CN102480971A - 化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了式III化合物。本发明还公开了所述化合物的盐、包含所述化合物或盐的药物组合物和通过给予所述化合物或盐来治疗HCV感染的方法。

Description

化合物
发明领域
本公开涉及抗病毒化合物。具体地说，本发明涉及可用于治疗C型肝炎病毒(HCV)感染的化合物、所述化合物的结晶盐、包含所述化合物的药物组合物及治疗HCV感染的方法。
发明背景
HCV慢性感染是与肝硬化、肝细胞癌和肝功能衰竭相关的主要健康问题。全世界估计有170,000,000位慢性携带者处于发展成肝病的危险之中。参见，例如Szabo等，Pathol.Oncol.Res.2003，9：215-221和Hoofnagle JH，Hepatology 1997，26：15S-20S。单在美国有2,700,000人慢性感染HCV，且2000年估计HCV有关死亡数为8,000-10,000，预计该数目在未来几年会显著增加。HCV感染以高比例隐伏在多年来可能未经历临床症状的慢性感染(和感染性)携带者中。肝硬化最终可导致肝功能衰竭。现在将由慢性HCV感染引起的肝功能衰竭视为肝移植的主要原因。
HCV是影响动物和人类的RNA病毒的黄病毒科(Flaviviridae)家族的成员。基因组为约9.6千碱基的单链RNA，且由一个开放阅读框组成，该开放阅读框编码在5’端和3’端的非翻译区(5’-UTR和3’-UTR)之间的约3000个氨基酸的多聚蛋白质。该多聚蛋白质用作对于子代病毒粒子的复制和组装关键的至少10种单独病毒蛋白质的前体。HCV多聚蛋白质中结构和非结构性蛋白质的组织如下：C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b。因为HCV的复制周期不包括任何DNA中间体且该病毒没有整合到宿主基因组中，所以理论上HCV感染可以医治。虽然HCV感染的病理主要影响肝，但该病毒还在包括外周血淋巴细胞的体内其他细胞类型中见到。参见，例如Thomson BJ and Finch RG，Clin Microbial Infect.2005，11：86-94及Moriishi K和Matsuura Y，Antivir.Chem.Chemother.2003，14：285-297。
目前，慢性HCV的标准治疗为干扰素α(IFN-α)和利巴韦林(ribavirin)联用，且这需要至少六(6)个月的治疗。IFN-α属于具有诸如抗病毒、免疫调节和抗肿瘤活性的特征性生物学作用的天然存在的小蛋白质家族，其由大多数动物有核细胞响应多种疾病、尤其是病毒性感染而产生并分泌。IFN-α为影响细胞通信和免疫学控制的生长和分化的重要调节剂。用干扰素治疗HCV常与诸如以下的不良副作用相关：疲劳、发烧、寒颤、头痛、肌肉痛、关节痛、轻度脱发、精神影响和相关病症、自体免疫现象和相关病症及甲状腺功能障碍。利巴韦林，肌苷5′-单磷酸盐脱氢酶(IMPDH)的抑制剂，增强HCV治疗中IFN-α的功效。尽管引入了利巴韦林，但在干扰素-α(IFN)和利巴韦林的当前标准疗法下超过50％的患者没有消除该病毒。至今，慢性丙肝的标准疗法已经转变为聚乙二醇IFN-α加利巴韦林的联用。然而，许多患者仍然具有主要与利巴韦林有关的显著副作用。利巴韦林在10-20％的以当前推荐剂量治疗的患者中引起显著溶血，且该药物具有致畸性和胚胎毒性。即使存在最新改良，但实质部分的患者没有作出病毒负荷的持续降低的响应且仍然需要HCV感染的更有效的抗病毒疗法。参见，例如Fried等，N.Engl.J Med 2002，347：975-982。
正在寻求许多方法来抗击该病毒。它们例如包括应用反义低聚核苷酸或核糖酶来抑制HCV复制。此外，直接抑制HCV蛋白质且妨碍病毒复制的低分子量化合物被视为控制HCV感染的有吸引力的策略。在病毒靶点之中，NS3/4A蛋白酶/解旋酶和NS5b RNA依赖型RNA聚合酶被视为新药的最有前途的病毒靶点。参见，例如Ni，Z.J.和Wagman，A.S.Curr.Opin.Drug Discov.Devel.2004，7，446-459；Beaulieu，P.L.和Tsantrizos，Y.S.Curr.Opin.Investig.Drugs 2004，5，838-850；及Griffith等，Ann.Rep.Med.Chem 39，223-237，2004。
除了靶向病毒基因及其转录和翻译产物之外，抗病毒活性还可通过靶向病毒复制所必需的宿主细胞蛋白质来获得。例如，Watashi等，Molecular Cell，19，111-122，2005显示病毒活性可如何通过抑制宿主细胞亲环素来获得。或者，已经显示有效的TLR7激动剂降低人类的血浆HCV水平。参见Horsmans等，Hepatology，42，724-731，2005。
据称可用于治疗HCV感染的化合物例如公开在WO2008/064218(Leivers等)、WO 2008/244380(Bachand等)和US2009/0068140(Bachand等)中。这些参考文献还公开了制备所述化合物的方法、包含所述化合物的组合物、包含所述化合物及其他化合物的药物组合物、治疗HCV的方法、所述化合物的盐、给予路径及关于如何制备、配制和使用所述化合物的其他信息。
发明概述
简要地讲，一方面，本发明公开了式I化合物：
Figure BPA00001516471500031
其中R1各自独立地为H或C1-3烷基；
R2各自独立地为C1-3烷基；
X各自独立地为CRR、O或S；
n为2或3；且
R各自独立地为甲基、氢或氘。
另一方面，本发明公开了式II化合物：
Figure BPA00001516471500041
其中R1各自独立地为H或C1-3烷基；
R2各自独立地为C1-3烷基；
X各自独立地为CRR、O或S；
n各自独立地为2或3；且
R各自独立地为甲基、氢或氘。
另一方面，本发明公开了式III化合物：
Figure BPA00001516471500042
其中R1各自独立地为H或C1-3烷基；
R2各自独立地为C1-3烷基；
在存在R3基团的各碳上，两个R3各自为H或所述R3基团连同与其连接的碳一起形成4、5或6元饱和螺环，前提条件是在各饱和含氮环上存在不超过1个螺环；
由R3基团形成的各饱和螺独立地为环烷基，或可含有1或2个氧原子，或1或2个硫原子，或1个SO2，或1个NR4；
R4各自独立地为H、C(O)OC1-4烷基、C(O)C1-4烷基、C(O)NC1-4烷基或SO2C1-4烷基；
各螺环可任选被氘、氟或1或2个甲基取代。
另一方面，本发明公开了式I、II或III的化合物的药学上可接受的盐。
另一方面，本发明公开了包含式I、II或III的化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物。
另一方面，本发明公开了治疗人类的病毒性感染、例如HCV感染的方法，其包括给予本发明的药物组合物。
发明详述
在上述式I、II和III中，除了当R1为氢时以外，与R1连接的碳为手性的。另外，在两个所描绘的含氮5元饱和杂环中每一个中的所描绘叔碳也为手性的。因此，所述化合物含有至少两个手性碳原子，且当R1各自为C1-3烷基时，所述化合物含有至少4个手性碳原子。因此，所述化合物可以各种对映异构混合物存在。
在本发明的一个实施方案中，式I、II或III的化合物或其药学上可接受的盐在对映异构上富集，其中所有在前一段落中提到的手性碳原子均处于S构型。一般来讲，提到对映异构富集化合物或盐意欲指出所指定的对映异构体将构成超过化合物或盐的所有对映异构体总重量的50％重量。具有四个以S构型的手性碳的化合物的实例如下所示：
Figure BPA00001516471500051
在本发明的一个实施方案中，各X相同。
在本发明的一个实施方案中，所有R中的每一个为H或所有R都为氘(D)。换句话说，在本发明的一个实施方案中，螺环中的每一个CRR基团为CH2或螺环中的每个CRR基团为CD2。氘以微小量自然存在于氢化合物中。将取代基指定为氘或D，申请人的意思是氘的天然同位素量已经增加，使得与H相比，特定取代基中超过一半为D。
在本发明的一个实施方案中，仅仅2个R为甲基。
在本发明的一个实施方案中，在式III化合物中，当R3基团在各饱和含氮环上形成螺环时，所述螺基各自与各饱和含氮环中的同一相关碳原子连接。
药学上可接受的盐可通过本领域熟知的方法制备。合适的盐包括例如在以下文献中描述的那些盐：P.Heinrich Stahl，Camilleg.Wermuth(编)，handbook of Pharmaceutical(药物手册)，Salts properties，selection，and Use(盐性质、选择和使用)；2002。例如参见WO2009/020828(Kimet.Al)，其描述某些抗病毒化合物的结晶盐的制备。优选的盐包括盐酸盐，例如二盐酸盐；和硫酸盐。
本发明的化合物和盐可单独使用或与一种或多种其他治疗剂组合使用。一方面，其他治疗剂选自治疗疗法的标准物，诸如干扰素/利巴韦林、小分子HCV复制抑制剂(更常称为直接作用病毒)。合适的组合疗法例如描述在WO 2008/064218(Leivers等)、WO2008/244380(Bachand等)和US 2009/0068140(Bachand等)中。这些参考文献还含有关于给药途径的大量公开内容及关于如何制备、配制和使用所述化合物的其他信息。
实施例
该实验部分中使用的缩写表如下所列：
Figure BPA00001516471500071
中间体1：{(1S)-1-[((2S)-2-{4-[4′-(氨基乙酰基)-4-联苯基]-1H-咪 唑-2-基}-1-吡咯烷基)羰基]-2-甲基丙基}氨基甲酸甲酯
中间体1可如由以下反应方案所说明来制备。
将[2-(4′-{2-[(2S)-1-((2S)-3-甲基-2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-2-吡咯烷基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-2-氧代乙基]氨基甲酸1，1-二甲基乙酯(中间体11)(3.8g，6.3mmol)在DCM(40mL)中的溶液用HCl(10mL，4M，在二
Figure BPA00001516471500082
烷中)处理以得到作为浅黄色固体的{(1S)-1-[((2S)-2-{4-[4′-(氨基乙酰基)-4-联苯基]-1H-咪唑-2-基}-1-吡咯烷基)羰基]-2-甲基丙基}氨基甲酸甲酯(中间体1)(3.5g，定量)。
中间体2：(3S，7S，9S)-7，9-二甲基-2-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰 基}-6，10-二氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-3-甲酸
Figure BPA00001516471500083
中间体2可如以下反应方案中所说明来制备。
向(3S，7S，9S)-7，9-二甲基-2-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}-6，10-二氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-3-甲酸甲酯(中间体14)(360mg，0.932mmol)在THF(4mL)、叔丁醇(1mL)和水(1mL)的混合溶剂中的搅拌溶液中加入LiOH(44mg，1.86mmol)。将所得混合物在室温下搅拌2小时，之后用1N HCl酸化到pH为约3且进一步用乙酸乙酯(100mL)稀释。将该溶液用盐水洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并蒸发以得到作为固体的(3S，7S，9S)-7，9-二甲基-2-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}-6，10-二氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-3-甲酸(中间体2)(315mg，产率：91％)。ES LC-MS m/z＝373(M+H)+。
中间体4：2-氨基-1-(4-溴苯基)乙酮
Figure BPA00001516471500092
向2-溴-1-(4-溴苯基)乙酮(130g，0.478mol)在甲苯(2500mL)中的搅拌溶液中加入六亚甲基四胺(65.6g，0.478mol)。将混合物在40℃下搅拌16小时。将所得固体滤出且用甲苯和乙醚洗涤以得到白色固体。向该白色固体在乙醇(800mL)中的搅拌悬浮液中加入浓盐酸(300mL)。将该混合物在周围温度下搅拌20小时。固体通过过滤收集且用乙醇和水洗涤并真空干燥以得到作为白色固体的2-氨基-1-(4-溴苯基)乙酮(4)(95g，产率：92％)，其不经纯化而用于下一步骤。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δppm 8.58(s，br，2H)，7.96(d，J＝8.7Hz，2H)，7.81(d，J＝8.7Hz，2H)，4.48-4.52(m，2H).ES LC-MS m/z＝214，216(M+H)+。
中间体5：[2-(4-溴苯基)-2-氧代乙基]氨基甲酸1，1-二甲基乙酯
Figure BPA00001516471500101
在0℃下向2-氨基-1-(4-溴苯基)乙酮盐酸盐(中间体4)(50g，0.2mol)、Boc2O(48g，0.22mol)在DCM(1000mL)中的混合物中逐滴加入TEA(68.8mL，0.5mol)。添加之后，将所得混合物在周围温度下搅拌过夜并过滤。将滤出物用1N HCl(300mL×3)和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，真空浓缩以得到灰白色固体，将其用石油醚进一步洗涤以提供[2-(4-溴苯基)-2-氧代乙基]氨基甲酸1，1-二甲基乙酯(中间体5)(40g，产率：64％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δppm 7.83(d，J＝8.7Hz，2H)，7.65(d，J＝8.7Hz，2H)，5.48(s，br，1H)，4.60-4.62(m，2H)，1.49(s，9H).ES LC-MS m/z＝336(M+Na)+。
中间体6：{2-氧代-2-[4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷 -2-基)苯基]乙基}氨基甲酸1，1-二甲基乙酯
Figure BPA00001516471500102
中间体6可如以下反应方案中所说明来制备。
Figure BPA00001516471500111
将Pd(dppf)Cl2(2.6g，3.18mmol)加到[2-(4-溴苯基)-2-氧代乙基]氨基甲酸1，1-二甲基乙酯(中间体5)(20g，63.7mmol)、硼酸双频哪醇酯(19.4g，76.4mmol)和KOAc(24.8g，0.254mol)在二
Figure BPA00001516471500112
烷(300mL)中的混合物中，将烧瓶用氮气吹扫(3×)且在氮气氛下加热到80℃历时16小时。将反应混合物用己烷(300mL)稀释，过滤，浓缩且残余物通过硅胶色谱(石油醚/乙酸乙酯＝5/1)纯化以得到作为白色固体的{2-氧代-2-[4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯基]乙基}氨基甲酸1，1-二甲基乙酯(中间体6)(13.3g，产率：58％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δppm 7.90-7.93(m，4H)，5.55(s，br，1H)，4.68(s，2H)，1.48(s，9H)，1.35(s，12H).ES LC-MS m/z＝384(M+Na)+。
中间体7：(2S)-2-({[2-(4-溴苯基)-2-氧代乙基]氨基}羰基)-1-吡咯 烷甲酸1，1-二甲基乙酯
Figure BPA00001516471500113
将1-{[(1，1-二甲基乙基)氧基]羰基}-L-脯氨酸(50g，0.233mol)、HATU(106g，0.279mol)和DIEA(150mL)在DMF(400mL)中的混合物在周围温度下搅拌10分钟。加入在DMF(500mL)中的2-氨基-1-(4-溴苯基)乙酮盐酸盐(中间体4)(70g，0.279mol)且将所得混合物搅拌过夜，之后用EtOAc(4L)稀释。将溶液用1N HCl(500mL×4)和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，浓缩。使粗产物从石油醚/乙酸乙酯(2/1)的混合物中重结晶以得到作为黄色固体的(2S)-2-({[2-(4-溴苯基)-2-氧代乙基]氨基}羰基)-1-吡咯烷甲酸1，1-二甲基乙酯(中间体7)(58.4g，产率：61％)。1H NMR(300MHz，DMSO)δppm 8.22(s，1H)，7.93(d，J＝8.4Hz，2H)，7.77(d，J＝8.4Hz，2H)，4.46-4.51(m，2H)，4.15-4.21(m，1H)，3.28-3.40(m，2H)，1.78-1.90(m，4H)，1.29-1.41(m，9H).ES LC-MS m/z＝411.1，4113.1(M+H)+。
中间体8：(2S)-2-[4-(4-溴苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷甲酸1，1- 二甲基乙酯
Figure BPA00001516471500121
在密封反应器中将(2S)-2-({[2-(4-溴苯基)-2-氧代乙基]氨基}羰基)-1-吡咯烷甲酸1，1-二甲基乙酯(7)(40.0g，97.2mmol)和NH4OAc(60g，0.778mol)在二甲苯(400mL)中的混合物加热到150℃历时5小时。将反应混合物浓缩，且将残余物溶解于EtOAc(500mL)中并用NaHCO3水溶液和盐水洗涤。有机相经Na2SO4干燥，浓缩至干。粗产物通过硅胶色谱(石油醚/乙酸乙酯＝1/1)纯化以得到作为褐色固体的(2S)-2-[4-(4-溴苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷甲酸1，1-二甲基乙酯(中间体8)(34g，产率：89％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δppm 7.52(d，J＝8.4Hz，2H)，7.46(d，J＝8.4Hz，2H)，7.20(s，1H)，5.58-5.71(m，1H)，3.38-3.42(m，1H)，2.80-2.87(m，2H)，2.03-2.06(m，2H)，1.88-2.00(m，2H)，1.49(s，9H).ES LC-MS m/z＝392，394(M+H)+。
中间体9：4-(4-溴苯基)-2-[(2S)-2-吡咯烷基]-1H-味唑
Figure BPA00001516471500122
将(2S)-2-[4-(4-溴苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷甲酸1，1-二甲基乙酯(中间体8)(72.4g，185mmol)用在二
Figure BPA00001516471500123
烷(200mL)中的饱和HCl处理，且在周围温度下搅拌过夜。将所得固体过滤并用石油醚洗涤以得到作为黄色固体的4-(4-溴苯基)-2-[(2S)-2-吡咯烷基]-1H-咪唑(中间体9)(60g，产率：90％)。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δppm 8.10(s，2H)，7.88(d，J＝6.6Hz，2H)，7.70(d，J＝6.6Hz，2H)，7.49(s，1H)，7.32(s，1H)，7.16(s，1H)，4.50-4.52(m，1H)，3.15-3.40(m，2H)，1.88-2.88(m，4H).ES LC-MS m/z＝291.1，293.1(M+H)+。
中间体10：[(1S)-1-({(2S)-2-[4-(4-溴苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯 烷基}羰基)-2-甲基丙基]氨基甲酸甲酯
Figure BPA00001516471500131
将在DCM(1000mL)中的N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酸(43.1g，0.246mol)和HATU(93.5g，0.246mol)搅拌10分钟。引入4-(4-溴苯基)-2-[(2S)-2-吡咯烷基]-1H-咪唑(中间体9)(60g，0.205mol)，接着逐滴引入DIEA(82.6mL，0.308mol)。将混合物在周围温度下搅拌过夜，之后用DCM(1000mL)稀释且用NaHCO3水溶液和盐水洗涤。有机相经Na2SO4干燥，浓缩至干。粗产物通过硅胶色谱(石油醚/乙酸乙酯＝1/1)纯化以得到作为黄色固体的[(1S)-1-({(2S)-2-[4-(4-溴苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰基)-2-甲基丙基]氨基甲酸甲酯(中间体10)(62g，产率：67％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：7.43-7.51(m，4H)，7.17(s，1H)，5.53-5.57(m，1H)，5.20-5.22(m，1H)，5.29-5.33(m，1H)，3..64-3.71(m，5H)，2.99-3.03(m，1H)，1.88-2.31(m，4H)，0.88-0.92(m，6H).ES LC-MS m/z＝449，451(M+H)+。
中间体11：[2-(4′-{2-[(2S)-1-((2S)-3-甲基-2-{[(甲氧基)羰基]氨基} 丁酰基)-2-吡咯烷基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-2-氧代乙基]氨基甲酸 1，1-二甲基乙酯
Figure BPA00001516471500141
向[(1S)-1-({(2S)-2-[4-(4-溴苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰基)-2-甲基丙基]氨基甲酸甲酯(中间体10)(62g，0.138mol)、{2-氧代-2-[4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯基]乙基}氨基甲酸1，1-二甲基乙酯(中间体6)(47.7g，0.152mol)和NaHCO3(34.2g，0.414mol)在混合DME(800mL)和水(260mL)中的混合物中加入Pd(dppf)Cl2(5.63g，6.9mmol)。将烧瓶用氮气吹扫(3×)，之后加热到80℃历时16小时。将反应冷却到室温且过滤。将滤液用EtOAc(1000mL)稀释，且将溶液用NaHCO3水溶液和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，浓缩。残余物通过硅胶色谱(石油醚/乙酸乙酯＝1/2)纯化以得到作为黄色固体的[2-(4′-{2-[(2S)-1-((2S)-3-甲基-2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-2-吡咯烷基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-2-氧代乙基]氨基甲酸1，1-二甲基乙酯(中间体11)(45g，产率：54％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δppm 8.03(d，J＝8.4Hz，2H)，7.88-760(m，6H)，5.58(S，br，1H)，5.42(m，1H)，5.28-5.30(m，1H)，4.71(s，2H)，4.32-4.35(m，1H)，3.70-3.84(m，5H)，2.96(s，br，1H)，1.96-2.11(m，4H)，1.49(s，9H)，0.88-0.92(m，6H).ES LC-MS m/z＝604，(M+H)+。
中间体12：N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基-(4R)-4-羟基-L-脯氨酸 甲酯
Figure BPA00001516471500142
向N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酸(2.89g，16.52mmol)在DCM中的搅拌溶液中加入TEA(3.51g，34.7mmol)和HATU(3g，16.52mmol)。在搅拌约10分钟之后，引入(4R)-4-羟基-L-脯氨酸甲酯盐酸盐(3g，16.52mmol)。将所得混合物在室温下额外搅拌4小时，之后用NaHCO3(ss)猝灭。将各层分离且将水层用DCM(2×)萃取。将合并的有机相经MgSO4干燥，过滤并浓缩。粗产物通过柱色谱(硅胶，在己烷中的0-70％乙酸乙酯)纯化以得到N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基-(4R)-4-羟基-L-脯氨酸甲酯(中间体12)(3.5g，产率：70％)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 5.34-5.54(m，1H)4.69(t，J＝8.41Hz，1H)4.55(br.s.，1H)4.21(s，1H)3.92-4.08(m，1H)3.74(s，4H)3.66(s，3H)2.29-2.50(m，1H)1.92-2.19(m，2H)0.86-1.13(m，6H).ES LC-MSm/z＝303.5(M+H)W。
中间体13：N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基-4-氧代-L-脯氨酸甲酯
Figure BPA00001516471500151
在室温下向N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基-(4R)-4-羟基-L-脯氨酸甲酯(中间体12)(3.5g，11.9mmol)在DCM(80mL)中的搅拌溶液中加入Dess-Martin(10g)。将所得混合物额外搅拌4小时，之后用5％硫代硫酸钠(350mL)猝灭且随后用饱和NaHCO3(200mL)猝灭。继续搅拌10分钟且将混合物用DCM(2×300mL)萃取。将有机层经MgSO4干燥，过滤并浓缩。粗产物通过柱色谱(硅胶，在己烷中的0-70％乙酸乙酯)纯化以得到N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基-4-氧代-L-脯氨酸甲酯(中间体13)(701mg，产率：20％)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 5.25(d，J＝9.18Hz，1H)5.07(dd，J＝10.74，2.93Hz，1H)4.36(d，J＝17.77Hz，1H)3.97-4.23(m，2H)3.69-3.77(m，3H)3.63(s，3H)2.92(dd，J＝18.94，10.74Hz，1H)2.62(dd，J＝18.94，2.73Hz，1H)2.01(t，J＝3.32Hz，1H)0.86-1.16(m，6H)。
中间体14：(3S，7S，9S)-7，9-二甲基-2-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰 基}-6，10-二氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-3-甲酸甲酯
Figure BPA00001516471500161
将N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基-4-氧代-L-脯氨酸甲酯(中间体13)(650mg，2.164mmol)、(2S，4S)-2，4-戊二醇(902mg，8.66mmol)和TsOH(82mg，0.43mmol)在甲苯(40mL)中在分离器(Dean-Stark Trap)存在下加热到回流过夜。在冷却到室温且用乙酸乙酯稀释之后，将所得溶液用NaHCO3(饱和溶液)和盐水洗涤。将有机层经MgSO4干燥，过滤并蒸发。粗产物通过柱色谱(硅胶，在己烷中的0-50％乙酸乙酯)纯化以得到作为油的(3S，7S，9S)-7，9-二甲基-2-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}-6，10-二氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-3-甲酸甲酯(中间体14)(366mg，产率：44％)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm.38-5.51(m，1H)4.54(t，J＝8.03Hz，1H)4.25-4.36(m，1H)3.91-4.05(m，2H)3.85(d，J＝10.04Hz，1H)3.54-3.77(m，6H)2.46-2.53(m，1H)2.12(dd，J＝12.92，7.65Hz，1H)2.00-2.06(m，1H)1.54-1.75(m，3H)1.10-1.25(m，6H)1.03(d，J＝6.78Hz，3H)0.84-0.96(m，3H).ES LC-MS m/z＝409.3(M+Na)+。
中间体15和17使用与中间体2的制备中概述的程序类似的程序制备。
中间体15：(3S，7R，9R)-7，9-二甲基-2-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰 基}-6，10-二氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-3-甲酸
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 12.53(br.s.，1H)，7.49(d，1H)，4.34(d，1H)，4.24(t，1H)，4.06(br.m，2H)，3.93(t，1H)，3.37(m，4H)，2.35(m，1H)，2.09-1.86(br.m，2H)，1.59(m，2H)，1.17(m，6H)，0.91(m，6H)。
中间体16：(8S)-7-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}-1，4-二氧杂-7- 氮杂螺[4.4]壬烷-8-甲酸甲酯
Figure BPA00001516471500172
ES LC-MS m/z＝345.3(M+H)+。
中间体17：(8S)-7-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}-1，4-二氧杂-7- 氮杂螺[4.4]壬烷-8-甲酸
Figure BPA00001516471500173
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 12.56(br.s.，1H)7.40(d，J＝8.39Hz，1H)4.33(dd，J＝8.78，7.02Hz，1H)3.81-4.10(m，5H)3.41-3.66(m，5H)2.28-2.43(m，1H)1.94-2.11(m，1H)1.74-1.94(m，1H)0.67-1.05(m，6H).ES LC-MS m/z＝331.6(M+H)+。
实施例1：[(1S)-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[(3S，7S，9S)-7，9-二甲基 -2-((2S)-3-甲基-2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-6，10-二氧杂-2-氮杂螺 [4.5]癸-3-基]-1H-味唑-4-基}-4-联苯基)-1H-味唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰 基)-2-甲基丙基]氨基甲酸甲酯
Figure BPA00001516471500181
向((3S，7S，9S)-7，9-二甲基-2-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}-6，10-二氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-3-甲酸(中间体2)(96mg，0.258mmol)在DMF(2mL)中的搅拌溶液中加入TEA(78mg，0.773mmol)和HATU(108mg，0.284mmol)。在搅拌约3分钟之后，引入{(1S)-1-[((2S)-2-{4-[4′-(氨基乙酰基)-4-联苯基]-1H-咪唑-2-基}-1-吡咯烷基)羰基]-2-甲基丙基}氨基甲酸甲酯二盐酸盐(中间体1)(149mg，0.258mmol)。在将反应物在室温下额外搅拌2小时之后，将混合物直接装载到RP HPLC中，用5-80％乙腈/水(0.2％NH3H2O(浓))洗脱，以得到作为固体的[(1S)-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[(3S，7S，9S)-7，9-二甲基-2-((2S)-3-甲基-2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-6，10-二氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸-3-基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰基)-2-甲基丙基]氨基甲酸甲酯(中间体3)(135mg，产率：61％)。1HNMR(400MHz，氯仿-d)δppm 10.40-11.01(m，1H)7.32-8.30(m，10H)5.28(br.s.，2H)4.53-4.96(m，4H)4.17-4.53(m，1H)3.40-4.17(m，11H)2.83-3.22(m，1H)2.26-2.74(m，3H)1.54-2.26(m，8H)0.47-1.43(m，18H).ESLC-MS m/z＝858.6(M+H)+。
向[(1S)-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[(3S，7S，9S)-7，9-二甲基-2-((2S)-3-甲基-2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-6，10-二氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸-3-基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰基)-2-甲基丙基]氨基甲酸甲酯(中间体3)(135mg，0.157mmol)在二
Figure BPA00001516471500191
烷(3mL)中的搅拌溶液中加入乙酸铵(121mg，1.57mmol)。在密封管中将反应混合物加热到110℃过夜。冷却到室温，过滤出过量的乙酸铵。将滤液蒸发且残余物通过柱色谱(硅胶，在乙酸乙酯中的0-15％甲醇)纯化以得到作为固体的[(1S)-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[(3S，7S，9S)-7，9-二甲基-2-((2S)-3-甲基-2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-6，10-二氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸-3-基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰基)-2-甲基丙基]氨基甲酸甲酯(实施例1)(81mg，产率：58％)。1HNMR(400MHz，氯仿-d)δppm 10.23-11.01(m，1H)7.31-8.08(m，8H)7.23(d，J＝8.03Hz，2H)5.13-5.89(m，4H)3.34-4.69(m，13H)2.84-3.31(m，2H)2.63-2.84(m，1H)2.29-2.53(m，1H)1.85-2.29(m，4H)1.56-1.85(m，4H)1.16-1.47(m，6H)0.63-1.16(m，12H).HRMS：(M+H)+计算值：835.4456；实测值：835.4458。
实施例2：[(1S)-2-甲基-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[(8S)-7-((2S)-3-甲基 -2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-1，4-二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬-8- 基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰基)丙基] 氨基甲酸甲酯
Figure BPA00001516471500192
根据实施例1中概述的类似的两步合成程序，[(1S)-2-甲基-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[(8S)-7-((2S)-3-甲基-2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-1，4-二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬-8-基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰基)丙基]氨基甲酸甲酯由(8S)-7-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}-1，4-二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-8-甲酸(中间体17)和{(1S)-1-[((2S)-2-{4-[4′-(氨基乙酰基)-4-联苯基]-1H-咪唑-2-基}-1-吡咯烷基)羰基]-2-甲基丙基}氨基甲酸甲酯二盐酸盐(中间体1)得到。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 10.00-11.36(m，2H)7.56(br.s.，10H)7.02-7.34(m，2H)5.05-5.89(m，4H)3.76-4.65(m，6H)3.53-3.83(m，6H)2.77-3.54(m，2H)2.26-2.70(m，2H)1.45-2.26(m，6H)0.61-1.25(m，12H).HRMS：(M+H)+计算值：797.3986；实测值：797.3981。
实施例3：(4，4′-联苯二基双{1H-味唑-4，2-二基[(3S，7S，9S)-7，9-二甲 基-6，10-二氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-3，2-二基][(2S)-3-甲基-1-氧代-1，2- 丁二基]})双氨基甲酸二甲酯
Figure BPA00001516471500201
在N2气氛下，向1，1′-(4，4′-联苯二基)双(2-溴乙酮)(113mg，0.285mmol，根据在WO2009020825中提供的程序制备)在乙腈(5mL)中的搅拌悬浮液中加入(3S，7S，9S)-7，9-二甲基-2-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}-6，10-二氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-3-甲酸(中间体2)(212mg，0.571mg)，接着加入TEA(57.5mg，0.571mmol)。将混合物在50℃下搅拌，直至悬浮液变澄清。在将其冷却到室温之后，将反应混合物用乙酸乙酯稀释并用盐水洗涤。将有机相经MgSO4干燥，过滤并蒸发以得到4，4′-联苯二基双-2-氧代-2，1-乙二基(3S，7S，9S，3′S，7′S，9′S)双(7，9-二甲基-2-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}-6，10-二氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-3-甲酸酯)(中间体18)(280mg，定量)。ES LC-MS m/z＝979.6(M+H)+。
向在密封管中的4，4′-联苯二基双-2-氧代-2，1-乙二基(3S，7S，9S，3′S，7′S，9′S)双(7，9-二甲基-2-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}-6，10-二氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-3-甲酸酯)(中间体18)(280mg，0.286mmol)在二
Figure BPA00001516471500211
烷(5mL)中的搅拌溶液中加入乙酸铵(441mg，5.72mmol)。将反应混合物加热到110℃过夜。冷却到室温，过滤出过量的乙酸铵。将滤液蒸发且残余物通过管柱(硅胶，在乙酸乙酯中的0-15％甲醇)纯化以得到作为固体的(4，4′-联苯二基双{1H-咪唑-4，2-二基[(3S，7S，9S)-7，9-二甲基-6，10-二氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-3，2-二基][(2S)-3-甲基-1-氧代-1，2-丁二基]})双氨基甲酸二甲酯(实施例3)(112mg，产率：40％)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 10.30-10.99(m，2H)7.68-8.00(m，2H)7.61(d，J＝7.53Hz，6H)7.26-7.35(m，4H)5.59(d，J＝8.53Hz，1H)5.23-5.39(m，1H)4.44(dd，J＝8.41，5.14Hz，2H)4.02-4.23(m，4H)3.97(d，J＝10.29Hz，2H)3.72(s，6H)3.62(d，J＝10.29Hz，2H)3.04-3.32(m，2H)2.70(d，J＝13.05Hz，2H)1.93(br.s.，2H)1.56-1.82(m，4H)1.13-1.46(m，12H)0.60-1.02(m，12H).HRMS：(M+H)+计算值：939.4980；实测值：939.4981。
实施例4：(4，4′-联苯二基双{1H-咪唑-4，2-二基(8S)-1，4-二氧杂-7- 氮杂螺[4.4]壬烷-8，7-二基[(2S)-3-甲基-1-氧代-1，2-丁二基]})双氨基甲 酸二甲酯
Figure BPA00001516471500221
(4，4′-联苯二基双{1H-咪唑-4，2-二基(8S)-1，4-二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-8，7-二基[(2S)-3-甲基-1-氧代-1，2-丁二基]})双氨基甲酸二甲酯使用类似于在实施例3中概述的两步程序的方法由1，1′-(4，4′-联苯二基)双(2-溴乙酮)和(8S)-7-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}-1，4-二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-8-甲酸(中间体17)得到。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 11.10-11.23(m，1H)10.10-11.63(m，2H)7.40-8.15(m，8H)7.27-7.40(m，2H)5.23-5.88(m，2H)4.31(dd，J＝8.68，6.54Hz，2H)3.83-4.21(m，10H)3.57-3.83(m，6H)3.05-3.46(m，3H)2.47(dd，J＝13.46，8.59Hz，2H)1.51-2.20(m，2H)1.08(d，J＝6.83Hz，2H)0.60-0.97(m，12H).HRMS：(M+H)+计算值：855.4041；实测值：855.4039。
实施例5：((1S)-1-甲基-2-{(3S)-3-[4-(4′-{2-[(2S)-1-((2S)-3-甲基 -2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-2-吡咯烷基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯 基)-1H-咪唑-2-基]-6，10-二氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸-2-基}-2-氧代乙基)氨 基甲酸甲酯
Figure BPA00001516471500222
向N-[(甲氧基)羰基]-L-丙氨酸(22.5mg，0.153mmol，根据在WO2003055474中提供的程序制备)在DMF(2mL)中的搅拌溶液中加入TEA(15.5mg，0.153mmol)和HATU(58.2mg，0.153mmol)。在搅拌约3分钟之后，引入[(1S)-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[(3S)-6，10-二氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸-3-基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰基)-2-甲基丙基]氨基甲酸甲酯(实施例19)(100mg，0.153mmol)。在于室温下额外搅拌2小时之后，将反应混合物直接装载到RP HPLC中，用5-80％乙腈/水(0.2％NH3H2O(浓))洗脱，以得到作为固体的((1S)-1-甲基-2-{(3S)-3-[4-(4′-{2-[(2S)-1-((2S)-3-甲基-2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-2-吡咯烷基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-6，10-二氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸-2-基}-2-氧代乙基)氨基甲酸甲酯(实施例5)(36mg，产率：29％)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 10.04-11.11(m，2H)7.37-8.02(m，8H)7.18-7.36(m，2H)5.60(br.s.，2H)5.17-5.40(m，2H)3.17-4.73(m，14H)2.79-3.19(m，1H)2.45-2.81(m，1H)2.29-2.45(m，1H)1.49-2.29(m，8H)1.22-1.47(m，3H)0.73-1.16(m，6H).HRMS：(M+H)+计算值：783.3830；实测值：783.3832。
中间体19：制备[(1S)-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[(3S)-6，10-二氧杂-2-氮 杂螺[4.5]癸-3-基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷 基}羰基)-2-甲基丙基]氨基甲酸甲酯
中间体19可如以下反应方案中所说明来制备。
Figure BPA00001516471500241
中间体21：(3S)-3-({[2-(4′-{2-[(2S)-1-((2S)-3-甲基-2-{[(甲氧基)羰 基]氨基}丁酰基)-2-吡咯烷基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-2-氧代乙基] 氨基}羰基)-6，10-二氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-2-甲酸苯基甲酯
Figure BPA00001516471500242
向(3S)-2-{[(苯基甲基)氧基]羰基}-6，10-二氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-3-甲酸(中间体20)(878mg，2.73mmol)在DMF(10mL)中的搅拌溶液中加入TEA(829mg，8.20mmol)和HATU(1039mg，2.73mmol)。在搅拌约3分钟之后，加入[(1S)-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[(3S)-6，10-二氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸-3-基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰基)-2-甲基丙基]氨基甲酸甲酯(中间体1)(1575mg，2.73mmol)。将所得混合物在室温下额外搅拌2小时，之后用NaHCO3(饱和溶液)猝灭并用EtOAc(3×)萃取。将合并的有机层经MgSO4干燥，过滤并蒸发。粗产物通过柱色谱(硅胶，在DCM中的0-6％MeOH(2M氨))纯化以得到作为固体的(3S)-3-({[2-(4′-{2-[(2S)-1-((2S)-3-甲基-2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-2-吡咯烷基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-2-氧代乙基]氨基}羰基)-6，10-二氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-2-甲酸苯基甲酯(中间体21)(1.76g，产率：80％)。ES LC-MS m/z＝807.5(M+H)+。
中间体22：(3S)-3-(4-{4′-[2-((2S)-1-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰 基}-2-吡咯烷基)-1H-咪唑-4-基]-4-联苯基}-1H-咪唑-2-基)-6，10-二氧 杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-2-甲酸苯基甲酯
Figure BPA00001516471500251
向在密封管中的(3S)-3-({[2-(4′-{2-[(2S)-1-((2S)-3-甲基-2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-2-吡咯烷基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-2-氧代乙基]氨基}羰基)-6，10-二氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-2-甲酸苯基甲酯(中间体21)(1.76g，2.18mmol)在二
Figure BPA00001516471500252
烷(5mL)中的搅拌溶液中加入乙酸铵(1.68g，21.8mmol)。将反应混合物加热到110℃过夜。冷却到室温，过滤出过量的乙酸铵。将滤液蒸发且残余物通过管柱(硅胶，在乙酸乙酯中的0-15％甲醇)纯化以得到作为泡沫的(3S)-3-(4-{4′-[2-((2S)-1-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}-2-吡咯烷基)-1H-咪唑-4-基]-4-联苯基}-1H-咪唑-2-基)-6，10-二氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-2-甲酸苯基甲酯(中间体22)(1.44g，产率：84％)。ES LC-MSm/z＝788.5(M+H)+。
中间体19：[(1S)-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[(3S)-6，10-二氧杂-2-氮杂螺 [4.5]癸-3-基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰 基)-2-甲基丙基]氨基甲酸甲酯
Figure BPA00001516471500261
使(3S)-3-(4-{4′-[2-((2S)-1-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}-2-吡咯烷基)-1H-咪唑-4-基]-4-联苯基}-1H-咪唑-2-基)-6，10-二氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-2-甲酸苯基甲酯(中间体22)(1.44g，1.83mmol)在乙醇(100mL)中在气囊下在Pd/C的催化下氢化20小时以得到[(1S)-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[(3S)-6，10-二氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸-3-基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰基)-2-甲基丙基]氨基甲酸甲酯(中间体19)。ES LC-MS m/z＝654.4(M+H)+。
中间体20：(3S)-2-{[(苯基甲基)氧基]羰基}-6，10-二氧杂-2-氮杂螺 [4.5]癸烷-3-甲酸
中间体20可如以下反应方案中所说明来制备。
Figure BPA00001516471500262
中间体23：(2S)-4-氧代-1，2-吡咯烷二甲酸2-甲酯1-(苯基甲基)酯
Figure BPA00001516471500271
在-78℃下，向乙二酰氯(5.97g，47mmol)在DCM(200mL)中的搅拌溶液中缓慢加入DMSO(4.8g，61.5mmol)。在10分钟搅拌之后，将(2S，4R)-4-羟基-1，2-吡咯烷二甲酸2-甲酯1-(苯基甲基)酯在DCM(30mL)中的溶液引入反应烧瓶中。继续搅拌62分钟，之后加入三乙胺(10.98g，108mmol)。随后除去冷却浴且让反应混合物缓慢升温至0℃并用饱和NH4Cl溶液猝灭。将各层分离且将水层用DCM(2×)萃取。将合并的有机层经MgSO4干燥，过滤并蒸发。粗产物通过柱色谱(硅胶，在己烷中的0-50％乙酸乙酯)纯化以得到(2S)-4-氧代-1，2-吡咯烷二甲酸2-甲酯1-(苯基甲基)酯(中间体23)(6.3g，产率：63％)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 7.29-7.56(m，5H)5.08-5.37(m，2H)4.80-5.02(m，1H)3.89-4.08(m，2H)3.53-3.88(m，3H)2.95(dd，J＝18.82，10.79Hz，1H)2.63(dd，1H)。
中间体24：(3S)-6，10-二氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-2，3-二甲酸3-甲酯 2-(苯基甲基)酯
Figure BPA00001516471500272
遵循中间体14的制备中概述的类似程序，(3S)-6，10-二氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-2，3-二甲酸3-甲酯2-(苯基甲基)酯(中间体24)(1.02g，产率：84％)由(2S)-4-氧代-1，2-吡咯烷二甲酸2-甲酯1-(苯基甲基)酯(1.0g，3.61mmol)和1，3-丙二醇(0.55g，7.21mmol)制备。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 7.05-7.61(m，5H)4.91-5.25(m，2H)4.29-4.68(m，1H)3.75-4.07(m，5H)3.38-3.75(m，4H)2.25-2.67(m，2H)1.51-2.00(m，1H).ES LC-MS m/z＝336.6(M+H)+。
中间体20：(3S)-2-{[(苯基甲基)氧基]羰基}-6，10-二氧杂-2-氮杂螺 [4.5]癸烷-3-甲酸
遵循中间体2的制备中概述的类似程序，(3S)-2-{[(苯基甲基)氧基]羰基}-6，10-二氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-3-甲酸(中间体20)(878mg，产率：90％)由(3S)-6，10-二氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-2，3-二甲酸3-甲酯2-(苯基甲基)酯(中间体24)(1.02g，3.04mmol)和LiOH(80mg，3.35mmol)得到。ES LC-MS m/z＝322.2(M+H)+。
中间体26、27、28、29、31、33和34使用与在中间体20的制备中所述类似的程序来制备：
Figure BPA00001516471500282
中间体25：(3S)-6，10-二氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-2，3-二甲酸3-甲酯 2-(苯基甲基)酯-d 2
Figure BPA00001516471500291
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 7.27-7.46(m，5H)4.97-5.27(m，2H)4.29-4.64(m，1H)3.72-4.02(m，6H)3.49-3.72(m，3H)2.19-2.67(m，2H).ES LC-MS m/z＝338.2(M+H)+。
中间体26：(3S)-2-{[(苯基甲基)氧基]羰基}-6，10-二氧杂-2-氮杂螺 [4.5]癸烷-3-甲酸-d 2
Figure BPA00001516471500292
ES LC-MS m/z＝324.2(M+H)+。
中间体27：(3S)-8，8-二甲基-2-{[(苯基甲基)氧基]羰基}-6，10-二氧 杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-3-甲酸
Figure BPA00001516471500293
中间体28：(3S)-2-{[(苯基甲基)氧基]羰基}-6，10-二氧杂-2-氮杂螺 [4.5]癸烷-3-甲酸-d 6
Figure BPA00001516471500301
中间体29：(8S)-7-{[(苯基甲基)氧基]羰基}-1，4-二氧杂-7-氮杂螺 [4.4]壬烷-8-甲酸-d 4
Figure BPA00001516471500302
中间体30：(2R，3R，8S)-2，3-二甲基-1，4-二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷 -7，8-二甲酸8-甲酯7-(苯基甲基)酯
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ.ppm 1.12-1.24(m，6H)，2.00-2.18(m，1H)，2.35-2.46(m，1H)，3.32(s，1H)，3.35-3.44(m，1H)，3.56(s，2H)，3.64(s，3H)，4.28-4.37(m，1H)，4.38-4.45(m，0H)，5.09(s，2H)，7.24-7.41(m，5H)
LC-MS(ESI)：m/z＝350.1(M+H)+；
中间体31：(2R，3R，8S)-2，3-二甲基-7-{[(苯基甲基)氧基]羰基}-1，4- 二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-8-甲酸
Figure BPA00001516471500311
LC-MS(ESI)：m/z＝336.2(M+H)+；
中间体32：(2S，3S，8S)-2，3-二甲基-1，4-二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷 -7，8-二甲酸8-甲酯7-(苯基甲基)酯
1HNMR(400MHz，氯仿-d)δppm 1.18-1.31(m，6H)，2.23(dd，J＝13.1，5.9Hz，1H)，2.39(dt，J＝13.1，8.0Hz，1H)，3.49-3.66(m，6H)，3.76(s，1H)，4.39-4.56(m，1H)，4.98-5.26(m，2H)，7.36(s，5H)
LC-MS(ESI)：m/z＝350.1(M+H)+；
中间体33：(2S，3S，8S)-2，3-二甲基-7-{[(苯基甲基)氧基]羰基}-1，4- 二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-8-甲酸
Figure BPA00001516471500313
LC-MS(ESI)：m/z＝336.2(M+H)+；
中间体34：(5′S)-1′-{[(苯基甲基)氧基]羰基}四氢螺[呋喃并 [3，4-d][1，3]二氧杂环戊烯-2，3′-吡咯烷]-5′-甲酸
Figure BPA00001516471500321
LC-MS(ESI)：m/z＝350.2(M+H)+；
实施例6：[(1S)-2-甲基-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[(3S)-2-((2S)-3-甲基 -2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-6，10-二氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸-3- 基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰基)丙基] 氨基甲酸甲酯
Figure BPA00001516471500322
遵循在实施例5中概述的类似程序，[(1S)-2-甲基-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[(3S)-2-((2S)-3-甲基-2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-6，10-二氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸-3-基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰基)丙基]氨基甲酸甲酯(47mg，产率：53％)由[(1S)-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[(3S)-6，10-二氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸-3-基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰基)-2-甲基丙基]氨基甲酸甲酯(中间体19)(68mg，0.104mmol)、N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酸(18.2mg，0.104)和HATU(40mg，0.104mmol)制备。1HNMR(400MHz，氯仿-d)δppm 10.20-11.06(m，2H)7.35-8.02(m，8H)7.22(d，J＝7.78Hz，2H)4.97-5.89(m，4H)3.22-4.58(m，15H)2.83-3.20(m，1H)2.58-2.83(m，1H)2.29-2.58(m，1H)1.57-2.31(m，8H)0.64-1.22(m，12H).HRMS：(M+H)+计算值：811.4143；实测值：811.4142。
实施例7-11使用对于实施例5的合成所述的类似合成顺序来制备。
Figure BPA00001516471500331
实施例7：[(1S)-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[(3S)-8，8-二甲基-2-((2S)-3-甲 基-2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-6，10-二氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸-3- 基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰基)-2-甲 基丙基]氨基甲酸甲酯
Figure BPA00001516471500332
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ(ppm)11.84(br.s.，1H)，11.80(br.s，1H)，7.90-7.60(br.m，9H)，7.52(s，1H)，7.36-7.25(br.m，2H)，5.09(br.m，1H)，4.98(m，1H)，4.49(br.m，1H)，4.14-4.02(br.m，2H)，3.81(br，2H)，3.73-3.40(br.m，11H)，2.65(m，1H)，2.43-2.09(br.m，3H)，2.07-1.81(br.m，4H)，1.05-0.75(br.m，18H)
ES LC-MS m/z＝839(M+H)+。纯度(LC/MS)96％。
实施例8：[(1S)-2-甲基-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[(3S)-2-((2S)-3-甲基 -2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-6，10-二氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸-3- 基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰基)丙基] 氨基甲酸甲酯-d 6
1H NMR(400MHz，CD3OD)δppm 7.62(m，8H)，7.29(m，2H)，5.17(m，2H)，4.20(m，2H)，4.00(m，2H)，3.88(m，2H)，3.65(s，6H)，2.65-2.03(m，8H)，0.90(m，12H).
LC-MS C43H48N8O8D6(M+H)+计算值：817，实测值：817。
HRMS C43H48N8O8D6(M+H)+计算值：817.4519，实测值：817.4517。
纯度(LC/MS)95％。
实施例9：[(1S)-2-甲基-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[(8S)-7-((2S)-3-甲基 -2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-1，4-二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬-8- 基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰基)丙基] 氨基甲酸甲酯-d 4
Figure BPA00001516471500351
1H NMR(400MHz，CD3OD)δppm 7.60(m，8H)，7.28(m，2H)，5.17(m，2H)，4.23(m，1H)，4.15(m，1H)，4.06(m，1H)，3.97(m，1H)，3.88(m，2H)，3.64(s，6H)，2.50-2.00(m，8H)，0.90(m，12H)。
LC-MS：C42H48N8O8D4(M+H)+计算值：801，实测值：801。
HRMS：C42H48N8O8D4(M+H)+计算值：801.4237，实测值：801.4238。
纯度(LC/MS)91％。
实施例10：[(1S)-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[(2R，3R，8S)-2，3-二甲基 -7-((2S)-3-甲基-2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-1，4-二氧杂-7-氮杂螺 [4.4]壬-8-基]-1H-咪唑-5-基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰 基)-2-甲基丙基]氨基甲酸甲酯
Figure BPA00001516471500352
1H NMR(400MHz，DMSSO-d6)δppm 0.85(d，J＝6.4Hz，12H)，1.24(dd，J＝11.9，5.8Hz，6H)，1.87-2.06(m，4H)，2.08-2.21(m，2H)，2.34-2.43(m，1H)，3.54(s，6H)，3.59-3.68(m，2H)，3.69-3.75(m，2H)，3.81(br.s.，2H)，3.97-4.14(m，3H)，5.00-5.17(m，2H)，7.25-7.33(m，2H)，7.49-7.54(m，2H)，7.62-7.71(m，4H)，7.78(d，J＝7.7Hz，4H)，11.79(br.s.，2H)；LC-MS(ESI)：m/z＝825.5(M+H)+；HRMS：(M+H)+计算值：825.4299；实测值：825.4302。纯度：92％。
实施例11：[(1S)-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[(2S，3S，8S)-2，3-二甲基 -7-((2S)-3-甲基-2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-1，4-二氧杂-7-氮杂螺 [4.4]壬-8-基]-1H-咪唑-5-基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰 基)-2-甲基丙基]氨基甲酸甲酯
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ.ppm 0.70-0.96(m，7H)，1.12-1.35(m，4H)，1.85-2.04(m，3H)，2.04-2.25(m，2H)，2.31-2.47(m，1H)，3.33(s，7H)，3.45-3.61(m，8H)，3.63-3.89(m，7H)，3.94-4.15(m，4H)，4.91-5.17(m，2H)，7.20-7.40(m，2H)，7.49-7.59(m，1H)，7.60-7.70(m，2H)，7.70-7.81(m，2H)，7.81-7.93(m，2H)，7.96-8.08(m，0H)，11.59-12.00(m，2H)；LC-MS(ESI)：m/z 825.5(M+H)+；HRMS：(M+H)+计算值：825.4299；实测值：825.4302。
中间体36：(8S)-7-{[(苯基甲基)氧基]羰基}-1，4-二硫杂-7-氮杂螺 [4.4]壬烷-8-甲酸：
Figure BPA00001516471500362
中间体35：(8S)-1，4-二硫杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7，8-二甲酸8-甲酯 7-(苯基甲基)酯
Figure BPA00001516471500371
向(2S)-4-氧代-1，2-吡咯烷二甲酸2-甲酯1-(苯基甲基)酯(中间体23)(680mg，2.452mmol)在无水DCM(50mL)中的搅拌溶液中加入1，2-乙二硫醇(462mg，4.9mmol)且接着加入BF3乙醚络合物(139mg，0.4mmol)。在室温下搅拌所得混合物过夜，之后用NaHCO3(饱和溶液)猝灭。将各层分离且将有机层干燥，过滤并蒸发。残余物通过柱色谱(硅胶，在己烷中的0-50％乙酸乙酯)纯化以得到作为油的(8S)-1，4-二硫杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7，8-二甲酸8-甲酯7-(苯基甲基)酯(中间体35)。1HNMR(400MHz，氯仿-d)δppm 7.28-7.48(m，5H)4.95-5.35(m，2H)4.34-4.63(m，1H)3.90-4.11(m，1H)3.82-3.90(m，1H)3.78(s，2H)3.50-3.69(m，1H)3.15-3.45(m，4H)2.74(ddd，J＝13.30，7.78，1.25Hz，1H)2.40-2.64(m，1H).ES LC-MSm/z＝354.2(M+H)。
中间体36：(8S)-7-{[(苯基甲基)氧基]羰基}-1，4-二硫杂-7-氮杂螺 [4.4]壬烷-8-甲酸
Figure BPA00001516471500372
遵循在中间体2的制备中概述的程序，(8S)-7-{[(苯基甲基)氧基]羰基}-1，4-二硫杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-8-甲酸(中间体36)酸(36)(640mg，产率：84％)由(8S)-1，4-二硫杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7，8-二甲酸8-甲酯7-(苯基甲基)酯(798mg，2.25mmol)和LiOH(60mg，2.5mmol)得到。ES LC-MSm/z＝340.1(M+H)。
中间体39：制备[(1S)-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[(8S)-1，4-二硫杂-7-氮杂 螺[4.4]壬-8-基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基} 羰基)-2-甲基丙基]氨基甲酸甲酯
Figure BPA00001516471500381
中间体37：(8S)-8-({[2-(4′-{2-[(2S)-1-((2S)-3-甲基-2-{[(甲氧基)羰 基]氨基)丁酰基)-2-吡咯烷基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-2-氧代乙基] 氨基}羰基)-1，4-二硫杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-甲酸苯基甲酯
Figure BPA00001516471500382
遵循在中间体21的制备中概述的类似程序，(8S)-8-({[2-(4′-{2-[(2S)-1-((2S)-3-甲基-2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-2-吡咯烷基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-2-氧代乙基]氨基}羰基)-1，4-二硫杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-甲酸苯基甲酯(中间体37)(584mg，产率：68％)由{(1S)-l-[((2S)-2-{4-[4′-(氨基乙酰基)-4-联苯基]-1H-咪唑-2-基}-1-吡咯烷基)羰基]-2-甲基丙基}氨基甲酸甲酯二盐酸盐(中间体1)(603mg，1.046mmol)、(8S)-7-{[(苯基甲基)氧基]羰基}-1，4-二硫杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-8-甲酸(中间体36)(355mg，1.046mmol)和HATU(498mg，1.046mmol)得到。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 7.88-8.03(m，2H)7.45-7.85(m，6H)7.05-7.45(m，6H)5.61(br.s.，1H)4.98-5.41(m，2H)4.42-4.92(m，2H)4.35(t，J＝7.78Hz，1H)3.93-4.06(m，1H)3.86(d，J＝8.78Hz，3H)3.62-3.80(m，4H)3.35(d，J＝5.02Hz，4H)3.21(d，J＝7.28Hz，1H)2.61-2.96(m，2H)2.24(br.s.，2H)1.93-2.16(m，2H)0.98-1.17(m，3H)0.91(t，J＝7.15Hz，6H).ES LC-MS m/z＝825.2(M+H)。
中间体38：(8S)-8-(4-{4′-[2-((2S)-1-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰 基}-2-吡咯烷基)-1H-咪唑-4-基]-4-联苯基}-1H-咪唑-2-基)-1，4-二硫杂 -7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-甲酸苯基甲酯
Figure BPA00001516471500391
遵循在中间体(22)的制备中概述的类似程序，(8S)-8-(4-{4′-[2-((2S)-1-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}-2-吡咯烷基)-1H-咪唑-4-基]-4-联苯基}-1H-咪唑-2-基)-1，4-二硫杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-甲酸苯基甲酯(中间体38)(497mg，87％)由(8S)-8-({[2-(4′-{2-[(2S)-1-((2S)-3-甲基-2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-2-吡咯烷基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-2-氧代乙基]氨基}羰基)-1，4-二硫杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-甲酸苯基甲酯(中间体37)(584mg，0.71mmol)和乙酸铵(546mg，7.1mmol)得到。ES LC-MSm/z＝806.4(M+H)。
中间体39：[(1S)-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[(8S)-14-二硫杂-7-氮杂螺 [4.4]壬-8-基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰 基)-2-甲基丙基]氨基甲酸甲酯
Figure BPA00001516471500401
在室温下，向(8S)-8-(4-{4′-[2-((2S)-1-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}-2-吡咯烷基)-1H-咪唑-4-基]-4-联苯基}-1H-咪唑-2-基)-1，4-二硫杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-甲酸苯基甲酯(中间体38)(497mg，0.617mmol)在TFA(6mL)中的搅拌溶液中加入三氟甲磺酸(278mg，1.85mmol)。将所得混合物在室温下搅拌3小时。蒸发溶剂，用NaHCO3(饱和溶液)中和且将水相用DCM(15％IPA)(3×)萃取。将合并的有机相干燥，过滤并蒸发以得到[(1S)-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[(8S)-1，4-二硫杂-7-氮杂螺[4.4]壬-8-基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰基)-2-甲基丙基]氨基甲酸甲酯(中间体39)(400mg，产率：97％)。ESLC-MS m/z＝672.2(M+H)。
实施例12：[(1S)-2-甲基-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[(8S)-7-((2S)-3-甲基 -2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-1，4-二硫杂-7-氮杂螺[4.4]壬-8- 基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰基)丙基] 氨基甲酸甲酯
Figure BPA00001516471500402
遵循在实施例5中概述的类似程序，[(1S)-2-甲基-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[(8S)-7-((2S)-3-甲基-2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-1，4-二硫杂-7-氮杂螺[4.4]壬-8-基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰基)丙基]氨基甲酸甲酯(88mg，产率：27％)由[(1S)-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[(8S)-1，4-二硫杂-7-氮杂螺[4.4]壬-8-基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰基)-2-甲基丙基]氨基甲酸甲酯(中间体39)(250mg，0.372mmol)、N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酸(65mg，0.372mmol)和HATU(141mg，0.372mmol)得到。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 10.07-11.08(m，2H)7.82(br.s.，3H)7.58(d，J＝6.02Hz，5H)7.10-7.30(m，2H)5.54(d，J＝9.29Hz，2H)5.17-5.42(m，3H)4.01-4.48(m，2H)3.23-4.03(m，10H)2.70-3.19(m，2H)2.30-2.49(m，1H)1.91-2.29(m，4H)1.19-1.56(m，4H)1.07(dd，J＝10.54，7.03Hz，2H)0.58-0.97(m，10H).HRMS：(M+H)+计算值：829.3530；实测值：829.3534。
实施例13：[(1S)-2-甲基-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[(8S)-7-((2S)-2-{[(甲 氧基)羰基]氨基}丁酰基)-1，4-二硫杂-7-氮杂螺[4.4]壬-8-基]-1H-咪唑 -4-基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰基)丙基]氨基甲酸甲 酯
遵循在实施例5中概述的类似程序，[(1S)-2-甲基-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[(8S)-7-((2S)-2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-1，4-二硫杂-7-氮杂螺[4.4]壬-8-基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰基)丙基]氨基甲酸甲酯(35mg，产率：27％)由[(1S)-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[(8S)-1，4-二硫杂-7-氮杂螺[4.4]壬-8-基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰基)-2-甲基丙基]氨基甲酸甲酯(中间体39)(100mg，0.149mmol)、(2S)-2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酸(24mg，0.15mmol)和HATU(56.5mg，0.149mmol)得到。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 9.99-11.64(m，2H)7.53(br.s.，8H)7.12-7.34(m，2H)5.26(br.s.，2H)3.18-4.64(m，17H)2.79(br.s.，2H)1.43-2.62(m，8H)0.70-1.19(m，9H).HRMS：(M+H)+计算值：815.3373；实测值：815.3373。
实施例14：[(1S)-2-甲基-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[(8S)-7-({[(甲氧基) 羰基]氨基}乙酰基)-1，4-二硫杂-7-氮杂螺[4.4]壬-8-基]-1H-咪唑-4- 基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰基)丙基]氨基甲酸甲酯
Figure BPA00001516471500421
遵循在实施例5中概述的类似程序，[(1S)-2-甲基-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[(8S)-7-({[(甲氧基)羰基]氨基}乙酰基)-1，4-二硫杂-7-氮杂螺[4.4]壬-8-基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰基)丙基]氨基甲酸甲酯(14mg，产率：24％)由[(1S)-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[(8S)-1，4-二硫杂-7-氮杂螺[4.4]壬-8-基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰基)-2-甲基丙基]氨基甲酸甲酯(中间体39)(50mg，0.074mmol)、N-[(甲氧基)羰基]甘氨酸(10mg，0.074mmol)和HATU(28.3mg，0.074mmol)得到。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 9.86-11.31(m，2H)7.50(br.s.，8H)6.91-7.27(m，2H)5.41-6.31(m，2H)5.24(br.s.，2H)3.12-4.45(m，18H)2.77(br.s.，2H)1.77-2.50(m，4H)0.58-1.15(m，6H).HRMS：(M+H)+计算值：787.3055；实测值：787.3056。
实施例15：[(1S)-2-甲基-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[2-((2S)-3-甲基 -2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-8-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸-3-基]-1H-咪 唑-4-基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰基)丙基]氨基甲酸 甲酯
Figure BPA00001516471500431
使((1S)-2-甲基-1-{[(2S)-2-(4-{4′-[({[2-((2S)-3-甲基-2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-8-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸-3-基]羰基}氨基)乙酰基]-4-联苯基}-1H-咪唑-2-基)-1-吡咯烷基]羰基}丙基)氨基甲酸甲酯(中间体104)(131mg，0.16mmol)和乙酸铵(122mg，1.6mmol)在二
Figure BPA00001516471500432
烷(2mL)中的溶液脱气并在密封管中将其加热到110℃历时18小时。将反应物冷却到室温，用乙酸乙酯稀释，过滤并真空浓缩。残余物通过C18RP色谱以10-90％水/乙腈/0.2％NH4OH洗脱来纯化以提供灰白色固体(44mg，产率34％)。1H NMR(400MHz，METHANOL-d4)δppm7.55-7.87(m，8H)7.32(br.s.，4H)5.02-5.23(m，3H)4.13-4.34(m，4H)3.93-4.04(m，1H)3.88(br.s.，2H)3.49-3.84(m，8H)1.86-2.54(m，10H)1.45-1.84(m，4H)0.69-1.12(m，12H).HRMS C44H57N8O7(M+H)+计算值：809.4350，实测值：809.4346。纯度(LC-MS)：96％。
制备中间体104
Figure BPA00001516471500433
中间体101：8-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-3-甲酸乙酯
Figure BPA00001516471500441
遵循在WO 98/08850，第50页中概述的程序，中间体101由四氢-2H-吡喃-4-甲醛(1.0g，8.8mmol)以定量产率作为外消旋物得到。
中间体102：2-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}-8-氧杂-2-氮杂螺 [4.5]癸烷-3-甲酸乙酯
Figure BPA00001516471500442
向8-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-3-甲酸乙酯(101)(200mg，0.94mmol)、HATU(392mg，1.03mmol)和N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酸(181mg，1.03mmol)在无水CH2Cl2(6mL)中的溶液中加入许尼希碱(Hunig’s base)(0.33mL，1.88mmol)且在室温下在氮气下搅拌所述溶液。2小时之后，将反应物真空浓缩，通过C18RP色谱用10-90％ACN/水/0.2％NH4OH洗脱来纯化，以提供作为黄色油的产物(313mg，产率90％)。
中间体103：2-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}-8-氧杂-2-氮杂螺 [4.5]癸烷-3-甲酸
Figure BPA00001516471500443
向2-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}-8-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-3-甲酸乙酯(102)(310mg，0.84mmol)在THF/水/甲醇(6mL)的2∶1∶1混合物中的溶液中加入氢氧化锂单水合物(70mg，1.67mmol)且将反应物在室温下搅拌2小时。用1N HCl(1.6mL)处理，在EtOAc和水(各30mL)之间分配，将有机层用EtOAc(30mL)萃取，干燥(MgSO4)且浓缩以得到白色泡沫(211mg，产率74％)。该物质在不经额外纯化的情况下用于随后步骤中。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 12.43(br.s.，1H)7.19-7.41(m，1H)4.05-4.28(m，1H)3.91-4.05(m，2H)3.40-3.71(m，6H)3.20-3.28(m，1H)1.81-1.98(m，2H)1.70-1.80(m，1H)1.46-1.69(m，2H)1.32-1.46(m，1H)0.65-1.03(m，10H)。
中间体104：((1S)-2-甲基-1-{[(2S)-2-(4-{4′-[({[2-((2S)-3-甲基 -2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-8-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸-3-基]羰基} 氨基)乙酰基]-4-联苯基}-1H-咪唑-2-基)-1-吡咯烷基]羰基}丙基)氨基 甲酸甲酯
Figure BPA00001516471500451
向2-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}-8-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-3-甲酸(103)(100mg，0.29mmol)、HATU(111mg，0.29mmol)和如在实施例1中所述制备的{(1S)-1-[((2S)-2-{4-[4′-(氨基乙酰基)-4-联苯基]-1H-咪唑-2-基}-1-吡咯烷基)羰基]-2-甲基丙基}氨基甲酸甲酯二盐酸盐(1)(168mg，0.29mmol)在无水CH2Cl2(2mL)中的溶液中加入许尼希碱(0.2mL，1.17mmol)且将溶液在室温下在氮气下搅拌。1小时之后，将反应物真空浓缩，通过C18RP色谱用10-90％ACN/水/0.2％NH4OH洗脱来纯化，以提供作为黄色固体的产物(133mg，产率55％)。
实施例16：[(1S)-2-甲基-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[2-((2S)-3-甲基 -2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-8，8-二氧代-8-硫杂-2-氮杂螺[4.5]癸 -3-基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰基)丙 基]氨基甲酸甲酯
Figure BPA00001516471500461
将((1S)-2-甲基-1-{[(2S)-2-(4-{4′-[({[2-((2S)-3-甲基-2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-8，8-二氧代-8-硫杂-2-氮杂螺[4.5]癸-3-基]羰基}氨基)乙酰基]-4-联苯基}-1H-咪唑-2-基)-1-吡咯烷基]羰基}丙基)氨基甲酸甲酯(108)(107mg，0.12mmol)和乙酸铵(94mg，1.2mmol)在二
Figure BPA00001516471500462
烷(1.5mL)中的溶液用氮气脱气并在密封管中将其加热到110℃历时18小时。将反应物冷却到室温，用乙酸乙酯稀释，过滤并真空浓缩。通过SFC纯化以提供作为褐色固体的产物(39mg，产率37％)。1H NMR(400MHz，METHANOL-d4)δppm 7.64(br.s.，10H)7.32(br.s.，2H)5.05-5.24(m，1H)4.04-4.29(m，1H)3.99(br.s.，1H)3.81(br.s.，1H)3.55-3.73(m，6H)3.03-3.25(m，4H)1.80-2.47(m，14H)0.68-1.06(m，16H).HRMS C44H57N8O8S(M+H)+计算值：857.4020，实测值：857.4020。纯度(LC-MS)：97％。
制备中间体108
Figure BPA00001516471500471
中间体105：8-硫杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-3-甲酸乙酯8，8-二氧化物
该化合物以与实施例15类似的方式由四氢-2H-噻喃-4-甲醛1，1-二氧化物(1.05g，6.47mmol)以90％的产率制备。
中间体106：2-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}-8-硫杂-2-氮杂螺 [4.5]癸烷-3-甲酸乙酯8，8-二氧化物
Figure BPA00001516471500473
中间体106以与实施例15类似的方式由8-硫杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-3-甲酸乙酯8，8-二氧化物(105)(200mg，0.77mmol)以60％的产率制备。
中间体107：2-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}-8-硫杂-2-氮杂螺 [4.5]癸烷-3-甲酸8，8-二氧化物
Figure BPA00001516471500481
中间体107以与实施例15类似的方式由2-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}-8-硫杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-3-甲酸乙酯8，8-二氧化物(106)(187mg，0.45mmol)以定量产率制备。在不经额外纯化的情况下用于随后的步骤。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 12.48(br.s.，1H)7.13-7.44(m，1H)4.10-4.31(m，1H)3.46-3.61(m，3H)2.93-3.24(m，3H)2.32(dd，J＝3.7，1.76Hz，1H)1.93-2.13(m，3H)1.73-1.94(m，2H)1.55-1.71(m，1H)0.66-1.04(m，10H)。
中间体108：((1S)-2-甲基-1-{[(2S)-2-(4-{4′-[({[2-((2S)-3-甲基 -2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-8，8-二氧代-8-硫杂-2-氮杂螺[4.5]癸 -3-基]羰基}氨基)乙酰基]-4-联苯基}-1H-咪唑-2-基)-1-吡咯烷基]羰基} 丙基)氨基甲酸甲酯
Figure BPA00001516471500482
以与实施例15中所述的类似方式由2-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}-8-硫杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-3-甲酸8，8-二氧化物(107)(100mg，0.26mmol)和{(1S)-1-[((25)-2-{4-[4′-(氨基乙酰基)-4-联苯基]-1H-咪唑-2-基}-1-吡咯烷基)羰基]-2-甲基丙基}氨基甲酸甲酯二盐酸盐(1)(148mg，0.26mmol)以49％的产率制备。
实施例17：[(1S)-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[8，8-二氟-2-((2S)-3-甲基 -2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-2-氮杂螺[4.5]癸-3-基]-1H-味唑-4- 基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰基)-2-甲基丙基]氨基甲 酸甲酯
Figure BPA00001516471500491
将乙酸铵(540mg，6.9mmol)和(3S)-8，8-二氟-2-((2S)-3-甲基-2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-2-氮杂螺[4.5]癸烷-3-甲酸2-{4′-[({[(2S)-1-((2S)-3-甲基-2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-2-吡咯烷基]羰基}氧基)乙酰基]-4-联苯基}-2-氧代乙酯(中间体117)(307mg，0.35mmol)在无水二
Figure BPA00001516471500492
烷(3.5mL)中的溶液用氮气脱气并在密封管中加热到110℃历时3小时。将反应物冷却到室温且在EtOAc和饱和NaHCO3(各35mL)分配，将有机层用盐水洗涤，干燥(MgSO4)并真空浓缩。残余物通过C18逆相色谱以10-100％乙腈/水/0.2％NH4OH洗脱来纯化以提供作为黄色固体的标题化合物(235mg，产率80％)。1H NMR(400MHz，METHANOL-d4).ppm 7.69-7.82(m，3H)7.63(br.s.，5H)7.17-7.37(m，2H)5.03-5.19(m，1H)4.20(br.s.，1H)4.06-4.16(m，1H)3.96(br.s.，1H)3.85(br.s.，1H)3.62(d，J＝3.1Hz，6H)2.24-2.38(m，3H)2.15(br.s.，3H)1.85-2.09(m，8H)1.77-1.85(m，2H)1.53-1.76(m，3H)0.96(br.s.，4H)0.87(d，J＝6.3Hz，12H).HRMS C45H57N8O6F2(M+H)+计算值：843.4369，实测值：843.4371.Purity(LC-MS)：97％。
制备中间体70
Figure BPA00001516471500501
中间体60：
将(2S)-2-{[((2S)-2-{[(1，1-二甲基乙基)氧基]羰基}-1-吡咯烷基)羰基]氨基}-3-甲基丁酸(24.57g，143mmol)和N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酸(25.1g，143mmol)溶解于DCM(50mL)中。加入DIPEA(75mL，430mmol)和HOBT(21.97g，143mmol)。5分钟之后，加入EDC(27.5g，143mmol)。将反应物在室温下搅拌3小时。用水(50mL)稀释且加入1N HCl(1mL)。将沉淀物滤出且将有机层/水层经疏水玻璃料过滤并浓缩以干燥以提供42.92g无色油。
中间体61：
将N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基-L-脯氨酸1，1-二甲基乙酯(61g，186mmol)溶解于HCl(50mL，1646mmol)中(150mL的4M溶液)并搅拌5小时。浓缩至干燥以提供47.9g作为浅黄色粘稠泡沫的产物。
中间体70
将1，1′-(4，4′-联苯二基)双(2-溴乙酮)(37.8g，95mmol)溶解于DMF(800mL)中并脱气15分钟(N2)。将中间体61(21.99g，81mmol)溶解于DMF(100mL)中，接着在氮气下经15分钟谨慎地加入NaH(2.94g，73.4mmol，60％在油中)。在氮气下将溶液搅拌15分钟，随后经15分钟逐滴缓慢加到1，1′-(4，4′-联苯二基)双(2-溴乙酮)的溶液中，接着在室温下搅拌1小时。随后使溶剂体积减少至约100mL并冷却到20℃。缓慢加入100mL水且将所得微灰黄色固体过滤并用水(200mL)、己烷(200mL)洗涤并在真空下干燥(12小时)。将粗化合物在500g硅胶上用己烷/乙酸乙酯(梯度从50％增加到100％EA)上纯化，产生14.5g(37.3％)中间体70。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 8.11(dd，J＝12.0，8.5Hz，4H)7.96(d，J＝8.4Hz，4H)7.41(d，J＝8.4Hz，1H)5.43-5.75(m，2H)4.99(s，2H)4.53(dd，J＝8.6，4.7Hz，1H)4.03(t，J＝8.6Hz，1H)3.76-3.90(m，1H)3.60-3.73(m，1H)3.53(s，3H)2.22-2.37(m，1H)2.12-2.21(m，1H)1.85-2.06(m，3H)0.90(dd，J＝10.7，6.6Hz，6H)。
制备中间体117
Figure BPA00001516471500511
中间体110：8-{[(1，1-二甲基乙基)(二甲基)甲硅烷基]氧基}-2-氮杂 螺[4.5]癸烷-3-甲酸乙酯
Figure BPA00001516471500521
该化合物以与实施例15类似的方式由4-{[(1，1-二甲基乙基)(二甲基)甲硅烷基]氧基}环己烷甲醛(顺式异构体/反式异构体的混合物)(7.35g，30.3mmol)作为外消旋物以98％的产率得到。
中间体111：8-{[(1，1-二甲基乙基)(二甲基)甲硅烷基]氧基}-2-氮杂 螺[4.5]癸烷-2，3-二甲酸3-乙酯2-(苯基甲基)酯
Figure BPA00001516471500522
向8-{[(1，1-二甲基乙基)(二甲基)甲硅烷基]氧基}-2-氮杂螺[4.5]癸烷-3-甲酸乙酯(110)(10.61g，31.3mmol)溶解于干燥DCM的溶液中加入三乙胺(10.8mL，78mmol)，将其冷却到0℃，接着加入Cbz-Cl(6.2mL，43.5mmol)，且将反应物在0℃下搅拌5分钟，在室温下搅拌1小时。将反应物用DCM(700mL)稀释，用0.1N HCl(700mL)洗涤，干燥(MgSO4)且真空浓缩。残余物通过硅胶色谱以10-60％己烷/EtOAc洗脱来纯化以提供作为黄色油的标题化合物(5.73g，产率39％)。
中间体112：8-羟基-2-氮杂螺[4.5]癸烷-2，3-二甲酸3-乙酯2-(苯基 甲基)酯
Figure BPA00001516471500531
向8-{[(1，1-二甲基乙基)(二甲基)甲硅烷基]氧基}-2-氮杂螺[4.5]癸烷-2，3-二甲酸3-乙酯2-(苯基甲基)酯(111)(5.73g，12.05mmol)在THF(60mL)中的溶液中加入冰乙酸(1.38mL，24.0mmol)，接着加入作为在THF中的1M溶液的TBAF(24mL)。将反应物在室温下搅拌72小时。将反应物在EtOAc和水(各250mL)之间分配，将有机层分离，用饱和NaHCO3(100mL)洗涤，干燥(MgSO4)并真空浓缩。通过TLC发现反应不完全。将残余物溶解于干燥THF(60mL)中，冷却到0℃并用HF-吡啶(1.6mL，18.0mmol)处理，升温至室温并在氮气下搅拌2小时。将反应物注入饱和NaHCO3(100mL)中，加入固体碳酸钾，直至气体逸出停止。用EtOAc(2×150mL)萃取，将有机层合并，用0.1N HCl(100mL)洗涤，干燥(MgSO4)并真空浓缩从而以定量产率提供作为黄色油的标题化合物，其不经额外纯化而用于随后反应。
中间体113：8-氧代-2-氮杂螺[4.5]癸烷-2，3-二甲酸3-乙酯2-(苯基 甲基)酯I
Figure BPA00001516471500532
向8-羟基-2-氮杂螺[4.5]癸烷-2，3-二甲酸3-乙酯2-(苯基甲基)酯(112)(4.36g，120.05mmol)在干燥DCM(60mL)中的溶液中加入戴斯-马丁高价碘化物(10.22g，24.1mmol)且将反应物在室温下在氮气下搅拌18小时。将反应物注入10％硫代硫酸钠水溶液(150mL)和饱和NaHCO3水溶液(150mL)中并搅拌10分钟。用DCM(2×150mL)萃取，干燥(MgSO4)并真空浓缩。残余物通过硅胶色谱以25-80％己烷/EtOAc洗脱来纯化以提供作为浅黄色油的标题化合物(2.89g，产率67％)。
中间体114：(3S)-8，8-二氟-2-氮杂螺[4.5]癸烷-2，3-二甲酸3-乙酯 2-(苯基甲基)酯
Figure BPA00001516471500541
向8-氧代-2-氮杂螺[4.5]癸烷-2，3-二甲酸3-乙酯2-(苯基甲基)酯(113)(2.89g，7.13mmol)在无水CH2Cl2(50mL)中的溶液中加入Deoxo-Fluor(2.2mL，12.1mmol)，接着加入催化量的乙醇且将反应物在室温下在氮气下搅拌。在2.5小时之后，将反应物注入饱和NaHCO3(150mL)中，搅拌10分钟。用DCM(2×150mL)萃取，将有机层用0.1NHCl(100mL)洗涤，干燥(MgSO4)并真空浓缩以提供作为黄色油的所需化合物(3.01g)，发现其被(3S)-8-氟-2-氮杂螺[4.5]癸-7-烯-2，3-二甲酸3-乙酯2-(苯基甲基)酯以1∶1比率污染。将残余物溶解于干燥DCM(35mL)中，用mCPBA(77％，1.66g，7.45mmol)处理并在氮气下搅拌18小时。将反应物注入包含饱和NaHCO3(40mL)和10％硫代硫酸钠水溶液(40mL)中并搅拌10分钟。用DCM(100mL)萃取，干燥(MgSO4)并真空浓缩。残余物通过硅胶色谱以5-50％己烷/EtOAc洗脱来纯化。外消旋物随后通过手性HPLC在10μm OD管柱上以在己烷中的25％异丙醇洗脱来分离以提供作为澄清油的标题化合物(632mg，产率23％)。绝对构型通过振动圆二色光谱(VCD)测定。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 7.28-7.41(m，5H)4.98-5.23(m，2H)4.37(ddd，J＝19.3，8.1，8.0Hz，1H)4.22(q，J＝7.2Hz，1H)3.93-4.12(m，1H)3.45-3.70(m，1H)3.36(dd，J＝10.8，2.0Hz，1H)2.22(dd，J＝12.8，8.5Hz，1H)1.79-2.03(m，4H)1.59-1.78(m，4H)1.56(br.s.，1H)1.28(t，J＝7.1Hz，1H)1.22(d，J＝6.1Hz，1H)1.13(t，J＝7.1Hz，1H).LC-MS ESI(M+H)+＝381.68。
中间体115：(3S)-8，8-二氟-2-氮杂螺[4.5]癸烷-3-甲酸乙酯
Figure BPA00001516471500551
向(3S)-8，8-二氟-2-氮杂螺[4.5]癸烷-2，3-二甲酸3-乙酯2-(苯基甲基)酯(114)(630mg，1.65mmol)在绝对乙醇(12mL)中的溶液中加入在碳(65mg)上的20％Pd(OH)2且反应物在Fisher-Porter设备上在60psi下氢化18小时。反应物经硅藻土过滤并真空浓缩以提供作为澄清油的标题化合物(380mg，产率93％)。
中间体116：(3S)-8，8-二氟-2-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}-2- 氮杂螺[4.5]癸烷-3-甲酸
Figure BPA00001516471500552
向(3S)-8，8-二氟-2-氮杂螺[4.5]癸烷-3-甲酸乙酯(115)(380mg，1.54mmol)在无水CH2Cl2(10mL)中的溶液中加入HATU(614mg，1.6mmol)、N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酸(283mg，1.6mmol)、接着加入三乙胺(0.43mL，3.1mmol)且将反应物在室温下在氮气下搅拌1小时。将反应物真空浓缩且残余物通过硅胶色谱以15-80％己烷/EtOAc洗脱来纯化。将适当级分合并并真空浓缩。将残余物溶解于THF/水/甲醇(5mL/2.5mL/2.5mL)中，加入氢氧化锂单水合物(119mg，2.8mmol)且将溶液在室温下搅拌30分钟。将反应物用1N HCl(3.5mL)处理并在EtOAc和水(各50mL)之间分配。将水层用乙酸乙酯(50mL)萃取，将有机层合并并干燥(MgSO4)且真空浓缩。将残余物在乙醚中湿磨且真空浓缩以提供作为白色固体的标题化合物(542mg，产率93％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 12.47(br.s.，1H)7.41(d，J＝8.0Hz，1H)4.24(t，J＝8.6Hz，1H)3.95-4.14(m，2H)3.52(s，3H)3.25-3.33(m，1H)2.22(dd，J＝12.3，8.4Hz，1H)1.79-2.11(m，5H)1.58-1.77(m，3H)1.41-1.59(m，2H)0.93(dd，J＝12.7，6.6Hz，6H).LC-MS ESI(M+H)+＝377.23。
中间体117：(3S)-8，8-二氟-2-((2S)-3-甲基-2-{[(甲氧基)羰基]氨基} 丁酰基)-2-氮杂螺[4.5]癸烷-3-甲酸2-{4′-[({[(2S)-1-((2S)-3-甲基-2-{[(甲 氧基)羰基]氨基}丁酰基)-2-吡咯烷基]羰基}氧基)乙酰基]-4-联苯 基}-2-氧代乙酯
向(3S)-8，8-二氟-2-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}-2-氮杂螺[4.5]癸烷-3-甲酸(116)(168mg，0.45mmol)和N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基-L-脯氨酸2-[4′-(溴乙酰基)-4-联苯基]-2-氧代乙酯(70)(250mg，0.43mmol)在无水乙腈(2mL)中的溶液中加入三乙胺(0.09mL，0.64mmol)且将反应物在室温下在氮气下搅拌1小时。将反应物在EtOAc和0.1N HCl(各30mL)之间分配，将有机层用盐水洗涤，干燥(MgSO4)并真空浓缩。残余物通过硅胶色谱以65-100％己烷/EtOAc洗脱来纯化以提供作为灰白色固体的标题化合物(309mg，产率82％)。
实施例18：(4，4′-联苯二基双{1H-咪唑-4，2-二基(3S)-8-氧杂-2-氮杂 螺[4.5]癸烷-3，2-二基[(2S)-3-甲基-1-氧代-1，2-丁二基]})双氨基甲酸二 甲酯
Figure BPA00001516471500571
向冷却到0℃的(3S，3′S)-3，3′-[4，4′-联苯二基双(1H-咪唑-4，2-二基)]双(8-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-2-甲酸苯基甲酯)(119)(210mg，0.25mmol)在三氟乙酸(2mL)中的溶液中加入三氟甲烷磺酸(0.13mL)且将反应物升温至室温且搅拌30分钟。将反应物真空浓缩并旋转蒸发。使残余物从甲苯中旋转蒸发出来且将残余物悬浮在二氯甲烷(3mL)中并用4N在二
Figure BPA00001516471500572
烷中的HCl(0.65mL)处理。将反应物真空浓缩并在乙醚中湿磨且过滤以得到棕色固体。
向该固体在无水DMF(2.5mL)中的溶液中加入N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酸(88mg，0.5mmol)、HATU(183mg，0.48mmol)和三乙胺(0.4mL，2.88mmol)且将反应物在室温下搅拌1小时。粗反应混合物通过HPLC以10-90％乙腈/水/0.2％NH4OH洗脱来纯化以提供作为浅黄色固体的标题化合物(79mg，产率37％)。1H NMR(400MHz，METHANOL-d4)δppm 7.60-7.79(m，10H)7.33(s，2H)5.11(dd，J＝9.9，7.9Hz，2H)4.30(d，J＝10.2Hz，2H)4.17(d，J＝8.2Hz，2H)3.70-3.87(m，6H)3.56-3.71(m，10H)2.40(dd，J＝12.9，7.8Hz，2H)2.13(dd，J＝12.6，10.3Hz，2H)1.88-2.00(m，2H)1.70-1.84(m，4H)1.46-1.69(m，6H)0.83-0.97(m，12H).HRMS C48H63N8O8(M+H)+计算值：879.4769，实测值：879.4769。纯度(LC-MS)：98％。
制备中间体119
Figure BPA00001516471500581
中间体118：3，3′-[4，4′-联苯二基双(2-氧代-2，1-乙二基)]2，2′-双(苯 基甲基)(3S，3′S)双(-8-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-2，3-二甲酸酯)
Figure BPA00001516471500582
向1，1′-(4，4′-联苯二基)双(2-溴乙酮)(155mg，0.39mmol)和(3S)-2-{[(苯基甲基)氧基]羰基}-8-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-3-甲酸(121)(275mg，0.86mmol)在无水乙腈(4mL)中的溶液中加入三乙胺(0.19mL，1.4mmol)且将溶液在室温下在氮气下搅拌3.5小时。将反应物在EtOAc和0.1N HCl(各40mL)之间分配，将有机层用盐水洗涤，干燥(MgSO4)并真空浓缩。残余物通过硅胶色谱以20-100％己烷/EtOAc洗脱来纯化以提供作为白色固体的标题化合物(225mg，产率66％)。
中间体119：(3S，3′S)-3，3′-[4，4′-联苯二基双(1H-咪唑-4，2-二基)]双 (8-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-2-甲酸苯基甲酯)
Figure BPA00001516471500591
向3，3′-[4，4′-联苯二基双(2-氧代-2，1-乙二基)]2，2′-双(苯基甲基)(3S，3′S)双(-8-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-2，3-二甲酸酯)(118)(225mg，0.26mmol)在二
Figure BPA00001516471500592
烷(3.5mL)中的溶液中加入乙酸铵(318mg，4.1mmol)。将反应物用氮气脱气且在密封管中加热到110℃历时18小时。将反应物在EtOAc和饱和NaHCO3(各35mL)之间分配，将有机层用盐水洗涤，干燥(MgSO4)并真空浓缩从而以定量产率提供标题化合物。
制备中间体121
Figure BPA00001516471500593
中间体120：(3S)-8-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-2，3-二甲酸3-乙酯 2-(苯基甲基)酯
Figure BPA00001516471500594
将8-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-3-甲酸乙酯(3.54g，16.6mmol)溶解于干燥二氯甲烷(80mL)中，加入三乙胺(5.8mL，41.5mmol)，接着加入氯甲酸苄酯(3.5mL，24.9mmol)且将反应物在室温下在氮气下搅拌2小时。将反应物用二氯甲烷稀释，用0.2N HCl洗涤，经MgSO4干燥并真空浓缩。残余物通过硅胶色谱以20-100％己烷/EtOAc洗脱来纯化以提供黄色油。外消旋物随后通过手性HPLC在10μm OD管柱上以在己烷中的25％异丙醇洗脱来分离以提供作为澄清油的标题化合物(1.66g，产率29％)。
中间体121：(3S)-2-{[苯基甲基)氧基]羰基}-8-氧杂-2-氮杂螺[4.5] 癸烷-3-甲酸
向(3S)-8-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-2，3-二甲酸3-乙酯2-(苯基甲基)酯(120)(300mg，0.86mmol)在THF/水/甲醇(3mL/1.5mL/1.5mL)中的溶液中加入氢氧化锂单水合物(72mg，1.7mmol)且将反应物在室温下搅拌30分钟。将反应物用1N HCl(mL)处理且使其在EtOAc和水之间分配。将水层用EtOAc萃取且有机层经MgSO4干燥并真空浓缩从而以定量产率提供标题化合物。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm12.54-12.93(m，1H)7.21-7.47(m，5H)4.90-5.20(m，2H)4.11-4.41(m，1H)3.44-3.70(m，5H)3.24(dd，J＝15.0，11.7Hz，1H)2.32(td，J＝13.6，8.5Hz，1H)1.73(ddd，J＝16.8，12.9，7.2Hz，1H)1.38-1.64(m，4H).LC-MS ESI(M-H)-＝318.19。
实施例19：2-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰 基}-3-(4-{4′-[2-((2S)-1-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}-2-吡咯烷 基)-1H-咪唑-4-基]-4-联苯基}-1H-咪唑-2-基)-2，8-二氮杂螺[4.5]癸烷 -8-甲酸1，1-二甲基乙酯
Figure BPA00001516471500611
将2-((2S)-3-甲基-2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-3-({[2-(4′-{2-[(2S)-1-((2S)-3-甲基-2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-2-吡咯烷基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-2-氧代乙基]氨基}羰基)-2，8-二氮杂螺[4.5]癸烷-8-甲酸1，1-二甲基乙酯(134)(126mg，0.14mmol)和乙酸铵(105mg，1.4mmol)在无水二
Figure BPA00001516471500612
烷(1.5mL)中的溶液用氮气脱气并在密封管中加热到110℃历时18小时。将反应物真空浓缩且通过HPLC以10-90％乙腈/水/0.2％NH4OH洗脱来纯化以提供作为褐色固体的标题化合物(84mg，产率68％)。1H NMR(400MHz，METHANOL-d4)δppm 7.56-7.87(m，10H)7.31(br.s.，2H)5.04-5.23(m，1H)4.11-4.32(m，2H)3.93-4.04(m，1H)3.80-3.92(m，1H)3.63(s，6H)3.33-3.61(m，6H)1.86-2.49(m，9H)1.68(br.s.，1H)1.56(br.s.，2H)1.37-1.49(m，9H)0.81-1.08(m，15H).HRMS C49H65N9O8(M+H)+计算值：908.5034，实测值：908.5031。纯度(LC-MS)：93％。
制备中间体134
Figure BPA00001516471500621
中间体131：2，8-二氮杂螺[4.5]癸烷-3，8-二甲酸8-(1，1-二甲基乙 基)酯3-乙酯
Figure BPA00001516471500622
该化合物遵循在WO 98/08850第50页中概述的程序由14-甲酰基-1-哌啶甲酸1-二甲基乙酯作为外消旋物得到。
中间体132：2-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}-2，8-二氮杂螺[4.5] 癸烷-3，8-二甲酸8-(1，1-二甲基乙基)酯3-乙酯
Figure BPA00001516471500623
向2，8-二氮杂螺[4.5]癸烷-3，8-二甲酸酯8-(1，1-二甲基乙基)酯3-乙酯(131)(150mg，0.48mmol)、HATU(183mg，0.48mmol)和N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酸(93mg，0.53mmol)在无水CH2Cl2(4mL)中的溶液中加入许尼希碱(0.17mL，0.96mmol)且将反应物在室温下在氮气下搅拌2小时。将反应物真空浓缩并通过硅胶色谱以15-80％己烷/EtOAc洗脱来纯化以提供作为浅黄色油的标题化合物(125mg，产率55％)。
中间体133：8-{[(1，1-二甲基乙基)氧基]羰基}-2-{N-[(甲氧基)羰 基]-L-缬氨酰基}-2，8-二氮杂螺[4.5]癸烷-3-甲酸
Figure BPA00001516471500631
向2-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}-2，8-二氮杂螺[4.5]癸烷-3，8-二甲酸8-(1，1-二甲基乙基)酯3-乙酯(132)(125mg，0.27mmol)在THF/水/甲醇(1.2mL/0.6mL/0.6mL)中的溶液中加入氢氧化锂单水合物(22mg，0.53mmol)且将反应物在室温下搅拌1.5小时。将反应物用1NHCl(0.5mL)处理且使其在EtOAc和0.1N HCl(各10mL)之间分配并将水层用EtOAc(10mL)萃取。将有机层合并，干燥(MgSO4)并真空浓缩以提供作为白色固体的标题化合物(107mg，产率91％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 12.29-12.54(m，1H)7.08-7.44(m，1H)4.47(t，J＝5.4Hz，1H)4.13-4.30(m，1H)3.86-4.13(m，3H)3.45-3.58(m，3H)3.16-3.27(m，2H)2.64(br.s.，1H)2.15-2.31(m，1H)1.81-1.95(m，1H)1.43-1.67(m，3H)1.29-1.43(m，11H)0.69-1.03(m，6H).LC-MS ESI(M-H)-＝440.59。
中间体134：2-((2S)-3-甲基-2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰 基)-3-({[2-(4′-{2-[(2S)-1-((2S)-3-甲基-2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰 基)-2-吡咯烷基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-2-氧代乙基]氨基}羰 基)-2，8-二氮杂螺[4.5]癸烷-8-甲酸1，1-二甲基乙酯
Figure BPA00001516471500632
向8-{[(1，1-二甲基乙基)氧基]羰基}-2-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}-2，8-二氮杂螺[4.5]癸烷-3-甲酸(133)(106mg，0.24mmol)、HATU(91mg，0.24mmol)和{(1S)-1-[((2S)-2-{4-[4′-(氨基乙酰基)-4-联苯基]-1H-咪唑-2-基}-1-吡咯烷基)羰基]-2-甲基丙基}氨基甲酸甲酯二盐酸盐(1)(138mg，0.24mmol)在无水CH2Cl2(4mL)中的溶液中加入许尼希碱(0.17mL，0.96mmol)且将反应物在室温下在氮气下搅拌1小时。将反应物真空浓缩且通过HPLC以10-90％乙腈/水/0.2％NH4OH洗脱来纯化以提供作为灰白色固体的标题化合物(129mg，产率58％)。
实施例20：[(1S)-2-甲基-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[2-((2S)-3-甲基 -2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-2，8-二氮杂螺[4.5]癸-3-基]-1H-咪唑 -4-基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰基)丙基]氨基甲酸甲 酯
Figure BPA00001516471500641
向2-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}-3-(4-{4′-[2-((2S)-1-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}-2-吡咯烷基)-1H-咪唑-4-基]-4-联苯基}-1H-咪唑-2-基)-2，8-二氮杂螺[4.5]癸烷-8-甲酸1，1-二甲基乙酯(68mg，0.08mmol)在无水CH2Cl2(1mL)中的溶液中加入三氟乙酸(0.3mL)且将反应物在室温下搅拌2小时。将反应物真空浓缩且通过HPLC以10-90％乙腈/水/0.2％NH4OH洗脱来纯化以提供作为褐色固体的标题化合物(49mg，产率81％)。1H NMR(400MHz，METHANOL-d4)δ.ppm7.56-7.83(m，10H)7.31(br.s.，2H)5.00-5.22(m，2H)4.12-4.30(m，3H)4.01(br.s.，1H)3.80-3.91(m，1H)3.57-3.70(m，6H)2.76-3.07(m，4H)1.89-2.48(m，10H)1.69-1.81(m，1H)1.61(br.s.，2H)0.82-1.09(m，15H).HRMS C44H58N9O6(M+H)+计算值：808.4510，实测值：808.4509。纯度(LC-MS)：94％。
实施例21：[(1S)-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[8-乙酰基-2-((2S)-3-甲基 -2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-2，8-二氮杂螺[4.5]癸-3-基]-1H-咪唑 -4-基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰基)-2-甲基丙基]氨基 甲酸甲酯
Figure BPA00001516471500651
向[(1S)-2-甲基-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[2-((2S)-3-甲基-2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-2，8-二氮杂螺[4.5]癸-3-基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰基)丙基]氨基甲酸甲酯(实施例20)(19mg，0.02mmol)在无水CH2Cl2(0.5mL)中的溶液中加入三乙胺(0.016mL，0.12mmol)，接着加入乙酰氯(0.01mL，0.14mmol)且将反应物在室温下搅拌1小时。将反应物真空浓缩并溶解于甲醇(0.7mL)中，向其中加入碳酸钾(30mg，0.22mmol)且将反应物在室温下搅拌2小时。将反应物真空浓缩且使其在CH2Cl2和水(各3mL)之间分配，且将水层用CH2Cl2(3mL)萃取且将有机层合并，干燥(MgSO4)并真空浓缩以提供作为黄色固体的标题化合物(18mg，产率90％)。1H NMR(400MHz，METHANOL-d4)δppm 7.54-7.88(m，10H)7.32(br.s.，2H)5.05-5.23(m，2H)4.03-4.34(m，2H)3.71-4.03(m，3H)3.56-3.71(m，8H)3.34-3.56(m，2H)2.14-2.46(m，4H)1.89-2.14(m，6H)1.46-1.83(m，4H)1.19-1.32(m，2H)0.78-1.07(m，14H).HRMS C46H60N9O7(M+H)+计算值：850.4616，实测值：850.4617。纯度(LC-MS)：94％。
实施例22：2-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰 基}-3-(4-{4′-[2-((2S)-1-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}-2-吡咯烷 基)-1H-咪唑-4-基]-4-联苯基}-1H-咪唑-2-基)-2，8-二氮杂螺[4.5]癸烷 -8-甲酸甲酯
Figure BPA00001516471500661
向[(1S)-2-甲基-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[2-((2S)-3-甲基-2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-2，8-二氮杂螺[4.5]癸-3-基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰基)丙基]氨基甲酸甲酯(实施例20)(19mg，0.02mmol)在无水CH2Cl2(0.5mL)中的溶液中加入三乙胺(0.016mL，0.12mmol)，接着加入乙酰氯(0.011mL，0.14mmol)且将反应物在室温下搅拌1小时。将反应物真空浓缩并溶解于甲醇(0.7mL)中，向其中加入碳酸钾(30mg，0.22mmol)且将反应物在室温下搅拌2小时。将反应物真空浓缩且使其在CH2Cl2和水(各3mL)之间分配，且将水层用CH2Cl2(3mL)萃取且将有机层合并，干燥(MgSO4)并真空浓缩以提供作为黄色固体的标题化合物(15mg，产率74％)。1H NMR(400MHz，METHANOL-d4)δppm 7.51-7.92(m，10H)7.32(br.s.，2H)5.02-5.25(m，1H)4.03-4.31(m，2H)3.75-4.05(m，2H)3.61-3.72(m，7H)3.34-3.60(m，4H)1.82-2.50(m，7H)1.70(br.s.，2H)1.44-1.63(m，4H)1.27(br.s.，4H)0.77-1.10(m，14H).HRMS C46H60N9O8(M+H)+计算值：866.4565，实测值：850.4564。纯度(LC-MS)：96％。
实施例23：6-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰 基}-7-(4-{4′-[2-((2S)-1-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}-2-吡咯烷 基)-1H-咪唑-4-基]-4-联苯基}-1H-咪唑-2-基)-2，6-二氮杂螺[3.4]辛烷 -2-甲酸1，1-二甲基乙酯
Figure BPA00001516471500671
将6-((2S)-3-甲基-2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-7-({[2-(4′-{2-[(2S)-1-((2S)-3-甲基-2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-2-吡咯烷基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-2-氧代乙基]氨基}羰基)-2，6-二氮杂螺[3.4]辛烷-2-甲酸1，1-二甲基乙酯(148)(400mg，0.45mmol)和乙酸铵(343mg，4.5mmol)在无水二
Figure BPA00001516471500672
烷(5mL)中的溶液用氮气脱气且在密封管中加热到110℃历时18小时。将反应物用EtOAc稀释，过滤并真空浓缩。残余物通过C18逆相色谱以10-100％乙腈/水/0.2％NH4OH洗脱来纯化以提供作为浅黄色固体的标题化合物(315mg，产率80％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 11.63-12.35(m，1H)7.47-7.92(m，9H)7.19-7.42(m，1H)5.08(br.s.，2H)3.94-4.23(m，4H)3.62-3.93(m，7H)3.56(s，6H)2.24-2.45(m，2H)2.14(br.s.，2H)1.77-2.07(m，6H)1.37(d，J＝5.5Hz，9H)0.76-1.02(m，12H).HRMS C47H62N9O8(M+H)+计算值：880.4721，实测值：880.4725。纯度(LC-MS)：95％。
制备中间体148
Figure BPA00001516471500673
中间体145：2，6-二氮杂螺[3.4]辛烷-2，7-二甲酸2-(1，1-二甲基乙 基)酯7-乙酯
Figure BPA00001516471500681
该化合物以在实施例19中对于中间体131类似的方式由3-甲酰基-1-吖丁啶甲酸1，1-二甲基乙酯(650mg，3.5mmol)以93％的产率制备。
中间体146：6-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}-2，6-二氮杂螺[3.4] 辛烷-2，7-二甲酸2-(1，1-二甲基乙基)酯7-乙酯
向2，6-二氮杂螺[3.4]辛烷-2，7-二甲酸2-(1，1-二甲基乙基)酯7-乙酯(145)(500mg，1.76mmol)、HATU(735mg，1.93mmol)和N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酸(339mg，1.93mmol)在无水CH2Cl2(10mL)中的溶液中加入许尼希碱(0.68mL，3.87mmol)且将反应物在室温下在氮气下搅拌2小时。将反应物真空浓缩且通过C18反相色谱以10-90％ACN/水/0.2％NH4OH洗脱来纯化以提供作为灰白色固体的标题化合物(398mg，产率51％)。
中间体147：2-{[(1，1-二甲基乙基)氧基]羰基}-6-{N-[(甲氧基)羰 基]-L-缬氨酰基}-2，6-二氮杂螺[3.4]辛烷-7-甲酸
向6-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}-2，6-二氮杂螺[3.4]辛烷-2，7-二甲酸2-(1，1-二甲基乙基)酯7-乙酯(146)(344mg，0.78mmol)在THF/水/甲醇(3mL/1.5mL/1.5mL)中的溶液中加入氢氧化锂单水合物(65mg，1.56mmol)且将反应物在室温下搅拌1.5小时，由此将其用1NHCl(1.5mL)处理。使反应物在EtOAc和水(各30mL)之间分配，将水层用EtOAc(30mL)萃取，将有机层合并，干燥(MgSO4)并真空浓缩以提供作为白色固体的标题化合物(245mg，产率76％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 12.46(br.s.，1H)7.06-7.66(m，1H)4.13-4.32(m，1H)3.88-4.12(m，2H)3.56-3.89(m，5H)3.39-3.57(m，3H)2.24-2.45(m，1H)1.99-2.19(m，1H)1.80-1.95(m，1H)1.26-1.44(m，9H)0.56-1.00(m，6H).LC-MS ESI(M-H)-＝412.41。
中间体148：6-((2S)-3-甲基-2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰 基)-7-({[2-(4′-{2-[(2S)-1-((2S)-3-甲基-2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰 基)-2-吡咯烷基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-2-氧代乙基]氨基}羰 基)-2，6-二氮杂螺[3.4]辛烷-2-甲酸1，1-二甲基乙酯
Figure BPA00001516471500691
向2-{[(1，1-二甲基乙基)氧基]羰基}-6-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}-2，6-二氮杂螺[3.4]辛烷-7-甲酸(147)(245mg，0.59mmol)、HATU(225mg，0.59mmol)和{(1S)-1-[((2S)-2-{4-[4′-(氨基乙酰基)-4-联苯基]-1H-咪唑-2-基}-1-吡咯烷基)羰基]-2-甲基丙基}氨基甲酸甲酯二盐酸盐(1)(342mg，0.59mmol)在无水CH2Cl2(6mL)中的溶液中加入许尼希碱(0.41mL，2.37mmol)且将反应物在室温下在氮气下搅拌1小时。将反应物真空浓缩且通过C18逆相色谱以10-100％乙腈/水/0.2％NH4OH洗脱来纯化以提供作为灰白色固体的标题化合物(400mg，产率75％)。
实施例24：[(1S)-2-甲基-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[6-((2S)-3-甲基 -2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-2，6-二氮杂螺[3.4]辛-7-基]-1H-咪唑 -4-基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰基)丙基]氨基甲酸甲 酯
Figure BPA00001516471500701
该化合物以与实施例20类似的方式由6-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}-7-(4-{4′-[2-((2S)-1-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}-2-吡咯烷基)-1H-咪唑-4-基]-4-联苯基}-1H-咪唑-2-基)-2，6-二氮杂螺[3.4]辛烷-2-甲酸1，1-二甲基乙酯(298mg，0.34mmol)制备以提供作为黄色固体的标题化合物(203mg，产率77％)。1H NMR(400MHz，METHANOL-d4)δppm 7.43-7.86(m，8H)7.04-7.42(m，2H)5.20-5.41(m，1H)5.01-5.19(m，2H)4.30-4.43(m，1H)4.12-4.27(m，3H)3.78-4.03(m，5H)3.65-3.78(m，4H)3.61-3.64(m，6H)3.39-3.52(m，1H)2.54-2.77(m，1H)2.38-2.54(m，1H)2.09-2.39(m，2H)1.89-2.13(m，4H)0.81-1.13(m，12H).HRMS C42H54N9O6(M+H)+计算值：780.4197，实测值：780.4200。纯度(LC-MS)：96％。
实施例25：[(1S)-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[2-乙酰基-6-((2S)-3-甲基 -2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-2，6-二氮杂螺[3.4]辛-7-基]-1H-咪唑 -4-基}-4-联苯基)-1H-味唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰基)-2-甲基丙基]氨基 甲酸甲酯
该化合物以与实施例21类似的方式由[(1S)-2-甲基-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[6-((2S)-3-甲基-2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-2，6-二氮杂螺[3.4]辛-7-基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰基)丙基]氨基甲酸甲酯(实施例24)(40mg，0.05mmol)制备以提供作为黄色固体的标题化合物(35mg，产率83％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 11.67-12.33(m，1H)7.19-7.99(m，12H)5.07(br.s.，1H)3.92-4.25(m，4H)3.67-3.94(m，4H)3.45-3.66(m，8H)2.20-2.46(m，3H)2.17(br.s.，2H)1.80-2.06(m，5H)1.60-1.82(m，3H)0.78-1.02(m，12H).HRMS C44H56N9O7(M+H)+计算值：822.4303，实测值：822.4300。纯度(LC-MS)：91％。
实施例26：6-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰 基}-7-(4-{4′-[2-((2S)-1-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}-2-吡咯烷 基)-1H-咪唑-4-基]-4-联苯基}-1H-咪唑-2-基)-2，6-二氮杂螺[3.4]辛烷 -2-甲酸甲酯
Figure BPA00001516471500711
该化合物以与实施例22类似的方式由[(1S)-2-甲基-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[6-((2S)-3-甲基-2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-2，6-二氮杂螺[3.4]辛-7-基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰基)丙基]氨基甲酸甲酯(实施例24)(40mg，0.05mmol)制备以提供作为黄色固体的标题化合物(37mg，产率87％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 11.38-12.37(m，1H)7.58-7.93(m，8H)7.19-7.59(m，3H)4.93-5.17(m，1H)3.63-4.22(m，7H)3.45-3.64(m，6H)2.24-2.48(m，4H)2.08(br.s.，4H)1.79-2.07(m，6H)0.99-1.18(m，1H)0.75-0.97(m，14H).HRMS C44H56N9O8(M+H)+计算值：838.4252，实测值：838.4252。纯度(LC-MS)：87％。
实施例27：[(1S)-2-甲基-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[2-[(甲基氨基)羰 基]-6-((2S)-3-甲基-2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-2，6-二氮杂螺[3.4] 辛-7-基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰基) 丙基]氨基甲酸甲酯
Figure BPA00001516471500721
向[(1S)-2-甲基-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[6-((2S)-3-甲基-2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-2，6-二氮杂螺[3.4]辛-7-基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰基)丙基]氨基甲酸甲酯(实施例24)(45mg，0.06mmol)在无水CH2Cl2(0.6mL)中的溶液中加入异氰酸甲酯(0.01mL，0.17mmol)，且将反应物在室温下搅拌2小时。真空除去溶剂，将残余物溶解于甲醇(1mL)中，加入碳酸钾(40mg，0.29mmol)且将反应物在室温下搅拌18小时。使反应物在CH2Cl2(10mL)和水(5mL)之间分配，将水层用CH2Cl2(5mL)萃取，将有机层合并，干燥(MgSO4)并真空浓缩以提供作为黄色固体的标题化合物(34mg，产率70％)。1HNMR(400MHz，METHANOL-d4)δppm 7.64(br.s.，10H)7.33(br.s.，2H)5.06-5.22(m，1H)4.03-4.46(m，3H)3.73-4.04(m，8H)3.54-3.73(m，6H)3.46(q，J＝7.0Hz，2H)2.52-2.76(m，5H)2.10-2.53(m，4H)2.02(br.s.，3H)0.70-1.09(m，12H).HRMS C44H57N10O7(M+H)+计算值：837.4412，实测值：838.4416。纯度(LC-MS)：91％。
实施例28：[(1S)-2-甲基-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[6-((2S)-3-甲基 -2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-2-(甲基磺酰基)-2，6-二氮杂螺[3.4]辛 -7-基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰基)丙 基]氨基甲酸甲酯
Figure BPA00001516471500731
向[(1S)-2-甲基-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[6-((2S)-3-甲基-2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-2，6-二氮杂螺[3.4]辛-7-基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰基)丙基]氨基甲酸甲酯(实施例24)(60mg，0.08mmol)在无水CH2Cl2(1mL)中的溶液中加入三乙胺(0.054mL，0.39mmol)，且将反应物冷却到0℃。加入甲磺酰氯(0.018mL，0.23mmol)且将反应物在0℃下搅拌15分钟。真空除去溶剂，将残余物溶解于甲醇(1mL)中，加入碳酸钾(80mg，0.58mmol)且将反应物在室温下搅拌1.5小时。使反应物在CH2Cl2(10mL)和水(10mL)之间分配，将有机层干燥(MgSO4)并真空浓缩以提供作为褐色固体的标题化合物(57mg，产率86％)1H NMR(400MHz，METHANOL-d4)δppm 7.50-7.86(m，10H)7.33(br.s.，2H)5.06-5.21(m，1H)4.04-4.26(m，2H)3.75-4.05(m，6H)3.56-3.72(m，6H)3.38-3.55(m，2H)2.84-3.04(m，3H)2.70-2.86(m，1H)2.40-2.64(m，1H)2.10-2.40(m，3H)1.83-2.09(m，2H)1.20-1.37(m，2H)1.07-1.20(m，2H)0.81-1.07(m，12H).HRMS C43H56N9O8S(M+H)+计算值：858.3973，实测值：858.3975。纯度(LC-MS)：86％。
实施例29：[(1S)-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[(7S)-2，2-二氟-6-((2S)-3-甲基 -2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-6-氮杂螺[3.4]辛-7-基]-1H-咪唑-4- 基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰基)-2-甲基丙基]氨基甲 酸甲酯
Figure BPA00001516471500741
向(7S)-2，2-二氟-6-((2S)-3-甲基-2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-6-氮杂螺[3.4]辛烷-7-甲酸2-{4′-[({[(2S)-1-((2S)-3-甲基-2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-2-吡咯烷基]羰基}氧基)乙酰基]-4-联苯基}-2-氧代乙酯(157)(102mg，0.12mmol)在无水二
Figure BPA00001516471500742
烷(1.2mL)中的溶液中加入乙酸铵(184mg，2.4mmol)且将反应物加热到110℃历时4小时。使反应物在EtOAc和饱和NaHCO3之间分配，将有机层用盐水洗涤，经MgSO4干燥并真空浓缩。残余物通过C18逆相色谱以10-100％乙腈/水/0.2％NH4OH洗脱来纯化以提供作为黄色固体的标题化合物(68mg，产率69％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 11.42-12.37(m，2H)7.56-7.90(m，8H)7.51(s，2H)7.19-7.46(m，2H)4.73-5.39(m，2H)3.91-4.23(m，3H)3.82(br.s.，2H)3.54(s，6H)2.55-2.86(m，4H)2.20-2.45(m，2H)2.14(br.s.，2H)1.73-2.09(m，5H)0.57-0.99(m，12H).HRMS C43H53N8O6F2(M+H)+计算值：815.4056，实测值：815.4059。纯度(LC-MS)：97％。
制备中间体157
Figure BPA00001516471500751
中间体150：2-{[(1，1-二甲基乙基)(二甲基)甲硅烷基]氧基}-6-氮杂 螺[3.4]辛烷-7-甲酸乙酯
该化合物以与110(实施例17)类似的方式由3-{[(1，1-二甲基乙基)(二甲基)甲硅烷基]氧基}环丁基甲醛(2.23g，10.4mmol)制备以提供作为黄色油的标题化合物(2.97g，产率92％)。
中间体151：2-{[(1，1-二甲基乙基)(二甲基)甲硅烷基]氧基}-6-氮杂 螺[3.4]辛烷-6，7-二甲酸7-乙酯6-(苯基甲基)酯
Figure BPA00001516471500761
该化合物以与111(实施例17)类似的方式由2-{[(1，1-二甲基乙基)(二甲基)甲硅烷基]氧基}-6-氮杂螺[3.4]辛烷-7-甲酸乙酯(150)(2.97g，9.5mmol)制备以得到作为黄色油的标题化合物(1.87g，产率44％)。
中间体152：2-羟基-6-氮杂螺[3.4]辛烷-6，7-二甲酸7-乙酯6-(苯基 甲基)酯
向2-{[(1，1-二甲基乙基)(二甲基)甲硅烷基]氧基}-6-氮杂螺[3.4]辛烷-6，7-二甲酸7-乙酯6-(苯基甲基)酯(151)(1.87g，4.2mmol)在THF(20mL)中的溶液中加入冰乙酸(0.48mL)，接着加入TBAF(8.5mL，在THF中的1M溶液)且将反应物加热到45℃历时18小时。将反应物真空浓缩并使其在EtOAc和水之间分配。将有机层用饱和NaHCO3洗涤，接着用盐水洗涤，随后经MgSO4干燥并真空浓缩从而以定量产率提供作为澄清油的标题化合物。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm7.17-7.48(m，5H)4.83-5.15(m，3H)3.88-4.34(m，4H)3.35-3.47(m，2H)2.02-2.39(m，3H)1.65-1.96(m，3H)1.00-1.22(m，3H).LC-MS ESI(M+H)+＝334.17。
中间体153：2-氧代-6-氮杂螺[3.4]辛烷-6，7-二甲酸7-乙酯6-(苯基 甲基)酯
该化合物以与113(实施例17)类似的方式由2-羟基-6-氮杂螺[3.4]辛烷-6，7-二甲酸7-乙酯6-(苯基甲基)酯(152)(1.39g，4.2mmol)制备以得到作为澄清油的标题化合物(1.25g，产率90％)。
中间体154：(7S)-2，2-二氟-6-氮杂螺[3.4]辛烷-6，7-二甲酸7-乙酯 6-(苯基甲基)酯
Figure BPA00001516471500772
向2-氧代-6-氮杂螺[3.4]辛烷-6，7-二甲酸7-乙酯6-(苯基甲基)酯(153)(1.25g，3.8mmol)在无水二氯甲烷(20mL)中的溶液中加入Deoxo-Fluor(1.2mL，6.4mmol)，接着加入乙醇(0.04mL，0.75mmol)且将反应物在室温下在氮气下搅拌18小时。将反应物注入饱和NaHCO3中并搅拌10分钟。将混合物用二氯甲烷(2×)萃取，将有机层用0.1N HCl洗涤，经MgSO4干燥并真空浓缩。残余物通过硅胶色谱以5-50％己烷/EtOAc洗脱来纯化。外消旋物随后通过手性HPLC在10μmOD管柱上以在己烷中的25％异丙醇洗脱来分离以提供作为澄清油的标题化合物(356mg，产率30％)。
中间体155：(7S)-2，2-二氟-6-氮杂螺[3.4]辛烷-7-甲酸乙酯
Figure BPA00001516471500781
该化合物以与115(实施例17)类似的方式由(7S)-2，2-二氟-6-氮杂螺[3.4]辛烷-6，7-二甲酸7-乙酯6-(苯基甲基)酯(14)(356mg，1.0mmol)制备以提供出作为澄清油的标题化合物(209mg，产率95％)。
中间体156：(7S)-2，2-二氟-6-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}-6- 氮杂螺[3.4]辛烷-7-甲酸
该化合物以与116(实施例17)类似的方式由(7S)-2，2-二氟-6-氮杂螺[3.4]辛烷-7-甲酸乙酯(155)(207mg，0.94mmol)制备以提供作为白色固体的标题化合物(263mg，产率81％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 12.53(br.s.，1H)7.46(d，J＝8.0Hz，1H)4.24(t，J＝7.8Hz，1H)4.02(d，J＝10.4Hz，1H)3.92(t，J＝8.5Hz，1H)3.62(d，J＝10.4Hz，1H)3.51(s，3H)2.54-2.78(m，4H)2.28-2.44(m，1H)1.81-2.05(m，2H)0.91(dd，J＝11.2，6.7Hz，6H).LC-MS ESI(M+H)+＝349.13。
中间体157：(7S)-2，2-二氟-6-((2S)-3-甲基-2-{[(甲氧基)羰基]氨基} 丁酰基)-6-氮杂螺[3.4]辛烷-7-甲酸2-{4′-[({[(2S)-1-((2S)-3-甲基-2-{[(甲 氧基)羰基]氨基}丁酰基)-2-吡咯烷基]羰基}氧基)乙酰基]-4-联苯 基}-2-氧代乙酯
该化合物以与117(实施例17)类似的方式由(7S)-2，2-二氟-6-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}-6-氮杂螺[3.4]辛烷-7-甲酸(156)(59mg，0.17mmol)和N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基-L-脯氨酸2-[4′-(溴乙酰基)-4-联苯基]-2-氧代乙酯(70)(95mg，0.16mmol)制备以提供作为白色固体的标题化合物(104mg，产率75％)。
实施例30：[(1S)-2-甲基-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[1-((2S)-3-甲基 -2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-8-氧杂-1-氮杂螺[4.5]癸-2-基]-1H-咪 唑-4-基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰基)丙基]氨基甲酸 甲酯
Figure BPA00001516471500792
向((1S)-2-甲基-1-{[(2S)-2-(4-{4′-[({[1-((2S)-3-甲基-2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-8-氧杂-1-氮杂螺[4.5]癸-2-基]羰基}氨基)乙酰基]-4-联苯基}-1H-咪唑-2-基)-1-吡咯烷基]羰基}丙基)氨基甲酸甲酯(169)(71mg，0.09mmol)在无水二
Figure BPA00001516471500793
烷(1mL)中的溶液中加入乙酸铵(66mg，0.86mmol)且将反应物用氮气脱气并在密封管中加热到110℃历时48小时。反应物通过HPLC以10-90％水/乙腈/0.2％NH4OH洗脱来纯化以提供作为灰白色固体的标题化合物(10mg，产率14％)。1H NMR(400MHz，METHANOL-d4)δppm 7.56-7.86(m，9H)7.16-7.44(m，2H)6.88-7.09(m，1H)5.72(br.s.，1H)5.09-5.21(m，1H)4.03-4.28(m，1H)3.80-4.04(m，6H)3.42-3.71(m，9H)2.11-2.56(m，8H)1.88-2.11(m，6H)0.80-1.06(m，12H).HRMS C44H57N8O7(M+H)+计算值：809.4350，实测值：809.4347。纯度(LC-MS)：93％。
制备中间体169
Figure BPA00001516471500801
中间体162：2-[(二苯基亚甲基)氨基]-4-(四氢-4H-吡喃-4-亚基)丁 酸乙酯
Figure BPA00001516471500802
向N-(二苯基亚甲基)氨基乙酸乙酯(5.29g，19.8mmol)、苄基三乙基氯化铵(0.41g，1.8mmol)和氢氧化铯单水合物(4.54g，27.0mmol)在无水二氯甲烷(50mL)中的溶液中加入作为在无水二氯甲烷(40mL)中的溶液的4-(2-溴乙亚基)四氢-2H-吡喃(3.44g，18.0mmol)且将反应物在室温下在氮气下搅拌72小时。使反应物在二氯甲烷和水之间分配且将水层用二氯甲烷萃取。将有机层经硫酸钠干燥并真空浓缩。残余物通过硅胶色谱以5-40％己烷/EtOAc洗脱来纯化从而以定量产率提供作为澄清油的标题化合物。
中间体163：2-氨基-4-(四氢-4H-吡喃-4-亚基)丁酸乙酯
向2-[(二苯基亚甲基)氨基]-4-(四氢-4H-吡喃-4-亚基)丁酸乙酯(162)(6.8g，18.0mmol)在THF(30mL)中的溶液中加入水(30mL)和冰乙酸(20mL)且将反应物在室温下搅拌2.5小时。将反应物真空浓缩且将残余物溶解于0.1N HCl中。将其用乙酸乙酯萃取两次且弃去有机层。向水层中加入固体碳酸钾，直至溶液使pH试纸显蓝色。将水层用15％异丙醇/二氯甲烷萃取3次，将有机层经硫酸钠干燥并真空浓缩以提供作为澄清油的标题化合物(3.05g，产率79％)。
中间体164：2-{[(4-硝基苯基)磺酰基]氨基}-4-(四氢-4H-吡喃-4- 亚基)丁酸乙酯
Figure BPA00001516471500812
向2-氨基-4-(四氢-4H-吡喃-4-亚基)丁酸乙酯(163)(1.0g，4.7mmol)在无水二氯甲烷(30mL)中的溶液中加入许尼希碱(1.6mL，9.4mmol)，接着加入4-硝基苯磺酰氯(1.14g，5.2mmol)，且将反应物在室温下在氮气下搅拌2小时。将反应物用二氯甲烷稀释并用0.1N HCl洗涤，将有机层经MgSO4干燥并真空浓缩。残余物通过硅胶色谱以10-70％己烷/EtOAc洗脱来纯化从而以定量产率提供作为灰白色固体的标题化合物。
中间体165：1-[(4-硝基苯基)磺酰基]-8-氧杂-1-氮杂螺[4.5]癸烷-2- 甲酸乙酯
Figure BPA00001516471500821
向2-{[(4-硝基苯基)磺酰基]氨基}-4-(四氢-4H-吡喃-4-亚基)丁酸乙酯(164)(1.87g，4.7mmol)在无水氯仿(47mL)中的溶液中加入三氟甲烷磺酸(0.2mL，2.3mmol)且将反应物在室温下在氮气下搅拌4小时。将反应物用二氯甲烷稀释并用饱和NaHCO3洗涤，且有机层经MgSO4干燥并真空浓缩。残余物通过硅胶色谱以10-70％己烷/EtOAc洗脱纯化以提供作为白色固体的标题化合物(1.47g，产率79％)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 8.19-8.36(m，2H)8.08(d，J＝8.8Hz，2H)4.52(dd，J＝8.5，2.1Hz，1H)3.99-4.14(m，2H)3.87-3.99(m，2H)3.21-3.49(m，2H)2.58-2.78(m，2H)2.10-2.30(m，2H)1.89-2.06(m，2H)1.77(dd，J＝13.0，2.1Hz，1H)1.35(dd，J＝12.9，1.6Hz，1H)1.22(t，J＝7.1Hz，3H).LC-MS ESI(M+H)+＝399.47。
中间体166：8-氧杂-1-氮杂螺[4.5]癸烷-2-甲酸乙酯
Figure BPA00001516471500822
向1-[(4-硝基苯基)磺酰基]-8-氧杂-1-氮杂螺[4.5]癸烷-2-甲酸乙酯(165)(1.47g，3.7mmol)在无水乙腈(25mL)中的溶液中加入碳酸钾(0.76g，5.5mmol)、18-冠-6(0.2g，0.7mmol)和硫苯酚(0.6mL，5.5mmol)且将反应物在室温下搅拌18小时。将反应物真空浓缩且将残余物溶解于0.1N HCl中。将水层用EtOAc萃取两次且弃去有机层。将水层用固体碳酸钾处理，直至溶液使pH试纸显蓝色。将其用15％异丙醇/二氯甲烷萃取3次，将有机层经硫酸钠干燥并真空浓缩以提供作为澄清油的标题化合物(0.71g，产率90％)。
中间体167：1-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}-8-氧杂-1-氮杂螺 [4.5]癸烷-2-甲酸乙酯
向8-氧杂-1-氮杂螺[4.5]癸烷-2-甲酸乙酯(166)(125mg，0.59mmol)在无水二氯甲烷(2mL)中的溶液中加入氰化银(98mg，0.73mmol)，接着加入作为溶液的在无水二氯甲烷(3.5mL)中的N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰氯(142mg，0.73mmol)且将溶液在室温下在氮气下搅拌18小时。将反应物过滤并用甲醇处理且搅拌5分钟。将反应物真空浓缩且残余物通过硅胶色谱以30-100％己烷/EtOAc洗脱来纯化以提供作为白色固体的标题化合物(43mg，产率20％)。
中间体168：1-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}-8-氧杂-1-氮杂螺 [4.5]癸烷-2-甲酸
Figure BPA00001516471500832
向1-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}-8-氧杂-1-氮杂螺[4.5]癸烷-2-甲酸乙酯(167)(80mg，0.2mmol)在THF/水/甲醇(1.0mL/0.5mL/0.5mL)中的溶液中加入氢氧化锂单水合物(13mg，0.3mmol)且将反应物在室温下搅拌72小时。将反应物用1N HCl(0.5mL)处理且使反应物在EtOAc和0.1N HCl之间分配。将有机层分隔，经MgSO4干燥并真空浓缩以提供作为白色固体的标题化合物(53mg，产率72％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 12.88(br.s.，1H)7.45-7.61(m，1H)4.89-5.03(m，1H)3.70-3.87(m，2H)3.65(t，J＝9.2Hz，1H)3.53(s，3H)3.02(td，J＝12.9，4.9Hz，1H)2.71-2.90(m，1H)2.22-2.38(m，1H)1.87-2.19(m，3H)1.53-1.73(m，1H)1.32-1.42(m，1H)1.06-1.15(m，1H)0.61-0.98(m，8H).LC-MS ESI(M+H)+＝342.95。
中间体169：((1S)-2-甲基-1-{[(2S)-2-(4-{4′-[({[1-((2S)-3-甲基 -2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-8-氧杂-1-氮杂螺[4.5]癸-2-基]羰基} 氨基)乙酰基]-4-联苯基}-1H-咪唑-2-基)-1-吡咯烷基]羰基}丙基)氨基 甲酸甲酯
Figure BPA00001516471500841
向1-{N-[(甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}-8-氧杂-1-氮杂螺[4.5]癸烷-2-甲酸(168)(52mg，1.5mmol)、{(1S)-1-[((2S)-2-{4-[4′-(氨基乙酰基)-4-联苯基]-1H-咪唑-2-基}-1-吡咯烷基)羰基]-2-甲基丙基}氨基甲酸甲酯二盐酸盐(1)(88mg，0.15mmol)和HATU(58mg，0.15mmol)在无水二氯甲烷(1.2mL)中的溶液中加入许尼希碱(0.12mL，0.68mmol)且将反应物在室温下搅拌1小时。将反应物真空浓缩且通过HPLC以10-90％水/乙腈/0.2％NH4OH洗脱来纯化以提供作为灰白色固体的标题化合物(73mg，产率58％)。
实施例31：((1S)-1-{[(2S)-2-(4-{4′-[2-(1-乙酰基-8-氧杂-1-氮杂螺 [4.5]癸-2-基)-1H-咪唑-4-基]-4-联苯基}-1H-咪唑-2-基)-1-吡咯烷基]羰 基}-2-甲基丙基)氨基甲酸甲酯
Figure BPA00001516471500851
该化合物以与实施例30类似的方式由{(1S)-1-[((2S)-2-{4-[4′-({[(1-乙酰基-8-氧杂-1-氮杂螺[4.5]癸-2-基)羰基]氨基}乙酰基)-4-联苯基]-1H-咪唑-2-基}-1-吡咯烷基)羰基]-2-甲基丙基}氨基甲酸甲酯(172)(116mg，0.16mmol)制备以提供作为褐色固体的标题化合物(19mg，产率17％)。1H NMR(400MHz，METHANOL-d4)δppm 7.51-7.90(m，8H)7.17-7.52(m，2H)5.08-5.26(m，2H)3.81-4.03(m，4H)3.64(s，3H)3.41-3.61(m，3H)2.21-2.51(m，5H)2.01-2.21(m，4H)1.97(d，J＝19.9Hz，5H)1.77-1.91(m，1H)1.64-1.75(m，1H)1.31-1.42(m，1H)0.79-1.04(m，8H).HRMS C39H48N7O5(M+H)+计算值：694.3717，实测值：694.3718。纯度(LC-MS)：79％。
制备中间体172
Figure BPA00001516471500852
中间体170：1-乙酰基-8-氧杂-1-氮杂螺[4.5]癸烷-2-甲酸乙酯
Figure BPA00001516471500853
向8-氧杂-1-氮杂螺[4.5]癸烷-2-甲酸乙酯(166)(135mg，0.63mmol)在无水二氯甲烷(2mL)中的溶液中加入许尼希碱(0.22mL，1.3mmol)，接着加入乙酰氯(0.05mL，0.76mmol)且将反应物在室温下在氮气下搅拌1.5小时。将反应物用二氯甲烷稀释并用0.1N HCl洗涤，有机层经MgSO4干燥并真空浓缩。残余物通过硅胶色谱以60-100％己烷/EtOAc洗脱来纯化以提供作为黄色油的标题化合物(94mg，产率58％)。
中间体171：1-乙酰基-8-氧杂-1-氮杂螺[4.5]癸烷-2-甲酸
Figure BPA00001516471500861
向1-乙酰基-8-氧杂-1-氮杂螺[4.5]癸烷-2-甲酸乙酯(170)(93mg，0.34mmol)在THF/水/甲醇(1.1mL/0.6mL/0.6mL)中的溶液中加入氢氧化锂单水合物(29mg，0.69mmol)且将反应物在室温下搅拌3小时。将反应物用1N HCl(0.7mL)处理且使反应物在EtOAc和0.1N HCl之间分配，将水层用EtOAc萃取两次，将合并的有机层经MgSO4干燥并真空浓缩以提供作为白色固体的标题化合物(79mg，产率95％)。
中间体172：{(1S)-1-[((2S)-2-{4-[4′-({[(1-乙酰基-8-氧杂-1-氮杂螺 [4.5]癸-2-基)羰基]氨基}乙酰基)-4-联苯基]-1H-咪唑-2-基}-1-吡咯烷 基)羰基]-2-甲基丙基}氨基甲酸甲酯
Figure BPA00001516471500862
该化合物以与169类似的方式由1-乙酰基-8-氧杂-1-氮杂螺[4.5]癸烷-2-甲酸(171)(56mg，0.25mmol)和{(1S)-1-[((2S)-2-{4-[4′-(氨基乙酰基)-4-联苯基]-1H-咪唑-2-基}-1-吡咯烷基)羰基]-2-甲基丙基}氨基甲酸甲酯二盐酸盐(1)(142mg，0.25mmol)制备以提供作为灰白色固体的标题化合物(118mg，产率67％)。
实施例32-37使用与实施例30和31类似的合成顺序来制备。
实施例32：[(1S)-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[8，8-二氟-1-((2S)-3-甲基 -2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-1-氮杂螺[4.5]癸-2-基)-1H-咪唑-4- 基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基)-1-吡咯烷基}羰基)-2-甲基丙基)氨基甲 酸甲酯
Figure BPA00001516471500871
1H NMR(400MHz，METHANOL-d4)δ7.92-7.51(m，8H)，7.29(br.s.，2H)，5.71(br.s.，1H)，5.32(br.s.，1H)，4.21(d，J＝7.4Hz，1H)，4.15-3.80(m，4H)，3.77-3.41(m，8H)，3.18(br.s.，1H)，3.12-2.82(m，1H)，2.63-1.40(m，16H)，1.05-0.84(m，10H)，0.78-0.64(m，1H)，0.44-0.28(m，1H).HRMS C45H57F2N8O6(M+H)+计算值：843.4369，实测值：843.4368。
实施例33：[(1S)-1-({8，8-二氟-2-[4-(4′-{2-[(2S)-1-((2S)-3-甲基 -2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-2-吡咯烷基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯 基)-1H-咪唑-2-基]-1-氮杂螺[4.5]癸-1-基}羰基)丙基]氨基甲酸甲酯
Figure BPA00001516471500872
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ7.84(d，J＝7.8Hz，3H)，7.72-7.41(m，6H)，7.31-7.09(m，3H)，5.73-5.17(m，4H)，5.12(br.s.，1H)，4.41-4.06(m，3H)，3.97-3.56(m，11H)，3.37-2.76(m，4H)，2.60-1.55(m，9H)，1.46-1.20(m，2H)，1.06(d，J＝6.0Hz，2H)，1.00-0.79(m，5H)，0.56(d，J＝7.3Hz，1H).HRMS C44H55F2N8O6(M+H)+计算值：829.4213，实测值：829.4211。
实施例34：((1S)-2-{8，8-二氟-2-[4-(4′-{2-[(2S)-1-((2S)-3-甲基 -2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-2-吡咯烷基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯 基)-1H-咪唑-2-基]-1-氮杂螺[4.5]癸-1-基}-1-甲基-2-氧代乙基)氨基甲 酸甲酯
Figure BPA00001516471500881
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ10.97-10.14(m，2H)，7.91-7.40(m，8H)，7.34-7.16(m，2H)，5.68-5.15(m，3H)，5.08(d，J＝6.0Hz，1H)，4.34(d，J＝8.0Hz，2H)，3.95-3.54(m，8H)，3.37-2.69(m，4H)，2.60-1.57(m，13H)，1.56-1.18(m，3H)，1.06(d，J＝6.8Hz，1H)，0.89(d，J＝6.5Hz，6H).HRMS C43H53F2N8O6(M+H)+计算值：815.4056，实测值：815.4061。
实施例35：[(1S)-1-({8，8-二氟-2-[4-(4′-{2-[(2S)-1-((2S)-3-甲基 -2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-2-吡咯烷基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯 基)-1H-咪唑-2-基]-1-氮杂螺[4.5]癸-1-基}羰基)-3-甲基丁基]氨基甲酸 甲酯
Figure BPA00001516471500882
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ11.07-9.94(m，2H)，8.17-7.42(m，10H)，7.33-7.08(m，2H)，5.72-5.19(m，3H)，5.14-4.99(m，1H)，4.86(br.s.，1H)，4.50-4.09(m，2H)，4.02-3.50(m，8H)，3.45(s，1H)，3.33-2.71(m，4H)，2.59-1.47(m，11H)，1.40(br.s.，3H)，1.19-0.67(m，11H)，0.63-0.40(m，1H).).HRMS C46H59F2N8O6(M+H)+计算值：857.4526，实测值：857.4531。
实施例36：((1S)-1-{[2S)-2-(4-{4′-[2-(1-乙酰基-8，8-二氟-1-氮杂螺 [4.5]癸-2-基)-1H-咪唑-4-基]-4-联苯基}-1H-咪唑-2-基)-1-吡咯烷基]羰 基}-2-甲基丙基)氨基甲酸甲酯
Figure BPA00001516471500891
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ11.17-10.07(m，2H)，8.16-7.40(m，10H)，7.35-7.03(m，2H)，5.85-4.98(m，2H)，4.59-4.12(m，1H)，3.72(s，5H)，3.46(br.s.，1H)，3.33-2.72(m，2H)，2.76-1.39(m，17H)，1.27-0.74(m，5H).HRMS C40H48F2N7O4(M+H)+计算值：728.3736，实测值：728.3736。
实施例37：[(1S)-2-甲基-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[1-((2S)-3-甲基 -2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-8，8-二氧代-8-硫杂-1-氮杂螺[4.5]癸 -2-基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰基)丙 基]氨基甲酸甲酯
Figure BPA00001516471500892
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ7.92-7.52(m，9H)，5.39(br.s.，4H)，4.36(br.s.，1H)，3.98-3.82(m，1H)，3.82-3.60(m，10H)，3.19(br.s.，4H)，2.88-2.70(m，1H)，2.33(br.s.，4H)，2.02(s，4H)，1.81(br.s.，5H)，1.06(s，1H)，0.89(d，J＝7.0Hz，6H)，0.74(d，J＝6.5Hz，3H)，0.44-0.34(m，3H).HRMS C44H57N8O8S(M+H)+计算值：857.4020，实测值：857.4018。
在HCV复制子测定中对化合物进行试验和数据分析的方案
使用基因型1a和1b亚基因复制子模型体系测定化合物对抗HCV的活性。使用携带基因型1a和1b复制子的稳定细胞系来筛选化合物。两种复制子均为双顺反子型且含有荧火虫荧光素酶基因。将ET细胞系用包埋I389LUC-UBI-NEO/NS3-3′/ET复制子的RNA转录体稳定转染，该复制子含有荧火虫荧光素酶-泛素-新霉素磷酸转移酶融合蛋白和含有细胞培养适应性突变(E1202G、T1280I、K1846T)的EMCV-IRES驱动NS3-5B多聚蛋白质的(Krieger等，2001和未发表的文献)。基因型1a复制子为Apath LLC许可的稳定细胞系，其经修饰以包含荧火虫荧光素酶基因。所述细胞在补充有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、青霉素(100IU/mL)/链霉素(100μg/mL)、1x非必需氨基酸和250-500μg/mLG418(“Geneticin”)的DMEM中生长。它们全可由LifeTechnologies(Bethesda，Md.)得到。将细胞在装有化合物的384孔板上以5×103个细胞/孔涂板。化合物的最后浓度为0.03pM-50μm且DMSO的最后浓度为0.5-1％。
荧光素酶活性通过加入Steady glo试剂(Promega，Madison，Wis.)于48小时后测量。相对于没有化合物对照物的情况绘出复制数据的抑制百分数。在相同条件下使用细胞滴度glo(Promega，Madison，Wis)测定化合物的细胞毒性。对于各化合物使用3-4倍系列稀释由11点剂量响应曲线测定EC50，其横跨大于1000倍的浓度范围。各化合物的抑制水平用活性基质(Activity Base)或BioAssay加Excel XC50组件测定。抑制百分数用以下方程确定，其中串扰校正值为得自试验孔的值，化合物正对照平均值为不存在化合物的孔的平均值，且DMSO负控制平均值为具有DMSO但不存在细胞的孔的平均值。
这些标准化值输出为EC50，其中它们使用标准4参数逻辑方程相对于化合物摩尔浓度绘制：
y = A + B - A 1 + [ 10 X 1 0 c ] D
其中：
A＝y最小值  D＝斜率因子
B＝y最大值  x＝log10化合物浓度[M]
C＝log10EC50  pEC50＝-C
如下所示，发现，除了实施例20以外，所有试验化合物都抑制复制子的活性，其中pEC50＞5。
Figure BPA00001516471500913
Figure BPA00001516471500921
制备实施例2的化合物[(1S)-2-甲基-1-({(2S)-2-[4-(4′-{2-[(8S)-7-((2S)-3-甲基-2-{[(甲氧基)羰基]氨基}丁酰基)-1，4-二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬-8-基]-1H-咪唑-4-基}-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯烷基}羰基)丙基]氨基甲酸甲酯的结晶盐。
实施例2的化合物的结晶二盐酸盐：
WO 2009/020828公开了据称可用于治疗HCV感染的化合物的结晶二盐酸盐。WO 2009/020828的标题化合物如该专利中所述来制备。
将实施例2的化合物分离并纯化为非晶游离碱。在室温下在搅拌下将该非晶游离碱溶解于丙酮(3.6mL，30体积)中。加入盐酸(316μL，1.0M，在二
Figure BPA00001516471500931
烷中；2.1当量)且产生非晶沉淀物。等分地加入甲醇(480μL，4体积)，直至固体刚好溶解。加入WO 2009/020828二盐酸盐化合物的晶种，且将混合物搅拌过周末。将产物过滤，不进行洗涤，实施例2的化合物的结晶二盐酸盐产率为62.6％(84.0mg，0.0946mmol)。
实施例2的化合物的结晶二盐酸盐：
将实施例2的化合物分离并纯化为非晶游离碱。在50℃下在搅拌下将该非晶游离碱(555mg，0.696mmol)溶解于丙酮(8.3mL，15体积)和甲醇(2.2mL，4体积)中。缓慢加入盐酸(1.46mL，1.0M，在二
Figure BPA00001516471500932
烷中；2.1当量)，接着加入实施例2的化合物的二盐酸盐的晶种。使浆料保持在50℃下历时1小时，冷却至室温并搅拌过周末。将产物快速过滤，不进行洗涤并在50℃下在放出氮气的真空烘箱中干燥。实施例2的化合物的结晶二盐酸盐的产率为54.0％(327mg，0.376mmol)。
实施例2的化合物的结晶硫酸盐：
实施例2的化合物的非晶硫酸盐通过向游离碱的溶液中加入1.0当量的硫酸并浓缩至干燥来制备。使非晶硫酸盐(约50mg，0.056mmol)溶解于丙酮(750μl，15体积)中，且将混合物加热到50℃。加入甲醇(210μL，4.2体积)，每次10μL，直至固体几乎全部溶解，产生浑浊溶液。将该浑浊溶液在50℃下混合16小时，随后冷却到23℃。将产物过滤，分析并确定与实施例2的化合物的结晶硫酸盐一致。
实施例2的化合物的结晶硫酸盐：
将实施例2的化合物的非晶游离碱(250mg，0.314mmol)与甲醇(1.25mL，5体积)混合且在搅拌下加热到50℃以加速溶解。缓慢加入硫酸(0.105mL，3.0M，在水中；1.0当量)，接着加入实施例2的化合物的硫酸盐的晶种。使浆料保持在50℃历时3小时以形成中等稠度的黄色浆料。使温度降低到50℃以增加产率。将产物过滤，不进行洗涤且在50℃下放出氮气的真空烘箱中干燥。GSK2336805的结晶硫酸盐产率为73.6％(211mg，0.231mmol)。
结晶盐分析：
实施例2的化合物的结晶二盐酸盐和硫酸盐通过离子色谱、粉末X射线衍射(PXRD)、拉曼光谱、DSC和TGA分析。所有分析都与结晶一致。粉末X射线衍射用具有Johansson Kα1单色仪的PANalyticalX′Pert-Pro MPD使用X′Celerator检测器进行。关键操作参数为：辐射：Cu(Kα1)，1.54060埃(单色)；检测器：X′Celerator；电压：45kV；电流：40mA；起始角度：
Figure BPA00001516471500941
终止角度：
Figure BPA00001516471500942
步长：0.02°；时间/步骤：40.0秒；扫描速度：0.05°/秒；入射光束：2°固定防散射狭缝，和可程序控制的发散狭缝；衍射光束：0.02rad梭拉狭缝和可程序控制的防散射狭缝。样品在硅零背景样品夹持器上制备。
实施例2的化合物的二盐酸盐在粉末X射线衍射图中在2θ值(以度计)和在括号中的d间距(以埃计)处具有显著峰：5.3(16.55)，9.9(8.94)，10.4(8.54)，13.3(6.65)，18.9(4.70)，20.3(4.37)，21.2(4.18)，22.5(3.95)，23.2(3.84)，23.7(3.75)，24.4(3.65)，26.3(3.39)，27.6(3.23)。实施例2的化合物的二盐酸盐的TGA曲线与非晶形式一致。实施例2的化合物的二盐酸盐的DSC曲线显示在约262℃开始熔融和/或分解。
实施例2的化合物的硫酸盐在粉末X射线衍射图中在2θ值(以度计)和在括号中的d间距(以埃计)处具有显著峰：5.6(15.87)，7.1(12.39)，8.0(11.10)，10.5(8.41)，11.9(7.41)，12.6(7.02)，13.4(6.61)，14.3(6.18)，16.6(5.33)，17.5(5.07)，18.4(4.81)，20.0(4.43)，21.2(4.19)，23.8(3.73)。实施例2的化合物的硫酸盐的TGA曲线与变体水合形式一致。实施例2的化合物的硫酸盐的DSC曲线显示在约241℃开始熔融和/或分解。

Claims (26)

1.式III化合物：
Figure FPA00001516471400011
其中R1各自独立地为H或C1-3烷基；
R2各自独立地为C1-3烷基；
在存在R3基团的各碳上，两个R3各自为H或所述R3基团连同与其连接的碳一起形成4、5或6元饱和螺环，前提条件是在各饱和含氮环上存在不超过1个螺环；
由R3基团形成的各饱和螺独立地为环烷基，或可含有1或2个氧原子，或1或2个硫原子，或1个SO2，或1个NR4；
R4各自独立地为H、C(O)OC1-4烷基、C(O)C1-4烷基、C(O)NC1-4烷基、SO2C1-4烷基；且
各螺环可任选被氘、氟或1-2个甲基取代。
2.权利要求1的化合物，其中R3基团在两个所示出饱和含氮环中的每一个上形成螺环。
3.权利要求2的化合物，其中所述螺环各自与在各饱和含氮环中的同一有关碳原子连接。
4.权利要求1的化合物，其中R3基团在两个所示出饱和含氮环中的仅一个上形成螺环。
5.式I化合物：
Figure FPA00001516471400021
其中R1各自独立地为H或C1-3烷基；
R2各自独立地为C1-3烷基；
X各自独立地为CRR、O或S；
n为2或3；且
R各自独立地为甲基、氢或氘。
6.式II化合物：
Figure FPA00001516471400022
其中R1各自独立地为H或C1-3烷基；
R2各自独立地为C1-3烷基；
X各自独立地为CRR、O或S；
n各自独立地为2或3；且
R各自独立地为甲基、氢或氘。
7.权利要求5或6的化合物，其中X各自相同。
8.权利要求5-7中任一项的化合物，其中X为S或O。
9.权利要求5-8中任一项的化合物，其中每个CRR为CH2。
10.权利要求5-8中任一项的化合物，其中在各螺中不多于2个R为甲基。
11.前述权利要求中任一项的化合物，其中R1各自为异丙基。
12.前述权利要求中任一项的化合物，其中R2各自为甲基。
13.化合物：
14.权利要求13的化合物，其中所述化合物对映异构富集以下对映异构体
Figure FPA00001516471400032
15.前述权利要求中任一项的化合物的药学上可接受的盐。
16.权利要求15的盐，其中所述盐为二盐酸盐或硫酸盐。
17.权利要求16的盐，其中所述盐为硫酸盐。
18.权利要求13或14的化合物的硫酸盐。
19.权利要求16、17或18的盐，其中所述盐为结晶盐。
20.药物组合物，其包含前述权利要求中任一项的化合物或盐。
21.药物组合物，其包含权利要求13或14的化合物或权利要求18的盐。
22.治疗人类的病毒性感染的方法，其包括给予权利要求20或21的药物组合物。
23.权利要求22的方法，其中所述病毒性感染为HCV感染。
24.用于治疗人类的病毒性感染的药物组合物，其包含权利要求1-19中任一项的化合物或盐。
25.用于治疗人类的病毒性感染的权利要求1-19中任一项的化合物或盐。
26.权利要求1-19中任一项的化合物或盐在制造用于治疗人类的病毒性感染的药物中的用途。
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