地获得拉伸纤维。纤度高的丝适于人工毛发。更优选的纤维直径为7～100μm的范围、进一步优选为10～80μm的范围。计算纤度(单位：tex或deci tex)时，纤维截面为圆形时，根据由纤维直径计算的截面积、比重和长度算出。需要说明的是，本发明的纤维由于通过湿式纺丝而得到，因此截面并不限于圆形，包括各种形状，因此平均直径是指将截面假定为圆形时的平均直径。

实施例

以下使用实施例对本发明更具体地进行说明。需要说明的是，本发明并不限于下述实施例。

(实施例1-5、比较例1-2)

1.蚕丝蛋白原料的准备

(1)将丝布料剪切为约2mm×10mm左右，在煮沸的0.5质量％马赛皂水(马赛皂使用用锉屑器挫细后的皂粉)中煮约30分钟。

(2)之后，在煮沸的热水中煮30分钟。

(3)在顺序1和2之后再重复2次(计3次)。

(4)最后在煮沸的热水中煮30分钟。通过该操作将包覆蚕丝蛋白的丝胶或其他添加剂等完全除去。

(5)将湿蚕丝蛋白在37℃环境下干燥过夜。

(6)测量干燥后的蚕丝的重量，加入LiBr水溶液(9mol/L)，使得达到10w/v％，在40℃环境下溶解2小时。

(7)将其水溶液倒入纤维素透析膜(VISKASESELES COAP制Seamless Cellulose Tubing，36/32)中，用蒸馏水透析3～4天。

(8)将透析后的回收溶液在20℃、15000rpm离心1小时，除去溶解残留物、杂质等。

(9)进而用MilliQ稀释，使得浓度达到2质量％以下。

(10)稀释后，从ADVANTEC公司的150μm过滤器通过，将细小的杂质完全除去。

(11)将蚕丝蛋白水溶液在－80℃环境下冷冻，冷冻干燥一整夜。确认充分地去除水分后，以蚕丝蛋白粉末形式保存。如此，得到蚕丝蛋白冻干粉。

2.蛛丝蛋白来源的多肽的准备

<基因合成>

(1)ADF3Kai基因的合成

从NCBI的web数据库获得作为十字园蛛的两种主要的拖丝蛋白之一的ADF3(GI：1263287)的部分氨基酸序列，委托GenScript公司合成编码在该序列的N末端添加了由起始密码子、His10标签和HRV3C蛋白酶(人鼻病毒3C蛋白酶)识别位点构成的氨基酸序列(序列号4)的氨基酸序列(序列号2)的基因。其结果，获得了导入了由序列号5所示的碱基序列构成的ADF3Kai基因的pUC57载体(基因在5’末端紧接的上游具有Nde I位点、和在5’末端紧接的下游具有Xba I位点)。其后，用Nde I和EcoR I对该基因进行限制性酶处理，重组到pET22b(+)表达载体中。

(2)ADF3Kai-Large基因的合成

以ADF3Kai为模板，使用T7启动子引物(序列号8)和Rep Xba I引物(序列号9)进行PCR反应，对ADF3Kai的基因序列中的5’侧一半的序列(以下记为序列A)进行扩增，将该片段重组到预先使用Mighty CloningKit(Takara Bio株式会社制)并用Nde I和Xba I进行限制性酶处理而得到的pUC118载体中。同样地，以ADF3Kai为模板，使用Xba I Rep引物(序列号10)和T7终止子引物(序列号11)进行PCR反应，对ADF3Kai的基因序列中3’侧一半的序列(以下记为序列B)进行扩增，将该片段重组到预先使用Mighty Cloning Kit(Takara Bio株式会社制)并用Xba I、EcoRI进行限制性酶处理而得到的pUC118载体中。将导入了序列A的pUC118载体用Nde I、Xba I进行限制性酶处理，将导入了序列B的pUC118载体用Xba I、EcoR I进行限制性酶处理，利用凝胶的切出对序列A和序列B的目标DNA片段进行精制。使DNA片段A、B与预先用Nde I和EcoR I进行限制性酶处理而得到的pET22b(+)进行连接反应，转化到大肠杆菌DH5α中。利用使用了T7启动子引物和T7终止子引物的菌落PCR，在确认了目标DNA片段插入后，从得到了目标大小(3.6kbp)的条带的菌落提取质粒，通过使用了3130xl Genetic Analyzer(Applied Biosystems)的序列反应对全碱基序列进行确认。其结果，确认构建了序列号6所示的ADF3Kai-Large基因。需要说明的是，ADF3Kai-Large的氨基酸序列如序列号3所示。

(3)ADF3Kai-Large-NRSH1基因的合成

以导入了上述中得到的ADF3Kai-Large基因的pET22b(+)载体为模板，通过使用了Prime Star Mutagenesis Basal Kit(Takara Bio株式会社制)的部位特异性变异导入，使ADF3Kai-Large的氨基酸序列(序列号3)中的与第1155号氨基酸残基甘氨酸(Gly)对应的密码子GGC变异为终止密码子TAA，在pET22b(+)上构建序列号7所示的ADF3Kai-Large-NRSH1基因。关于变异导入的准确性，通过使用了3130xl Genetic Analyzer(AppliedBiosystems)的序列反应进行确认。需要说明的是，ADF3Kai-Large-NRSH1的氨基酸序列如序列号1所示。

<蛋白的表达>

将包含上述得到的ADF3Kai-Large-NRSH1的基因序列的pET22b(+)表达载体转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中。将得到的单菌落在含有氨苄青霉素的2mL的LB培养基中培养15小时后，将该培养液1.4ml添加到含有氨苄青霉素的140mL的LB培养基中，在37℃、200rpm的条件下进行培养，直至培养液的OD₆₀₀达到3.5。接着，将OD₆₀₀为3.5的培养液与50％葡萄糖140mL一起加入到含有氨苄青霉素的7L的2×YT培养基中进一步进行培养，直至OD₆₀₀达到4.0。其后，向得到的OD₆₀₀为4.0的培养液中添加异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)使终浓度达到0.5mM，诱导蛋白表达。在IPTG添加后的2小时时，将培养液离心分离，回收菌体。将由IPTG添加前和IPTG添加后的培养液制备的蛋白溶液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果观察到依赖于IPTG添加的目标大小(约101.1kDa)的条带，从而确认了目标蛋白表达。

<精制>

(1)向离心管(1000ml)中添加表达ADF3Kai-Large-NRSH1蛋白的大肠杆菌的菌体约50g和缓冲液AI(20mM Tris-HCl，pH为7.4)300ml，用混合机(IKA公司制“T18 basic ULTRA TURRAX”，2级)将菌体分散，然后用离心分离机(Kubota制的“Model 7000”)进行离心分离(11000g、10分钟、室温)，弃去上清。

(2)向通过离心分离得到的沉淀物(菌体)中添加300ml缓冲液AI和3ml的0.1M的PMSF(用异丙醇溶解)，用上述IKA公司制的混合机(2级)分散3分钟。之后，用高压匀浆机(GEA Niro Saovi公司制的“PandaPlus 2000”)将菌体重复破碎3次。

(3)在经破碎的菌体中加入含有3w/v％SDS的缓冲液B(50mM Tris-HCL、100mM NaCl、pH为7.0)300mL，用上述IKA公司制的混合机(2级)使其充分分散后，用振荡器(TAITEC公司制、200rpm、37℃)搅拌60分钟。之后，用上述Kubota制的离心分离机进行离心分离(11000g、30分钟、室温)，弃去上清，得到SDS洗涤颗粒(沉淀物)。

(4)将SDS洗涤颗粒用含有1M氯化锂的DMSO溶液悬浮，使得达到100mg/mL的浓度，在80℃下热处理1小时。之后，用上述Kubota制的离心分离机进行离心分离(11000g、30分钟、室温)，回收上清。

(5)准备相对于回收的上清为3倍量的乙醇，向乙醇中加入回收的上清，在室温下静置1小时。之后，用上述Kubota制的离心分离机进行离心分离(11000g、30分钟、室温)，回收凝聚蛋白。接着，用纯水洗涤凝聚蛋白，通过离心分离回收凝聚蛋白，重复该工序3次，然后用冷冻干燥机将水分除去，回收冻干粉。得到的冻干粉中的目标蛋白ADF3Kai-Large-NRSH1(约56.1kDa)的精制度通过使用Totallab(nonlineardynamics ltd.)对粉末的聚丙烯酰胺凝胶电泳(CBB染色)的结果进行图像解析来确认。其结果，ADF3Kai-Large-NRSH1的精制度为约85％。

3.着色剂的制备

计量作为着色剂的纤维用酸性染料Acid Milling Sky Blue FSE(日本化药公司制)，使得单位纤维的干燥质量(制品质量)的染料浓度达到1质量％，首先以20质量％将酸性染料溶解或分散到二甲基亚砜DMSO中。酸性染料易于溶解或分散在DMSO中，而完全不溶解或分散在六氟异丙醇(HFIP)中。在使酸性染料溶解的DMSO液：5质量％中加入六氟异丙醇(HFIP)：95质量％进行混合。DMSO和HFIP为使蚕丝蛋白粉末和蛛丝蛋白来源的多肽粉末溶解的胶浆溶剂。

4.纺丝液(胶浆液)的制备

(1)实施例1-5

实施例1-5中，计量蚕丝蛋白冷冻干燥后的粉末和蛛丝蛋白来源的多肽冷冻干燥后的粉末，以下述比例的合计粉末浓度使它们溶解，制成胶浆液。用于制成胶浆液的溶剂使用DMSO。

(a)蚕丝100％、蚕丝：蛛丝＝75：25，6.3(w/w)％

(b)蚕丝：蛛丝＝50：50，7.5(w/w)％

(c)蚕丝：蛛丝＝25：75，8.6(w/w)％

(d)蛛丝100％，12.9(w/w)％

胶浆液用振荡器溶解16小时后，除去杂质和泡，制成纺丝液(胶浆液)。胶浆液的溶液粘度为4500cP(厘泊)。

(2)比较例1-2

比较例1-2除了未加入染料以外，与实施例1-5同样地制成纺丝液(胶浆液)。胶浆液的溶液粘度为4500cP(厘泊)。

5.纺丝工序

纺丝工序使用图3所示的方法。首先，将纺丝液(胶浆液)填充到滚筒中，用注射器泵从0.2mm直径的喷嘴在100质量％甲醇凝固液中制作未拉伸丝。挤出速度设为2.0～2.5ml/h。使凝固液槽的长度为400mm、使热水浴拉伸槽的长度也为400mm，凝固液槽中的拉伸倍率为1.5倍、热水浴拉伸槽中的拉伸倍率为2倍。

6.拉伸工序

纺丝工序使用图2B所示的方法。将上述得到的拉伸丝用干热板进一步进行干热拉伸。干热板的长度为500mm、拉伸倍率为1.05～1.5倍。拉伸温度如下所述。

(a)蚕丝100％、蚕丝：蛛丝＝75：25，160℃

(b)蚕丝：蛛丝＝50：50，170℃

(c)蚕丝：蛛丝＝25：75，180℃

(d)蛛丝100％，180℃

7.物性测定

(1)使用光学显微镜求出纤维的直径。

(2)在温度为25℃、相对湿度为60％的气氛温度下使用牵引试验机(岛津公司制小型台式试验机EZ-S)测定纤维的强度(应力)、初始弹性模量(测定20点的最大斜率。以50msec间隔进行测定，将以20点间隔进行斜率计算时的最大斜率作为初始弹性模量)，测定伸长率，算出韧性。将样品贴到用厚纸制作的框架上，在夹具间距离为20mm、牵引速度为10mm/分钟下进行。测力传感器容量为1N、夹具为clip式。测定值取样品数n＝5的平均值。韧性的算出式如下所述。

[E/(r²×π×L)×1000](单位：MJ/m³)

其中：

E：破坏能量(单位：J)

R：纤维的半径(单位：mm)

π：圆周率

L：牵引试验测定时的夹具间距离：20mm

(3)纤维的比重测定向外委托一般财团法人Kaken Test Center进行分析，基于JIS L 1015浮沉法进行测定。实施例5样品的比重为1.34。

8.溶剂残量测定

在实施例33中测定溶剂残量。准备作为内部标准的1,2-二氯乙烷-甲酸溶液浓度为3100ppm(0.00310mg/ml)。将蛋白溶液(10ml甲酸中溶解有0.1g纺前染色纤维的蛋白溶液)500μl与内部标准溶液500μl混合。进而，同量程度地加入用于H-NMR测定的乙腈氘化溶剂，稀释至约2倍，进行H-NMR测定(NMR的机型：JEOL公司JNM-ECX 100)。比较内部标准试样1,2-二氯乙烷的H-NMR积分强度与DMSO的H-NMR积分强度。标准曲线的作成为制作3ppm～3000ppm的DMSO-甲酸溶液，按照上述操作流程制成标准曲线。通过与标准曲线进行比较，求出蛋白溶液中的DMSO浓度。DMSO浓度测定使用JEOL公司制、核磁共振装置(NMR)。

实施例1-5、比较例1-2的条件和结果一并示于表1。

表1

(备注)“蚕丝”为蚕丝蛋白的简称，“蛛丝”为蛛丝蛋白来源的多肽的简称。

如表1所示，实施例1-5得到了鲜亮蓝色的纺前染色纤维。特别是实施例1-4可见金属光泽，得到了漂亮地着色的纺前染色纤维。

(实施例6-8)

该实施例中，改变酸性染料的添加量进行实验。使蚕丝蛋白为100质量％，改变酸性染料的添加量，除此以外，与实施例1-5同样地实验。将条件和结果一并示于表2。

表2

如表2所示，实施例6-8得到了鲜亮蓝色的纺前染色纤维。实施例8为可适于人工毛发的粗细的纤度，也可制作这样粗细纤度的纺前染色纤维。

(实施例9-12、比较例3)

该实施例中，改变纤维用酸性染料的种类进行实验。使蚕丝蛋白为80质量％、使蛛丝蛋白为20质量％，使纤维用酸性染料如下所述，除此以外，与实施例1-5同样地实验。条件和结果一并示于表3。

纤维用蓝色酸性染料：与实施例1-5相同

纤维用紫色酸性染料：Kayanol milling Vioret FBW(日本化药公司制)

纤维用红色酸性染料：Polar Red B 125％(Huntsman公司制)

纤维用黑色酸性染料：Irgran Black BGL 200％(Huntsman公司制)

表3

如表3所示，实施例9-11得到了鲜亮颜色的纺前染色纤维。并可见金属光泽，得到了漂亮地着色的纺前染色纤维。

(实施例13-19)

该实施例中，改变纤维用酸性染料的种类进行Lab测色实验。使蚕丝蛋白为80质量％、使蛛丝蛋白为20质量％，使酸性染料如下所述，除此以外与实施例1-5同样地实验。条件和结果一并示于表4。

纤维用蓝色酸性染料：与实施例1-5相同

纤维用紫色酸性染料：Kayanol milling Vioret FBW(日本化药公司制)

纤维用红色酸性染料：Polar Red B 125％(Huntsman公司制)

纤维用黑色酸性染料：Irgran Black BGL 200％(Huntsman公司制)

纤维用黄色酸性染料：Acid Yerrow RW New(日本化药公司制)

表4

表4的各色纺前染色纤维的鲜亮度高、表现出金属光泽。

(实施例20)

该实施例中，制成加入了纤维用荧光染料的纺前染色纤维。使用实施例1-5中使用的蛛丝蛋白，添加作为着色剂的纤维用荧光染料NKP-8315Yellow(征兴涂料运营公司销售)，使得制品浓度达到1质量，除此以外，与实施例1-5同样地实验。得到的纺前染色纤维(拉伸丝)的物性如下。

单纤维直径：42.7μm

最大应力：330.0MPa

平均应力：322.5MPa

弹性模量：5.8GPa

变形：11.6％

韧性：26.4MJ/m³

当对得到的纺前染色纤维照射黑光灯时，表现出鲜艳的荧光色。是如同荧光灯发出的光那样的强烈的荧光。

(实施例21-23)

该实施例中，制成加入了天然植物色素的纺前染色纤维。将作为着色剂的天然植物色素Safflower Y1500(Daiwa化成公司制)水溶性·红花黄色素溶解在六氟异丙醇(HFIP)中，使得制品浓度达到1质量％，除此以外，与实施例1-5同样地实验。得到的纺前染色纤维(拉伸丝)的物性如下所述。

表5

如表5所示，实施例21-23为与加入了酸性染料的纺前染色纤维几乎没有色差的色调。但是，蛛丝100质量％稍微没有光泽，发浊，还可见白化。

(实施例24-26)

该实施例中，制成加入了纤维用阳离子染料的纺前染色纤维。添加作为着色剂的阳离子染料Kayacryl Blue GSL-ED(日本化药公司制)，使得制品浓度达到1质量％，除此以外，与实施例1-5同样地实验。得到的纺前染色纤维(拉伸丝)的物性如下所述。

表6

如表6所述，实施例25的应力、韧性等物性低。加入有阳离子染料的纺丝液可见粘度增高的现象。得到的纺前染色纤维的色调良好。

(实施例27-29)

该实施例中，制成加入了纤维用分散染料的纺前染色纤维。添加作为着色剂的分散染料Disperse Black FD(Shinko公司销售)，使得制品浓度达到1质量％，除此以外，与实施例1-5同样地实验。得到的纺前染色纤维(拉伸丝)的物性如下所述。

表7

如表7所述，与其它染料相比，应力、韧性等物性低。另外，蛛丝100％与加入了蚕丝的纤维相比，在MeOH凝固浴中染料的脱落较多。

(实施例30-35、比较例4)

使用实施例1中记载的蛛丝蛋白，使用在作为溶剂的DMSO中加入了8wt％LiCL的混合溶剂，使蛛丝蛋白浓度为15wt％。其中，实施例31由于发生凝胶化，为8wt％。溶解条件为90℃下保持3小时、然后在80℃下保持12小时。各染料或色素在DMSO中溶解或分散后加入到胶浆液中。所述蛛丝蛋白浓度也包括将各染料或色素溶解或分散而成的DMSO量。胶浆液的粘度如下表8所示。

表8

使用上述胶浆液进行如图3所示的湿式纺丝。其中，实施例31为干湿式纺丝。这里，干湿式纺丝是指使图3的空隙13的距離为8mm的纺丝方法。湿式纺丝的空隙为数mm。使胶浆液的温度为70℃，并挤出到15℃的甲醇凝固液中。接着，在50℃的水中进行热水拉伸。之后，使用如图2B所示的干式拉伸装置，在180℃下进行拉伸。将条件示于表9，将结果示于表10。

表9

表10

得到的纺前染色纤维长丝的目视检査的结果如下。

(1)实施例30的纺前染色纤维长丝为具有金属光泽的鲜艳的蓝色。

(2)实施例31的纺前染色纤维长丝为鲜艳的黄色，在黑光灯下可见荧光性。

(3)实施例32的纺前染色纤维长丝为具有金属光泽的鲜艳的黄色。

(4)实施例33的纺前染色纤维长丝为具有金属光泽的鲜艳的红色。

(5)实施例34的纺前染色纤维长丝为漆黑色。

(6)实施例35的纺前染色纤维长丝为具有金属光泽的黑色。

实施例33中，使用核磁共振装置(NMR)测定溶剂的残量，由于结果未得到溶剂的峰值，因此认为本纺前染色纤维长丝中基本没有溶剂残留。因此，可知是在人体的适用方面优异的纺前染色纤维。

产业上的可利用性

本发明的蛋白纤维表现出鲜亮且漂亮的色调，因此还适用于时尚制品、装饰品、绣线、商标等标记或标签、进而也适用于钓线、网球或羽毛球的肠线、小提琴的弦、小提琴的弓、人工毛发等。作为形态，可应用于丝、棉、织物(weave)、编织物(knit)、braid、无纺布等。

符号说明

1 挤出工序

2、20 未拉伸丝制造工序

3、30 干热拉伸工序

4、26、32 卷丝体

6、22 纺丝液

7 贮槽

8 齿轮泵

9 纺丝头

10 纺丝拉伸装置

11、25 凝固液

12、24 凝固液槽

13 空隙

14a～14f 导丝器

15、27 供给夹持辊

16、28 牵引夹持辊

17、29 干热拉伸装置

18、31 丝道

21 注射器

33a 未拉伸丝

33b 拉伸丝

34 热水浴槽

35 热水浴

36、37 夹持辊

38 卷丝体

39 热水浴拉伸工序

40 2根茧丝

41 丝蛋白

42 丝胶

43 原纤

44 1根茧丝

序列表自由文本

序列号1～4 氨基酸序列

序列号5～7 碱基序列

序列号8～11 引物序列

Claims

1.一种纺前染色蛋白纤维，其特征在于，其为当将蛋白纤维记为100质量％时蚕丝蛋白为0～100质量％、蛛丝蛋白来源的多肽为100～0质量％的纺前染色蛋白纤维，其中，所述纺前染色蛋白纤维含有纺前染色色素。

2.根据权利要求1所述的纺前染色蛋白纤维，其中，所述纺前染色色素为选自染料和颜料中的至少一种纺前染色色素。

3.根据权利要求1或2所述的纺前染色蛋白纤维，其中，所述纺前染色色素为选自酸性染料、碱性染料、荧光染料、直接染料、分散染料、植物色素、食品用天然色素和炭黑中的至少一种纺前染色色素。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的纺前染色蛋白纤维，其中，所述纺前染色色素的存在量相对于蛋白纤维100质量％为0.1～2质量％。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的纺前染色蛋白纤维，其中，所述纺前染色蛋白纤维的直径为5～200μm的范围。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的纺前染色蛋白纤维，其中，所述纺前染色蛋白纤维中含有选自碱金属卤化物、碱土类金属卤化物、碱土类金属硝酸盐和硫氰酸钠中的至少一种无机盐。

7.一种纺前染色蛋白纤维的制造方法，其特征在于，其为当将蛋白纤维记为100质量％时蚕丝蛋白为0～100质量％、蛛丝蛋白来源的多肽为100～0质量％的纺前染色蛋白纤维的制造方法，

其中，将纺前染色色素预先溶解或分散到纺丝液所用的溶剂中或者溶解或分散到二甲基亚砜中制成着色液，在所述着色液中加入纺丝液所需量的溶剂，在所述溶剂中加入蛋白粉体并溶解，制成纺丝液，进行湿式纺丝或干湿式纺丝。

8.根据权利要求7所述的纺前染色蛋白纤维的制造方法，其中，将进行了所述湿式纺丝的纺前染色蛋白纤维的未拉伸丝至少在干热下进行加热拉伸。

9.根据权利要求8所述的纺前染色蛋白纤维的制造方法，其中，所述干热加热拉伸的条件为160℃以上、拉伸倍率为1.05～4倍。

10.根据权利要求8或9所述的纺前染色蛋白纤维的制造方法，其中，在所述干热加热拉伸之前，预先进行热水浴拉伸。

11.根据权利要求10所述的纺前染色蛋白纤维的制造方法，其中，所述热水浴拉伸的条件为30～90℃、拉伸倍率为1.05～6倍。

12.根据权利要求7～11中任一项所述的纺前染色蛋白纤维的制造方法，其中，所述纺前染色色素为选自染料和颜料中的至少一种纺前染色色素。

13.根据权利要求7～12中任一项所述的纺前染色蛋白纤维的制造方法，其中，所述纺前染色色素为选自酸性染料、碱性染料、荧光染料、直接染料、分散染料、植物色素、食品用天然色素和炭黑中的至少一种纺前染色色素。

14.根据权利要求7～13中任一项所述的纺前染色蛋白纤维的制造方法，其中，所述纺前染色色素相对于蛋白100质量％添加0.1～2质量％。

15.根据权利要求7～14中任一项所述的纺前染色蛋白纤维的制造方法，其中，所述纺丝液使用在作为溶解蛋白纤维的溶剂的二甲基亚砜中含有选自碱金属卤化物、碱土类金属卤化物、碱土类金属硝酸盐和硫氰酸钠中的至少一种无机盐的溶剂。