CN109942726A - 一种高质量那屈肝素钙的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药领域，具体说是一种高质量那屈肝素钙的制备方法。该制备方法使用肝素钠为原料，通过降解、还原、乙醇沉淀、弱阴离子交换层析分级并转钙、过滤沉淀脱水得到高质量那曲肝素钙，与现有技术相比，其分子量分布控制更精准，产品抗Xa因子/抗Ⅱa因子效价比更高，操作更简便，收率更高，适于工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体说是一种高质量那屈肝素钙的制备方法。
背景技术
那屈肝素钙是一种低分子肝素钙盐，一般是通过对猪肠粘膜来源的肝素进行亚硝酸裂解后分级，选择性的去除大部分分子量小于2000 Da的糖链而获得。那屈肝素钙由一系列复杂寡糖组成，非还原端主要由2-O-硫-α-L-艾杜糖醛酸组成，还原端主要由 6-O-硫-2,5-脱水-D-甘露醇组成，其重均分子量应为3600～5000，抗Xa因子活性为95 IU/mg～130IU/mg，抗Xa因子效价与抗IIa因子效价比为2.5～4.0。那屈肝素钙临床上可以用于预防静脉血栓栓塞性疾病，治疗已形成的深静脉血栓，在血液透析中预防体外循环中的血凝块形成。
目前国内多以化学法降解得到低分子肝素粗品，其分子量分布从几百到一万不等，因此需采用有效分离方法进行纯化。现有的酒精分级沉淀（CN 106986954 A）、超滤膜分离（CN 104072638 A、CN 104804110 A）、分子筛等控制分子量方法中，酒精分级沉淀技术落后，超滤膜分离损失大量收率，难以分离出分子量分布范围狭窄的片段，分子筛效率低，传统阴离子交换层析也只是起到钙转型（CN 104072639 A），而未能分离得到符合那屈肝素钙分子量分布的片段。CN104163878 A提供的方法的肝素钠除杂步骤难以保证肝素钠质量，且还使用毒性大的氯化钡，造成产品存在安全性的风险，且增加了环保压力。CN 103275246A、CN 103382232 A和CN 103408676 A的方法工序较为复杂、操作繁琐，同时产品的抗Xa/抗IIa比值整体偏低，仍需要进一步提高，分子量分布中小于2000Da组分比例偏高，影响那屈肝素钙的整体品质。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种高质量那屈肝素钙的制备方法，该制备方法使用肝素钠为原料，通过降解、还原、乙醇沉淀、弱阴离子交换层析分级并转钙、过滤沉淀脱水得到高质量那曲肝素钙，与现有技术相比，其分子量分布控制更精准，产品抗 Xa 因子/抗Ⅱa因子效价比更高，操作更简便，收率更高，适于工业化生产。
为解决上述问题，采取以下技术方案：
本发明的高质量那屈肝素钙的制备方法的特点是包括以下步骤：
第一步，肝素钠的裂解：用纯水将肝素钠固体原料制成质量浓度为9-11%的肝素溶液，用盐酸溶液调pH值至2.5-3.0；向肝素溶液中滴加质量浓度为35%-40%的亚硝酸钠溶液，亚硝酸钠与肝素钠的固体质量比为（28-32g）:1000g，控制温度在23-25℃，搅拌反应1.5-2.5h，再用氧化钙调pH值至8.5-9.0终止裂解反应；
第二步，裂解液的还原：向裂解液中加入硼氢化钠，硼氢化钠加入量与初始肝素钠的固体质量比为（10-15g）:1000g，控制温度在30-40℃，反应2-4h后降温至20℃以下；用盐酸调整pH值至2.5-3.0，搅拌反应15-20min后，再用氢氧化钠调整pH值至6.5-7.0，将该溶液流过紫外灯照射管，以220-254nm波长照射20-30min；
第三步，乙醇沉淀：向第二步结束后的料液中边搅拌边加入相当于1.5-2倍料液体积的95%乙醇，搅拌15-20min后静置12-18h，然后倒去上清液；用95%乙醇洗涤沉淀2-3次，静置去除乙醇上清，得到固态的晶体颗粒沉淀；
第四步，弱阴离子交换层析分级并转钙：将第三步得到的晶体颗粒用纯水溶解成浓度为3-5%的料液，调节料液pH值至6.5-7.5；弱阴离子交换层析柱用0.01-0.05 mol/L的Tris-HCl缓冲液平衡，检测波长232nm，平衡稳定后，将料液按30-35mg肝素/ml介质上样；上样结束后，用0.10-0.15 mol/L的氯化钙溶液进行洗涤，再以0.5-1.0 mol/L氯化钙溶液进行洗脱，根据232nm紫外信号收集洗脱液；
第五步，过滤、沉淀和脱水：将第四步收集的洗脱液通过0.22um除菌滤膜过滤，滤液中加入相当于2-3倍滤液体积的95%乙醇，搅拌10-15min，静置8-12h后去除乙醇上清液；再用无水乙醇洗涤沉淀2-3次，沉淀离心脱水，55-60℃真空干燥48~56h得到那屈肝素钙。
其中，所述弱阴离子交换层析柱选用Bettsep D501。
采取上述方案，具有以下优点：
本发明的高质量那屈肝素钙的制备方法是针对现有的那屈肝素钙生产工艺进行的优化和改进。其使用肝素钠为原料，先通过降解、还原、乙醇沉淀得到低分子肝素钠粗品，再通过弱阴离子交换层析来控制低分子肝素钙的分子量及分布，能够精确控制分子量，与原研样对比显示，在抗Xa/抗IIa比值以及小于2000Da的百分比例方面，本发明得到的高质量那屈肝素钙产品和进口原研样具有同等的品质；并且该制备方法自动化程度高，操作便捷，产品收率高，有利于实现工业化批量生产。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步详细说明。
实施例一
本实施例的高质量那屈肝素钙的制备方法包括以下步骤：
第一步，肝素钠的裂解：用纯水将1000g肝素钠固体原料制成质量浓度为9%的肝素溶液，用盐酸溶液调pH值至2.5；向肝素溶液中滴加质量浓度为35%的亚硝酸钠溶液，亚硝酸钠与肝素钠的固体质量比为32g:1000g，控制温度在23℃，搅拌反应1.5h，再用氧化钙调pH值至8.5终止裂解反应；
第二步，裂解液的还原：向裂解液中加入10g硼氢化钠，控制温度在30℃，反应2h后降温至20℃以下；用盐酸调整pH值至2.5，搅拌反应15min后，再用氢氧化钠调整pH值至6.5，将该溶液流过紫外灯照射管，以220nm波长照射20min；
第三步，乙醇沉淀：向第二步结束后的料液中边搅拌边加入相当于1.5倍料液体积的95%乙醇，搅拌15min后静置12h，然后倒去上清液；用95%乙醇洗涤沉淀2次，静置去除乙醇上清，得到固态的晶体颗粒沉淀；
第四步，弱阴离子交换层析分级并转钙：将第三步得到的晶体颗粒用纯水溶解成浓度为3%的料液，调节料液pH值至6.5；弱阴离子交换层析柱用0.01 mol/L的Tris-HCl缓冲液平衡，检测波长232nm，平衡稳定后，将料液按30mg肝素/ml介质上样；上样结束后，用0.10mol/L的氯化钙溶液进行洗涤，再以0.5 mol/L氯化钙溶液进行洗脱，根据232nm紫外信号收集洗脱液；
第五步，过滤、沉淀和脱水：将第四步收集的洗脱液通过0.22um除菌滤膜过滤，滤液中加入相当于2倍滤液体积的95%乙醇，搅拌10min，静置8h后去除乙醇上清液；再用无水乙醇洗涤沉淀2次，沉淀离心脱水，55℃真空干燥48h得到那屈肝素钙724g。
实施例二
本实施例的高质量那屈肝素钙的制备方法包括以下步骤：
第一步，肝素钠的裂解：用纯水将1000g肝素钠固体原料制成质量浓度为10%的肝素溶液，用盐酸溶液调pH值至2.7；向肝素溶液中滴加质量浓度为38%的亚硝酸钠溶液，亚硝酸钠与肝素钠的固体质量比为30g:1000g，控制温度在24℃，搅拌反应2.0h，再用氧化钙调pH值至8.8终止裂解反应；
第二步，裂解液的还原：向裂解液中加入12g硼氢化钠，控制温度在35℃，反应3h后降温至20℃以下；用盐酸调整pH值至2.7，搅拌反应18min后，再用氢氧化钠调整pH值至6.8，将该溶液流过紫外灯照射管，以240nm波长照射25min；
第三步，乙醇沉淀：向第二步结束后的料液中边搅拌边加入相当于1.8倍料液体积的95%乙醇，搅拌18min后静置15h，然后倒去上清液；用95%乙醇洗涤沉淀2次，静置去除乙醇上清，得到固态的晶体颗粒沉淀；
第四步，弱阴离子交换层析分级并转钙：将第三步得到的晶体颗粒用纯水溶解成浓度为4%的料液，调节料液pH值至7.0；弱阴离子交换层析柱用0.03 mol/L的Tris-HCl缓冲液平衡，检测波长232nm，平衡稳定后，将料液按32mg肝素/ml介质上样；上样结束后，用0.12mol/L的氯化钙溶液进行洗涤，再以0.8 mol/L氯化钙溶液进行洗脱，根据232nm紫外信号收集洗脱液；
第五步，过滤、沉淀和脱水：将第四步收集的洗脱液通过0.22um除菌滤膜过滤，滤液中加入相当于2.5倍滤液体积的95%乙醇，搅拌12min，静置10h后去除乙醇上清液；再用无水乙醇洗涤沉淀2次，沉淀离心脱水，58℃真空干燥52h得到那屈肝素钙751g。
实施例三
本实施例的高质量那屈肝素钙的制备方法包括以下步骤：
第一步，肝素钠的裂解：用纯水将1000g肝素钠固体原料制成质量浓度为11%的肝素溶液，用盐酸溶液调pH值至3.0；向肝素溶液中滴加质量浓度为40%的亚硝酸钠溶液，亚硝酸钠与肝素钠的固体质量比为28g:1000g，控制温度在25℃，搅拌反应2.5h，再用氧化钙调pH值至9.0终止裂解反应；
第二步，裂解液的还原：向裂解液中加入15g硼氢化钠，控制温度在40℃，反应4h后降温至20℃以下；用盐酸调整pH值至3.0，搅拌反应20min后，再用氢氧化钠调整pH值至7.0，将该溶液流过紫外灯照射管，以254nm波长照射30min；
第三步，乙醇沉淀：向第二步结束后的料液中边搅拌边加入相当于2倍料液体积的95%乙醇，搅拌20min后静置18h，然后倒去上清液；用95%乙醇洗涤沉淀3次，静置去除乙醇上清，得到固态的晶体颗粒沉淀；
第四步，弱阴离子交换层析分级并转钙：将第三步得到的晶体颗粒用纯水溶解成浓度为5%的料液，调节料液pH值至7.5；弱阴离子交换层析柱用0.05 mol/L的Tris-HCl缓冲液平衡，检测波长232nm，平衡稳定后，将料液按35mg肝素/ml介质上样；上样结束后，用0.15mol/L的氯化钙溶液进行洗涤，再以1.0 mol/L氯化钙溶液进行洗脱，根据232nm紫外信号收集洗脱液；
第五步，过滤、沉淀和脱水：将第四步收集的洗脱液通过0.22um除菌滤膜过滤，滤液中加入相当于3倍滤液体积的95%乙醇，搅拌15min，静置12h后去除乙醇上清液；再用无水乙醇洗涤沉淀3次，沉淀离心脱水，60℃真空干燥56h得到那屈肝素钙768g。
上述实施例1-3中所得那屈肝素钙和进口原研样品的质量检测结果如表1所示。
上述实施例中，所述弱阴离子交换层析柱选用Bettsep D501。
本发明的高质量那屈肝素钙的制备方法是针对现有的那屈肝素钙生产工艺进行的优化和改进。其使用肝素钠为原料，先通过降解、还原、乙醇沉淀得到低分子肝素钠粗品，再通过弱阴离子交换层析来控制低分子肝素钙的分子量及分布，能够精确控制分子量，与原研样对比显示，在抗Xa/抗IIa比值以及小于2000Da的百分比例方面，本发明得到的高质量那屈肝素钙产品和进口原研样具有同等的品质；并且该制备方法自动化程度高，操作便捷，产品收率高，有利于实现工业化批量生产。
Claims (2)
1.一种高质量那屈肝素钙的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
第一步，肝素钠的裂解
用纯水将肝素钠固体原料制成质量浓度为9-11%的肝素溶液，用盐酸溶液调pH值至2.5-3.0；向肝素溶液中滴加质量浓度为35%-40%的亚硝酸钠溶液，亚硝酸钠与肝素钠的固体质量比为（28-32g）:1000g，控制温度在23-25℃，搅拌反应1.5-2.5h，再用氧化钙调pH值至8.5-9.0终止裂解反应；
第二步，裂解液的还原
向裂解液中加入硼氢化钠，硼氢化钠加入量与初始肝素钠的固体质量比为（10-15g）:1000g，控制温度在30-40℃，反应2-4h后降温至20℃以下；用盐酸调整pH值至2.5-3.0，搅拌反应15-20min后，再用氢氧化钠调整pH值至6.5-7.0，将该溶液流过紫外灯照射管，以220-254nm波长照射20-30min；
第三步，乙醇沉淀
向第二步结束后的料液中边搅拌边加入相当于1.5-2倍料液体积的95%乙醇，搅拌15-20min后静置12-18h，然后倒去上清液；用95%乙醇洗涤沉淀2-3次，静置去除乙醇上清，得到固态的晶体颗粒沉淀；
第四步，弱阴离子交换层析分级并转钙
将第三步得到的晶体颗粒用纯水溶解成浓度为3-5%的料液，调节料液pH值至6.5-7.5；弱阴离子交换层析柱用0.01-0.05 mol/L的Tris-HCl缓冲液平衡，检测波长232nm，平衡稳定后，将料液按30-35mg肝素/ml介质上样；上样结束后，用0.10-0.15 mol/L的氯化钙溶液进行洗涤，再以0.5-1.0 mol/L氯化钙溶液进行洗脱，根据232nm紫外信号收集洗脱液；
第五步，过滤、沉淀和脱水
将第四步收集的洗脱液通过0.22um除菌滤膜过滤，滤液中加入相当于2-3倍滤液体积的95%乙醇，搅拌10-15min，静置8-12h后去除乙醇上清液；再用无水乙醇洗涤沉淀2-3次，沉淀离心脱水，55-60℃真空干燥48~56h得到那屈肝素钙。
2.如权利要求1所述的高质量那屈肝素钙的制备方法，其特征在于所述弱阴离子交换层析柱选用Bettsep D501。
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