抗肿瘤二价铂配合物以及该配合物和其配体的制备方法
技术领域
本发明涉及用于治疗癌症的新型铂配合物及其制备方法,具体地说涉及含3-酮环丁烷-1,1-二羧酸根为离去基团的抗肿瘤铂(II)配合物。
背景技术
自顺铂临床使用以来,研究者对数千个铂配合物进行了药物筛选,特别是近二十年来,对具有新型构效关系的抗肿瘤铂配合物及其机理进行了大量的研究,但迄今为止还没有发现综合性能超过顺铂的铂类药物。目前顺铂、卡铂和奥沙利铂等多个抗肿瘤铂类药物已广泛应用于临床,不过,它们在临床使用过程中也表现出较大的毒性和一定的耐药性,这些不足在一定程度上限制了这些铂类药物的应用。在现有铂药物中,顺铂无疑具有很强的抗癌活性,但其毒性也是最大的;虽然卡铂的毒性远低于顺铂,但其在许多肿瘤细胞中表现出的抑制能力令人失望。鉴于以上,通过改变或调节顺铂、卡铂和奥沙利铂的离去基团或载体配体仍就不失为一个有效的途径来获得高效、低毒的铂类药物。
发明内容
技术问题:本发明的目的是提供一种抗肿瘤铂(II)配合物及其和配体的制备方法,
本发明的配合物的毒性小于顺铂和奥沙利铂,特别是配合物GSH-5的毒性还小于卡铂;抗肿瘤活性一般高于卡铂,尤其是配合物GSH-5,其抗肿瘤活性与顺铂和奥沙利铂相当,还具有水溶性好和一定的克服耐药性的特点,是一种潜在的有效、低毒的抗肿瘤铂药物。
技术方案: 本发明的抗肿瘤二价铂配合物中,3-酮环丁烷-1,1-二羧酸根为铂配合物的离去基团配体;铂配合物其一是顺-[3-酮环丁烷-1,1-二羧酸根·二氨合铂(II)],简称:GSH-5,化学结构式由式(1)表示:
式(1);
铂配合物其二是顺-[3-酮-1,1-环丁二羧酸根·反式-1,2-环己二胺合铂(II)],简称:GSH-6,化学结构式由式(2)表示:
式(2),
式(2)中,反式1,2-环己二胺基团中标有*号的两个手性碳原子都为R构型或S构型。
对于式(1)和式(2)所示的抗肿瘤二价铂配合物,采用下列方法制备;
首先是由四卤合铂酸钾与氨或反式1,2-环己二胺在水溶液中作用得到顺-[二卤·二氨(或二胺)合铂(II)]配合物,然后在避光通氮气条件下,于水溶液中,通过方法A:使用银离子除去[二卤·二氨(或二胺)合铂(II)]的卤离子,所得中间体与3-酮环丁烷-1,1-二羧酸碱金属盐作用得到目标产物;或通过方法B:使用3-酮环丁烷-1,1-二羧酸银盐与[二卤·二氨(或二胺)合铂(II)]作用得到目标产物。
所述方法A中涉及的3-酮环丁烷-1,1-二羧酸碱金属盐,通过一当量的3-酮环丁烷-1,1-二羧酸和两当量的MOH或MHCO3在水溶液中反应得到,或通过等当量的3-酮环丁烷-1,1-二羧酸和M2CO3在水溶液中反应得到,其中,M为Na+或K+。
所述方法B中涉及的3-酮环丁烷-1,1-二羧酸银盐,由一当量的3-酮环丁烷-1,1-二羧酸和两当量的硝酸银在水溶液中反应制备。
抗肿瘤二价铂配合物的配体的制备方法中,所述3-酮环丁烷-1,1-二羧酸根为铂配合物的离去基团配体,通过下列反应路线A制备:
反应路线A
首先丙酮、甲醇和溴反应经缩合溴化得到Ia,其次Ia与丙二酸二异丙酯在氢化钠作用下成环反应得到Ib,然后Ib在氢氧化钠溶液中水解得到Ic,Ic经盐酸酸化得到Id即3-酮环丁烷-1,1-二羧酸;配体即3-酮环丁烷-1,1-二羧酸根通过一当量的Id和两当量的MOH或MHCO3在水溶液中反应得到,或通过等当量的Id和M2CO3在水溶液中反应得到;其中M+为Na+、K+。
上述反应路线A中,中间体Ia和Ib的制备已有文献报道,见J.Fluorine Chem.,2010,131,221和J.Org.Chem.,1988,53,3841。
文献已有两种有关3-酮环丁烷-1,1-二羧酸制备方法的报道,参见J.Med.Chem.,1990,33,1905和《北京工业大学学报》,l998,24,97。但与反应路线A相比,前者报道的方法反应路线较长,涉及氧化和高压催化加氢步骤,总产率低,且成本较高; 而后者报道的方法涉及的原料或中间体为限制性化学品,且产率仅有10%,因而它们都不太适合工业放大生产。
通过反应路线A获得的产物经核磁氢谱和高分辨电喷雾质谱及元素分析证实为3-酮环丁烷-1,1-二羧酸。产物的光谱数据:1H NMR(D2O)δ:3.702 ppm(s,4H);ESI-MS:[M-H]-157.0128(100%)。元素分析数据(分子式:C6H6O5):理论值C45.57%,H 3.82%;测定值C 45.59%,H 3.85%。
有益效果: 本发明涉及的二价铂配合物具有较好的水溶性,特别是配合物GSH-5,可以制成常规的冻干粉和注射液制剂使用。
使用本发明配合物GSH-5和配合物GSH-6对一系列人肿瘤细胞进行了体外抗癌活性研究,相关的IC50值见表1。由表1中的数据可以看出,配合物GSH-5对不同肿瘤细胞的抑制效果不同程度地接近顺铂,有的甚至优于奥沙利铂,抗癌效果远优于卡铂。除对一般肿瘤细胞表现出与顺铂相当的细胞毒活性外,配合物GSH-5还对人乳腺癌耐药细胞MCF-7具有明显的抑制作用,活性超过了顺铂。
采用小鼠移植性肿瘤动物模型分别考察了本发明配合物GSH-5和配合物GSH-6对动物移植性肿瘤S180肉瘤和Heps肿瘤的抑制作用,相关数据分别见表2和表3。表2结果表明,与模型对照组相比,样品GSH-5和GSH-6对S180的肿瘤生长以及实验动物体重均有显著的抑制作用(P<0.05);比较而言,前者较后者具有更好的抗肿瘤生长作用。表3结果表明,与模型对照组相比,样品GSH-5对Heps的肿瘤生长以及实验动物体重均有明显的抑制作用(P<0.01);比较而言,样品GSH-5较GSH-6具有更好的抗肿瘤生长作用。
对本发明的两个铂配合物进行了初步毒性研究,其中样品GSH-5小鼠静脉注射给药急毒的结果为150 mg/kg,样品GSH-6小鼠静脉注射给药急毒的结果为100 mg/kg。有关顺铂、奥沙利铂和卡铂小鼠LD50的文献值分别为13.40、14.63和139.00 mg/kg(参见Toxicology&AppliedPharmacology,1973,25,230;《西北药学杂志》,2001,16(2),67;《浙江省医学科学院学报》,1993,15,33)。
以上结果表明,本发明的配合物的毒性小于顺铂和奥沙利铂,特别是配合物GSH-5的毒性还小于卡铂;本发明的配合物的抗肿瘤活性一般高于卡铂,尤其是配合物GSH-5,其抗肿瘤活性与顺铂和奥沙利铂相当,还具有水溶性好和一定的克服耐药性的特点,是一种潜在的有效、低毒的抗肿瘤铂药物。
具体实施方式
本发明提供两个具有有效抗肿瘤生物活性且低毒的二价铂配合物, 3-酮环丁烷-1,1-二羧酸根为这两个铂配合物的离去基团配体;配合物其一是顺-[3-酮环丁烷-1,1-二羧酸根·二氨合铂(II)](简称:GSH-5),化学结构式由式(1)表示:
式(1);
配合物其二是顺-[3-酮-1,1-环丁二羧酸根·反式-1,2-环己二胺合铂(II)](简称:GSH-6),化学结构式由式(2)表示:
式(2),
式(2)中,反式1,2-环己二胺基团中两个手性碳原子(标有*号)都为R构型或S构型。
对于制备本发明式(1)和式(2)所示的抗肿瘤铂(II)配合物,是采用下列方法制备;首先是由四卤合铂酸钾与氨或反式1,2-环己二胺在水溶液中作用得到顺-[二卤·二氨(或二胺)合铂(II)]配合物,然后在避光通氮气条件下,于水溶液中,通过方法A:使用银离子除去[二卤·二氨(或二胺)合铂(II)]的卤离子,所得中间体与3-酮环丁烷-1,1-二羧酸碱金属盐(钠盐或钾盐)作用得到目标产物;或通过方法B:使用3-酮环丁烷-1,1-二羧酸银盐与[二卤·二氨(或二胺)合铂(II)]作用得到目标产物。
上述方法A中涉及的3-酮环丁烷-1,1-二羧酸碱金属盐,可通过一当量的3-酮环丁烷-1,1-二羧酸和两当量的MOH(M为Na+、K+)或MHCO3(M为Na+、K+)在水溶液中反应得到,或可通过等当量的3-酮环丁烷-1,1-二羧酸和M2CO3(M为Na+、K+)在水溶液中反应得到。
上述方法B中涉及的3-酮环丁烷-1,1-二羧酸银盐,由一当量的3-酮环丁烷-1,1-二羧酸和两当量的硝酸银在水溶液中反应制备。
按本发明方法制备的铂配合物经核磁氢谱和高分辨电喷雾质谱及元素分析确定了化合物的分子结构,并测定了化合物在水中的溶解度。
配合物GSH-5光谱数据:1H NMR(d6-DMSO):δ 3.717(s,4H,CH2 ofcyclobutyl),4.195(br,6H,2×NH3)ppm;ESI-MS:[M+H]+=386.02854(48%),[M+Na]+=408.01273(100%)。元素分析数据(分子式:C6H10N2O5Pt):理论值C18.71%,H 2.62%,N 7.27%,Pt 50.64%;测定值C 18.66%,H 2.58%,N 7.29%,Pt50.60%。
配合物GSH-6光谱数据:1H NMR(d6-DMSO):δ1.011-1.044(m,2H,CH2ofDACH),1.195-1.232(m,2H,CH2of DACH),1.445-1.473(m,2H,CH2of DACH),1.801-1.841(m,2H,CH2of DACH),2.056(m,2H,CHNH2),3.718(s,4H,CH2ofcyclobutyl),5.248(br,2H,NH2),5.947-5.977(br,2H,NH2)ppm;ESI-MS:[M+H]+=466..09358(29%),[M+Na]+=488.07568(100%)。DACH代表反式1,2-环己二胺的骨架,cyclobutyl代表环丁烷基。元素分析数据(分子式:C12H18N2O5Pt):理论值C 30.97%,H 3.90%,N 6.02%,Pt 41.92%;测定值C 31.02%,H 3.93%,N 6.03%,Pt41.87%。
配合物GSH-5在水中的溶解度为16mg/mL,配合物GSH-6在水中的溶解度为2mg/mL。
本发明还提供作为离去基团配体的3-酮环丁烷-1,1-二羧酸根的一种高效制备方法,通过下列反应路线A制备:
反应路线A
首先丙酮、甲醇和溴反应经缩合溴化得到Ia,其次Ia与丙二酸二异丙酯在氢化钠作用下成环反应得到Ib,然后Ib在氢氧化钠溶液中水解得到Ic,Ic经盐酸酸化得到Id(3-酮环丁烷-1,1-二羧酸);配体(3-酮环丁烷-1,1-二羧酸根)可通过一当量的Id和两当量的MOH(M为Na+、K+)或MHCO3(M为Na+、K+)在水溶液中反应得到,也可通过等当量的Id和M2CO3(M为Na+、K+)在水溶液中反应得到。
本发明由下述实施例得到进一步的说明,但这些说明并不是限制本发明。起始物二卤二氨(或反式-1,2-环己二胺)合铂(II)均采用公知的方法制备,已在说明书中说明。
(一)化合物的制备
实施例1.配合物GSH-5的制备(方法A)
在避光通氮气条件下,将顺式-二碘二氨合铂(II)(4.83g,10mmol)悬浮于400mL水中,加入AgNO3(3.40g,20mmol)的30mL水溶液,于40℃避光搅拌反应12小时,过滤除去碘化银。将3-酮环丁烷-1,1-二羧酸(1.58g,10mmol)和NaOH(0.80g,20mmol)或Na2CO3(1.06g,10mmol)构成的40mL水溶液加入到上述滤液中,于40℃避光搅拌反应24小时,然后过滤。将滤液浓缩,析出大量固体。过滤,用水、乙醇、乙醚反复洗涤,真空干燥,得白色固体2.51g,产率65%。
实施例2.配合物GSH-5的制备(方法B)
在避光通氮气条件下,将顺式-二碘二氨合铂(II)(0.48g,1mmol)悬浮于100mL水中,加入3-酮环丁烷-1,1-二羧酸银(0.37g,1mmol),于55℃避光搅拌反应12小时,过滤除去碘化银。将滤液浓缩,析出大量固体。过滤,真空干燥,得白色固体0.20g,产率53%。
实施例3.配合物GSH-6的制备(方法A)
在避光通氮气条件下,将二氯(反式-1R,2R-环己二胺)合铂(II)(0.38g,1mmol)悬浮于100mL水中,加入AgNO3(0.34g,2mmol)的10mL水溶液,于40℃避光搅拌反应12小时,过滤除去氯化银。将滤液加入到由3-酮环丁烷-1,1-二羧酸(0.16g,1mmol)和KOH(0.11g,2mmol)或KHCO3(0.20g,2mmol)构成的20mL水溶液中,于55℃避光搅拌反应24小时,然后过滤。将滤液浓缩,析出大量固体。过滤,用水洗涤,真空干燥,得白色固体0.24g,产率51%。
实施例4.配合物GSH-6的制备(方法B)
在避光通氮气条件下,将二氯(反式-1R,2R-环己二胺)合铂(II)(0.38g,1mmol)悬浮于100mL水中,加入3-酮环丁烷-1,1-二羧酸银(0.37g,1mmol),于55℃避光搅拌反应12小时,过滤除去氯化银。将滤液浓缩,析出大量固体。过滤,真空干燥,得白色固体0.31g,产率66%。
实施例5.3-酮-1,1-环丁二羧酸(Id)的制备(反应路线A)
中间体Ia和Ib按文献方法制备。 将中间体Ib 15 g溶于200 mL乙醇中,加入30 mL的NaOH(12 g,0.3mol)水溶液,反应液回流3小时,抽滤得白色固体,用乙醇洗涤3次,得中间体Ic。
将中间体Ic溶于100 mL的6M盐酸溶液中,室温搅拌反应过夜。反应液用400mL乙酸乙酯萃取,有机相经无水硫酸钠干燥,然后浓缩至10 mL左右,加入300 mL石油醚或乙醚,混合液冷藏过夜,有淡黄色固体析出。粗产物用水溶解,经加热活性炭脱色,重结晶得白色固体产物Id,产率为89%。
实施例6.配体(3-酮-1,1-环丁二羧酸根)的制备(反应路线A)
配体可通过下述三种方式获得:
(i)将Id(1.58g,10mmol)和NaOH(0.80g,20mmol)或KOH(1.12g,20mmol)溶于40mL水溶液中获得。
(ii)将Id(1.58g,10mmol)和NaHCO3(1.68g,20mmol)或KHCO3(2.00g,20mmol)溶于50mL水溶液中获得。
(iii)将Id(1.58g,10mmol)和Na2CO3(1.06g,10mmol)或K2CO3(1.38g,10mmol)溶于50mL水溶液中获得。
实施例7.3-酮环丁烷-1,1-二羧酸银的制备
在避光条件下,将3-酮环丁烷-1,1-二羧酸(1.58g,10mmol)悬浮于100mL水中,加入AgNO3(3.40g,20mmol)的20 mL水溶液,于室温避光搅拌反应1-2小时,过滤,用水洗涤析出的白色固体,真空干燥,得3.41g,产率92%。
(二)配合物的体外细胞毒活性测试
试验例1.
本试验例采用MTT方法对本发明的配合物以及临床常用的抗癌铂药物进行了细胞毒活性测试。
MTT法:取对数生长期的细胞计数,接种于96孔培养板内,每孔约8000-10000个细胞。过夜培养,待细胞贴壁后进行给药,分别设给药组,阳性对照组和阴性对照组。待测的配合物用5%的葡萄糖水溶液配制成贮液,临用前用细胞培养基稀释成一系列浓度。每个浓度设3个复孔。加药后培养48小时,加20μL浓度为5mg/mL的MTT,37℃孵育4小时,去上清,加入150μL的DMSO溶解甲瓒。用酶标仪在490波长下测定每孔的OD值,并计算抑制率,做浓度-抑制率曲线计算IC50值。
本试验例采用MTT法对多种人肿瘤细胞(人肺癌细胞A549,人脐静脉血管内皮细胞HUVEC,人乳腺癌细胞MCF-7,人乳腺癌耐药细胞MCF-7,人乳腺癌细胞MDA-MB-231,人胃腺癌细胞BGC823,人肝癌细胞HepG-2,人红白血病细胞K562,人急性早幼粒白血病细胞NB4,人大细胞肺癌细胞NCI-H460,人肝癌细胞SMMC-7721)测试了配合物GSH-5和GSH-6的细胞毒活性,以顺铂、奥沙利铂和卡铂作为阳性对照。由于制备的铂配合物具有较好的水溶性,故采用样品的5%葡萄糖溶液测定,结果见表1。
表1.配合物对一些人肿瘤细胞的IC50值(μM)
*.没有测定。
(三)配合物的体内抑瘤作用
试验例2.
本试验例采用小鼠移植性肿瘤动物模型方法测试了本发明的配合物对动物移植性肿瘤S180肉瘤和Heps肿瘤的抑制作用。
取ICR小鼠,按移植性肿瘤研究法,接种实体型瘤。接种后24小时称鼠重,并随机分为7组,给药组每组8只。于接种24小时后(d1)第一次给药,静脉注射给药,隔天给药一次,共给药4次,给药体积均为0.4ml/20g。于接种后第10天(d10)处死荷瘤小鼠称重,并分离瘤块称重,所得数据进行统计学处理(t检验)。配合物对小鼠移植瘤S180和Heps的抑制作用分别见表2和表3。
表2.配合物对小鼠移植瘤S180抑制作用
*P<0 05与模型对照组比较,**P<0 01与模型对照组比较。
表3.配合物对小鼠移植瘤Heps抑制作用
**P<0.01与模型对照组比较。
(四)配合物的初步毒性
试验例3.
选择清洁级昆明种小白鼠50只,雌雄各半,体重18~22 g,随机分为5组,每组动物数10只,禁食时间12小时。将配合物GSH-5和配合物GSH-6用5%葡萄糖溶液溶解,分为5个剂量,进行小鼠尾静脉注射给药(iv),每只动物接受容量为0.4mL/20g。给药后连续观察14天,记录小鼠各种中毒症状和死亡情况。实验结果按Bliss法计算,测得小鼠(iv)配合物GSH-5和配合物GSH-6的LD50值分别为150mg/kg和100mg/kg(95%的置信限)。