CN114891044B - 一种具有抗肿瘤活性的四价铂配合物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有抗肿瘤活性的四价铂配合物，所述四价铂配合物的结构如通式(1)所示：本发明四价铂配合物在轴向上多了两个配体，空间上形成八面体结构，因而具有动力学惰性，具有较低的反应活性，较小的毒副作用；其在血浆以及正常组织中保持稳定，在肿瘤乏氧和高还原环境中会被还原成二价铂(II)配合物，进而发挥药效，是一种潜在的抗肿瘤前药。

Description

一种具有抗肿瘤活性的四价铂配合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及化药技术领域，尤其是涉及一种具有抗肿瘤活性的四价铂配合物及其制备方法与应用。

背景技术

铂类配合物是一类临床使用最广泛地抗肿瘤药物之一，尤其是第一代铂类抗癌药顺铂，它对生殖系统癌症和头颈癌等非常有效，自从1978年被美国FDA批准治疗癌症以来，已使睾丸癌患者的死亡率从几乎100％降到10％以下，对早期发现的患者，治愈率可达100％，因而成为抗癌药物的杰出代表。

继顺铂之后，1989年FDA批准第二代铂类抗癌药卡铂上市，其抗癌谱与顺铂相似，但毒副反应较轻。2002年FDA又批准第三代铂类抗肿瘤药奥沙利铂进入临床治疗结肠癌，其抗癌谱有别于顺铂且与之无交叉耐药性，毒副反应较顺铂轻。目前在临床中使用的铂类抗肿瘤药物还有奈达铂和乐铂，另还有约10种铂类化合物正处在不同阶段的临床试验中，据统计，临床肿瘤治疗方案中，大约50％都含有铂类药物。

尽管如此，铂类药物也遇到了一些困难和问题，主要包括毒副作用和耐药性，这极大地限制它们更广泛的临床使用。这些问题也促使人们继续寻求新的铂类抗肿瘤药物来弥补传统铂类药物的缺陷。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种具有抗肿瘤活性的四价铂配合物及其制备方法与应用。本发明解决了临床铂类药物化疗中存在的耐药性以及毒副作用的问题，可用于制备克服肿瘤的顺铂耐药性的潜在药物。

本发明的技术方案如下：

一种具有抗肿瘤活性的四价铂配合物，所述四价铂配合物的结构如通式(1)所示：

通式(1)中，表示为如下结构中的任一种：

R₅表示为-OH、-OOCCH₃、中的一种。

所述四价铂配合物的结构为：

一种所述具有抗肿瘤活性的四价铂配合物的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

(1)二价铂配合物与双氧水在50-80℃下反应，制得四价铂配合物；

(2)步骤(1)所得四价铂配合物、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)、三乙胺(TEA)混合在DMF溶液中，在20-40℃下搅拌反应；反应结束后，后处理制得所述具有抗肿瘤活性的四价铂配合物。

步骤(2)中，四价铂配合物与反应当量为1:0.8-1.2；四价铂配合物与O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸的反应当量为1:0.8-1.2；四价铂配合物与与三乙胺的反应当量为1:0.8-1.2。

步骤(2)中，后处理的方法为：过滤去除沉淀物，减压浓缩，浓缩后的产物滴入乙醚中，静置；离心收集沉淀，用甲醇、乙醚洗涤沉淀，真空干燥。

一种所述具有抗肿瘤活性的四价铂配合物的应用，用于制备抗肿瘤或逆转肿瘤的药物。

所述抗肿瘤或逆转肿瘤的药物以所述具有抗肿瘤活性的四价铂配合物或其药学上可以接受的盐为活性成分。

所述抗肿瘤或逆转肿瘤的药物含有药学上可接受的辅料。

所述辅料为崩解剂、稀释剂、润滑剂、粘合剂、湿润剂、矫味剂、助悬剂、表面活性剂、防腐剂中的一种或多种。肿瘤疾病为胰腺癌。

本发明有益的技术效果在于：

本发明具有抗肿瘤活性的四价铂配合物与传统二价铂(II)配合物相比，在轴向上多了两个配体，空间上形成八面体结构，因而具有动力学惰性，具有较低的反应活性，较小的毒副作用。其在血浆以及正常组织中保持稳定，在肿瘤乏氧和高还原环境中会被还原成二价铂(II)配合物，进而发挥药效，是一种潜在的抗肿瘤前药。

本发明具有抗肿瘤活性的四价铂配合物对顺铂耐药的KRAS突变型胰腺癌肿瘤细胞表现出优异的毒活性，具有克服顺铂耐药性的潜力。活体的实验表明，四价铂配合物能够有效抑制活体肿瘤的生长，并表现出较低的毒性。本发明有望解决临床铂类药物化疗中存在的耐药性以及毒副作用的问题，基于这类化合物在抗肿瘤方面的杰出性能，可用于制备克服肿瘤顺铂耐药性的潜在药物。

本发明四价铂配合物在肿瘤细胞中还原为二价铂药物和塞曲司特，二价铂发挥损伤DNA的功效，塞曲司特高效产生活性氧，两者协同杀死肿瘤细胞。值得注意的是，化合物诱导细胞发生多种死亡方式，包括凋亡、坏死、焦亡。胰腺癌是一种已知的凋亡抵抗的肿瘤，该化合物能够诱导多种死亡方式，可以克服胰腺癌的化疗耐药性。

附图说明

图1为本发明实施例1制得配合物SEP的¹H-NMR谱图(DMSO-d6，400MHz)；

图2为本发明实施例1制得配合物SEP的¹³C{1H}-NMR谱图(DMSO-d6，100MHz)；

图3为本发明实施例1制得配合物SEP的¹⁹⁵Pt-NMR谱图(DMSO-d6，86MHz)；

图4为本发明实施例1制得配合物SEP刺激胰腺癌细胞PANC-1后，凋亡和坏死相关蛋白的表达；

图5为本发明实施例1制得配合物SEP刺激胰腺癌细胞PANC-1后，焦亡相关蛋白的表达；

图6为本发明实施例1制得配合物SEP以及顺铂对荷瘤小鼠的肿瘤抑制曲线；

图7为本发明实施例1制得配合物SEP以及顺铂对荷瘤小鼠治疗过程中体重变化图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。

实施例1

一种具有抗肿瘤活性的四价铂配合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)将1g顺铂(Cisplatin)置于烧瓶中，再滴加60mL 30％双氧水，加热到75℃避光搅拌6h后，室温放置两天，4℃冰箱放置两天，过滤、真空干燥即可得到四价的Oxoplatin黄色粉末；

(2)取100mg Oxoplatin，63.8mg25μL三乙胺(TEA)和58mgO-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)溶解于10mL的干燥DMF中，室温避光搅拌48h；

(3)反应结束后，过滤除去沉淀物，减压浓缩至5mL，加入至40mL乙醚沉出淡黄色固体，静置，产物分别用甲醇和乙醚各洗两遍，得到纯净的固体，产率约为40％。

本实施例制得配合物SEP的¹H-NMR谱图(DMSO-d6，400MHz)、¹³C{1H}-NMR谱图(DMSO-d6，100MHz)、¹⁹⁵Pt-NMR谱图(DMSO-d6，86MHz)分别如图1、2、3所示；

由图1可以看出，¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.28-7.24(m,4H),7.18-7.12(m,1H),6.18–5.71(m,6H),4.25(dd,J＝9.0,6.6Hz,1H),2.17–2.04(m,4H),2.00(s,3H),1.93(d,J＝1.3Hz,3H),1.89(d,J＝1.3Hz,3H),1.48–1.37(m,2H),1.36–1.12(m,4H)。化合物每一种化学环境的氢都与图谱对应，没有多余的峰，说明成功合成了该配合物。

由图2可以看出，¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δ187.17,186.49,180.99,144.92,142.31,141.24,140.04,139.85,128.14,127.61,125.87,42.68,36.38,31.18,28.84,27.52,25.49,12.34,12.18,12.13。化合物每一种化学环境的碳都与图谱对应，说明成功合成了该配合物。

由图3可以看出，化合物的Pt的化学位移为1047，与四价铂对应，说明成功合成了该配合物。

测试例

(1)配合物SEP的细胞毒活测试

对实施例1制备的配合物SEP进行细胞毒活测试，分别以PANC-1(KRAS突变的人胰腺癌)、BxPC3(野生型人胰腺癌)、PAN02(小鼠胰腺癌)、A549(人非小细胞肺癌)和A549/DDP(顺铂耐药的人非小细胞肺癌)为模型，以实施例1中合成的配合物SEP和顺铂为待检测物，将所述待检测物作用于细胞后，观察细胞的存活率情况，以噻唑蓝(MTT)方法测试细胞存活率，具体操作步骤如下：

(a)收集上述对数期细胞，调整细胞悬液的浓度，加入96孔板中；

(b)将上述实验细胞置于CO₂浓度为5％，37℃的细胞培养箱中，培养24h；

(c)将化合物SEP和顺铂按一定梯度倍数用含10％FBS的培养基稀释，加入上述植入细胞的96孔板中，每个浓度设3个复孔，孵化时间72h；

(d)每孔加入20μL的MTT溶液(5mg/mL),继续孵化4h，吸取培养基，每孔加150μL的DMSO，摇床低速震荡10min；

(e)酶标仪570nm处检测每个孔的吸光度值；

(f)同时设置调零孔和对照组(培养基、DMSO)，按照以下公式计算细胞存活率：

其中，Abs(sample)为样品组细胞的吸光度值；Abs(blank)为空白对照组中液体的吸光度值；Abs(control)为未经过药物处理的实验组的细胞的吸光度值；

(g)作出细胞存活率-浓度曲线，计算化合物的半抑制浓度(IC₅₀)，本发明实施例1制备配合物SEP以及顺铂对不同细胞的IC50值(72h)，结果见表1。

表1

Compound	PANC-1	BxPC3	PAN02	A549	A549/DDP
						SEP	0.5±0.1	0.7±0.1	1.0±0.2	0.7±0.2	1.4±0.2
CDDP	12.1±0.7	6.1±0.7	8.2±0.9	5.6±0.6	51.2±5.8

由表1可以看出，SEP对多种肿瘤细胞都有很好的毒活性，尤其是胰腺癌细胞，活性显著高于顺铂。

(2)配合物SEP诱导细胞死亡方式的检测

对实施例1制备的配合物SEP进行诱导细胞死亡方式的分析，以PANC-1(KRAS突变的人胰腺癌)细胞为模型，以实施例1中合成的配合物SEP和顺铂为待检测物，将所述待检测物作用于细胞后，用免疫印迹的方法检测细胞内蛋白的表达量，具体操作步骤如下：

(a)将PANC-1细胞接种到6孔板中，并在37℃下培养12h，除去原有培养液，加入一定浓度待检测物，在37℃下共培养36h；

(b)收集细胞，通过RIPA裂解液提取全蛋白，冰上裂解30min后，高速离心(12000rpm)，取上层清液通过BCA法测定蛋白浓度；

(c)通过加水和5×Loading buffer把各个样品的蛋白浓度稀释成4μg/μL，95℃孵育5min，获得蛋白样品；

(d)在电泳缓冲液中进行电泳实验，条件为3W，1.5h，每孔中加入20μL各蛋白样品。电泳结束后，把蛋白转于PVDF膜上，转膜的条件为100V，100min；

(e)然后用对应一抗稀释液孵育目标条带的PVDF膜4℃过夜，用1×TBST缓冲液洗三次，每次5min；

(f)继续在室温下用相应的二抗进行孵育1h，1×TBST洗三次后，化学发光仪曝光，结果如图4和图5。

由图4可以看出，配合物SEP能够诱导胰腺癌细胞中凋亡相关蛋白cleaved cas3和坏死相关蛋白RIPK1和RIPK3的上调，说明它能够诱导肿瘤细胞发生凋亡和坏死；由图5可以看出，配合物SEP能够诱导胰腺癌细胞中焦亡调控蛋白GSDMD-F、GSDMD-N、GSDME-F和GSDME-N的上调，意味着SEP能够诱导焦亡。

综上所述，SEP能够同时诱导肿瘤细胞发生凋亡、坏死和焦亡，与新发现的细胞死亡方式泛凋亡的特征类似，所以通过轴向配体的修饰，配合物能够诱导肿瘤细胞发生泛凋亡。

(3)配合物SEP的活体抑瘤测试

(a)向C57BL/6鼠皮下种植鼠胰腺癌PAN02细胞并成瘤后，将老鼠分笼分组，每组5只老鼠；

(b)用尾静脉注射的方法给老鼠给药，顺铂4.5mg/kg，化合物SEP 10mg/kg，每三天给药一次并测量瘤体积及老鼠的体重，结果如图6和7所示。

由图6可以看出，本发明配合物SEP能够显著抑制小鼠胰腺癌Pan02的生长；由图7可以看出，在SEP治疗过程中小鼠体重没有明显变化，说明SEP没有明显的毒性。

以上仅为本发明的优选实施例而已，只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种具有抗肿瘤活性的四价铂配合物，其特征在于，所述四价铂配合物的结构如通式(1)所示：

通式(1)中，表示为如下结构中的任一种：

R₅表示为-OH、-OOCCH₃、中的一种。

2.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的四价铂配合物，其特征在于，所述四价铂配合物的结构为：

3.一种权利要求2所述具有抗肿瘤活性的四价铂配合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

(1)二价铂配合物与双氧水反应，制得四价铂配合物；

(2)步骤(1)所得四价铂配合物、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)、三乙胺(TEA)混合在DMF溶液中，搅拌；反应结束后，后处理制得所述具有抗肿瘤活性的四价铂配合物。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，反应的温度为50-80℃；步骤(2)中，反应温度为20-40℃，四价铂配合物与反应当量为1:0.8-1.2；四价铂配合物与O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸的反应当量为1:0.8-1.2；四价铂配合物与与三乙胺的反应当量为1:0.8-1.2。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，后处理的方法为：过滤去除沉淀物，减压浓缩，浓缩后的产物滴入乙醚中，静置；离心收集沉淀，用甲醇、乙醚洗涤沉淀，真空干燥。

6.一种权利要求1所述具有抗肿瘤活性的四价铂配合物的应用，其特征在于，用于制备抗肿瘤或逆转肿瘤的药物。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤或逆转肿瘤的药物以所述具有抗肿瘤活性的四价铂配合物或其药学上可以接受的盐为活性成分。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤或逆转肿瘤的药物含有药学上可接受的辅料。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述辅料为崩解剂、稀释剂、润滑剂、粘合剂、湿润剂、矫味剂、助悬剂、表面活性剂、防腐剂中的一种或多种。

10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，肿瘤为胰腺癌。