CN104381303B

CN104381303B - 组合物及其应用

Info

Publication number: CN104381303B
Application number: CN201410585160.7A
Authority: CN
Inventors: 张成省; 孔凡玉; 黄树立; 张立猛; 计思贵; 李青诚; 祖秉桥; 高加明; 李锡宏; 郭利; 杨海凌; 焦永鸽; 王静; 冯超
Original assignee: Hubei Branch Of China National Tobacco Corp; Tobacco Research Institute of CAAS
Current assignee: Hubei Branch Of China National Tobacco Corp; Tobacco Research Institute of CAAS
Priority date: 2014-10-28
Filing date: 2014-10-28
Publication date: 2017-07-21
Anticipated expiration: 2034-10-28
Also published as: CN104381303A

Abstract

本发明公开了一种组合物，由质量比为1.21～2.34∶97.76～98.79的核黄素与枯草芽孢杆菌Tpb55菌粉构成；及该组合物在防治烟草的黑胫病和赤星病方面的应用。本发明组合物与单独施用枯草芽孢杆菌Tpb55菌株相比，能显著提高对烟草黑胫病、赤星病等真菌病害的防治效果，与生产主用化学药剂的防治效果相当。两组分相容性好、并能增加防治效果的诱导植物抗病性物质，并利用其与生防微生物复配，兼做杀菌剂和诱抗剂来用于烟草赤星病、黑胫病等真菌病害的防治，并将其作为新型杀菌剂原料进行开发应用。

Description

组合物及其应用

技术领域

本发明涉及生物药剂技术领域，尤其是一种组合物，及其应用。

背景技术

目前烟草黑胫病、赤星病等是烟草上重要的真菌病害，每年造成巨额经济损失，上述病害防治严重依赖化学药剂，由于药剂品种单一、使用年限较长，病原菌抗药性增加，防治效果明显下降，且随着人们对环境与健康的日益重视，化学农药的使用越来越受到严格限制，因此亟需寻找替代化学防治的技术。生物防治被认为非常有希望替代化学药剂的防治技术，成为人们研究的热点。然而，大量实践表明，单纯依赖生防微生物，往往存在效果慢、防效差、受环境影响大等不利因素，难以替代化学农药，在生产上难以推广。

种植抗病品种、加强栽培管理以及化学防治是我国目前防治烟草赤星病的主要措施。但是，优良的抗性品种难以获得，且容易丧失，而且生产上的主栽品种均抗性较差。利用地膜覆盖，合理轮作，适时早移栽以及适宜的种植密度等措施，在一定程度上可以减轻病害的发生程度，但在病害选择压力大时往往效果并不明显，只能发挥辅助作用。因此，化学药剂的使用仍是主要手段，其中，菌核净是使用最广泛的药剂。黑胫病的防治同样以化学防治为主，常用药剂主要有甲霜灵系列、乙磷铝及乙磷铝锰锌、敌克松、恶霜灵锰锌、代森锌、福美双、代森锰锌等。这些化学药剂多为苯基酰胺类及乙磷铝等同一种或作用机制相同的几种内吸性杀菌剂，很容易产生耐药性，从而引起药效下降。烟草黑胫病和赤星病的防治严重依赖化学防治，存在诸多弊端。一是，造成环境污染和农药残留。二是产生抗药性，防治效果下降，防治成本增加。袁宗胜等检测了山东、湖南等9个主要烟区的烟草黑胫病菌对甲霜灵的敏感性，发现所测菌株菌丝生长对甲霜灵都存在不同程度的敏感性，EC50值相差15倍左右，通过甲霜灵对烟草黑胫病菌继代培养物的测定，也证明了烟草黑胫病菌对甲霜灵的耐药性。三是药剂的使用受环境影响大，防治效果不理想。如高温多雨天气利于烟草赤星病的爆发，化学药剂难以使用。

另外，新的化学农药研发不仅成本高，而且难度大，且有时使用效果不理想，而生物防治不仅环境友好，而且有时效果较为理想，成为近年来研究热点，针对烟草赤星病和黑胫病等真菌病害生物防治，国内研究者作了大量研究，特别是在拮抗菌的筛选上作了大量努力，获得了大量优良生防微生物。经过长期努力，我国烟草真菌病害生物防治取得了较大进展，但是还存在诸多问题，突出表现在：(1)研究多限于低水平的重复，突破少。目前大量研究仅限于低水平重复性的室内研究上，特别是菌株的筛选上。虽然高效菌株的获得是非常重要的，但仅仅停留在这个水平上，造成了大量的资源浪费；(2)多不具备产业化基础，技术走不出实验室，离生产应用距离尚远，生产上缺乏能推广应用的生防产品；(3)普遍单一依赖生防微生物，防治效果有限，且易受环境影响，防治效果不稳定，与化学药剂防治效果相比相差太远，无法替代化学农药施用。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提出一种组合物，能诱导烟草抗病性，对烟草黑胫病、赤星病等真菌病害防治效果能达到生产主用化学药剂的防治效果，具有较大应用价值，可以用于烟草真菌病害的绿色防控。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：一种组合物，由质量比为1.21～2.34∶97.76～98.79的核黄素与枯草芽孢杆菌Tpb55菌粉构成。

优选的，核黄素与枯草芽孢杆菌Tpb55菌粉的质量比为1.88∶98.12。

优选的，该枯草芽孢杆菌Tpb55菌粉的芽孢含量4×10¹⁰cfu/g。

如上所述的组合物在防治烟草的黑胫病和赤星病方面的应用。

优选的，防治赤星病时，在烟草赤星病发病初期施用组合物，稀释400倍液，叶片均匀喷雾，连续施药2～3次，每次间隔7～10天。

优选的，防治烟草黑胫病时，在烟草移栽后7天施用组合物1次，稀释为400倍液，灌根，黑胫病发病初期连续施药2～3次，每次间隔7～10天。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明组合物与单独施用枯草芽孢杆菌Tpb55菌株相比，能显著提高对烟草黑胫病、赤星病等真菌病害的防治效果，与生产主用化学药剂的防治效果相当。两组分相容性好、并能增加防治效果的诱导植物抗病性物质，并利用其与生防微生物复配，兼做杀菌剂和诱抗剂来用于烟草赤星病、黑胫病等真菌病害的防治，并将其作为新型杀菌剂原料进行开发应用。

附图说明

图1为诱导抗性物质对Tpb55菌株生长的影响；

图2为诱导抗性物质与Tpb55菌株复配对黑胫病防治效果；

图3为枯草芽孢杆菌Tpb55与核黄素组合物对POD酶活性影响；

图4为枯草芽孢杆菌Tpb55与核黄素组合物对CAT酶活性影响；

图5为枯草芽孢杆菌Tpb55与核黄素组合物对SOD酶活性影响。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行详细描述，本部分的描述仅是示范性和解释性，不应对本发明的保护范围有任何的限制作用。

一种由核黄素与枯草芽孢杆菌Tpb55菌株按照质量比1.21～2.34∶97.76～98.79构成的组合物；将两种组分混匀即可。其中，枯草芽孢杆菌Tpb55菌株的制备，可参照专利ZL201110093415.4方法发酵完成后，喷雾干燥即得枯草芽孢杆菌Tpb55菌粉，芽孢含量4×10¹⁰cfu/g。

上述组合物在防治烟草的黑胫病和赤星病方面，有显著地效果；可以通过以下措施达到：

1、防治烟草赤星病时，在烟草赤星病发病初期开始施用枯草芽孢杆菌与核黄素的组合物，施用倍数为稀释为400倍液，施用方法为叶片均匀喷雾，连续施药2～3次，每次间隔7～10天。

2、防治烟草黑胫病时，在烟草移栽后7天施用枯草芽孢杆菌与核黄素的组合物1次，黑胫病发病初期连续施药2～3次，每次间隔7～10天，施用倍数为稀释为400倍液，施用方法为灌根。

为更好的说明本发明，特列举以下实施例，但不限于这些实施例。

实施例1：抗烟草黑胫病诱导抗性物质筛选

1.1材料

供试烟草红花大金元，种子由本实验室保存。将种子播种在装有沃土的育苗盘内，置于28℃左右的温室里生长，至1-2片真叶时移至营养钵中单株培养，待烟苗生长至5-6片真叶时进行试验。

供试病原菌烟草黑胫病菌(PhytophthoraParasiticaVarnicotianae)0号生理小钟，由本实验室保存。病原菌在燕麦培养基上培养，参照杨建卿的方法刺激游动抱子囊产生，制备游动抱子悬浮液，接种浓度为6×10³个游动抱子/mL悬浮液。

供试药剂如表1所示。

表1供试诱导抗性物质

温室防效对10个备选药剂分别选定5个不同梯度浓度进行诱导处理，每组10株，重复三次。分别在第1、3天连续诱导两次。在最后一次诱导的72h后，进行烟草黑胫病菌菌丝体创伤茎接种。接种后第10天、第20天观察并记录病情发展情况，按烟草病害分级及调查方法(GB/T23222-2008)调查及分级。表2是筛选出防效最好的3种诱抗剂的实验结果。表2显示，从接种后第10天调查，经200mg/L乙烯利、5umol/L核黄素、2mmol/L水杨酸处理的烟草黑胫病的病指较低，防效均达到80.00％，其中200mg/L乙烯利的防效高达88.16％，接种第20天调查，三种药剂处理的烟草黑胫病的病指升高，防效不断降低，但均高于50.00％。其中200mg/L乙烯利处理的烟草防效显著降低，说明相对于200mg/L乙烯利处理的烟草，5umol/L核黄素、2mmol/L水杨酸处理的烟草更具有持久抗性。

病情指数＝∑(各级病株×该病级值)/(调查总株数×最高级值)×100

诱抗效果％＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100

表2不同浓度药剂喷雾处理对烟草黑胫病的防治效果

对菌丝生长的影响对菌丝生长的影响参照杀菌剂毒力测定方法-生长速率法。无菌操作条件下，将各诱抗剂混入融化的培养基，制成系列浓度的带药培养基，每个浓度重复3次，将事先培养好的菌平板用5mm的打孔器在菌落边缘切取菌块，用挑针转移到混有药剂的培养基上，27-28℃培养4d，用十字交叉法测量菌落直径，计算抑菌率。表3显示，壳聚糖、乙烯利、茉莉酸、丁香酚4种药剂对黑胫病菌丝生长的抑制作用随着浓度增大而增大，而ABA、BTH、核黄素、INA在供试浓度梯度内对菌丝生长抑菌效果均不明显，均小于25％。而水杨酸和甜菜碱对菌丝生长的抑制作用较明显，浓度2mmol/L的水杨酸和5mmol/L的甜菜碱已完全抑制菌丝生长。

抑菌率＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100％

表3各诱抗剂对烟草黑胫病菌菌丝生长的影响

实施例2：诱导抗性物质与Tpb55菌株相容性测定

选择盆栽试验防病效果较佳的核黄素和水杨酸测定其不同浓度处理对Tpb55菌株生长的影响。预试验结果表明，水杨酸对Tpb55菌株表现低促高抑的活性，当浓度高于10umol/L时，对Tpb55菌株有明显的抑制作用，且对烟草易产生药害。因此本实验设计试验浓度选择低于该浓度水平。向100ml的NA液体培养基中，分别加入水杨酸和核黄素，配成1、3、5、7、9umol/L的含水杨酸培养基和5、10、50、100、200umol/L的含核黄素培养基，调pH值至7.0。加入1×10⁸cfu/ml的枯草芽孢杆菌Tpb55菌株，180rpm、28℃培养36h，600nm下测定吸光值，设3次重复。

结果表明，核黄素和水杨酸对Tpb55菌株在试验浓度下，均对Tpb55菌株的生长有一定的促进作用，以水杨酸7umol/L和核黄素100umol/L促进效果较为明显，如图1所示，说明在上述浓度下，水杨酸、核黄素分别与Tpb55菌株有良好的相容性。

实施例3诱导抗性物质与Tpb55菌株联合控病试验

试验分别设6个处理：(1)核黄素5umol/L溶液；(2)水杨酸7umol/L溶液；(3)2.0×10⁸cfu/ml的Tpb55；核黄素5umol/L溶液含2.0×10⁸cfu/ml的Tpb55；(5)水杨酸7umol/L溶液含2.0×10⁸cfu/ml的Tpb55；(6)空白对照。取5～6片真叶烟苗浸根于上述各处理溶液中，1h后取出并移栽于装有灭菌土的花盆中。缓苗后约3d，接种烟草黑胫病菌菌谷于烟草根际，每株1.0g。对照以清水浸根。完成后将烟株置于20℃左右的温室中保温保湿，观察发病情况。见病株后，每日观察记录发病株数。以接种病原菌日为起点日，共观察15d。分级标准按全国烟草行业烟草病害调查分级标准Yc/T39-1996进行。病情指数和防治效果按烟草病害药效试验方法Yc/T40-1996计算。

结果如图2所示，水杨酸和核黄素与Tpb55菌株复配后，较单剂均能显著提高对烟草黑胫病的抑制作用。以核黄素与Tpb55菌株复配防病效果最佳，温室防治效果达82.9％。

实施例4：枯草芽孢杆菌Tpb55菌株与核黄素组合物对烟草防御酶活性影响

1.1试验材料

烟草品种：小黄金，种子由本实验室保存。将种子播种在装有沃土的育苗盘内，置于28℃左右的温室里生长，至1-2片真叶时移至营养钵中单株培养，待烟苗生长至5-6片真叶时进行试验。

供试病原菌：烟草黑胫病菌(PhytophthoraParasiticaVarnicotianae)0号生理小种，由本实验室保存。

供试试剂：核黄素(VB2)购自北京博奥拓科技有限公司。

1.2酶液提取及活性测定

核黄素与枯草芽孢杆菌Tpb55菌粉按1.88∶98.12(质量∶质量)混合即得组合物，利用组合物诱导处理烟草后0、6、12、、24、48、72、96、120h分别取第3叶片，在液氮速冻后于-80℃下保存，用于植物防御酶活性测定。酶的提取：称取1.0克新鲜烟叶，去除主脉，放入研钵中，加入适量的pH7.5磷酸缓冲液，在冰浴中磨成匀浆，将匀浆全部转入离心管中，在4℃3000r/min的冷冻离心机中离心10min，上清液即为酶粗提液。过氧化氢酶(CAT)的活性参照Dhindsa的方法测定，以每分钟OD240值变化0.01的酶量定义为1个酶活单位。过氧化物酶(POD)的活性参照Schaffrath[2]的方法测定，以OD470值变化0.1为1个酶活单位。超氧化物歧化酶(SOD)活性参照Schaffrath的方法。

结果如图3至图5所示，烟草叶片过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性显著增加。

实施例5枯草芽孢杆菌Tpb55与核黄素组合物防治烟草赤星病田间试验

烟草赤星病防治试验分别于2012年和2013年安排在青岛市即墨烟田，烤烟品种为NC89。2012年移栽期为5月17日，在发病初期开始施药。于7月20日、7月30日和8月7日连续喷施Tpb55菌剂400倍液3次，以40％菌核净可湿性粉剂500倍液为药剂对照，以清水为空白对照。小区面积66.7m2，每小区植烟100株。于7月20日、8月17日各调查一次病情指数。213年移栽期为5月20日，在田间初现病斑时开始施药，7月18日第一次施药，7月25日、8月4日连续用药2次，于7月18日调查病情基数，8月14日最后一次统计调查结果。结果如表4和表5所示，对烟草赤星病有良好的防治效果，枯草芽孢杆菌Tpb55与核黄素组合物400倍液防治效果与菌核净相当。2013年试验结果表明，Tpb55与诱导抗性剂核黄素复配后，对烟草赤星病的防治效果优于生产主用药剂菌核净，建议在生产中用于防治赤星病时以400倍液为佳，在田间尚未发病或发病初期使用，间隔7-10天，连续用药2-3次。

表4Tpb55菌剂对烟草赤星病的田间防治效果(2012)

表5Tpb55菌剂对烟草赤星病的田间防治效果(2013)

实施例6枯草芽孢杆菌Tpb55与核黄素组合物防治烟草赤星病田间试验

本试验分别于2012年和2013年安排在中国农科研烟草所即墨实验站黑胫病病圃进行，试验用地为平原田块，土壤为淋溶褐土。2012年，6月8日移栽，行距100cm，株距30cm，所有实验小区的栽培条件一致。7月5日人工接种黑胫病菌菌谷5克/株。栽培管理按照试验田统一生产规范进行，符合当地科学的农业实践(GAP)。施药3次，移栽时蘸根，移栽后2次，即6月15日和6月27日，使用方法为灌根，亩用药液量为50升，每株100mL。7月15日，至对照黑胫病达到中等程度发病时调查。2013年6月15日移栽，行距100cm，株距30cm，所有实验小区的栽培条件一致。7月20日人工接种黑胫病菌菌谷5克/株。施药3次，移栽时蘸根，移栽后2次，即6月25日和7月5日，使用方法为灌根，亩用药液量为50升，每株100mL。8月3日至对照黑胫病达到中等发病程度时进行调查。结果如表6、表7所示。综合2012和2013年试验结果来看，Tpb55菌粉与核黄素复配后能显著提高对烟草黑胫病的防治效果。建议在生产中用于防治黑胫病时以400倍液为佳，在移栽时浸根1h，移栽后7-10天灌根1次，移栽后15-20天再灌根一次。

表6Tpb55菌剂对烟草黑胫病的田间防治效果(2012)

表7Tpb55菌剂对烟草黑胫病的田间防治效果(2013)

本发明通过诱导抗性物质与优良生防菌株复配后的组合物，可以充分发挥诱导抗性物质和生防菌株的双重作用机制，显著提高对烟草赤星病、黑胫病等真菌病害的防治效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种组合物，由质量比为1.21～2.34∶97.76～98.79的核黄素与枯草芽孢杆菌Tpb55菌粉构成。

2.如权利要求1所述组合物，其特征在于：核黄素与枯草芽孢杆菌Tpb55菌粉的质量比为1.88∶98.12。

3.如权利要求1或2所述组合物，其特征在于：该枯草芽孢杆菌Tpb55菌粉的芽孢含量4×10¹⁰cfu/g。

4.如权利要求1所述组合物在防治烟草的黑胫病和赤星病方面的应用。

5.如权利要求4所述应用，其特征在于：防治赤星病时，在烟草赤星病发病初期施用组合物，稀释400倍液，叶片均匀喷雾，连续施药2～3次，每次间隔7～10天。

6.如权利要求4所述应用，其特征在于：防治烟草黑胫病时，在烟草移栽后7天施用组合物1次，稀释为400倍液，灌根，黑胫病发病初期连续施药2～3次，每次间隔7～10天。