CN104086673B - 一种那屈肝素钙的制备工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种那屈肝素钙的制备工艺，包括以下步骤：S1肝素钠的降解；S2降解液的还原；S3紫外照射：用的紫外灯照射还原液，消除还原液中残留的亚硝基化合物，降低N-NO基团含量；S4转钙和浓缩：用5％氯化钙溶液在超滤膜上超滤，将还原液浓缩成固液比为1∶10的浓度；S5阴离子交换层析：采用阴离子交换树脂进行层析，收集洗脱液；S6冻干，得到所述的那屈肝素钙。该工艺通过阴离子交换层析来控制低分子肝素钙的分子量，使得分子量能在1％以内精确控制，同时收率能提高至50％以上，并且自动化程度高，操作便捷，为提升产能提供了有力保障。
Description
技术领域
本发明涉及医药和化学领域中的一种药用化学药品的制备，具体涉及一种高质量高纯度的精品那屈肝素钙的制备工艺。
背景技术
普通肝素是含多种氨基葡萄糖苷的混合物。肝素钙在体内外能延缓或阻止血液凝固。其抗凝机理复杂，对凝血的各个环节均有作用，包括抑制凝血酶原转变为凝血酶、抑制凝血酶活性、妨碍纤维蛋白原转变为纤维蛋白、防止血小板聚集。肝素钙还可以降低血脂，降低LDL和VLDL，升高HDL，改变血液粘滞度，保护血管内皮细胞，预防动脉粥样硬化，促进血液流动，改善冠状动脉循环等作用。
肝素钙的抗FIIa作用较肝素钠强，抗FXa作用较肝素钠弱。由于其是以钙盐形式在体内发挥作用，经皮下注射后，在血液循环中缓慢扩散，不会减少局部细胞间毛细血管的钙胶质，也不改变血管通透性，几乎无肝素钠皮下注射可引起局部出血的副作用。适用于预防和治疗血栓-栓性疾病以及血栓形成。肝素钙还具有较明显的抗肾素和抗醛固酮活性，故亦适用于人工肾、人工肝和体外循环使用。
目前，国内有采用酒精分级沉淀、超滤膜分离、分子筛和凝胶吸附分离的方法来控制小分子肝素钙的分子量，酒精分级沉淀技术落后，超滤膜分离损失大量收率，分子筛效率低，凝胶吸附分离法代价昂贵，这些因素都限制了该产品的工业化生产和产能的扩大。
发明内容
本发明的目的是提供一种那屈肝素钙的制备工艺，该工艺通过阴离子交换层析来控制低分子肝素钙的分子量，使得分子量能在1％以内精确控制，同时收率能提高至50％以上，并且自动化程度高，操作便捷，为提升产能提供了有力保障；克服了现有技术中的分离方法收率低，代价昂贵、自动化程度低的缺点。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现：
一种那屈肝素钙的制备工艺，该制备工艺包括以下步骤：
S1肝素钠的降解：以肝素钠为原料，并将其溶解，调节pH至酸性，然后加入亚硝酸钠，搅拌反应3～6小时，得到降解液；
S2降解液的还原：将降解液的pH调节至中性，加入硼氢化钠，10℃～30℃搅拌反应12～24小时，得到还原液；
S3紫外照射：室温下用254nm波长的紫外灯插入还原液中照射45～90分钟，消除还原液中残留的亚硝基化合物，降低N-NO基团含量；
S4转钙和浓缩：将紫外照射后的还原液用10～20倍重量的5％氯化钙溶液在1000Da的超滤膜上超滤，将肝素钠上的钠离子转化为钙离子的同时，将还原液浓缩成固液比为1∶10的浓度，准备进行阴离子交换层析；
S5阴离子交换层析：采用阴离子交换树脂，按25-35mg低分子肝素钙/ml-resin上样，温度为室温，检测波长为UV232nm，上样结束后先用300～500mmol/L的氯化钠溶液洗涤，再用1～2mol/L的氯化钠溶液洗脱，洗脱终点为232nm紫外吸收降至基线平稳，收集洗脱液，检测分子量分布为重均分子量3800～4800；
S6冻干：向洗脱液中加入酒精进行沉淀，静置过夜，弃去上清液，沉淀再加酒精进行脱水，弃去上清，加入纯化水溶解，除菌，冻干，得到所述的那屈肝素钙。
进一步优选地，步骤S1中的肝素钠的降解具体方法为：以肝素钠为原料，并将其溶解于其重量的10～30倍纯化水中，调节pH至酸性，加入重量为肝素钠2％～5％的亚硝酸钠，保温10℃～30℃搅拌反应3～6小时的降解液然后加入亚硝酸钠，搅拌反应3～6小时，得到降解液。
进一步优选地，用醋酸将pH调节至4～5。
进一步优选地，亚硝酸钠的加入量为肝素钠重量的2.1％～2.5％。
进一步优选地，步骤S2中硼氢化钠的加入量为肝素钠重量的0.5％～2％。
进一步优选地，步骤S6中所述冻干的具体方法为：向洗脱液中加入两倍酒精进行沉淀，开启冷媒，静置过夜，第二天弃去上清液，沉淀再加一倍酒精进行脱水，弃去上清，加入一定量的纯化水溶解，除菌，在-40～-10℃下进行冻干，得到所述的那屈肝素钙。
进一步优选地，所述的除菌为通过除菌膜进行除菌。
本发明提供了一种那屈肝素钙的制备工艺，该工艺通过阴离子交换层析来控制低分子肝素钙的分子量，使得分子量能在1％以内精确控制，同时收率能从30％以下提高至50％以上，且该方法能够制备出高纯度、高活性的那屈肝素钙产品，产品质量明显高于EP现行版药典标准；并且自动化程度高，操作便捷，为提升产能提供了有力保障；故该方法具有重要的工业应用前景。
具体实施方式
本发明实施例所述的一种那屈肝素钙的制备工艺，下面以具体实验案例为例来说明具体实施方式，应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：那屈肝素钙的制备
肝素钠的降解：按30kg肝素钠投料，溶解于21～30倍肝素钠重量的纯化水中，调节pH至5.5～6，加入投料量4.5％～5％的亚硝酸钠，保温10℃～30℃搅拌反应3～6小时的降解液。
降解液的还原：将降解液的pH调回至中性，加入肝素钠投料量的1.5％～2％的硼氢化钠，10℃～30℃搅拌反应12～24小时，得到降解还原液。
紫外照射：室温下用254nm波长的紫外灯插入还原液中照射45～90分钟，消除溶液中残留的亚硝基化合物，降低N-NO基团含量。
转钙、浓缩：还原液用10～13倍肝素钠重量的5％氯化钙溶液在1000Da的超滤膜上超滤，将肝素钠上的钠离子转化为钙离子的同时，将还原液浓缩成约1∶10的浓度，准备上阴离子层析柱。
阴离子交换层析调节分子量：采用GEhealthcare公司生产的QSepharoseFF阴离子交换树脂，按25-35mg低分子肝素钙/ml-resin上样，温度为室温，检测波长为UV232nm，上样结束后先用300～500mmol/L的氯化钠溶液洗涤，再用1～2mol/L的氯化钠溶液洗脱，洗脱终点为232nm紫外吸收降至基线平稳，收集洗脱液，检测分子量分布为重均分子量3800～4800。
放入冰箱冻干：向洗脱液中加入两倍酒精进行沉淀，开启冷媒，静置过夜，第二天弃去上清液，沉淀再加一倍酒精进行脱水，弃去上清，加入一定量的纯化水溶解，溶解液过除菌膜，进箱冻干，收得最终产品17.5kg，收率为58.33％。
实施例2：那屈肝素钙的制备
肝素钠的降解：按30kg肝素钠投料，溶解于15～20倍肝素钠重量的纯化水中，调节pH至4.5，加入投料量2％～2.3％的亚硝酸钠，保温15℃～30℃搅拌反应3～6小时的降解液。
降解液的还原：将降解液的pH调回至中性，加入肝素钠投料量的0.6％～1％的硼氢化钠，15℃～20℃搅拌反应12～24小时，得到降解还原液。
紫外照射：室温下用254nm波长的紫外灯插入还原液中照射45～90分钟，消除溶液中残留的亚硝基化合物，降低N-NO基团含量。
转钙、浓缩：还原液用13～16倍肝素钠重量的5％氯化钙溶液在1000Da的超滤膜上超滤，将肝素钠上的钠离子转化为钙离子的同时，将还原液浓缩成固液比约为1∶10的浓度，准备上阴离子层析柱。
阴离子交换层析调节分子量：采用GEhealthcare公司生产的QSepharoseFF阴离子交换树脂，按25-35mg低分子肝素钙/ml-resin上样，温度为室温，检测波长为UV232nm，上样结束后先用300～500mmol/L的氯化钠溶液洗涤，再用1～2mol/L的氯化钠溶液洗脱，洗脱终点为232nm紫外吸收降至基线平稳，收集洗脱液，检测分子量分布为重均分子量3800～4800。
放入冰箱冻干：向洗脱液中加入两倍酒精进行沉淀，开启冷媒，静置过夜，第二天弃去上清液，沉淀再加一倍酒精进行脱水，弃去上清，加入一定量的纯化水溶解，溶解液过除菌膜，进箱冻干，收得最终产品18.4kg。
实施例3：那屈肝素钙的制备
肝素钠的降解：按30kg肝素钠投料，溶解于10～14倍肝素钠重量的纯化水中，调节pH至5，加入投料量3％～4％的亚硝酸钠，保温20℃～30℃搅拌反应3～6小时的降解液。
降解液的还原：将降解液的pH调回至中性，加入肝素钠投料量的0.5％～0.8％的硼氢化钠，10℃～30℃搅拌反应12～24小时，得到降解还原液。
紫外照射：室温下用254nm波长的紫外灯插入还原液中照射45～90分钟，消除溶液中残留的亚硝基化合物，降低N-NO基团含量。
转钙、浓缩：还原液用17～20倍的5％氯化钙溶液在1000Da的超滤膜上超滤，将肝素钠上的钠离子转化为钙离子的同时，将还原液浓缩成固液比为1∶10的浓度，准备上阴离子层析柱。
阴离子交换层析调节分子量：采用GEhealthcare公司生产的QSepharoseFF阴离子交换树脂，按25-35mg低分子肝素钙/ml-resin上样，温度为室温，检测波长为UV232nm，上样结束后先用300～500mmol/L的氯化钠溶液洗涤，再用1～2mol/L的氯化钠溶液洗脱，洗脱终点为232nm紫外吸收降至基线平稳，收集洗脱液，检测分子量分布为重均分子量3800～4800。
放入冰箱冻干：向洗脱液中加入两倍酒精进行沉淀，开启冷媒，静置过夜，第二天弃去上清液，沉淀再加一倍酒精进行脱水，弃去上清，加入一定量的纯化水溶解，溶解液过除菌膜，进箱冻干，收得最终产品17.9kg。
实施例4
本发明创造了一种采用阴离子交换层析技术制备那屈肝素钙的工艺。肝素钠经过降解、还原，紫外照射、转钙，浓缩再经阴离子交换层析处理，得到平均分子量分布范围符合要求的那屈肝素钙产品。其通过阴离子交换树脂，分布洗脱收集液，制备出高纯度、高活性的那屈肝素钙产品，质量明显高于EP7.0现行版药典标准(EP：欧洲药典)。本产品具有抗凝血、抗血栓、抗肿瘤、抗炎、抗过敏等作用和调节血脂的功效，广泛用于预防普通外科、神经外科的术前和术后的血栓形成，有效解决普通分子量为分级的肝素及其衍生物长期使用后易出现的出血、骨质疏松、诱导血小板减少等副作用，见下表。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下所作的有关本发明的任何修饰或变更，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种那屈肝素钙的制备工艺，其特征在于：该制备工艺包括以下步骤：
S1肝素钠的降解：以肝素钠为原料，并将其溶解，用醋酸将pH调节至4～5，然后加入亚硝酸钠，搅拌反应3～6小时，得到降解液；
S2降解液的还原：将降解液的pH调节至中性，加入硼氢化钠，10℃～30℃搅拌反应12～24小时，得到还原液；硼氢化钠的加入量为肝素钠重量的0.5％～2％；
S3紫外照射：室温下用254nm波长的紫外灯插入还原液中照射45～90分钟，消除还原液中残留的亚硝基化合物，降低N-NO基团含量；
S4转钙和浓缩：将紫外照射后的还原液用10～20倍重量的5％氯化钙溶液在1000Da的超滤膜上超滤，将肝素钠上的钠离子转化为钙离子的同时，将还原液浓缩成固液比为1:10的浓度，准备进行阴离子交换层析；
S5阴离子交换层析：采用阴离子交换树脂，按25-35mg低分子肝素钙/ml-树脂上样，温度为室温，检测波长为UV232nm，上样结束后先用300～500mmol/L的氯化钠溶液洗涤，再用1～2mol/L的氯化钠溶液洗脱，洗脱终点为232nm紫外吸收降至基线平稳，收集洗脱液，检测分子量分布为重均分子量3800～4800；
S6冻干：向洗脱液中加入酒精进行沉淀，静置过夜，弃去上清液，沉淀再加酒精进行脱水，弃去上清，加入纯化水溶解，除菌，冻干，得到所述的那屈肝素钙。
2.根据权利要求1所述的那屈肝素钙的制备工艺，其特征在于：步骤S1中的肝素钠的降解具体方法为：以肝素钠为原料，并将其溶解于其重量的10～30倍纯化水中，用醋酸将pH调节至4～5，加入重量为肝素钠2％～5％的亚硝酸钠，保温10℃～30℃，搅拌反应3～6小时，得到降解液。
3.根据权利要求2所述的那屈肝素钙的制备工艺，其特征在于：亚硝酸钠的加入量为肝素钠重量的2.1％～2.5％。
4.根据权利要求1所述的那屈肝素钙的制备工艺，其特征在于：步骤S6中所述冻干的具体方法为：向洗脱液中加入两倍酒精进行沉淀，开启冷媒，静置过夜，第二天弃去上清液，沉淀再加一倍酒精进行脱水，弃去上清，加入一定量的纯化水溶解，除菌，在-40～-10℃下进行冻干，得到所述的那屈肝素钙。
5.根据权利要求4所述的那屈肝素钙的制备工艺，其特征在于：所述的除菌为通过除菌膜进行除菌。
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