CN115363043A - 一种防治烟草赤星病的组合物、制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种防治烟草赤星病的组合物、制备方法和应用，涉及农药领域，解决了在防治烟草赤星病时，如何减少化学农药使用量的问题。本发明防治烟草赤星病的组合物，包括生防菌剂、异菌脲和助剂，其中，生防菌剂为枯草芽孢杆菌YWF‑21‑2103制得的发酵液，并且生防菌剂与异菌脲的体积比为4∶1。该组合物通过生防菌剂和异菌脲共同防治烟草赤星病，对烟草赤星病病原菌有很强的抑制作用，对烟草赤星病显示出很好的防病效果，而且还具有病菌不易产生抗药性、增效作用明显、成本低、效果好、对环境友好的优势；另一方面，该组合物通过生防菌剂和异菌脲共同防治烟草赤星病，能够在很大程度上减少化学农药的使用，减少环境污染，提高作物品质和安全性。

Description

一种防治烟草赤星病的组合物、制备方法和应用
技术领域
本发明涉及农药技术领域，尤其涉及一种防治烟草赤星病的组合物、制备方法和应用。
背景技术
烟草(学名：Nicotiana tabacum)属于茄科，一年生草本植物。烟草赤星病是由链格孢属真菌(Alternaria alternate(Fr)Keissler)引起的病害，又称褐斑斑病、赤斑病。烟草赤星病具有潜育期短、暴发快、流行广、危害大等特点，在烟叶近成熟时危害叶片，发病初期为褐色小斑点，以后逐渐扩大为1～2cm 的深褐色至赤褐色病斑，为圆形或不规则圆形，扩展中的病斑周围有淡黄色晕圈，病斑具有多重同心轮纹，病斑质脆易破，病害严重时，许多病斑相互连接合并成大斑块枯焦。烟草赤星病导致可供烘烤的烟叶损失过多，不利于优质烟叶生产，但至今除了化学农药外，尚无有效的防治手段。
赤星病于1916年在北京首次发现，1964年在河南、山东烟区大肆传播， 1990年后迅速在全国各烟区发展传播，赤星病造成的病害损失居第2位。赤星病的烟田发病率为5％～10％，重病田可达20％甚至50％以上。据近年统计，赤星病对烟叶产值的负影响远大于对产量的影响，烟叶产量损失率最高为 28.56％，产值损失率最高可达89.67％。
烟草是叶用经济作物，对烟叶的外观和内在质量有特殊的要求，农药残留、病原菌抗药性以及对卷烟安全的影响，限制了农药的大规模利用，同时也不利于烟叶的出口。近年来，随着烟草生产及烟草制品逐渐向生态、安全、优质方向发展，以及人们对自身健康和生存环境的日益重视，人们逐渐意识到对烟草病害进行安全、无污染、无公害绿色防控的重要性。
因此，在防治烟草赤星病时，如何减少化学农药的使用量，以减少环境污染，提高作物安全性，已成为本领域技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的是提出一种防治烟草赤星病的组合物、制备方法和应用，解决了在防治烟草赤星病时，如何减少化学农药使用量的技术问题。本发明优选技术方案所能产生的诸多技术效果详见下文阐述。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明防治烟草赤星病的组合物，包括生防菌剂、异菌脲和助剂，其中，所述生防菌剂为枯草芽孢杆菌YWF-21-2103制得的发酵液，并且所述生防菌剂与所述异菌脲的体积比为4∶1。
本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其编号为YWF-21-2103，保藏登记号为CCTCC NO：M 20221097，保藏日期2022年07月12日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学(湖北省武汉市武昌区八一路299号)。
根据一个优选实施方式，所述生防菌剂稀释倍数为150～200倍，所述异菌脲稀释倍数为800～1000倍。
根据一个优选实施方式，所述助剂为吐温20，所述助剂的质量为所述生防菌剂和/或所述异菌脲质量的0.5‰。
本发明中任一项防治烟草赤星病的组合物的制备方法，包括如下步骤：
将枯草芽孢杆菌YWF-21-2103菌种培养发酵制得生防菌剂；
将生防菌剂稀释后与助剂混合；
将异菌脲稀释后与生防菌剂混合，生防菌剂与异菌脲的体积比为4∶1。
根据一个优选实施方式，将枯草芽孢杆菌YWF-21-2103菌种培养发酵制得生防菌剂包括如下步骤：
步骤1，菌种活化，将-80℃下保存的枯草芽孢杆菌YWF-21-2103菌株在 LB固体培养基上活化18～24h，得活化的枯草芽孢杆菌YWF-21-2103菌株；
步骤2，种子液制备，用无菌接种方法挑取步骤1中长势较优的枯草芽孢杆菌YWF-21-2103菌株接种到50ml LB液体培养基中，在温度为35℃、转速为180rpm/min条件下培养24h，得枯草芽孢杆菌YWF-21-2103种子液；
步骤3，发酵液制备，按照种子液、培养液体积比为1∶10的比例将步骤2 所得的枯草芽孢杆菌YWF-21-2103种子液接入到车间发酵料培养基中，在温度为35℃条件下，转速为180rpm/min条件下培养28～35h，得枯草芽孢杆菌 YWF-21-2103发酵液，枯草芽孢杆菌YWF-21-2103发酵液即为生防菌剂。
根据一个优选实施方式，枯草芽孢杆菌YWF-21-2103发酵液的有效活菌数为2.0×109cfu/g以上。
根据一个优选实施方式，步骤1中，LB固体培养基的组成为：细菌学蛋白胨10g/L，酵母提取粉5g/L，氯化钠5g/L，水1L，琼脂粉20g/L。
根据一个优选实施方式，步骤3中，以质量计，车间发酵料培养基的组成为：葡萄糖2.5～3.0％、玉米淀粉0.8～1.2％、豆粕粉2.2～2.8％、蛋白胨0.5～0.8％、磷酸氢二钾0.08～0.12％、硫酸镁0.03～0.06％、余量为水，并且车间发酵料培养基的pH为6.8～7.5。
本发明中任一项防治烟草赤星病的组合物在烟草种植中的应用。
根据一个优选实施方式，所述组合物采用喷雾的方法施用于烟叶叶片的正面和反面。
本发明提供的防治烟草赤星病的组合物、制备方法和应用至少具有如下有益技术效果：
本发明防治烟草赤星病的组合物，包括生防菌剂、异菌脲和助剂，其中，生防菌剂为枯草芽孢杆菌YWF-21-2103制得的发酵液，并且生防菌剂与异菌脲的体积比为4∶1，该组合物通过生防菌剂和异菌脲共同防治烟草赤星病，对烟草赤星病病原菌有很强的抑制作用，对烟草赤星病显示出很好的防病效果，而且还具有病菌不易产生抗药性、增效作用明显、成本低、效果好、对环境友好的优势；另一方面，该组合物通过生防菌剂和异菌脲共同防治烟草赤星病，能够在很大程度上减少化学农药的使用，减少环境污染，提高作物品质和安全性。
即本发明防治烟草赤星病的组合物、制备方法和应用，解决了在防治烟草赤星病时，如何减少化学农药使用量的技术问题。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1
本实施例对本发明防治烟草赤星病的组合物及其制备方法进行具体说明。
防治烟草赤星病的组合物，包括以下组分：生防菌剂，该生防菌剂为枯草芽孢杆菌YWF-21-2103制得的发酵液、润湿助剂吐温20，以及低毒化学农药 50％异菌脲可湿性粉剂。枯草芽孢杆菌YWF-21-2103制得的发酵液与50％异菌脲可湿性粉剂的质量比为为4∶1。润湿助剂吐温20的用量为0.5‰。
防治烟草赤星病的组合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)先将生防菌剂稀释150～200倍后加入0.5‰的润湿助剂吐温20备用；
(2)再将50％异菌脲可湿性粉剂稀释900-1000倍稀释后备用；
(3)将上述配制好的“药液”转入到大容器中进行搅拌均匀后使用。
生防菌株为枯草芽孢杆菌YWF-21-2103，从云南省微生物发酵工程研究中心有限公司菌种库中筛选得到。
菌株YWF-21-2103形态特征：在LB培养基上黄色近圆形菌落，表面粗糙，边缘锯齿状，菌落不透明。鉴定为枯草芽孢杆菌。
枯草芽孢杆菌YWF-21-2103发酵液的制备方法按以下步骤进行：
(1)菌种活化：将-80℃下保存的枯草芽孢杆菌YWF-21-2103菌株在LB 固体培养基上活化18～24h，得活化的枯草芽孢杆菌YWF-21-2103菌株。
(2)种子液制备：用无菌接种方法挑取步骤1中长势较优的枯草芽孢杆菌YWF-21-2103菌株接种到50ml LB液体培养基中，在温度为35℃、转速为180rpm/min条件下培养24h，得枯草芽孢杆菌YWF-21-2103种子液。
(3)发酵液制备：按照种子液、培养液体积比为1∶10的比例将步骤2 所得的枯草芽孢杆菌YWF-21-2103种子液接入到车间发酵料培养基中，在温度为35±0.5℃条件下，转速为180rpm/min条件下培养28～35h，得枯草芽孢杆菌 YWF-21-2103发酵液，枯草芽孢杆菌YWF-21-2103发酵液即为生防菌剂。枯草芽孢杆菌YWF-21-2103发酵液的有效活菌数为2.0×109cfu/g以上。
LB液体培养基的组成为：细菌学蛋白胨10g/L，酵母提取粉5g/L，氯化钠10g/L，水1L，即得液体培养基；在以上液体培养基中再加入琼脂粉20g/L即得固体培养基。
以质量计，车间发酵料培养基的组成为：葡萄糖2.5～3.0％、玉米淀粉 0.8～1.2％、豆粕粉2.2～2.8％、蛋白胨0.5～0.8％、磷酸氢二钾0.08～0.12％、硫酸镁0.03～0.06％、余量为水，并且车间发酵料培养基的pH为6.8～7.5。
实施例2
本实施例对本发明防治烟草赤星病的组合物的室内毒力进行测定。
一、生防菌剂与低毒化学农药对烟草赤星病的室内毒力测定
(1)药液配制
准确称取含量为50％的异菌脲WP原药0.75g于10mL容量瓶中，加2mL 无菌水充分溶解后用无菌纯水定容至刻度，制成75mg/mL异菌脲WP母液备用。再将75mg/mL母液等比稀释成37.5mg/mL、18.75mg/mL、9.38mg/mL和 4.69mg/mL的无菌纯水溶液，备用。
准确吸取生防菌剂原液1mL于10mL容量瓶中，加无菌纯水定容至刻度，制成有效活菌数为2×108cfu/mL的母液备用。再将有效活菌数为2×108cfu/mL 的母液等比稀释成有效活菌数为2×107cfu/mL、2×106cfu/mL、2×105cfu/mL 和2×104cfu/mL的带菌水溶液，备用。
(2)含药平板制备
取58mL灭菌后的PDA培养基3份，待其温度降至50℃左右时分别加入 2mL含75mg/mL、37.5mg/mL、18.75mg/mL、9.38mg/mL和4.69mg/mL的WP 无菌纯水溶液，用灭菌玻棒搅拌混匀后制成含异菌脲WP分别为2500μg/mL、 1250μg/mL、625μg/mL、312.7μg/mL和156.3μg/mL的带药平板。
取54mL灭菌后的培养基3份，待其温度降至50℃左右时分别加入6mL 有效活菌数为2×108cfu/mL、2×107cfu/mL、2×106cfu/mL、2×105cfu/mL和2 ×104cfu/mL的带菌水溶液，用灭菌玻棒搅拌混匀后制成有效活菌数为2× 107cfu/mL、2×106cfu/mL、2×105cfu/mL、2×104cfu/mL和2×103cfu/mL的带菌平板。
(3)异菌脲WP和生防菌剂的毒力测定
以只接赤星病菌丝块的处理为对照。28℃下培养，当空白对照菌落长至平皿边缘时，采用十字交叉法用游标卡尺测量菌落直径，并根据不同浓度梯度的抑菌率值。将抑菌率大小换算成机率值作为因变量y，质量浓度的对数作为自变量x，建立“质量浓度对数-机率值”直线方程，即y＝a+bx毒力回归方程， y＝5时，求得x后计算得到EC50值。结果见表1。
抑菌率(％)＝[﹙对照菌落直径－处理菌落直径﹚÷对照菌落直径]×100 表1供试药剂对烟草赤星病菌的毒力测定结果表
药剂处理 毒力回归方程(y＝) 相关系数(r) EC50值/(mg·L<sup>-1</sup>)
50％异菌脲WP 0.880+1.462x 0.993 657.744
生防菌YWF-21-2013 1.715+0.563x 0.990 683617.230
从表1可知，生防菌剂与50％异菌脲可湿性粉剂均有一定的抑菌作用。
二、生防菌剂与50％异菌脲可湿性粉剂对烟草赤星病菌的联合毒力测定
根据上述试验结果，生防菌剂单剂EC50值为683617.230μg/mL，化学药剂50％异菌脲WP单剂EC50值为657.744cfu/mL。
将生防菌剂与化学农药50％异菌脲可湿性粉剂互配的联合毒力测定，配制生防菌剂与化学农药体积比分别为1∶4、3∶2、1∶1、2∶3、4∶1的混剂母液，后续接种病原菌及测量计算相关数据与上述单剂的毒力测定方法一致。选择化学农药50％的异菌脲可湿性粉剂作为标准农药，生防菌剂及混剂作为供试“药剂”，根据测定的抑菌率，计算得出EC50的值，并根据标准药剂及供试药剂的EC50进行计算其毒力系数(TI)、共毒系数(CTC)，根据共毒系数确定复配制剂的作用，CTC小于80为拮抗作用，CTC大于80小于120为加成作用， CTC大于120为增效作用。其毒力指数及及共毒系数计算公式如下，结果统计于表2。
毒力指数(TI)＝标准药剂的EC50值/供试药剂的EC50值*100
混剂实测毒力指数(ATI)＝标准药剂的EC50值/混剂EC50值*100
混剂理论毒力指数(TTI)＝TIA×PA+TIB×PB；式中，TIA为A药剂毒力指数；PA为A药剂在混剂中的百分含量；TIB为B药剂毒力指数；PB为B药剂在混剂中的百分含量。
混剂共毒系数(CTC)＝混剂实测毒力指数/混剂理论毒力指数*100
表2不同比例混剂的毒力测定结果表
Figure BDA0003833831550000071
结果表明：YWF-21-2013发酵液与50％异菌脲可湿性粉剂不同配比对烟草赤星病菌均具有一定的抑制效果，EC50值为463.87～1101.49mg/L，根据共毒系数确定复配后的抑制效果相对单剂均具有增效作用，共毒系数为88.2～ 491.6，其中，生防菌剂与化学农药体积比按照1∶4和2∶3配比，共毒系数为： 80≤CTC≤120，即二者为加成作用，其它混合比例，混剂共毒系数均高于120，其中，生防菌剂与化学农药体积比按照4∶1配比，二者的共毒系数最高，增效作用最大。
实施例3
本实施例对本发明防治烟草赤星病的组合物的田间效果进行测定。
生防菌剂YWF-21-2103与低毒化学农药50％异菌脲WP互配使用田间效果
(1)试验喷施处理：采用18L电动喷雾器，以喷施叶片润湿为度进行处理。试验设置以下4个处理，分别为：
a.全量50％异菌脲WP(稀释1000倍)；
b.50％异菌脲WP(稀释1000倍)+生防菌剂YWF-21-2103(稀释200倍)，生防菌剂与化学农药体积比按照4∶1；
c.生防菌剂YWF-21-2103(稀释200倍)；
d.空白对照。上述每个处理重复3次。在打顶时开始进行防治，连续用药 3次，每次间隔5天。
(2)调查方法
处理前及处理结束后5、10、15天进行病害调查，按照烟草赤星病病害严重度分级标准调查所有叶片(每个重复10株)，并做好记录。
每小区调查10株，每株调查全部叶片，以株为单位分级统计。
分级方法：
0级：全株无病斑；
1级：全株病斑很少，即小病斑(直径≤2mm)不超过15个，大病斑(直径＞2mm)不超过2个；
3级：全株叶片有少量病斑，即小病斑50个以内，大病斑2个～10个；
5级：三分之一以下叶片上有中量病斑，即小病斑50个～100个，大病斑 10个～20个；
7级：三分之一至三分之二叶片上有病斑，病斑中量到多量，即小病斑100 以上，大病斑20个以上，下部个别叶片干枯；
9级：三分之二以上叶片上有病斑，病斑多，部分叶片干枯。
按照上述调查处理前后的病害严重程度，计算其病情指数及防治效果。
病情指数及防治效果的公式分别如下：
病情指数＝∑【(各级病叶数×各级代表值)/(调查总叶数×最高级代表值)】×100
防治效果(％)＝[(1-(空白对照区施药前病情指数×处理区施药后病情指数)/(空白对照区施药后病情指数×处理区施药前病情指数)]×100
(3)云南省曲靖市麒麟区越州镇马坊村烟草赤星病防效统计结果
从表3中可以看出：单独喷施生防菌剂与低毒化学农药在烟草赤星病的防治上均有一定的作用，其防治效果分别为54.05％、51.83％。而利用生防菌剂与低毒化学农药按照体积比为4∶1互配后喷施，其防治效果达到64.43％，说明二者互配使用有增效的作用，能提高对烟草赤星病的防治效果。
表3不同处理对烟草赤星病的防效统计结果表(马坊村)
Figure BDA0003833831550000091
注：上述处理均为三次重复的平均值，“/”表示无防效作用。
(4)云南省曲靖市罗平县罗雄镇烟草赤星病防效统计结果
从表4中可以看出：单独喷施生防菌剂与低毒化学农药在烟草赤星病的防治上均有一定的作用，其防治效果分别为54.30％、54.56％。而利用生防菌剂与低毒化学农药按照体积比为4∶1互配后喷施，其防治效果达到64.07％，说明二者互配使用有增效的作用，能提高对烟草赤星病的防治效果。
表4不同处理对烟草赤星病的防效统计结果表(罗雄镇)
Figure BDA0003833831550000092
Figure BDA0003833831550000101
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种防治烟草赤星病的组合物，其特征在于，包括生防菌剂、异菌脲和助剂，其中，所述生防菌剂为枯草芽孢杆菌YWF-21-2103制得的发酵液，并且所述生防菌剂与所述异菌脲的体积比为4∶1。
2.根据权利要求1所述的防治烟草赤星病的组合物，其特征在于，所述生防菌剂稀释倍数为150～200倍，所述异菌脲稀释倍数为800～1000倍。
3.根据权利要求1或2所述的防治烟草赤星病的组合物，其特征在于，所述助剂为吐温20，所述助剂的质量为所述生防菌剂和/或所述异菌脲质量的0.5‰。
4.一种根据权利要求1至3中任一项防治烟草赤星病的组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将枯草芽孢杆菌YWF-21-2103菌种培养发酵制得生防菌剂；
将生防菌剂稀释后与助剂混合；
将异菌脲稀释后与生防菌剂混合，生防菌剂与异菌脲的体积比为4∶1。
5.根据权利要求4所述的防治烟草赤星病的组合物的制备方法，其特征在于，将枯草芽孢杆菌YWF-21-2103菌种培养发酵制得生防菌剂包括如下步骤：
步骤1，菌种活化，将-80℃下保存的枯草芽孢杆菌YWF-21-2103菌株在LB固体培养基上活化18～24h，得活化的枯草芽孢杆菌YWF-21-2103菌株；
步骤2，种子液制备，用无菌接种方法挑取步骤1中长势较优的枯草芽孢杆菌YWF-21-2103菌株接种到50ml LB液体培养基中，在温度为35℃、转速为180rpm/min条件下培养24h，得枯草芽孢杆菌YWF-21-2103种子液；
步骤3，发酵液制备，按照种子液、培养液体积比为1∶10的比例将步骤2所得的枯草芽孢杆菌YWF-21-2103种子液接入到车间发酵料培养基中，在温度为35℃条件下，转速为180rpm/min条件下培养28～35h，得枯草芽孢杆菌YWF-21-2103发酵液，枯草芽孢杆菌YWF-21-2103发酵液即为生防菌剂。
6.根据权利要求5所述的防治烟草赤星病的组合物的制备方法，其特征在于，枯草芽孢杆菌YWF-21-2103发酵液的有效活菌数为2.0×109cfu/g以上。
7.根据权利要求5所述的防治烟草赤星病的组合物的制备方法，其特征在于，步骤1中，LB固体培养基的组成为：细菌学蛋白胨10g/L，酵母提取粉5g/L，氯化钠5g/L，水1L，琼脂粉20g/L。
8.根据权利要求5所述的防治烟草赤星病的组合物的制备方法，其特征在于，步骤3中，以质量计，车间发酵料培养基的组成为：葡萄糖2.5～3.0％、玉米淀粉0.8～1.2％、豆粕粉2.2～2.8％、蛋白胨0.5～0.8％、磷酸氢二钾0.08～0.12％、硫酸镁0.03～0.06％、余量为水，并且车间发酵料培养基的pH为6.8～7.5。
9.权利要求1至3中任一项防治烟草赤星病的组合物在烟草种植中的应用。
10.根据权利要求9所述的防治烟草赤星病的组合物在烟草种植中的应用，其特征在于，所述组合物采用喷雾的方法施用于烟叶叶片的正面和反面。
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