CN103396961B - 耐福美双的桑氏链霉菌突变株μv-2及其液体制剂与制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株耐福美双的桑氏链霉菌突变株ΜV-2及其液体制剂与制备方法和应用，该菌株已于2013年7月15日保藏在中国北京市朝阳区中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC NO：7920，分类命名为桑氏链霉菌Streptomyces sampsonii。本发明采用紫外线照射与药物培养基驯化相结合的方法，选育对福美双具有抗性的桑氏链霉菌突变菌株，通过筛选获得抗福美双突变株，结合化学农药联合控制杨树紫纹羽病。通过紫外诱变和药剂驯化后，拮抗菌对杨树紫纹羽病菌的拮抗效果发生显著变化。
Description
技术领域
本发明涉及的是一株耐福美双的桑氏链霉菌突变株ΜV-2及其液体制剂与制备方法和应用。
背景技术
随着近代对化学农药的过度依赖，很多病原真菌对化学农药产生了强烈的抗药性，更进一步导致了化学农药的滥用，对全球的环境健康和食品安全构成了巨大威胁。目前，应用生物防治控制植物病害已经越来越受到世界各国的重视，筛选有益微生物，由生防微生物开发的农药已成为国内外生物防治研究的热点。但能够实际应用到植物病害防治上的还很少。四川农业大学林学院森保实验室从杨树根系分离得到了一株对杨树紫丝核菌有抑制作用的桑氏链霉菌KJ40。国内对桑氏链霉菌的研究较少，Jain从花园的土壤中分离得到S.sampsonii菌株，发现具有抗真菌活性。
野生链霉菌株对农药的抗药性差，当施用农药后对具生防作用的菌株也有杀灭效果，造成生防作用下降或者无明显生防作用。报道显示，生防菌和化学农药混合使用，不仅可以降低农药的使用量，减轻对环境的污染，还因为化学杀菌剂的使用削弱了病原菌的生长，使其对生防菌更加敏感，从而提高了生防菌的防治效果。实现生防菌和化学农药综合利用的前提是生防菌对化学农药要有一定的耐药性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是在前一发明专利（201210122697.0）基础上通过人工诱变技术获得一株耐福美双的桑氏链霉菌突变株ΜV-2，耐福美双的桑氏链霉菌突变株ΜV-2生物型与发明人的前一发明（201210122697.0）相比，可显著提高预防、治病能力和促生效果。
本发明的技术方案如下：
耐福美双的桑氏链霉菌突变株ΜV-2，该菌株已于2013年7月15日保藏在中国北京市朝阳区中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCCNO：7920，分类命名为桑氏链霉菌Streptomyces sampsonii。
本发明采用紫外线照射与药物培养基驯化相结合的方法，选育对福美双具有抗性的桑氏链霉菌突变菌株，通过筛选获得抗福美双突变株，结合化学农药联合控制杨树紫纹羽病。通过紫外诱变和药剂驯化后，拮抗菌对杨树紫纹羽病菌的拮抗效果发生显著变化。有的突变株拮抗活性减弱，如ΜV-5，对杨树紫纹羽病菌无抑制效果；有的突变株对菌丝的拮抗活性无显著变化，如ΜV-1和ΜV-3。有的突变株拮抗活性增强，如ΜV-2和ΜV-4，抑制率分别是80.39%和76.08%大大高于原KJ40的抑制率。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
（一）耐福美双的桑氏链霉菌生物型的选育
1材料与方法
1.1材料
1.1.1供试菌株：
（1）生防菌：桑氏链霉菌（Streptomyces sampsonii）KJ40菌株（该菌株在中国专利201210122697.0已经公开并提交保藏证明）。
（2）病原菌：杨树紫纹羽病（紫丝核菌（Rhizoctonia crocorμm Fr.）），油橄榄焦枯菌，桉焦枯菌，板栗疫病菌，红豆杉根腐，山茶灰斑病。
1.1.2供试药剂
福美双40%、甲基硫菌灵30%甲硫·福美双（山东潍坊万盛生物农药有限公司）
1.1.3培养基
牛肉膏蛋白胨培养基：葡萄糖10g，牛肉膏5g，蛋白胨10g，琼脂粉20g，NaC15g，水1000mL，pH7.0～7.2；用于放线菌的培养。
PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml，pH自然；用于拮抗性测定。
1.2方法
1.2.1福美双对链霉菌孢子致死浓度的测定
链霉菌KJ40斜面25℃培养2d，将其制备成单孢子悬液。将制备好的出发菌株孢子悬液分别涂布于含福美双1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml的牛肉膏蛋白胨培养基平板上，以不加福美双的处理为对照，置于25℃恒温培养箱中培养。2d后逐日观察记载菌落生长情况。凡是在前一个低浓度平板上长出菌落而在后一个较高浓度平板上未长出菌落的，后一浓度即为福美双对出发菌株的孢子的致死浓度。
表1福美双对菌株KJ40孢子的致死浓度测定
由表1可知，福美双对菌株KJ40孢子的致死浓度为40μg/mL，以此为菌株KJ40抗药性致死突变的标注。将在40μg/mL长出的5株耐药菌株平板划线培养后保存。
1.2.2福美双对病原菌致死浓度的测定
将各供试菌株在培养基上活化后，移至25℃黑暗条件下培养5d，沿其菌落边缘打菌碟(直径5mm)，分别移入含福美双1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml的PDA平板上，以不加福美双的处理为对照，置于25℃恒温培养箱中培养，每处理重复4次。3d后逐日观察记载菌落生长情况和菌落直径，计算菌丝生长抑制率。
下列公式计算菌丝生长抑制率:
菌落直径(mm)=测量菌落直径值－5.0
菌丝生长抑制率(%)=(对照菌落直径－处理菌落直径)/对照菌落直径×100%
表2福美双对各病原菌的抑菌率测定
注:采用Duncan多重比较法分析，同一列不同字母表示显著性差异（P<0.05，N=3）
由表2看出，福美双对病原菌抑制效果明显。除红豆杉根腐病菌和油橄榄焦枯病菌外，5μg/ml浓度的福美双对山茶灰斑病菌，板栗疫病菌，杨树紫纹羽病菌，桉树焦枯病菌抑制率达到100%，对暗孢接菱孢也达到了91.38%。20μg/ml的福美双对红豆杉根腐病菌和油橄榄焦枯病菌的抑制率分别为79.22%和52.16%，还是具有较强的抑制性。说明真菌病原菌对低浓度福美双敏感。福美双对桑氏链霉菌链霉菌KJ40的致死浓度为40μg/mL，提高到抗200μg/ml，对大多数真菌病原菌5μg/ml的敏感浓度提高了40倍。
1.2.3紫外线诱变
确定诱变浓度：将出发菌株接种于斜面牛肉膏蛋白胨培养基中进行25℃恒温培养活化2d，将其制备成单孢子悬液。取1ml菌悬液按照梯度稀释法稀释为10-3，10-4，10-5。吸取不同稀释梯度的菌悬液100μL分别涂布在平板培上，于30W紫外灯下诱变30s。25℃恒温黑暗培养3d后计算菌落数，以未经紫外线诱变菌株的涂布培养结果为对照，统计菌落数，计算紫外诱变后的致死率，确定最佳的诱变菌悬液浓度。
表3紫外线诱变最适菌悬液浓度的确定
以菌株KJ40为出发菌株，对其不同浓度的菌悬液进行30W紫外灯下30s诱变，诱变结果如表3所示。由表3可知，随着菌悬液浓度的降低，致死率逐渐升高，由于高剂量可能造成更多负突变株，所以选择致死率为60%～90%的剂量诱变，即本试验确定最适的诱变菌悬液浓度为10-3。
确定诱变时间：将确定的最佳诱变浓度菌悬液吸取100μL涂布在平板上，30W紫外灯下诱变10，20，30，60，和120s，25℃恒温黑暗培养3d后计算菌落数。试验以不进行紫外诱变的平板为对照，并以致死率在60%～90%之间确定最佳诱变时间。
表4紫外线最适诱变时间的确定
以菌悬液浓度10-3为最适诱变浓度，进行30W紫外灯下不同时间诱变，诱变时间与菌落数变化关系如表4所示。由表4可知，随着诱变时间的增长，存活菌落数逐渐减少，致死率逐渐增加，依据致死率为60%～90%，确定最适诱变时间为30s，此时致死率为85.38%。
1.2.3抗福美双突变株的筛选
初选：将突变株接入斜面进行培养保存。再将得到的突变株平板划线培养后转入斜面2～3d，将其制备成单孢子悬液。将制备好的孢子悬液吸取100μL分别涂布于含福美双40μg/ml的培养基平板上，30W紫外灯下诱变30s，每处理重复3次，25℃恒温黑暗培养3d后计算菌落数。3d后逐日观察记载菌落生长情况。凡是在平板上长出菌落的，即为抗福美双40μg/ml的突变菌株。如此反复，逐步提高药剂浓度直到获得抗福美双200μg/ml的抗药性菌株。计算菌落数并将单菌落挑接于斜面上25℃培养，待斜面孢子丰满，置于4℃冰箱保存。
通过紫外线诱变与药剂驯化相结合的方法对亲本桑氏链霉菌菌株KJ40进行反复诱导，最终得到5个能在40%福美双可湿性粉剂浓度为200μg/ml的培养基上正常生长并产孢的突变菌株，初步观察突变株外部形态无较大变化，但生长速度变缓,将筛选出的命名为ΜV-1，ΜV-2，ΜV-3，ΜV-4，ΜV-5，进行抑制作用试验。
复选：通过平板对峙法测定出发菌株和突变菌株的抑菌效果测定。在直径90mm的PDA平板中心接种活化后的直径5mm大小的紫丝核菌，将牛肉膏蛋白胨培养基上活化的出发菌株和抗福美双的突变菌株在PDA平板距中心25mm对称的两侧划线。25℃培养5d后，观察记录抑菌情况，测定抑菌带宽度，3次重复。
通过紫外诱变和药剂驯化后，拮抗菌对杨树紫纹羽病菌的拮抗效果发生显著变化。有的突变株拮抗活性减弱，如ΜV-5，对杨树紫纹羽病菌无抑制效果；有的突变株对菌丝的拮抗活性无显著变化，如ΜV-1和ΜV-3。有的突变株拮抗活性增强，如ΜV-2和ΜV-4，抑制率分别是80.39%和76.08%大大高于原KJ40的抑制率。
表5抗药性桑氏链霉菌对杨树紫纹羽病菌的抑制效果
1.2.4抗性突变株的遗传稳定性
将上述ΜV-2，ΜV-4经过多菌灵油边获得的抗性突变株继代转管20次以上，再转移至含福美双浓度200μg/mL的平板上，突变株菌落均能够正常生长和产孢，且对病原菌的抑制效果不变。这说明突变株ΜV-2，ΜV-4的抗药性和拮抗性较为稳定和持久。
（二）田间防治实例
（1）桑氏链霉菌（Streptomyces sampsonii）突变株ΜV-2液体制剂的发酵
①一级斜面种子：常规方法制作改良高氏一号斜面培养基（KNO31g，KH2PO40.5g，MgSO4.7H2O0.5g，NaCl0.5g，Fe2(S04)3.7H2O0.01g，可溶性淀粉20g，琼脂17g，水1000ml），接种ΜV-2后在26-28℃下培养48小时制成一级斜面种子。
②二级液体种子：改良高氏一号培养液（KNO31g，KH2PO40.5g，MgSO4.7H2O0.5g，NaCl0.5g，Fe2(S04)3.7H2O0.01g，可溶性淀粉20g，杨树根浸渍液1000ml，杨树根浸渍液：洗净的杨树根10g在1000ml水中煮沸10分钟，保持水量，除去根后所得滤液）经高压灭菌后，按100mL液体盛于300mL三角瓶比例（通氧控制）装瓶，在无菌状态接种ΜV-2斜面种子，每瓶接种2支斜面种子，温度26-28℃，初始pH值7.0，120r/min振荡培养36h，制成桑氏链霉菌KJ40突变株ΜV-2二级液体种子。
③液体发酵：改良高氏一号培养液（KNO31g，KH2PO40.5g，MgSO4.7H2O0.5g，NaCl0.5g，Fe2(S04)3.7H2O0.01g，可溶性淀粉20g，杨树根浸渍液1000ml）经高压灭菌后，按200mL液体盛于500mL三角瓶比例（通氧控制）装瓶，在无菌状态接种上述桑氏链霉菌KJ40突变株ΜV-2二级液体种子，接种量10%（体积比），温度26-28℃，初始pH值7.0，120r/min振荡培养72h，制成ΜV-2液体制剂。
（2）制剂保存：瓶装制剂常温保存半年或低温（4度）1年半不影响防治和促生效果。
（3）突变株ΜV-2制剂与福美双田间联合施用：
①预防处理：未发病杨树在用福美双（200μg/ml）100毫升处理1周后，用上述液体制剂200-400倍(体积比)稀释度沿根系幅面灌根，每株100毫升，每年春季施用一次，与发明人的前一发明（201210122697.0）相比，可提高防病能力和促生效果、其改善土壤微生物区系能力相当。
②防治处理：发病杨树在用福美双（200μg/ml）100毫升处理1周后，ΜV-2制剂按100-200倍(体积比)稀释度沿根系幅面灌根及附近土壤淋灌，每株200毫升，春、夏各一次，连续三年，与发明人的前一发明（201210122697.0）相比，可提高治病能力和促生效果、其改善土壤微生物区系能力相当。
表1突变株ΜV-2制剂与福美双预防和促生功能参数：未发病杨树林地（1年生）
表2突变株ΜV-2制剂与福美双治疗和改善根系微生物环境参数：发病杨树林地（2年生），处理2年后
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (4)
1.耐福美双的桑氏链霉菌（ Streptomyces sampsonii ） 突变株ΜV-2，保藏编号为CGMCC NO：7920。
2.含有权利要求1所述的桑氏链霉菌突变株ΜV-2的液体制剂。
3.权利要求2中所述的液体制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
①一级斜面种子：常规方法制作改良高氏一号斜面培养基，接种桑氏链霉菌突变株ΜV-2后在26-28℃下培养48小时制成一级斜面种子，所述改良高氏一号斜面培养基成分为KNO31g，KH2PO40.5g，MgSO4 · 7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，Fe2(SO4 )3· 7H2O 0.01g，可溶性淀粉20g，琼脂17g，水1000ml；
②二级液体种子：改良高氏一号培养液经高压灭菌后，按100mL液体盛于300mL三角瓶比例装瓶，在无菌状态接种ΜV-2斜面种子，每瓶接种2支斜面种子，温度26-28℃，初始pH值7.0，120r/min振荡培养36h，制成桑氏链霉菌突变株ΜV-2二级液体种子；
③液体发酵：改良高氏一号培养液经高压灭菌后，按200mL液体盛于500mL三角瓶比例装瓶，在无菌状态接种上述桑氏链霉菌突变株ΜV-2二级液体种子，接种量体积比10％，温度26-28℃，初始pH值7.0，120r/min振荡培养72h，制成桑氏链霉菌ΜV-2液体制剂；改良高氏一号培养液的组分 如下：KNO31g，KH2PO40.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，Fe2(SO4 )3·7H2O 0.01g，可溶性淀粉20g，杨树根浸渍液1000ml，杨树根浸渍液的配制方法为：洗净的杨树根10g在1000ml水中煮沸10分钟，保持水量，除去根后所得滤液。
4.权利要求2中所述的液体制剂在防治杨树紫纹羽病中的应用。
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