CN102232098B - 用于治疗血管栓塞形成的微球 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了，例如微球，其包含明胶或明胶替代物和N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体单元、二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体单元和N，N-亚甲基-二丙烯酰胺单体单元的共聚物。本发明还提供了制备微球的方法，所述微球包含明胶或明胶替代物和N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体单元、二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体单元和N，N-亚甲基-二丙烯酰胺单体单元的共聚物。例如，本发明进一步提供了包含所述微球的组合物及所述微球和组合物的使用方法。

Description

用于治疗血管栓塞形成的微球
发明领域
本发明提供了，例如微球，其包含明胶或明胶替代物和N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体单元、二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体单元和N，N-亚甲基-二丙烯酰胺单体单元的共聚物。本发明还提供了制备微球的方法，所述微球包含明胶或明胶替代物和N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体单元、二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体单元和N，N-亚甲基-二丙烯酰胺单体单元的共聚物。例如，本发明进一步提供了包含所述微球的组合物和使用所述微球和其组合物的方法。
背景技术
使用治疗性血管闭塞(即栓塞形成)原位预防或治疗某些病理学病症。其可以利用导管施用，这使得有可能在成像控制下，将微粒闭塞试剂(即，栓子)定位于循环系统中。其有许多医学应用，例如治疗肿瘤，包括例如子宫纤维瘤、血管畸形和出血病程。例如，血管闭塞可以抑制疼痛、限制外科手术介入的失血及随后的栓塞形成，或者甚至引起肿瘤坏死，及避免进行手术。在血管畸形的情况下，血管闭塞能够使正常组织供血正常化，在外科手术中有帮助，且限制出血危险。在出血病程中，血管闭塞可引起流量减少，其促进动脉开口愈合。而且，根据待治疗的病理学病症，可以形成栓塞用于暂时性以及永久性目的。
已经使用不同类型的栓子进行栓塞形成，例如液体试剂(例如，丙烯酸胶、凝胶或粘性悬浮液)以及微粒试剂(例如，混杂聚合物(miscellaneouspolymers)、硬膜、海绵胶、球、囊或螺旋物)，包括EmboSphere三丙烯基明胶微球(BioSphere Medical，Rockland，MA)(参见，例如，美国专利号5,635,215和5,648,100)。
在各种闭塞试剂中，已证实微球具有比其他固体栓子更好的栓子性质。然而，微球的性质和产率通常由于在生产方法中使用的材料和及其制备方法而变化。
因此，仍然需要一种制备微球的方法，该方法具有例如较好的产率和较好的均匀性或纯度。另外，还需要具有例如在生产批次之间具有较好或更好的一致性的微球，其能够提供最佳的栓子效果。
发明简述
本发明提供的方法一般性地涉及微球和包含该微球的组合物。本发明还提供了微球的制备方法和使用方法。
在一个方面，本发明提供了微球，其包含：(a)包含N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体单元、二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体单元和N，N-亚甲基-二丙烯酰胺单体单元的共聚物，和(b)交联的明胶。在某些实施方案中，所述微球在1H NMR谱中显示在约3.5ppm至约4ppm的第一个峰、约3ppm至约3.5ppm的第二个峰和约1ppm至约1.5ppm的第三个峰。在具体的实施方案中，(i)第二个峰与第一个峰的积分比为约0.50至约0.65，(ii)第三个峰与第一个峰的积分比为约0.55至约0.75(例如约0.61至约0.75)，或(iii)(i)和(ii)的组合。在某些实施方案中，所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体单元是超纯的单体单元，所述二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体是超纯的单体单元，和/或所述N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体单元是超纯的单体。在另一个方面，本发明提供了微球，其包含：(a)通过共聚N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体、二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体和N，N-亚甲基-二丙烯酰胺单体制备的共聚物，和(b)交联的明胶。在某些实施方案中，所述微球在1H NMR谱中显示在约3.5ppm至约4ppm的第一个峰、约3ppm至约3.5ppm的第二个峰和约1ppm至约1.5ppm的第三个峰。在具体的实施方案中，(i)第二个峰与第一个峰的积分比为约0.50至约0.65，(ii)第三个峰与第一个峰的积分比为约0.55至约0.75(例如约0.61至约0.75)，或(iii)(i)和(ii)的组合。在某些实施方案中，所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体是超纯的单体，所述二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体是超纯的单体，和/或所述N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体是超纯的单体。
在另一个方面，本发明提供了一种制备微球的方法，其包含：(a)制备下述水溶液，该水溶液包含(i)N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体，(ii)二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体，(iii)N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体，和(iv)明胶，其中所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体是超纯的单体，所述二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体是超纯的单体和/或所述N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体是超纯的单体；(b)在搅拌之前或搅拌同时，将该水溶液加入到具有低水混容性的液体有机相(例如油，例如矿物油，例如石蜡油)中；从而得到包含下述共聚物的微球，该共聚物含有N-三羟甲基甲基丙烯酰胺、二乙基氨基乙基丙烯酰胺和N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体单元；(c)交联明胶。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在交联明胶之前，对微球进行超声处理(例如超声粉碎)。在一个实施方案中，经由进料环(feed ring)将该水溶液加入到液体有机相中。本发明还提供了通过这些方法制备的微球。
在另一个方面，本发明提供了在个体中形成栓塞的方法，其包括向个体使用本发明提供的微球。
在仍然另一个方面，本发明提供了控制或治疗个体中血管生成依赖性疾病的方法，其包括向个体施用本发明提供的微球。
术语
除非另有定义，所有本文使用的技术术语和科技术语具有与如本领域普通技术人员通常理解的相同含义。将所有的专利、申请、公布的申请及其它出版物的全部内容引入本文作为参考。如果对于本文的术语存在多个定义，除非另有说明，以本部分中的定义为准。
术语“约”或“近似”指在给定值或范围的20％之内，例如在15％之内、在10％之内、在9％之内、在8％之内、在7％之内、在6％之内、在5％之内、在4％之内、在3％之内、在2％之内、在1％之内、在0.5％之内或更低。
在用于本文时，“施用/给药”指通过注射或以其它手段将存在于体外的物质(例如本发明提供的微粒或微球)物理递送至患者体内的行为，例如但不限于通过肺(例如吸入)、粘膜(例如鼻内)、真皮内、静脉内、动脉内、胆道内、眼内、骨内、肌内递送和/或本文描述的或本领域已知的任何其它物理递送方法递送。在具体的实施方案中，使用注射器和/或导管递送所述微球。当治疗或以其它方式控制疾病或其症状时，所述物质的给药典型地发生在疾病或其症状发病之后。当预防疾病或其疾病时，所述物质的给药典型地发生在疾病或其症状发病之前。在某些实施方案中，这样的给药使递送的微粒(例如，本发明提供的微球)接触靶区域(例如，血管、组织或器官)。
术语“血管造影”指在身体各个部分(例如，肝、前列腺、子宫)进行血管成像，以便确定所述血管患病、狭窄、扩大或完全阻塞的一种X射线检查。在某些实施方案中，将导管穿入通向感兴趣身体区域的动脉之后，通过注射对照物质增亮该血管，拍摄血管造影照片(例如，X射线)。“超选择性血管造影”指使用较小导管的血管造影，该较小导管可以穿过较大导管进入供应小的组织或肿瘤区域的支链动脉。
术语“动静脉畸形”、“AVM”、“血管畸形”指在动脉和静脉之间出现至少一个(最典型地，许多)异常交流，导致主要由血管构成的局部肿瘤样物质的一组疾病。这样的疾病可以是先天性的或获得性的。
术语“良性前列腺肥大”指例如中年和老年男性的前列腺增大。
如本文使用的“交联”、“交联的”、“交联性”通常指通过一个或多个桥连接两种或多种增稳物(包括脂质、蛋白质、聚合物、糖类、表面活性剂增稳物)、生物活性治疗因子和/或生物活性剂。所述桥可以由一个或多个元素、基团或化合物组成，通常使来自第一种增稳物分子的原子结合来自第二种增稳物分子的原子。交联桥可涉及共价连接和(或)非共价连接。多种元素、基团和(或)化合物中的任何一种都可以形成交联物中的桥，增稳物可以是天然交联的或经由合成方法交联的。例如，交联可以天然存在于由肽链构成的物质中，所述肽链由胱氨酸残基上的二硫键相连接，二硫键例如存在于角蛋白、胰岛素和其它蛋白质中。可选地，交联可受到合适的化学修饰的影响，所述化学修饰例如，可通过暴露于热、高能辐射等引起化合物例如增稳物与可充当交联剂的化学物质相结合。实例包括，通过硫形成二硫键的交联、使用有机过氧化物的交联、利用高能辐射的不饱和物质交联、与二羟甲基甲氨酸酯交联等。在本发明提供的微球的某些实施方案中，明胶是交联的。
如本文使用的术语“细胞粘附促进剂”指由于其存在于微球中或与微球结合而促进或增强微球粘附到细胞表面的任何物质。这些物质通常经由蛋白质和聚合物的共价键结合所述微球的蛋白质。
如本文使用的“化学修饰”指在微球制备过程期间、或通过混合微球与多种试剂或组织、或使微球接触多种试剂或组织时，微球的化学性质和特征的变化，使得一旦注射到体内，所述微球具有除了栓塞形成之外，进行例如其它功能的能力。
如本文使用的术语“有效量”指足够部分地或完全地闭塞血管(例如动脉或静脉)的治疗剂(例如，本发明提供的微球或组合物)的量。这样的闭塞可以是暂时性的或永久性的。在某些实施方案中，有效量将进一步改善给定疾病和/或其相关症状的严重性和/或持续时间。在本发明提供的方法的某些实施方案中，将有效量的微球施用给患者。
如本文使用的术语“形成栓塞”或“形成治疗性栓塞”指部分或全部闭塞充满了血液的血管，例如通过将栓子有意引入血管中来选择性闭塞血管。例如，形成栓塞使动脉或静脉闭塞，以矫正功能障碍(例如动静脉畸形)或堵塞或减缓血流(例如，流向实体瘤/癌症生长)。在某些实施方案中，栓塞形成是一种被动行为，在此意义上，没有活性分子被运送和/或递送到栓子物质沉积的位点。
在施用其它治疗剂的上下文中，如本文使用的术语“组合”指使用超过一种治疗剂。术语“组合”的使用并不限制向个体施用治疗剂的顺序。第一治疗剂可以在向个体施用第二治疗剂之前(例如1分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)、同时或之后(例如1分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之后)给药，所述个体例如患有或易患给定的疾病。任一种另外的治疗剂可以与其它另外的治疗剂以任何顺序施用。在某些实施方案中，本发明提供的微粒可以与一种或多种治疗剂(例如，目前用于预防、治疗、控制和/或改善给定疾病或其相关症状所施用的非微球治疗剂)组合给药。可以与本发明提供的微粒组合给药的治疗剂的非限制性实例包括止痛剂、麻醉剂、抗生素或免疫调节剂或在U.S.Pharmacopoeia-National Formulary(2009)U.S.Pharmacopoeia，包括修订版，和/或hysiciaN’s Desk Reference(2009)63rd ed.，Thomson Reuters中列出的任何其它试剂。
如本文使用的，术语“杂质”指以材料或化合物(例如单体或单体单元)的限制量存在的物质，其与所述物质或化合物的化学组成不同。杂质可以是天然存在的，或者在合成物质或化合物期间增加的或由合成物质或化合物引起的。
如本文使用的“可注射的”指能够经由注射器、导管、针或其它方式注射或灌注液体介质中的微球的给药、递送或运送到体内。在某些实施方案中，本发明提供的微粒微粒是可注射的微粒。
如本文使用的具有“低水混容性”的液体或溶液指在25℃下，具有约50％或更低、约40％或更低、约35％或更低、约30％或更低、约25％或更低、约20％或更低、约15％或更低、约10％或更低、约5％或更低、约4％或更低、约3％或更低、约2％或更低、约1％或更低、约0.5％、约0.1％或更低、或约0％水混容性的液体或溶液。在具体的实施方案中，所述液体或溶液在25℃下具有约5％或更低的水混容性。在另一个具体的实施方案中，所述液体或溶液在25℃下具有约1％或更低的水混容性。在某些实施方案中，所述液体或溶液是不可混溶性的。
如本文使用的术语“控制”指个体从不能引起治愈疾病的治疗剂(例如，本发明提供的微球)得到的有益效果。在本发明提供的方法的某些实施方案中，向个体施用一种或多种治疗剂以“控制”给定的疾病或其一种或多种相关症状，从而防止所述疾病的进展或恶化。
如本文使用的术语“微球”指能够制成多个不同尺寸的小体的聚合物或一种或多种聚合物的组合。如本文使用的微球可以是任何形状。在某些实施方案中，所述微球是基本上球形的。所述微球的这些结构通常可以是球形或球状体形，或者受限于想象的球形或球状体形。在某些实施方案中，本发明提供的微球的表面在放大至多1000倍，例如至多100倍、至多10倍、0倍或它们的范围内似乎是光滑的。可以通过本领域已知的任何方法对所述微球灭菌，所述方法例如照射，例如γ照射或β照射。本发明提供的微球可以包括如本文描述和定义的其它物质。然而，应当理解术语“微球”代表为了便于解释本发明提供的组合物和方法而进行的描述，在某些实施方案中，本文描述的示例性的微球并不必须限于精确的球形(例如，其为微粒)。
术语“单体”指可以化学键合其它单体以形成聚合物或共聚物的小分子。在本文中，单体的某些性质或特征也可以应用于相应单体单元，反之亦然。
术语“单体单元”指在聚合物或共聚物中的单体。
如本文使用的术语“药学可接受的”指联邦政府或州政府的管理机构批准的，或在美国药典、欧洲药典或用于动物、更特别地用于人类的其它通常公认的药典中列出的。
如本文使用的术语“预防”、“防止”指全部或部分抑制个体中给定的疾病；全部或部分抑制个体中给定疾病或其相关症状的发展或疾病进程的发病。
如本文使用的术语“副作用”涵盖治疗剂的不需要的作用和不良作用。不需要的作用并不一定是不良的。来自治疗剂的副作用可以是有害的或不舒服的或危险的。副作用的实例包括，但不限于鼻炎、腹泻、咳嗽、肠胃炎、喘气、恶心、呕吐、食欲缺乏、腹绞痛、发热、疼痛、体重减轻、脱水、脱发、消化不良、失眠、头晕、粘膜炎、神经和肌肉作用、疲劳、口干燥和食欲不振、给药部位的皮疹或肿胀、流行性感冒样症状例如发热、发冷疲劳、消化道问题和过敏性反应。患者经受的另外不想要的作用很多，其都是本领域已知的。许多描述在PhysiciaN’s Desk Reference(第58版，2004)中。
术语“超声处理”指施用声能(例如超声粉碎)搅拌样品(例如微球)中微粒的作用。
如本文使用的“增稳物”或“增稳化合物”指能够提高本文描述的组合物、靶配体和/或其它生物活性治疗因子的稳定性的任何物质，其包括，例如混合物、悬浮液、乳剂、分散剂、囊泡等。
术语“干细胞”指具有自我更新和产生分化后代的能力的细胞。在某些实施方案中，干细胞是间充质干细胞。
术语“粘着”或“聚集”指其中一种物体或制品(例如微球)紧密地物理接触一种或多种物体或制品，且在没有外部力量下不能与其它物体或制品分离的状态(例如聚集成块或整体)。在某些实施方案中，粘着或聚集的微球指例如由于明胶或明胶替代品引起紧密地物理接触一种或多种微球的微球。术语“未粘着”、“没有粘着”、“未聚集”或“没有聚集”指没有紧密地物理接触或粘附的状态。在某些实施方案中，未粘着、没有粘着、未聚集、没有聚集的微球指基本上没有或完全没有与其它微球紧密地物理接触的微球。可以例如通过在显微镜下观察粘着微球在总数中的百分数。
如本文使用的术语“个体”和“患者”可互换地使用。如本文使用的个体是包括施用如本发明提供的微粒的哺乳动物，例如非灵长类(例如母牛、猪、马、猫、狗、大鼠、兔子等)或灵长类(例如猴子和人类)。在某些实施方案中，所述患者需要治疗或控制疾病或其症状。在具体的实施方案中，个体是人类。
如本文使用的术语“基本上球形”或“通常为球形”指接近理想球形的形状，其由呈现的最低外表面区域的体积定义。特别地，如本文使用的“基本上球形”指当查看所述微粒的任一个横截面(例如在显微镜下)时，平均大直径和平均小直径之间的差异为小于20％、小于15％、小于10％、小于5％或小于1％。在某些实施方案中，本发明提供的微球的表面在放大至多1000倍，例如至多100倍、至多10倍、0倍或其范围下似乎是光滑的。
术语“治疗剂”或“治疗药物”可以在本文中可互换地使用，其指递送到生物体内导管以产生期望的、通常是有益的作用的任何治疗活性物质。
如本文使用的术语“治疗”指可以在控制、治疗和/或改善给定疾病或其相关症状中使用的任何方案、方法和/或试剂。在某些实施方案中，术语“治疗”指生物学疗法、支持疗法和/或本领域技术人员例如医务人员已知用于控制或治疗给定的疾病或其相关症状的其它治疗。
如本文使用的术语“治疗”指减少或改善疾病或其症状的发展、严重性和/或持续时间。
如本文使用的术语“超纯的”指与没有用外来化合物或物质稀释或混合的化合物或物质(例如，单体或单体单元)相比，含有非常低水平杂质的化合物或物质(例如，单体或单体单元)的状态。在某些实施方案中，所述杂质是盐。在某些实施方案中，存在于化合物或物质中的杂质水平可以表示为(％)；例如，超纯的单体或超纯的单体单元可以含有小于1％、小于2％、小于3％、小于4％、小于5％、小于6％、小于7％、小于8％、小于9％、小于10％、小于15％、小于20％、小于25％的杂质或其任何范围。在某些实施方案中，通过溴化试验(参见，例如实施例3和6)测定杂质的水平。在其它的实施方案中，通过HPLC(参见例如实施例2和5)测定杂质的水平。
术语“子宫纤维瘤”或“平滑肌瘤”指由某些类型的子宫肌纤维和纤维结缔组织组成的非癌性肿瘤。
附图简述
图1A-1B显示单体纯度的比较。图1A显示对于从BioSepra获得的给定批次DEAE单体(T209，U088和U089)，使用溴化反应(右柱，如制造商BioSepra提供的)和HPLC(左柱)观察到的纯度灵敏性差异。图1B显示对于两种不同批次的三丙烯醛(从BioSepra获得的R426和R402)，使用溴化反应(右柱)或HPLC(左柱)观察到的纯度灵敏性差异，数据以假定获得的重结晶三丙烯醛(TA-R)的纯度为100％表示，并且将其与重结晶(TA)之前来自SAFC的三丙烯单体比较。
图2A-2C显示超声粉碎减少粘着性微球。图像分析显示超声粉碎显著减少粘着性微球。用方法没有观察到微球破碎。图2A显示未交联的微球，超声粉碎开始时的微球(左图)和超声粉碎15分钟后的微球(右图)。超声粉碎使粘着性微球的百分数从约7％降低至约0.2％。图2B显示交联后的微球，在交联之前没有用超声粉碎的微球(左图)，或在交联之前用超声粉碎的微球(右图)。在超声粉碎步骤之后，进行过筛。超声粉碎使粘着性微球的百分数从约3％降低至接近约0％。图2C显示交联之前的微球，超声粉碎开始时的微球(左图)和超声粉碎2×15min.之后的微球(右图)。超声粉碎使粘着性微球的百分数从约9.2％降低至约1.6％。
图3A-3C显示在明胶交联之前(图3A)和之后(图3B)接受超声粉碎的粘着性微球的百分数。在超声粉碎步骤之后进行过筛，将筛上的体积量的百分数显示在图3C中。
图4A-4G显示起始原料和微球的高分辨魔角自旋(HR-MAS)一维(1D)1H谱。图4A-D显示三丙烯醛(4A)、明胶(4B)、MBA(4C)和DEAE丙烯酰胺(4D)的HR-MAS一维1H谱。图4E-4G显示三丙烯醛(4E)、MBA(4F)和DEAE丙烯酰胺(4G)的1H核的属性。
图5A-5J显示由不同来源的物质制备的微球的一维1H NMR谱。图5A-5D显示样品SAFC FMP 128和PALL FMP 130的NMR谱。图5A是NMR谱的叠加，显示由该图谱鉴定的相应主峰(标记为A、B和C)之间的类似性。图5B显示在9-5ppm区域的NMR谱。图5C显示在5-0ppm区域的NMR谱。图5D显示在3.4-1.2ppm区域的NMR谱。图5E-5J显示样品SAFC FMP 128、PALL FMP 130、FM0903031-M1675和FM0903021-M1654的NMR谱。图5E显示NMR谱的比较。图5F显示2.6-1.5ppm的NMR谱。图5G显示在3.4-1.2ppm区域的谱图。图5H显示在9-5ppm区域的NMR谱。图5I显示所述谱图的叠加(图5I)。图5J显示拆解重叠峰后的NMR谱。
图6显示示例性进料环处理的示意图。
图7显示用于NMR分析的HR-MAS转子。
详细说明
在某些实施方案中，本发明提供的微球是对器官、组织和细胞无毒的，生物相容的，且利用其促进的细胞生长而粘附到植入部位的各种细胞和组织。另外，在某些实施方案中，这些微球是非吸收的和非生物降解的，因此，其是稳定的、持久性的，并且一旦植入期望的部位，将保持其一般形状和位置。在进一步的实施方案中，所述微球在悬浮液中也是稳定的，其允许微球或其它固体基质配制和贮存在悬浮液中，和用不同的液体注射。
A.用于栓塞形成的微球
在一个方面，本发明提供了微球，其包含：(a)包含N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体单元、二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体单元和N，N-亚甲基-二丙烯酰胺单体单元的共聚物，和(b)交联的明胶或明胶替代物。在另一个方面，本发明提供了微球，其包含：(a)通过共聚N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体、二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体和N，N-亚甲基-二丙烯酰胺单体制备的共聚物，和(b)交联的明胶或明胶替代物。在具体的实施方案中，所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺、二乙基氨基乙基丙烯酰胺和N，N-亚甲基二丙烯酰胺单体(或单体单元)中的一个、两个或所有三个都是超纯的单体(或单体单元)。在某些实施方案中，所述微球在1H NMR谱中显示出第一个峰(例如，约3.5ppm至约4ppm)、第二个峰(例如，约3ppm至约3.5ppm)和第三个峰(例如，约1ppm至约1.5ppm)。在具体的实施方案中，第二个峰与第一个峰的积分比为约0.50至约0.65，和/或第三个峰与第一个峰的积分比为约0.55至约0.75(例如，约0.61至约0.75)。
在一个实施方案中，所述微球包含：(a)包含N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体单元、二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体单元和N，N-亚甲基-二丙烯酰胺单体单元的共聚物，和(b)交联的明胶，其中所述微球在1H NMR谱中显示出约3.5ppm至约4ppm的第一个峰、约3ppm至约3.5ppm的第二个峰和约1ppm至约1.5ppm的第三个峰；并且其中(i)第二个峰与第一个峰的积分比为约0.50至约0.65，(ii)第三个峰与第一个峰的积分比为约0.55至约0.75(例如，约0.61至约0.75)，或(iii)(i)和(ii)的组合。在另一个实施方案中，所述微球包含：(a)通过共聚N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体、二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体和N，N-亚甲基-二丙烯酰胺单体制备的共聚物，和(b)交联的明胶；其中所述微球在1H NMR谱中显示出约3.5ppm至约4ppm的第一个峰、约3ppm至约3.5ppm的第二个峰和约1ppm至约1.5ppm的第三个峰；并且其中(i)第二个峰与第一个峰的积分比为约0.50至约0.65，(ii)第三个峰与第一个峰的积分比为约0.55至约0.75(例如，约0.61至约0.75)，或(iii)(i)和(ii)的组合。在某些实施方案中，第一个峰在约3.77ppm，第二个峰在约3.2ppm，第三个峰在约1.3ppm，或其组合。在其它的实施方案中，第二个峰与第一个峰的积分比为约0.574，或者其中第三个峰与第一个峰的积分比为约0.625。在某些实施方案中，当记录1H NMR谱(例如，在400MHz)时，所述微球在25℃下和/或在氘代溶剂中。
在一些实施方案中，一个或多个所述单体(或单体单元)是超纯的单体(或单体单元)。在某些实施方案中，所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体、二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体和/或N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体各自是超纯的单体。在具体的实施方案中，所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体包含少于9％的杂质，和/或所述二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体包含少于2％的杂质(例如，如通过HPLC(参见，例如实施例2和5)或溴化试验(参见，例如实施例3和6)测定)。在某些实施方案中，所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体、二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体和N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体各自是超纯的单体。在一个实施方案中所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体是超纯的单体，而所述二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体和N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体不是超纯的单体。在另一个实施方案中，所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体和所述二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体各自是超纯的单体，而所述N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体不是超纯的单体。在某些实施方案中，所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体和所述N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体各自是超纯的单体，而所述二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体不是超纯的单体。在一个实施方案中，所述二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体是超纯的单体，而所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体和所述N，N-亚甲基二丙烯酰胺单体不是超纯的单体。在另一个实施方案中，所述二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体和所述N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体各自是超纯的单体，而所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺不是超纯的单体。在一个实施方案中，所述N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体是超纯的单体，而所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体和所述二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体不是超纯的单体。在另一个实施方案中，所述二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体是超纯的单体，当所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体不是。在仍然另一个实施方案中，所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺和二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体都是超纯的单体。在进一步的实施方案中，当认为必需时，可以通过引入例如但不限于烃链和/或亲水性电离化学基团改变这些单体的疏水性或离子特性，所述化学基团可以例如用于促进微球的药物-负载特性(例如，共聚物和药物之间的离子相互作用)。例如，在某些实施方案中，修饰所述单体或聚合物以增加酸性官能团(例如，向单体混合物加成丙烯酸钠或乙烯磺酸钠)，其可以例如与给定药物(例如，多柔比星或其它蒽环类)的胺官能团相互作用。在一个具体的实施方案中，所述单体是用磺酸酯基团修饰的。在某些实施方案中，所述单体的含水量为约5％至约0％，例如小于等于约5％、小于等于约4％、小于等于约3％、小于等于约2％或小于等于约1％。含水量可以使用本领域已知的方法例如NMR分析来测定。
在一些实施方案中，所述明胶是交联的，例如交联到所述微球的共聚物或在其之内。在其它的实施方案中，所述明胶不是交联的。如本文使用的明胶可以来自任何来源。示例性的来源包括，但不限于从牛、猪和马的骨、结缔组织、器官和一些肠提取的胶原。在一个具体的实施方案中，所述明胶是猪明胶。在具体的实施方案中，所述明胶是药物和/或食品级明胶，其可以从市售供应商例如PB Leiner(Vilvoorde，Belgium)获得。
在第二个方面，本发明提供了微球，其是通过包括如下步骤的方法制备的：(a)制备包含(i)N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体，(ii)二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体，(iii)N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体，和(iv)明胶的水溶液，其中所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体、二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体和/或N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体是超纯的单体；(b)将该水溶液加入到具有低水混容性的液体有机相(例如油，例如矿物油，例如石蜡油)中；从而得到包含下述共聚物的微球，该共聚物含有N-三羟甲基甲基丙烯酰胺、二乙基氨基乙基丙烯酰胺和N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体单元；(c)任选地超声处理该微球(例如，超声粉碎)；和(d)交联明胶。该方法的实施方案描述在下述部分C中。
本发明提供的微球可以具有任何形状。在具体的实施方案中，这些微球的形状是基本上球形的。在某些实施方案中，所述微球是均匀的形状。
在某些实施方案中，将提供的微球调整至某一大小范围。这样的调整可以使用本领域已知的方法获得，所述方法例如使用合适大小筛孔的进行一轮或多轮过筛。
在某些实施方案中，本发明提供的微球的直径为约1μm至2000μm，例如约10μm至1000μm、约40μm至约120μm、约100μm至约300μm、约300μm至约500μm、约500μm至约700μm、约700μm至约900μm或约900μm至约1200微米。这些直径可以使得通过多种途径经由导管、针(例如18标准规格或更小的针)、管等将所述微球递送到靶血管、组织或器官，所述途径包括血管、导管内、经食道、表皮下、皮下、粘膜下、经支气管或间质。在某些实施方案中，所述微球可以经由巨噬细胞或免疫系统或淋巴系统的其它成分消除。
在某些实施方案中，所述微球具有均匀的大小。在某些实施方案中，所述微球具有均匀的大小，其中个体微球之间的直径差异为约0μm至约100μm、约0μm至约50μm、或约0μm至约25μm，例如100μm以下、约50μm以下、约25mm以下、约10mm以下、或约5μm以下。
在某些实施方案中，所述微球以如下群体存在，其中超过68％具有的直径为平均直径的±20％、平均直径的±10％、平均直径的±15％、平均直径的±10％、平均直径的±9％、平均直径的±8％、平均直径的±7％、平均直径的±6％、平均直径的±5％、平均直径的±4％、平均直径的±3％、平均直径的±2％或平均直径的±1％、或其任何范围。在一个实施方案中，所述微球以如下群体存在，其中超过70％具有的直径为平均直径的±20％、平均直径的±10％、平均直径的±15％、平均直径的±10％、平均直径的±9％、平均直径的±8％、平均直径的±7％、平均直径的±6％、平均直径的±5％、平均直径的±4％、平均直径的±3％、平均直径的±2％或平均直径的±1％、或其任何范围。在一个实施方案中，所述微球以如下群体存在，其中超过75％具有的直径为平均直径的±20％、平均直径的±10％、平均直径的±15％、平均直径的±10％、平均直径的±9％、平均直径的±8％、平均直径的±7％、平均直径的±6％、平均直径的±5％、平均直径的±4％、平均直径的±3％、平均直径的±2％或平均直径的±1％、或其任何范围。在一个实施方案中，所述微球以如下群体存在，其中超过80％具有的直径为平均直径的±20％、平均直径的±10％、平均直径的±15％、平均直径的±10％、平均直径的±9％、平均直径的±8％、平均直径的±7％、平均直径的±6％、平均直径的±5％、平均直径的±4％、平均直径的±3％、平均直径的±2％或平均直径的±1％、或其任何范围。在一个实施方案中，所述微球以如下群体存在，其中超过85％具有的直径为平均直径的±20％、平均直径的±10％、平均直径的±15％、平均直径的±10％、平均直径的±9％、平均直径的±8％、平均直径的±7％、平均直径的±6％、平均直径的±5％、平均直径的±4％、平均直径的±3％、平均直径的±2％或平均直径的±1％、或其任何范围。在一个实施方案中，所述微球以如下群体存在，其中超过90％具有的直径为平均直径的±20％、平均直径的±10％、平均直径的±15％、平均直径的±10％、平均直径的±9％、平均直径的±8％、平均直径的±7％、平均直径的±6％、平均直径的±5％、平均直径的±4％、平均直径的±3％、平均直径的±2％或平均直径的±1％、或其任何范围。在一个实施方案中，所述微球以如下群体存在，其中超过95％具有的直径为平均直径的±20％、平均直径的±10％、平均直径的±15％、平均直径的±10％、平均直径的±9％、平均直径的±8％、平均直径的±7％、平均直径的±6％、平均直径的±5％、平均直径的±4％、平均直径的±3％、平均直径的±2％或平均直径的±1％、或其任何范围。
在一些实施方案中，小于1％、小于0.9％、小于0.8％、小于0.7％、小于0.6％、小于0.5％、小于0.4％、小于0.3％或少于0.2％、小于0.1％或0％(或其范围)的微球群体在所述微球给定的扩展范围(例如，±50μm、±100μm、±150μm、±200μm、±250μm或±300μm)之外。作为一个示例性的实例，如果调整后的微球群体的直径为500μm至700μm(范围)，则扩展范围可以为例如±100μm，例如其中99％的微球具有的大小范围为400μm到800μm，1％的微球的大小范围在扩展范围之外。在另一个示例性的实施方案中，所述范围为500μm至700μm，标准范围为600μm，其中80％的群体具有标准范围的±100μm(即，扩展范围500μm至700μm)、99％的群体具有标准范围的±200μm(即，扩展范围400μm至800μm)，0.5％至1％的群体大于800μm，其余0％至0.5％具有小于400μm的群体(总共100％)。在某些实施方案中，所述标准范围为约50μm至2000μm，例如80μm、100μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、1000μm、1100μm、1150μm、1200μm、1300μm、1400μm、1500μm、1600μm、1700μm、1800μm、1900μm、2000μm或其任何范围。
所述微球在悬浮液中是稳定的，其允许微球或其它固体基质配制和贮存在悬浮液中，用不同的液体注射。更特别地，所述微球的亲水性性质允许将其置于悬浮液中，特别地，其为无菌非致热或无热原可注射溶液的形式，而避免形成聚集体或粘附到贮存容器和植入装置例如导管、注射器、针等的壁。
本发明提供的微球可以被例如通过注射植入到身体的各个部位。用于本发明提供的组合物和方法的聚合材料对组织和细胞无毒，并且是生物相容的，即通常不会引起炎症。当植入期望的部位时，所述微球可以保持其一般形状和位置。本发明提供的微球是可压缩的，在具体的实施方案中，其可以经由18标准规格或更小的针注射。
在某些实施方案中，所述微球是经由18标准规格或更小的针可注射的，且不能被免疫系统或淋巴系统清除，或减少被消除。在某些实施方案中，用促进细胞粘附的试剂涂布所述聚合物。在某些实施方案中，所述微球除了包含明胶或明胶替代物之外，还包含细胞粘附促进剂。可以使用本领域熟知的各种类型的细胞粘附促进剂。在某些实施方案中，所述细胞粘附促进剂选自胶原、明胶、羧甲基(CM)葡聚糖、DEAE葡聚糖、葡糖胺聚糖、纤连蛋白、凝集素、聚阳离子(例如聚赖氨酸、壳聚糖)、任何其它天然的或合成的生物学细胞粘附试剂或其任意组合。在某些实施方案中，通过使粘合剂成网状增加微球的稳定性。在明胶的情况下，例如，帮助形成网状的试剂可以选自在明胶胺上反应的双官能团化学试剂(例如，戊二醛、甲醛、乙二醛等)。在某些实施方案中，所述细胞粘附促进剂在微球或其它固体基材中的存在量为沉降的微球的约0.1g/ml至1g/ml。
在某些实施方案中，由于例如进一步包含标记试剂，所述微球在光下和在体内是可见的。在某些实施方案中，所述微球可以在其合成之后进行标记。这可以通过例如接枝荧光标记物衍生物(包括，例如异硫氰酸荧光素(FITC)、若丹明异硫氰酸盐(RITC)等)来进行。在某些实施方案中，可以通过用标记物化学偶合所述单体获得可检测的单体，所述标记物可以为：使得所述微球能够直接显色的化学染料，例如Cibacron Blue或Procion RedHE-3B，磁共振成像试剂(铒、钆或磁铁矿)；造影剂，例如钡或碘盐，包括例如(丙烯酰氨基-3-丙酰胺基)-3-三碘-2，4，6-苯甲酸。在钡或磁铁矿盐的情况下，其可以直接以粉末形式引入初始单体溶液中。在一些实施方案中，造影剂是不透射线的造影剂，例如非离子造影剂。在某些实施方案中，在注射到患者之前、期间和/或之后，将造影剂与所述微球混合。在一个具体的实施方案中，向患者施用造影剂(例如，非离子造影剂)和本发明提供的微球的组合物。
可以通过亲和层析中熟知的化学偶合方法将细胞粘附促进剂或标记试剂引入到微球上。该引入也可以通过扩散到构成微球的凝胶网络之内，然后通过沉淀或化学交联将扩散的分子俘获在合适的位置来实现。在某些实施方案中，活细胞(例如干细胞)连接所述微球，在其中或其上与周围组织连接形成细胞层，其可以增强珠粒的长期稳定性。
1.N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体
N-三羟甲基甲基丙烯酰胺也可以被称为三丙烯醛，N-[1，3-二羟基-2-(羟甲基)丙-2-基]丙-2-烯酰胺；TRIS-丙烯酰胺；N-[三(羟甲基)甲基]丙烯酰胺；N-丙烯醛基三(羟甲基)氨基甲烷；或N-丙烯酰基-三(羟甲基)氨基甲烷。在某些实施方案中，N-三羟甲基甲基丙烯酰胺定义为具有CAS登记号13880-05-2，分子式C7H13NO4，分子量约175.2克/摩尔，结构：
N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体是市售可获得的(例如，PALLBiosepra，France or Sigma Aldrich Fine Chemicals(SAFC)，产品号码78561)或可以是合成的(参见，例如实施例4)。在某些实施方案中，所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体是根据下述方案合成的；
在某些实施方案中，所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体是超纯的单体。在具体的实施方案中，所述超纯的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体包含0％至9％的杂质，即不同于N-三羟甲基甲基丙烯酰胺的物质，例如过量的起始原料或其衍生物(例如丙烯酰氯或2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1，3-二醇)、副产物或无机盐，例如如通过溴化试验(例如如在实施例6中提供的)测定的。在某些实施方案中，所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体包含25％至0％的杂质，例如25％至20％、25％至15％、25％至10％、25％至5％、25％至1％、25％至0％、20％至15％、20％至10％、20％至5％、20％至1％、20％至0％、15％至10％、15％至5％、15％至1％、15％至0％、10％至5％、10％至1％、10％至0％、5％至1％、5％至0％(例如，如通过例如如在实施例5中提供的HPLC测定的)的杂质。在其它的实施方案中，所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体包含25％至0％的杂质，例如25％至20％、25％至15％、25％至10％、25％至5％、25％至1％、25％至0％、20％至15％、20％至10％、20％至5％、20％至1％、20％至0％、15％至10％、15％至5％、15％至1％、15％至0％、10％至5％、10％至1％、10％至0％、5％至1％、5％至0％(例如，如通过例如如在实施例5中提供的HPLC测定的)。在某些实施方案中，所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体包含小于25％、小于24％、小于23％、小于22％、小于21％、小于20％、小于19％、小于18％、小于17％、小于16％、小于15％、小于14％、小于13％、小于12％、小于11％、小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2.75％、小于2.5％、小于2.25％、小于2％、小于1.75％、小于1.5％、小于1.25％、小于1％、小于0.25％、小于0.5％、小于0.25％或0％或其任何范围的杂质(例如，如通过例如如在实施例6中提供的溴化试验测定的)。在其它的实施方案中，所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体包含小于25％、小于24％、小于23％、小于22％、小于21％、小于20％、小于19％、小于18％、小于17％、小于16％、小于15％、小于14％、小于13％、小于12％、小于11％、小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2.75％、小于2.5％、小于2.25％、小于2％、小于1.75％、小于1.5％、小于1.25％、小于1％、小于0.25％、小于0.5％、小于0.25％或0％或其任何范围的杂质(例如，如通过例如如在实施例5中提供的HPLC测定的)。在具体的实施方案中，所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体包含小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％或0％或其任何范围的杂质(例如，如通过如在实施例6中提供的溴化试验测定的)。在其它的实施方案中，所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体包含小于9％、小于8％、小于7％、小于5％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％或0％或其任何范围的杂质(例如，如通过如在实施例5中提供的HPLC测定的)。
2.二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体
二乙基氨基乙基丙烯酰胺也可以称为DEAE、DEAE丙烯酰胺、N-((2-二乙氨基)乙基)丙烯酰胺；N-(2-二乙氨基乙基)丙-2-烯酰胺；N-((2-二乙氨基)乙基)丙烯酰胺；N-(2-(二乙氨基)乙基)丙烯酰胺；或N-(2-(二乙氨基)乙基)-2-丙烯酰胺。
在某些实施方案中，二乙基氨基乙基丙烯酰胺定义为具有分子式C9H18N2O，分子量约170.3克/摩尔，结构：
二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体是市售可获得的(例如，PALLBiosepra，France或SAFC)或可以合成的(参见，例如实施例1)。在某些实施方案中，所述二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体是根据下述方案合成的：
在某些实施方案中，所述二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体是超纯的单体。在具体的实施方案中，所述超纯的二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体包含0％到2％的杂质，即不同于二乙基氨基乙基丙烯酰胺的物质，例如过量的起始原料或其衍生物(例如丙烯酰氯、N，N，N’，N’-四甲基乙二胺或N，N-二乙基乙二胺)、副产物或无机盐(如通过如在实施例3中提供的溴化试验测定的)。在某些实施方案中，所述二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体包含20％至0％的杂质，例如20％至15％、20％至10％、20％至5％、20％至1％、20％至0％、15％至10％、15％至5％、15％至1％、15％至0％、10％至5％、10％至1％、10％至0％、5％至1％、5％到0％(例如，如通过例如如在实施例3中提供的溴化试验测定的)。在其它的实施方案中，所述二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体包含20％至0％的杂质，例如20％至15％、20％至10％、20％至5％、20％至1％、20％至0％、15％至10％、15％至5％、15％至1％、15％至0％、10％至5％、10％至1％、10％至0％、5％至1％、5％到0％(例如，如通过例如如在实施例2中提供的HPLC测定的)。在某些实施方案中，所述二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体包含小于20％、小于19％、小于18％、小于17％、小于16％、小于15％、小于14％、小于13％、小于12％、小于11％、小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6、小于5％、小于4％、小于3％、小于2.75％、小于2.5％、小于2.25％、小于2％、小于1.75％、小于1.5％、小于1.25％、小于1％、小于0.25％、小于0.5％、小于0.25％或0％或其任何范围的杂质(例如，如通过例如如在实施例3中提供的溴化试验测定的)。在其它的实施方案中，所述二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体包含小于20％、小于19％、小于18％、小于17％、小于16％、小于15％、小于14％、小于13％、小于12％、小于11％、小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6、小于5％、小于4％、小于2％、小于2.75％、小于2.5％、小于2.25％、小于2％、小于1.75％、小于1.5％、小于1.25％、小于1％、小于0.25％、小于0.5％、小于0.25％或0％或其任何范围的杂质(例如，如通过例如如在实施例2中提供的HPLC测定的)。在具体的实施方案中，所述DEAE单体包含小于5％、小于4％、小于3％、小于2.75％、小于2.5％、小于2.25％、小于2％、小于1.75％、小于1.5％、小于1.25％、小于1％、小于0.25％、小于0.5％小于0.25％、或0％或其任何范围的杂质(例如，如通过例如如在实施例3中提供的溴化试验测定的)。在其它具体的实施方案中，所述DEAE单体包含小于5％、小于4％、小于3％、小于2.75％、小于2.5％、小于2.25％、小于2％、小于1.75％、小于1.5％、小于1.25％、小于1％、小于0.25％、小于0.5％、小于0.25％、或0％或其任何范围的杂质(例如，如通过例如如在实施例2中提供的HPLC测定的)。所述DEAE单体可以以液体或固体形式提供。在某些实施方案中，所述DEAE单体以液体胺形式提供。在具体的实施方案中，所述DEAE单体不以粉末盐形式(粉末)提供。
3.N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体
N，N-亚甲基二丙烯酰胺也可以称为MBA，N-[(丙-2-烯酰胺基)甲基]丙-2-烯酰胺；亚甲基二丙烯酰胺；亚甲基双丙烯酰胺；N，N’-亚甲基二丙烯酰胺；N，N’-亚甲基双丙烯酰胺；或N，N’-次甲基二丙烯酰胺。
在某些实施方案中，N，N-亚甲基二-丙烯酰胺定义为具有分子式C7H10N2O2，分子量约154.2克/摩尔，结构：
N，N-亚甲基二丙烯酰胺单体是市售可获得的(例如，PALL Biosepra，France or SAFC)或者可以合成的。在某些实施方案中，所述N，N-亚甲基二丙烯酰胺单体是根据下述方案合成的：
在某些实施方案中，所述N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体是超纯的单体。在具体的实施方案中，所述超纯的N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体包含0％到9％的杂质，即不同于N，N-亚甲基二丙烯酰胺单体的物质，例如过量的起始原料或其衍生物、副产物或无机盐(例如，如通过溴化试验测定的)。在其它的实施方案中，所述超纯的N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体包含0％到9％的杂质，即不同于N，N-亚甲基二丙烯酰胺单体的物质，例如过量的起始原料或其衍生物、副产物或无机盐(例如，如通过HPLC测定的)。在某些实施方案中，所述N，N-亚甲基二丙烯酰胺单体包含小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％、小于0.5％或0％或其任何范围的杂质(例如，如通过溴化试验测定的)。在某些实施方案中，所述N，N-亚甲基二丙烯酰胺单体包含小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％、小于0.5％或0％或其任何范围的杂质(例如，如通过HPLC测定的)。
本发明提供的任何单体的纯度都可以通过本领域已知的多种方法来评价。例如，杂质的含量可以通过单体中双键的含量来测定，例如通过溴化试验(参见，例如实施例3和6)。可以使用溴化试验来测定所述化合物是否包含任何C＝C双键，或烯烃官能团，因为烯烃可以容易地与溴反应引起变色。示例性的溴化反应：
溴与双键反应，溴的消耗量可测定存在双键的量，其用于评价单体(例如，三丙烯醛)的纯度或实际存在性。使用该反应的标准偏差可以为至少+/-3％。存在双键的量可对应于存在单体的纯度，因为副产物不应该以大量存在。示例性的副产物为：
还可以通过具有较高检测灵敏度的其它方法(例如高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)或核磁共振(NMR))来检测单体中存在的杂质。在一个示例性的实例中，可以进行HPLC分析来评价N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体的纯度，其在Waters Atlantic C18柱(例如5μm，4.6×250mm)上使单体样品运行，并检测在特定波长例如在约230nm的吸附(参见，例如实施例2和5)。试验单体的纯度可以例如通过比较试验样品的HPLC曲线与具有已知纯度的对照单体的HPLC曲线来测定。
在某些实施方案中，所述DEAE单体包含小于2.5％、小于2％、小于1.5％或小于1％的下述杂质的一种或两种(例如，如通过HPLC测定的)，单独或组合：
在某些实施方案中，所述微球包含约1％至约95％重量N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体(例如，超纯的单体)。在某些实施方案中，所述微球包含选自下述量的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体(例如，超纯的单体)：约1％重量、约5％重量、约10％重量、约15％重量、约20％重量、约25％重量、约30％重量、约35％重量、约40％重量、约45％重量、约50％重量、约55％重量、约60％重量、约65％重量、约70％重量、约75％重量、约80％重量、约85％重量、约90％重量和约95％重量(或其范围)。
在某些实施方案中，所述微球包含约1％至约95％重量二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体(例如，超纯的单体)。在某些实施方案中，所述微球包含选自下述量的二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体(例如，超纯的单体)：约1％重量、约5％重量、约10％重量、约15％重量、约20％重量、约25％重量、约30％重量、约35％重量、约40％重量、约45％重量、约50％重量、约55％重量、约60％重量、约65％重量、约70％重量、约75％重量、约80％重量、约85％重量、约90％重量和约95％重量(或其范围)。
在其它的实施方案中，所述微球包含约1％至约95％重量N，N-亚甲基二丙烯酰胺单体(例如，超纯的单体)。在某些实施方案中，所述微球包含选自下述量的N，N-亚甲基二丙烯酰胺单体(例如，超纯的单体)：约1％重量、约5％重量、约10％重量、约15％重量、约20％重量、约25％重量、约30％重量、约35％重量、约40％重量、约45％重量、约50％重量、约55％重量、约60％重量、约65％重量、约70％重量、约75％重量、约80％重量、约85％重量、约90％重量和约95％重量(或其范围)。
在一个实施方案中，所述微球包含约58％至约66％重量的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体、约22％至约26％重量的二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体和约6％至约7％重量的N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体、及约0％至约13％重量的明胶或明胶替代物，使得总量为100％。
在某些实施方案中，本发明提供的微球可以包括任何重量百分数组合的上述单体(例如，一种或多种超纯的单体)。
在某些实施方案中，与没有采用一种或多种超纯的单体制备的相同微球相比，由本发明提供的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺、二乙基氨基乙基丙烯酰胺和/或N，N-亚甲基二-丙烯酰胺超纯的单体中的一种或多种制备的或包含本发明提供的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺、二乙基氨基乙基丙烯酰胺和/或N，N-亚甲基二-丙烯酰胺超纯的单体中的一种或多种(例如，使用本发明提供的方法)的本发明提供的微球可以引起减少注射后一种或多种副作用。不希望受到理论的束缚，副作用减少可能是制备的微球中杂质(例如，反应副产物，例如乙醇或丙烯酸，未反应的单体和/或抑制剂)数量减少的结果。
在其它的实施方案中，与没有采用一种或多种超纯的单体制备的相同微球相比，由本发明提供的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺、二乙基氨基乙基丙烯酰胺和/或N，N-亚甲基二-丙烯酰胺超纯的单体中的一种或多种制备的或包含本发明提供的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺、二乙基氨基乙基丙烯酰胺和/或N，N-亚甲基二-丙烯酰胺超纯的单体中的一种或多种(例如，使用本发明提供的方法)的本发明提供的微球可以引起聚合效率增加(例如，其中多种单体加入聚合物中，和/或交联效率更好)。
在另一个实施方案中，与没有采用一种或多种超纯的单体制备的相同微球相比，由本发明提供的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺、二乙基氨基乙基丙烯酰胺和/或N，N-亚甲基二-丙烯酰胺超纯的单体中的一种或多种制备的或包含本发明提供的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺、二乙基氨基乙基丙烯酰胺和/或N，N-亚甲基二-丙烯酰胺超纯的单体中的一种或多种(例如，使用本发明提供的方法)的本发明提供的微球可以引起凝胶点增加。凝胶点增加可以导致聚合反应更快，其可以进一步引起群体中聚集微球的数量降低。用于评价聚合反应中凝胶点的方法是本领域已知的(参见，例如Nita等人(2007)Rheol.Acta 46，595-600)。
在仍然其它的实施方案中，与没有采用一种或多种超纯的单体制备的相同微球相比，由本发明提供的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺、二乙基氨基乙基丙烯酰胺和/或N，N-亚甲基二-丙烯酰胺超纯的单体中的一种或多种制备的或包含本发明提供的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺、二乙基氨基乙基丙烯酰胺和/或N，N-亚甲基二-丙烯酰胺超纯的单体中的一种或多种(例如，使用本发明提供的方法)的本发明提供的微球可以引起所述微球的整个制备方法的改善，其可以导致微球的产率和/或总体质量改善(例如，破裂和/或聚集的微球更少)、产物更加一致性、大小均匀性更好、大小分布更窄、形状均匀性更好或其任意组合。
4.微球的NMR分析
在某些实施方案中，当通过NMR光谱学分析(参见，例如实施例14)时，本发明提供的微球显示出在一维(1D)1H NMR谱中的第一个峰(例如，约3.5ppm至约4.0ppm)、第二个峰(例如，约3.0ppm至约3.5ppm)和第三个峰(例如，约1.0ppm至约1.4ppm)。在某些实施方案中，可以通过NMR光谱仪，例如装备调谐的4mm HR-MAS probehead(1H，13C，lock 2H)或类似装置的Avance I Bruker光谱仪(1H)，进行NMR。在某些实施方案中，可以应用所述高分辨魔角自旋(HR-MAS)分析微球。不希望受到任何理论的束缚，最初开发HR-MAS技术用于使用固相合成的组合化学。所述HR-MAS特别地用于分析非完全可溶或包含固体的样品。当样品具有在合适的溶剂中膨胀或流动性增加的性质时，其具有非常好的结果。HR-MASNMR可以被认为是一种介于固态NMR和经典溶液态NMR的混合技术。类似于固态NMR，使用魔角自旋(MAS)有效地消除了由于化学位移各向异性、同核偶极相互作用和磁化率引起的谱线增宽。
在一些实施方案中，可以记录在100MHz和900MHz，例如100MHz、200MHz、300MHz、400MHz、500MHz、600MHz、700MHz、800MHz或900MHz或其范围的1H NMR谱。在一个具体的实施方案中，记录在400MHz的1H NMR谱。在某些实施方案中，所述微球可以分散在与NMR分析相容的任何溶剂中。示例性的溶剂包括，但不限于氘代溶剂，例如重水、乙酸-d4、丙酮-d6、乙腈-d3、苯-d6、氯仿-d、二氯甲烷-d2、N，N-二甲基甲酰胺-d7、二甲亚砜-d6、乙醇-d6、甲醇-d4、硝基甲烷-d3、比啶-d5、四氢呋喃-d8、甲苯-d8、三氟乙酸-d4和三氟乙醇-d3，及其它溶剂，例如二硫化碳、1，1，2，2-四氯乙烷、四氯化碳、乙醚(-100℃)、二甲醚(-100℃)、1，4-二噁烷、三氯氟甲烷、硝基苯、四氢呋喃(-100℃)。在一个具体的实施方案中，所述溶剂是重水(D2O)。
在某些实施方案中，可以在约0℃至约80℃，例如约10℃至约50℃、约15℃至约35℃、约20℃至约25℃(例如，室温)或约0℃至约5℃、或其任何范围的温度下，通过NMR光谱学分析微球。在一个具体的实施方案中，在约25℃的温度下分析微球。
在一个具体的实施方案中，以一维1D 1H NMR谱分析微球，使用基本上如在实施例14种提供的参数(例如，表10)，测定第一个、第二个和第三个峰和/或第二个峰与第一个峰的积分比(标准化成1)和第三个峰与第一个峰的积分比。
微球在1H NMR谱中显示的第一个峰可能应归于例如微球共聚物中的三羟甲基基团(例如C(CH2OH)3)。在某些实施方案中，微球在1H NMR谱中显示出的第一个峰为约3.60ppm至约3.95ppm，例如约3.65ppm至约3.90ppm、约3.70ppm至约3.85ppm或约3.75ppm到约3.80ppm、或其任何范围。在一个具体的实施方案中，微球在1H NMR谱中显示出的第一个峰在约3.77ppm。
微球在1H NMR谱中显示的第二个峰可能应归于例如连接碱性氮原子的CH2基团(例如(CH2N(CH2CH3)2))。在某些实施方案中，微球在1HNMR谱中显示出的第二峰为约3.05ppm至约3.45ppm，例如约3.10ppm至约3.40ppm、约3.15ppm至约3.35ppm、约3.20ppm到约3.30ppm、或约3.15ppm至约3.25ppm、或其任何范围。在一个具体的实施方案中，微球在1H NMR谱中显示出的第二峰在约3.2ppm。
微球在1H NMR谱中显示的第三个峰可能应归于微球的聚合结构中甲酰胺基团β位的基团(例如，CH2-CHCONH)。在某些实施方案中，微球在1H NMR谱中显示出的第三个峰为约1.01ppm至约1.49ppm，例如约1.05ppm至约1.47ppm、约1.10ppm至约1.45ppm、约1.15ppm到约1.40ppm、或约1.25ppm至约1.35ppm、或其任何范围。在一个具体的实施方案中，微球在1H NMR谱中显示出的第三个峰在约1.3ppm。在某些实施方案中，(i)第二个峰在约3.245ppm或以下，例如约3.211ppm或以下或约3.192ppm或以下；(ii)第三个峰在约1.297ppm或以下，例如约1.283ppm或以下或者约1.276ppm或以下；(ii)或(i)和(ii)的任意组合。在一个实施方案中，第二峰不在3.212或3.246(+/-0.002或0.005)ppm和/或第三个峰不在1.284或1.298(+/-0.002或0.005)ppm。
在某些实施方案中，微球在1H NMR谱中显示出的第二个峰与第一个峰的积分比为约0.498至约0.650，例如约0.53至约0.63、约0.55至约0.60或其任何范围。在某些实施方案中，微球在1H NMR谱中显示出的第二个峰与第一个峰的积分比为约0.50、0.51、0.52、0.53、0.54、0.55、0.56、0.57、0.58、0.59、0.60、0.61、0.62、0.63、0.64或0.65或其任何范围。在某些实施方案中，微球在1H NMR谱中显示出的第二个峰与第一个峰的积分比为约0.571、0.572、0.573、0.574、0.575、0.576、0.577、0.578或0.579或其任何范围。在一个具体的实施方案中，微球在1H NMR谱中显示出的第二峰与第一个峰的积分比为约0.574。
积分比可以使用本领域已知的方法计算，例如，通过将第一峰标准化成值1，并将其与第二(或第三个)峰与第一个峰的比相比较。不希望受到理论的束缚，认为可以将积分比与加入聚合物链中的每种物质的比例直接相关。即，较高的积分比可能与更多单体和/或更高比例的单体和掺入最终聚合物产物中的更少杂质、以及整体较好的聚合效率相关。
在一些实施方案中，与没有使用超纯的单体制备的相同微球相比，包含通过共聚如下组分制备的共聚物的微球在1H NMR谱中显示出的第二个峰与第一个峰的积分比为约5％至约100％以上，例如约5％以上、约10％以上、约15％以上、约20％以上、约25％以上、约30％以上、约35％以上、约40％以上、约45％以上、约50％以上、约55％以上、约60％以上、约65％以上、约70％以上、约75％以上、约80％以上、约85％以上、约85％以上、约90％以上、约95％以上、约100％以上或其任何范围，所述组分为：(i)超纯的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体，(ii)超纯的二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体，(iii)超纯的N，N亚甲基二丙烯酰胺单体，(iv)超纯的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体和超纯的二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体，(v)超纯的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体，和超纯的N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体，(vi)超纯的二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体和超纯的N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体，或(vii)超纯的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体、超纯的二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体和超纯的N，N-亚甲基二丙烯酰胺单体。
在一些实施方案中，与不包含超纯的单体单元的相同微球(没有使用相应的超纯的单体制备)相比，包含如下组分的微球在1H NMR谱中显示出的第二个峰与第一个峰的积分比为约5％至约100％以上，例如约5％以上、约10％以上、约15％以上、约20％以上、约25％以上、约30％以上、约35％以上、约40％以上、约45％以上、约50％以上、约55％以上、约60％以上、约65％以上、约70％以上、约75％以上、约80％以上、约85％以上、约85％以上、约90％以上、约95％以上、约100％以上或其任何范围，所述组分为：(i)超纯的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体单元，(ii)超纯的二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体单元，(iii)超纯的N，N亚甲基二丙烯酰胺单体单元，(iv)超纯的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体单元和超纯的二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体单元，(v)超纯的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体单元，和超纯的N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体单元，(vi)超纯的二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体单元和超纯的N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体单元，或(vii)超纯的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体单元、超纯的二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体单元和超纯的N，N-亚甲基二丙烯酰胺单体单元。
在某些实施方案中，微球在1H NMR谱中显示出的第三个峰与第一个峰的积分比为约0.53至约0.75，例如约0.57至约0.60、约0.60至约0.65、约0.61至约0.75或约0.61至约0.65或其任何范围。在某些实施方案中，微球在1H NMR谱中显示出的第三个峰与第一个峰的积分比为约0.53、0.54、0.55、0.56、0.57、0.58、0.59、0.60、0.61、0.62、0.63、0.64、0.65、0.66、0.67、0.68、0.69、0.70、0.71、0.72、0.73、0.74或0.75或其任何范围。在某些实施方案中，微球在1H NMR谱中显示出的第三个峰与第一个峰的积分比为约0.611、0.612、0.613、0.614、0.615、0.616、0.617、0.618、0.619、0.620、0.621、0.622、0.623、0.624、0.625、0.626、0.627、0.628或0.629或其任何范围。在一个具体的实施方案中，微球在1H NMR谱中显示出的第三个峰与第一个峰的积分比为约0.625。
在一些实施方案中，与没有使用超纯的单体制备的相同微球相比，包含通过共聚如下组分制备的共聚物的微球在1H NMR谱中显示出的第三个峰与第一个峰的积分比为约5％至约100％以上，例如约5％以上、约10％以上、约15％以上、约20％以上、约25％以上、约30％以上、约35％以上、约40％以上、约45％以上、约50％以上、约55％以上、约60％以上、约65％以上、约70％以上、约75％以上、约80％以上、约85％以上、约85％以上、约90％以上、约95％以上、约100％以上或其任何范围，所述组分为：(i)超纯的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体，(ii)超纯的二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体，(iii)超纯的N，N亚甲基二丙烯酰胺单体，(iv)超纯的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体和超纯的二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体，(v)超纯的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体，和超纯的N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体，(vi)超纯的二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体和超纯的N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体，或(vii)超纯的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体、超纯的二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体和超纯的N，N-亚甲基二丙烯酰胺单体。
在一些实施方案中，与不包含超纯的单体单元的相同微球(没有使用相应的超纯的单体制备)相比，包含如下组分的微球在1H NMR谱中显示出的第三个峰与第一个峰的积分比为约5％至约100％以上，例如约5％以上、约10％以上、约15％以上、约20％以上、约25％以上、约30％以上、约35％以上、约40％以上、约45％以上、约50％以上、约55％以上、约60％以上、约65％以上、约70％以上、约75％以上、约80％以上、约85％以上、约85％以上、约90％以上、约95％以上、约100％以上或其任何范围，所述组分为：(i)超纯的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体单元，(ii)超纯的二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体单元，(iii)超纯的N，N亚甲基二丙烯酰胺单体单元，(iv)超纯的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体单元和超纯的二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体单元，(v)超纯的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体单元，和超纯的N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体单元，(vi)超纯的二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体单元和超纯的N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体单元，或(vii)超纯的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体单元、超纯的二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体单元和超纯的N，N-亚甲基二丙烯酰胺单体单元。
在一些实施方案中，包含通过共聚如下组分制备的共聚物的微球在1HNMR谱中显示出的第二个峰与第一个峰的积分比为约5％至约100％以上，例如约5％以上、约10％以上、约15％以上、约20％以上、约25％以上、约30％以上、约35％以上、约40％以上、约45％以上、约50％以上、约55％以上、约60％以上、约65％以上、约70％以上、约75％以上、约80％以上、约85％以上、约85％以上、约90％以上、约95％以上、约100％以上或其任何范围，所述组分为：(i)超纯的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体，(ii)超纯的二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体，(iii)超纯的N，N亚甲基二丙烯酰胺单体，(iv)超纯的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体和超纯的二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体，(v)超纯的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体，和超纯的N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体，(vi)超纯的二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体和超纯的N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体，或(vii)超纯的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体、超纯的二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体和超纯的N，N-亚甲基二丙烯酰胺单体，和(b)包含通过共聚如下组分制备的共聚物的微球分别在1H NMR谱中显示出的第三个峰与第一个峰的积分比为约5％至约100％以上，例如约5％以上、约10％以上、约15％以上、约20％以上、约25％以上、约30％以上、约35％以上、约40％以上、约45％以上、约50％以上、约55％以上、约60％以上、约65％以上、约70％以上、约75％以上、约80％以上、约85％以上、约85％以上、约90％以上、约95％以上、约100％以上或其任何范围，所述组分为：(i)超纯的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体，(ii)超纯的二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体，(iii)超纯的N，N亚甲基二丙烯酰胺单体，(iv)超纯的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体和超纯的二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体，(v)超纯的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体，和超纯的N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体，(vi)超纯的二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体和超纯的N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体，或(vii)超纯的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体、超纯的二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体和超纯的N，N-亚甲基二丙烯酰胺单体；和(b)。
在其它的实施方案中，与不包含超纯的单体单元的相同微球(没有使用相应的超纯的单体制备)相比，包含如下组分的微球在1H NMR谱中显示出的第二个峰与第一个峰的积分比为约5％至约100％以上，例如约5％以上、约10％以上、约15％以上、约20％以上、约25％以上、约30％以上、约35％以上、约40％以上、约45％以上、约50％以上、约55％以上、约60％以上、约65％以上、约70％以上、约75％以上、约80％以上、约85％以上、约85％以上、约90％以上、约95％以上、约100％以上或其任何范围，所述组分为：(i)超纯的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体单元，(ii)超纯的二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体单元，(iii)超纯的N，N亚甲基二丙烯酰胺单体单元，(iv)超纯的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体单元和超纯的二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体单元，(v)超纯的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体单元和超纯的N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体单元，(vi)超纯的二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体单元和超纯的N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体单元，或(vii)超纯的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体单元、超纯的二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体单元和超纯的N，N-亚甲基二丙烯酰胺单体单元，和(b)包含如下组分的微球在1H NMR谱中显示出的第三个峰与第一个峰的积分比为约5％至约100％以上，例如约5％以上、约10％以上、约15％以上、约20％以上、约25％以上、约30％以上、约35％以上、约40％以上、约45％以上、约50％以上、约55％以上、约60％以上、约65％以上、约70％以上、约75％以上、约80％以上、约85％以上、约85％以上、约90％以上、约95％以上、约100％以上或其任何范围，所述组分为：(i)超纯的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体单元，(ii)超纯的二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体单元，(iii)超纯的N，N亚甲基二丙烯酰胺单体单元，(iv)超纯的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体单元和超纯的二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体单元，(v)超纯的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体单元和超纯的N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体单元，(vi)超纯的二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体单元和超纯的N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体单元，或(vii)超纯的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体单元、超纯的二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体单元和超纯的N，N-亚甲基二丙烯酰胺单体单元。
本发明还提供了微球，其包含：(a)通过共聚N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体、二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体和N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体制备的共聚物，其中一个、两个或三个所述单体是超纯的单体，和(b)交联的明胶；其中所述微球在1H NMR谱中显示出约3.5ppm至约4ppm的第一个峰、约3ppm至约3.5ppm的第二个峰、和约1ppm至约1.5ppm的第三个峰；和其中(i)第二个峰与第一个峰的积分比高于没有用超纯的单体制备的相同微球的积分比，(ii))第三个峰与第一个峰的积分比高于没有用超纯的单体制备的相同微球的积分比，或(iii)第二个峰与第一个峰的积分比和第三个峰与第一个峰的积分比高于没有用超纯的单体制备的相同微球的相应积分比高。在某些实施方案中，第二个峰与第一个峰的积分比和/或第三个峰与第一个峰的积分比独立地选自约5％以上、约10％以上、约15％以上、约20％以上、约25％以上、约30％以上、约35％以上、约40％以上、约45％以上、约50％以上、约55％以上、约60％以上、约65％以上、约70％以上、约75％以上、约80％以上、约85％以上、约90％以上、约95％以上、约100％以上或其任何范围。
本发明还提供了微球，其包含(a)包含N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体单元、二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体单元和N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体单元的共聚物，其中一个、两个或三个所述单体单元是超纯的单体单元，和(b)交联的明胶；其中所述微球在1H NMR谱中显示出约3.5ppm至约4ppm的第一个峰、约3ppm至约3.5ppm的第二个峰和约1ppm至约1.5ppm的第三个峰；和其中(i)第二个峰与第一个峰的积分比高于不包含超纯的单体单元(没有用相应的超纯的单体制备)的相同微球的积分比，(ii))第三个峰与第一个峰的积分比高于不包含超纯的单体单元(没有用相应的超纯的单体制备)的相同微球的积分比，或(iii)第二个峰与第一个峰的积分比和第三个峰与第一个峰的积分比分别高于不包含超纯的单体单元(没有用相应的超纯的单体制备)的相同微球的相应积分比。在某些实施方案中，第二个峰与第一个峰的积分比和/或第三个峰与第一个峰的积分比独立地选自约5％以上、约10％以上、约15％以上、约20％以上、约25％以上、约30％以上、约35％以上、约40％以上、约45％以上、约50％以上、约55％以上、约60％以上、约65％以上、约70％以上、约75％以上、约80％以上、约85％以上、约90％以上、约95％以上、约100％以上或其任何范围。
在具体的实施方案中，所述微球是超纯的微球。在某些实施方案中，所述超纯的微球包含10％以下、小于等于约9％、小于等于约8％、小于等于约7％、小于等于约6％、小于等于约5％、小于等于约4％、小于等于约3％、小于等于约2％、小于等于约1％或0％重量的杂质。在某些实施方案中，所述超纯的微球包含90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上或100％重量的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺、二乙基氨基乙基丙烯酰胺、N，N-亚甲基二-丙烯酰胺和明胶。
在一个实施方案中，本发明提供了微球，其包含：(a)包含N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体单元、二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体单元和N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体单元的共聚物，和(b)交联的明胶；其中所述微球在1HNMR谱中显示出约3.5ppm至约4ppm的第一个峰、约3ppm至约3.5ppm的第二个峰和约1ppm至约1.5ppm的第三个峰；和其中第二个峰与第一个峰的积分比为0.50至约0.65，(ii)第三个峰与第一个峰的积分比为0.61到约0.75；或(iii)(i)和(ii)的组合。在一个实施方案中，第一个峰在约3.77ppm，第二个峰在约3.2ppm，第三个峰在约1.3ppm或其组合。在某些实施方案中，第二个峰与第一个峰的积分比为约0.574，或其中第三个峰与第一个峰的积分比为约0.625。在权利要求1的微球的一个实施方案中，其中当记录1H NMR谱和/或在400MHz记录1H NMR谱时，所述微球在25℃和/或氘代溶剂中。在某些实施方案中，所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺、二乙基氨基乙基丙烯酰胺和N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体单元的一个、两个或三个是超纯的单体单元。在某些实施方案中，所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体单元包含小于9％的杂质，和/或所述二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体单元包含小于2％的杂质(例如，如通过溴化试验测定的)。在某些实施方案中，所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体单元包含小于9％的杂质，和/或所述二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体单元包含小于2％的杂质(例如，如通过HPLC测定的)。在另一个实施方案中，所述微球的直径为约1μm至约2000μm、约40μm至约120μm、约100μm至约300μm、约300μm至约500μm、约500μm至约700μm、约700μm至约900μm或约900μm至约1200μm。
B.组合物
本发明提供的微球可以与药学可接受的液体或其它生物相容性载体的组合物(例如药物组合物)使用。
在某些实施方案中，所述微球或组合物中的微球是基本上大小均匀。例如，在某些实施方案中，每个微球之间的直径差为约0μm至约100μm、约0μm至约50μm、或约0μm至约25μm。在某些实施方案中，所述微球的直径差为100μm以下、约50μm以下、约25mm以下、约10mm以下或约5μm以下。
在某些实施方案中，所述组合物中的微球的直径为约1μm至2000μm、约10μm至1000μm、约40μm至约120μm、约100μm至约300μm、约300μm至约500μm、约500μm至约700μm、约700μm至约900μm或约900μm到约1200μm。
在某些实施方案中，所述微球以如下群体存在，其中超过68％具有的直径为平均直径的±20％、平均直径的±10％或平均直径的±5％。在一个实施方案中，所述微球以如下群体存在，其中超过75％具有的直径为平均直径的±20％、平均直径的±15％、平均直径的±10％或平均直径的±5％、或其范围。
所述组合物可以为悬浮液、水凝胶或乳剂的形式。所述组合物也可以为微球在液体中的悬浮液。所述微球的亲水性性质允许将其置于悬浮液中，特别地，其为无菌非致热或无热原可注射溶液的形式，而避免形成聚集体或粘附到贮存容器和植入装置例如导管、注射器、针等的壁。
在一些实施方案中，使用导管给药。在一个具体的实施方案中，使用选择性定位的导管。这样的导管具有插入大动脉的引导管、有或者没有可控微型导管丝的微导管及提供引导管和微导管之间密封的止血阀，使得可以使用连续肝素冲洗以防止凝血。
在具体的实施方案中，所述微球或药物组合物适于注射。在具体的实施方案中，所述微球和/或包含该微球的组合物是无菌的。所述微球可以通过本领域已知的任何方法灭菌，例如照射，例如γ照射或β照射。在某些实施方案中，所述微球是使用无菌技术无菌制备的。在某些实施方案中，无菌制备的微球包括治疗剂或药物。
所述药学可接受的液体可以是，但不限于生理盐水、缓冲溶液、水、等渗溶液、体液或其混合物。所述液体也可以是盐溶液，在某些实施方案中，其由例如约0.01M至约5M量的选自钠、钾、钙、镁、铁、锌和铵的阳离子组成。在某些实施方案中，所述微球悬浮在碘化油中，或者以其它方式与碘化油和任选的药物(例如多柔比星)或其它治疗剂组合施用于个体。
所述组合物可以包括含量为约10％至约90％重量的微球和含量约10％至约90％重量的液体(或其它生物相容性载体)。所述组合物还可以包括含量为约10％至约50％重量的微球和含量约50％至约90％重量的液体(或其它生物相容性载体)。
用于治疗用途的可接受的药物载体包括稀释剂，增溶剂，润滑剂，助悬剂，包囊物质，溶剂，增稠剂，分散剂，缓冲液例如磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐及其它有机酸盐，抗氧剂例如抗坏血酸，防腐剂，低分子量(小于约10个残基)肽例如聚精氨酸，蛋白质例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白，亲水性聚合物例如聚(乙烯基吡咯烷酮)，氨基酸例如甘氨酸、谷氨酸、门冬氨酸或精氨酸，单糖、二糖及其它糖类包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精，螯合剂例如EDTA，糖醇例如甘露醇或山梨醇，抗衡离子例如钠和/或非离子表面活性剂例如吐温、普流尼克或PEG。
在一些实施方案中，所述组合物或制剂包含本发明提供的微球，例如呈干燥粉末，其可以提供在容器例如小瓶或注射器中。在使用前、使用期间或使用后(例如，在注射给患者之前、期间或之后)，可以将所述微球与一种或多种药物载体和/或一种或多种本发明提供的其它组分(例如，标记试剂和/或治疗剂，例如药物)混合。
在一些实施方案中，所述生物相容性载体为水基溶液、水有机溶液、有机溶液、非水溶液或其混合物。在某些实施方案中，所述生物相容性载体包含例如含量为约0.01M到约5M的由阳离子构成的盐，所述阳离子例如钠、钾、钙、镁、铁、锌、铵及其混合物。
在某些实施方案中，由于进一步包含标记试剂，所述微球或组合物在光下和在体内是可见的。在某些实施方案中，所述微球可以在其合成之后进行标记。这可以通过例如接枝荧光标记物衍生物(包括，例如异硫氰酸荧光素(FITC)、若丹明异硫氰酸盐(RITC)等)来进行。在某些实施方案中，可以通过用标记物化学偶合所述单体获得可检测的单体，所述标记物可以为：使得所述微球能够直接显色的化学染料，例如Cibacron Blue或Procion Red HE-3B，磁共振成像试剂(铒、钆或磁铁矿)；造影剂，例如钡或碘盐，包括例如(丙烯酰氨基-3-丙酰胺基)-3-三碘-2，4，6-苯甲酸。在钡盐或磁铁矿盐的情况下，它们可以以粉末形式直接引入初始单体溶液中。
在某些实施方案中，所述组合物包含造影剂或其它标记试剂，例如不透射线的造影剂，例如非离子造影剂。在某些实施方案中，在注射到患者之前、期间和/或之后，将造影剂与所述组合物中的微球混合。在一个具体的实施方案中，向患者施用包含造影剂(例如非离子造影剂)和本发明提供的微球的组合物。
C.制备微球的方法
本发明提供了一种制备微球的方法，其包括明胶或明胶替代物和N-三羟甲基甲基丙烯酰胺、和N，N-亚甲基二-丙烯酰胺的共聚物。例如，本发明进一步提供了通过该方法制备的微球、和该微球的组合物及其用途。
本发明提供的微球可以通过本领域已知的任何方法来制备，例如悬浮聚合(例如，油包水悬浮或乳液聚合)、逐滴聚合，如在E.Boschetti，Microspheres for Biochromatography and Biomedical Applications.Part I，Preparation of Microbeads In：Microspheres，Microencapsulation and  Liposomes，John Wiley & Sons，Arshady R.，Ed.，vol.2，第171-189页(1999)或在美国专利号5,635,215和5,648,100中描述的，将其每篇都引入本文作为参考。微球制剂的选择方式将通常取决于期望的特征，例如微球直径和最终微球的化学组成。在本发明提供的多种方法的某些实施方案中，通过自由基聚合或放射聚合所述单体。
在某些实施方案中，通过乳液聚合或悬浮聚合悬浮进行聚合，因为其能够直接得到期望大小的微球。其可以如下进行：通过搅拌混合包含不同溶解组分(例如，不同的单体、细胞粘附试剂)的水溶液与在25℃下具有低(例如，约15％以下、约10％以下、约5％以下、约4％以下、约3％以下、约小于等于约2％、约1％以下、约0.5％、约0.1％以下或约0％)水可混性(例如，不可混溶的)的包含液体有机相的溶液(例如植物油、动物油或矿物油、某些石油蒸馏产物、氯化烃类或这些不同溶液的混合物)，任选地在乳化剂(例如，脱水山梨醇倍半油酸酯)下得到液滴悬浮液，然后，通过利用合适催化剂的单体聚合将其转化成固体凝胶。在一个具体的实施方案中，所述液体有机相具有在25℃约小于等于约1％的水混容性。在一些实施方案中，所述液体有机相包含油或由其组成。在一个具体的实施方案中，所述液体有机相包含植物油或矿物油(例如石蜡油)或植物油和矿物油的组合，或由其组成。调节搅拌速率，以便获得在形成期望直径液滴的有机相中的水相乳剂。然后，通过加入引发剂开始聚合。其伴随放热反应，接着，通过测量反应介质的温度追踪其进展。
所述聚合引发剂有利地选自氧化还原系统，例如使用碱金属过硫酸盐与N，N，N’，N’-四甲基乙二胺或与二甲基氨基丙氰、有机过氧化物例如过氧化苯甲酰或甚至2，2′-偶氮基二异丁腈的组合。使用的引发剂的量适合于单体的量和寻求的聚合速率。聚合可以以本体聚合或乳液聚合进行。在本体聚合的情况下，包含不同溶解组分和引发剂的水溶液在均匀介质中进行聚合。这使得有可能获得含水凝胶块，然后，可以通过例如穿过筛网分离出微球。在某些实施方案中，当聚合引发剂包括几种组分(氧化还原系统)时，在乳化之前，将聚合引发剂加入水相中。
然后，可以通过冷却、倾析和过滤回收如此得到的微球。接着，按照大小级别将其分离，并洗涤以除去任何痕量的次级产物。
所述聚合步骤之后可以进行细胞粘附试剂的网状形成步骤，并且可以在网状形成步骤之后进行标记试剂步骤，通过合成后接枝使得微球可识别。例如，在某些实施方案中，在自由基聚合N-三羟甲基甲基丙烯酰胺、二乙基氨基乙基丙烯酰胺和N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体之后，在较高的温度例如37℃下加热，使得微球中的明胶变成水溶性的。然后，使用交联剂例如戊二醛交联明胶(例如，约300ml的戊二醛/约1L的微球)。在某些实施方案中，在明胶交联之前，对微球进行超声处理。
因此，在一个方面，本发明提供了一种制备微球的方法，其包括：(a)制备包含N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体、二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体、N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体和明胶的水溶液，其中至少一种所述单体是超纯的单体；(b)在搅拌之前或搅拌同时，将该水溶液加入到具有低水混容性的液体有机相(例如，油例如矿物油，例如石蜡油)中；从而得到包含下述共聚物的微球，该共聚物含有N-三羟甲基甲基丙烯酰胺、二乙基氨基乙基丙烯酰胺和N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体单元；(c)任选地对该微球进行超声处理(例如，超声粉碎)；和(d)交联明胶。接着，可以通过过滤或离心和洗涤收集微球。在某些实施方案中，所述单体的水溶液可以包含粘合剂，例如胶原(明胶是一种变性的胶原)。
在另一个方面，本发明提供了通过如下方法制备的微球，所述方法包括：(a)制备包含(i)N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体、(ii)二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体、(iii)N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体和(iv)明胶的水溶液，其中所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体、二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体和/或N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体是超纯的单体；(b)在搅拌之前或搅拌同时，将该水溶液加入到具有低水混容性的液体有机相(例如，油例如矿物油，例如石蜡油)中；从而得到包含下述共聚物的微球，该共聚物含有N-三羟甲基甲基丙烯酰胺、二乙基氨基乙基丙烯酰胺和N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体单元；(c)任选地对该微球进行超声处理(例如，超声粉碎)；和(d)交联明胶。在某些实施方案中，所述微球在1H NMR谱(例如，如在实施例14中提供的)中显示出第一个峰(例如，约3.5ppm至约4ppm)、第二个峰(例如，约3ppm至约3.5ppm)和第三个峰(例如，约1ppm至约1.5ppm)。在具体的实施方案中，第二个峰与第一个峰的积分比为约0.50至约0.65，和/或第三个峰与第一个峰的积分比为约0.55至约0.75(例如，约0.61至约0.75)。在某些实施方案中，所述微球是大小均匀的。在其它的实施方案中，所述微球的直径为约1μm至2000μm，40μm至约120μm、约100μm至约300μm、约300μm至约500μm、约500μm至约700μm、约700μm至约900μm、或约900μm至约1200μm。在具体的实施方案中，小于1％的微球是聚集的(粘着性)微球。
本发明还提供了一种悬浮聚合制备超纯的微球的方法，所述超纯的微球包含小于等于约10％、小于等于约9％、小于等于约8％、小于等于约7％、小于等于约6％、小于等于约5％、小于等于约4％、小于等于约3％、小于等于约2％或小于等于约1％的杂质和/或包含大于等于90％、大于等于91％、大于等于92％、大于等于93％、大于等于94％、大于等于95％、大于等于96％、大于等于97％、大于等于98％或大于等于99％重量的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺超纯的单体、二乙基氨基乙基丙烯酰胺超纯的单体、N，N-亚甲基二-丙烯酰胺超纯的单体和明胶，所述方法例如通过(a)制备包含(i)N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体，(ii)二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体，(iii)N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体，和(iv)明胶的水溶液，所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体和/或二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体或N，N-亚甲基二-丙烯酰胺中的一种、两种或三种是超纯的单体；(b)在搅拌之前或搅拌同时，将该水溶液加入到具有低水混容性的液体有机相(例如，油，例如矿物油，例如石蜡油)中；从而得到包含下述共聚物的微球，该共聚物含有N-三羟甲基甲基丙烯酰胺、二乙基氨基乙基丙烯酰胺和N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体单元；(c)任选地对该微球进行超声粉碎；和(d)交联明胶。本发明还提供了通过该方法制备的包含相应单体单元的超纯的微球。
在本发明提供的多种方法的某些实施方案中，经由进料环将该水溶液加入到液体有机相中。
在本发明提供的方法的某些实施方案中，所述方法进一步包括过筛微球(例如，用于调整大小和/或减少微球群体中聚集微球的数量)。在其它的实施方案中，所述方法不包括使微球进行一轮或多轮的过筛(例如，用于调整大小和/或减少微球群体中聚集微球的数量)。
在具体的实施方案中，本发明提供的方法包括对微球进行超声处理(例如，超声粉碎)。在某些实施方案中，在超声波浴中进行超声处理，例如进行约10分钟到约15分钟。在具体的实施方案中，所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体单元包含小于9％的杂质，和/或所述二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体单元包含小于2％的杂质。
在本发明提供的方法的某些实施方案中，与没有使用一种或多种超纯的单体的方法相比，使用一种或多种本发明提供的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺、二乙基氨基乙基丙烯酰胺和N，N-亚甲基二-丙烯酰胺超纯的单体得到更高产率的微球产物。
在本发明提供的方法的其它的实施方案中，与没有使用一种或多种超纯的单体的方法相比，使用一种或多种本发明提供的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺、二乙基氨基乙基丙烯酰胺和N，N-亚甲基二-丙烯酰胺超纯的单体得到大小分布更窄的微球。
在本发明提供的方法的其它的实施方案中，与没有使用一种或多种超纯的单体制备的相同微球相比，使用一种或多种本发明提供的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺、二乙基氨基乙基丙烯酰胺和N，N-亚甲基二-丙烯酰胺超纯的单体引起聚合效率增加(例如，其中多种单体加入到所述聚合物中和/或更好的交联效率)。
在本发明提供的方法的另一个实施方案中，与没有使用一种或多种超纯的单体的制备的相同微球相比，使用一种或多种本发明提供的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺、二乙基氨基乙基丙烯酰胺和N，N-亚甲基二-丙烯酰胺超纯的单体引起凝胶点增加。凝胶点增加可以导致聚合反应更快，其可以进一步引起群体中聚集微球的数量降低。用于评价聚合反应中凝胶点的方法是本领域已知的(参见，例如Nita等人，(2007)Rheol.Acta 46，595-600)。
在本发明提供的方法的仍然其它的实施方案中，与没有使用一种或多种超纯的单体制备的相同微球相比，使用一种或多种本发明提供的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺、二乙基氨基乙基丙烯酰胺和N，N-亚甲基二-丙烯酰胺超纯的单体引起微球的整个制备方法的改善，其可以导致微球的产率和/或总体质量改善(例如，破裂和/或聚集的微球更少)、产物产物更加一致性、大小均匀性更好、大小分布更窄、形状均匀性更好或其任意组合。
1.进料环处理
在某些实施方案中，本发明提供的微球是在搅拌之前或搅拌同时(例如，在本发明提供的一些方法的步骤(b)中)，将所述水溶液加入到具有低水混容性的液体有机相(例如，油例如矿物油，例如石蜡油)中的步骤期间，使用进料环装置(例如，如图6所示)制备的。所述进料环处理可用于进一步改善得到的微球的质量，例如消除了导致微球包囊、油包囊和/或限制群体中球破裂数量的某些副反应。
在一个示例性的实施方案中，进料环装置可以包括静态混合器。在一个实施方案中，所述静态混合器包括纵轴和梳状物，梳状物具有多个从连接纵轴的横梁向外延伸的间隔性指状物(spaced fingers)。在某些实施方案中，所述进料环装置连接一种或多种泵。在一个实施方案中，所述一个或多个泵包括第一个泵(例如Q2泵)和第二个泵(例如RHO泵)。在某些实施方案中，将所述包含例如单体(例如，N-三羟甲基甲基丙烯酰胺、二乙基氨基乙基丙烯酰胺和N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体)和/或明胶的水溶液过滤，并置于搅拌下。在某些实施方案中，搅拌是在约25℃至约80℃，例如约40℃至约70℃的温度下进行的。在某些实施方案中，搅拌是在约25℃、40℃、50℃、55℃、60℃、65℃或70℃或其任何范围的温度下进行的。在一个具体的实施方案中，搅拌是在约60℃的温度下进行的。在某些实施方案中，将包含微球单体和明胶的水溶液经由第一个泵注入置于包含油例如矿物油(例如石蜡油)和乳化剂例如脱水山梨醇倍半油酸酯(例如Arlacel83；或类似产品)的溶液中的进料环装置中。在某些实施方案中，所述乳化剂(例如脱水山梨醇倍半油酸酯)在油中的浓度为约0.01g/l至约1g/l，例如约0.02g/l至约0.5g/l，或约0.03g/l至约0.3g/l。在一个实施方案中，所述乳化剂(例如脱水山梨醇倍半油酸酯)在油中的浓度为约0.031g/l(例如，在4升油中3.1g(或3ml)的Arlacel)。在某些实施方案中，所述溶液进一步包含N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)。
在某些实施方案中，制备过硫酸铵水溶液，并将其经由第二个泵注入置于包含乳化剂(例如，脱水山梨醇倍半油酸酯)的溶液中的进料环装置中。在一个实施方案中，将所述单体/明胶溶液和过硫酸铵溶液分别经由第一个泵和第二泵同时注入进料环装置中。在某些实施方案中，过硫酸铵在水中的浓度为约0.01g/ml至约1g/ml，例如约0.02g/ml至约0.5g/ml，或约0.03g/ml至约0.3g/ml。在一个实施方案中，所述过硫酸铵水溶液在水中的浓度为约0.034g/ml(例如，在101.6g的水中3.5g的过硫酸铵)。在某些实施方案中，使用进料环处理引起油包囊的微球减少、较大颗粒内形成的多个小颗粒减少和/或破裂的微球减少。
2.超声处理
在某些实施方案中，对本发明提供的微球任选地进行超声处理(特别是超声粉碎)。在具体的实施方案中，在明胶交联之前、期间或之后，使所述微球进行超声处理(例如超声粉碎)。在一个实施方案中，在明胶交联之前，对本发明提供的微球进行超声处理(例如超声粉碎)。超声处理(例如超声粉碎)可用于破坏微球之间的相互作用和减少存在于微球群体中粘着性微球的百分数。这样的超声处理步骤的结果可以引起制备非粘着性微球的效率更大(即，减少聚集微球的含量)，并且由于降低了用于消除给定微球群体中粘着性微球的一轮或多轮过筛的必要性(或数量)，其是一种制备微球的成本有效的方式。
任何超声发生器都可以与一种或多种本发明提供的制备微球的过程或方法组合使用。在某些实施方案中，使用超声波仪，例如超声波浴、超声波探头或超声波处理器进行超声处理。在一个实施方案中，使用超声波浴进行超声处理。在某些实施方案中，进行超声处理一次。在其它的实施方案中，进行超声处理超过一次。在某些实施方案中，以约20kHz至约200kHz，例如约30kHz至约100kHz，或约35kHz至约70kHz的频率进行超声处理。在某些实施方案中，以约35kH、40kHz、45kHz、50kHz、55kHz、60kHz、65kHz、或约70kHz或其任何范围的频率进行超声处理。在一个实施方案中，以约35kHz的频率进行超声处理。在某些实施方案中，在约0℃至约80℃，例如约10℃至约50℃、约15℃至约35℃、约20℃至约25℃(例如，室温)或约0℃至约5℃(例如，在冰上)或其任何范围的温度下进行超声处理。在某些实施方案中，在约0℃、4℃、5℃、10℃、25℃或室温的温度下进行超声处理。
在某些实施方案中，进行超声处理约1分钟至约60分钟，例如约5分钟至约40分钟，或约10分钟至约15分钟，或其任何范围。在某些实施方案中，进行超声处理约5、10、15或20分钟。在一个实施方案中，进行超声处理约10分钟或约15分钟。上述时期可以反映为单次、连续超声处理或多次超声处理。
在某些实施方案中，在超声处理之后粘着性(或聚集的)微球的百分数为约0％至约3％、约0％至约2％、约0％至约1.5％、约0％至约1％、或约0％至约0.5％、或其任何范围。在某些实施方案中，在超声处理之后存在于微球中粘着性球的百分数为约0％、约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％或约1％。在某些实施方案中，在超声处理之后，没有观察到破裂的微球。
在一些实施方案中，与没有使用超声粉碎制备的相同微球相比，使用超声处理(例如超声粉碎)制备的本发明提供的微球引起所述微球的整个制备方法的改善(例如，产率较高和/或价格更低)，其可以导致微球的质量改善(例如，破裂和/或聚集的微球更少)、产物更加一致性(例如，大小和/或形状的均匀性更大)或其组合。在具体的实施方案中，使用超声处理(例如超声粉碎)制备的本发明提供的微球引起微球批量(或群体)制备的微球的产率大于30％、大于35％、大于40％、大于50％、大于55％、大于60％(或更高)，其包含小于等于约5％、小于等于约4.5％、小于等于约3.5％、小于等于约3％、小于等于约2.5％、小于等于约2％、小于等于约1.5％、小于等于约1％、小于等于约0.5％、小于等于约0.4％、小于等于约0.3％、小于等于约0.25％、小于等于约0.2％、或小于等于约0.1％的聚集的微球。
在一个实施方案中，本发明提供了一种制备微球的方法，其包括：(a)制备包含：(i)N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体、(ii)二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体、(iii)N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体，和(iv)明胶的水溶液，其中所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体和/或二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体是超纯的单体；(b)在搅拌之前或搅拌同时，将该水溶液加入到具有低水混容性的液体有机相中；从而得到包含下述共聚物的微球，该共聚物含有N-三羟甲基甲基丙烯酰胺、二乙基氨基乙基丙烯酰胺和N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体单元；(c)任选地对该微球进行超声处理；和(d)交联明胶。在某些实施方案中，将所述水溶液经由进料环加入到液体有机相中。在一个实施方案中，所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体包含小于9％的杂质，和/或所述二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体包含小于2％的杂质。在一个实施方案中，所述微球是超纯的微球。在另一个实施方案中，(i)所述超纯的微球包小于等于约10％、小于等于约9％、小于等于约8％、小于等于约7％、小于等于约6％、小于等于约5％、小于等于约4％、小于等于约3％、小于等于约2％或小于等于约1％的杂质，(ii)所述超纯的微球包含大于等于90％、大于等于91％、大于等于92％、大于等于93％、大于等于94％、大于等于95％、大于等于96％、大于等于97％、大于等于98％或大于等于99％重量的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺、二乙基氨基乙基丙烯酰胺、N，N-亚甲基二-丙烯酰胺和明胶，或(iii)(i)和(ii)的组合。在仍然另一个实施方案中，在超声波浴中进行超声粉碎。在某些实施方案中，所述方法不包括过筛微球。
本发明还提供了通过本发明提供的多种方法的任一种制备的微球。在一个实施方案中，通过这些方法制备的微球在1H NMR谱中显示出约3.5ppm至约4ppm的第一个峰、约3ppm至约3.5ppm的第二个峰和约1ppm至约1.5ppm的第三个峰；和其中(i)第二个峰与第一个峰的积分比为0.50至约0.65，(ii)第三个峰与第一个峰的积分比为0.61到约0.75；或(iii)(i)和(ii)的组合。在一个实施方案中，所述微球是大小均匀的。在另一个实施方案中，所述微球的直径为约1μm至约2000μm、40μm至约120μm、约100μm至约300μm、约300μm至约500μm、约500μm至约700μm、约700μm至约900μm或约900μm到约1200μm。在某些实施方案中，少于1％的微球是聚集的微球。
D.使用方法
在某些实施方案中，所述微球是能变形的，而不是脆性的，因此它们容易进入和穿过注入装置和小导管，而不会永久地改变或破裂，但是该微球也对植入过程期间和其后产生的肌肉收缩应力有抗性。在某些实施方案中，所述微球是热稳定的，其允许容易地、方便地灭菌和冷冻贮存。
因此，本发明提供的微球具有多种应用。例如，本发明提供的微球可以用于栓塞形成、组织工程学、组织引导性再生、体内干细胞采集、培养或分化、将治疗物质递送和悬浮在靶向人或动物组织中和/或其它应用。
本发明提供的或通过本发明提供的多种方法制备的多种微球中的任一种都可以用于本发明提供的多种栓塞形成和疾病控制和治疗实施方案中的任一个中。在一个实施方案中，提供一种个体中栓塞形成的方法，其包括向个体施用本发明提供的微球。在另一个实施方案中，本发明提供了一种控制或治疗个体中血管生成依赖性疾病的方法，其包括向个体施用本发明提供的微球。在一个实施方案中，所述血管生成依赖性疾病是动静脉畸形、子宫纤维瘤或良性前列腺肥大。在一个实施方案中，所述血管生成依赖性疾病是癌症或肿瘤，例如肝癌或前列腺癌或肿瘤。
1.栓塞形成
存在许多期望减少或停止向器官或区域供血的临床情形(例如，出血、肿瘤形成)。如下更详细描述的，这可以通过在选择性定位的针或导管，或者在X射线照相机(例如荧光镜)的指导下，将所述微球或组合物注射到期望的血管来实现。所述微球或组合物经由血流移动，直到其变成楔入血管系统中，从而物理地(或化学地)闭合血管。向选择的区域减少或停止血流引起受损血管的梗塞(由于氧气和营养物供应不足，细胞死亡)或减少血损失。
因此，在某些实施方案中，本发明提供了一种个体或患者栓塞形成的方法，其包括向个体施用微球或包含该微球的组合物。在一个实施方案中，提供用于栓塞血管的方法，其包括向个体或患者的血管施用治疗有效量的微球，使得该血管有效地闭合。在某些实施方案中，为了治疗或预防大量出血的情形，可以实施栓塞形成。利用本发明提供的微球或组合物的栓塞形成治疗还可以用于需要闭合血管的多种其它临床应用，例如，用于急性失血、血管异常、中枢神经系统病症和脾机能亢进。
在血管畸形例如AVM或动静脉瘘的情况下，血管闭塞能够使血液流向正常的组织，有助于外科手术和限制出血的危险。在出血病程中，血管闭塞可引起流量减少，其促进动脉开口愈合。
栓塞形成可以用于治疗子宫纤维瘤、产后出血和/post-caesarian出血、阴道手术后出血，预防和/或治疗子宫外孕失血，预防肌瘤切除术前和高风险产科患者的出血，所述高风险产科患者例如具有前置胎盘、植入胎盘和双胎之一胎死的那些患者。栓塞形成还可以用于终止不受控制的出血，或者减慢外科手术之前或期间出血，和密封内漏(endoleaks)到动脉瘤囊(sacs)中。
任一种本发明提供的多种疾病或病症或其症状都可以根据本发明提供的方法来控制、治疗或预防。
进一步，根据待治疗的病理学病症，可以进行栓塞形成用于暂时性以及永久性目的。
栓塞形成也可以与其它临床处理例如血管造影联合使用。例如，当接受X射线时，可以经由例如经皮插入的导管将不透射线的造影剂注射到待栓塞的区域，或者通过外科手术将其注射到动脉或静脉中。然后，可以通过使本发明提供的微球经由导管回流栓塞血管，直到观察到血流停止。可以通过多个血管造影照片确认闭塞。
本发明提供的微球可以通过本领域已知的方式施用至(或者以其它方式接触)血管、组织或器官(例如，心脏、肾、脊髓、子宫、肝或胰腺)。在某些实施方案中，将所述微球施用(例如，通过注射)至具有超过一种供血的组织或器官，例如肝、肺、脊柱、脊髓、子宫或胰腺。在某些实施方案中，将所述微球施用至患者的心脏、肺、神经系统、脑、肺、肝、子宫或胰腺。在某些实施方案中，将所述微球施用至一个或多个血管，包含在组织或器官内的静脉或动脉。在某些实施方案中，本发明提供的微球用于对抗靶区域的局部缺血，例如给药或注射的区域，例如组织或器官中或接近组织或器官。在本发明提供的方法的某些实施方案中，通过管腔内施用或注射施用所述微球。在本发明提供的方法的其它实施方案中，通过血管内施用或注射将所述微球施用给患者。
所述微球可以全身或局部递送至期望的血管、组织或器官。在某些实施方案中，在外科手术之前、期间或之后将所述微球施用至血管、组织或器官。在其它的实施方案中，使用非外科手术方法，例如直接局部注射到靶区域将所述微球递送到血管、组织或器官，将其递送到距离较远部位并使其被动循环至靶区域，或者将其递送到距离较远部位且其直接主动到达靶部位。这样的非外科手术递送方法包括，例如输注或血管内(例如，静脉内或动脉内)、肌内、腹膜内、鞘内、真皮内或皮下给药。在某些实施方案中，使用血管造影(例如，选择性动脉造影或超选择性血管造影)连同栓塞形成评价向组织或器官的血液供给。在这样的实施方案中，可以在栓塞形成之前、期间或之后拍摄血管造影照片。
本发明提供的疾病或病症可以通过向患者(例如需要其的患者)施用治疗有效量的本发明提供的微球或组合物来治疗或以其它方式控制。
在某些实施方案中，通过注射进行给药。在某些实施方案中，通过导管施用所述微球。在其它的实施方案中，使用连接注射器的针注射所述微球。在某些实施方案中，施用到血管中。在其它的实施方案中，直接地施用至作用部位，例如需要这样的治疗或控制的肿瘤块、或细胞、器官或组织。在某些实施方案中，将所述微球与药物溶液或其它治疗组合施用，其中在施用所述微球之前、同时或之后施用所述药物溶液或其它治疗。
应当理解适于用本发明提供的微球进行栓塞形成的患者包括人类和动物，包括男性或女性婴儿、孩子和成年人，包括老年人。在一个具体的实施方案中，所述患者处于肝细胞疾病的危险，或者目前被该疾病所烦扰，所述肝细胞疾病例如肝炎或肝癌或肿瘤，例如白种人或亚洲人(例如，包括，但不限于日本人)患者，18至75岁。在某些实施方案中，所述患者为25至75岁、25至50岁、50至75岁、或18至25岁。在一个实施方案中，所述患者小于18岁(例如，1至5岁、5至10岁、10至15岁或15至18岁)。在另一个实施方案中，所述患者为75岁以上。
在某些实施方案中，本发明提供的微球用于治疗、控制或预防患者中的肝细胞疾病或其症状。在一个实施方案中，所述患者为Child-Pugh classA。在另一个实施方案中，所述患者是Child-Pugh class B。在仍然其它的实施方案中，所述患者是Child-Pugh class C。Child-Pugh分类是本领域熟知的，参见，例如Child and Turcotte(1964)Surgery and portalhypertension，In：The liver and portal hypertension(Child CG编著).Philadelphia，Saunders 1964，50-64；Pugh等人后来修订过。Transection ofthe esophagus in bleeding oesophageal varices(1973)Br.J.Surg.60：648-652。在某些实施方案中，所述患者感染丙型肝炎病毒(HCV)。
本发明提供的微球和组合物也可以与药物或其它治疗组合。例如，所述微球和组合物可用于治疗或以其它方式控制肿瘤或癌症(例如，前列腺癌或肝癌)、炎症疾病或与炎症有关的其它疾病，或其症状。在其它的实施方案中，本发明提供的微球和组合物可以用于治疗或以其它方式控制子宫纤维瘤或其症状。在其它的实施方案中，本发明提供的微球和组合物可用于治疗或以其它方式控制血管畸形例如AVM或其症状。在仍然其它的实施方案中，本发明提供的微球和组合物可用于治疗或以其它方式控制前列腺疾病，例如良性前列腺增生，或其症状。
在某些实施方案中，将药物或其它治疗剂与本发明提供的微球组合同时施用至个体。在某些实施方案中，在施用微球之前，将药物或其它治疗剂施用至个体。在某些实施方案中，在施用微球之前约1分钟至约60分钟，施用药物或其它治疗剂。在某些实施方案中，在施用微球约1分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约30分钟、约45分钟或约1小时、约2小时、约4小时、约6小时、约10小时、约12小时、约18小时、约20小时或约24小时之内，将药物或其它治疗剂施用至个体。在仍然其它的实施方案中，将药物或其它治疗剂与微球同时施用。在某些实施方案中，在施用药物或其它治疗剂之前，将微球施用至个体。在某些实施方案中，在施用药物或其它治疗剂之前约1分钟至约60分钟之间，施用微球。在某些实施方案中，在施用药物或其它治疗剂之前约1分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约30分钟、约45分钟或约1小时、约2小时、约4小时、约6小时、约10小时、约12小时、约18小时、约20小时或约24小时之内，将微球施用至个体。
2.血管生成依赖性疾病
血管生成依赖性疾病(即，需要或诱导血管生长的那些疾病)代表寻求医学治疗的所有疾病的重要部分。这样的疾病包括，例如癌症或肿瘤(例如，肝癌或肿瘤，或前列腺癌或肿瘤)和非致瘤性血管生成依赖性疾病。
在某些实施方案中，本发明提供了适于治疗或以其它方式控制下述疾病的微球、组合物和方法：血管生成依赖性疾病，包括肿瘤或其它癌症、非致瘤性血管生成依赖性疾病或疼痛，例如与存在肿瘤或其它癌症相关的疼痛，或其症状。在一个实施方案中，提供用于控制或治疗个体中血管生成依赖性疾病的方法，其包括向个体施用微球或包含该微球的组合物。在具体的实施方案中，提供用于控制或治疗个体中血管生成依赖性疾病的方法，其包括例如向个体施用微球或包含该微球的组合物。
除了癌症之外，还可以经由下调或上调，或者以其它方式用本发明提供的微球或组合物控制，来治疗特征在于血管异常生长的许多其它非致瘤性血管生成依赖性疾病。这样的非致瘤性血管生成依赖性疾病的代表性实例包括，但不限于肥厚性瘢痕和瘢痕疙瘩、糖尿病增殖性视网膜病变、类风湿性关节炎、动静脉畸形(AVM)、淋巴管畸形、静脉畸形、动脉粥样硬化斑块、伤口愈合延迟、血友病性关节、骨折不连接畸形骨肥大综合征(Klippel Trenaunay Syndrome)、Parkes Weber Syndrome、遗传性出血性毛细血管扩张(Osler-Weber-Rendu Syndrome)、蓝色硬血管痣综合征(BlueRubber Bleb Syndrome)、皮肤表面和皮下痣、血管瘤、肌瘤(leiomyomata)、腺瘤、错构瘤、银屑病、脓性肉芽肿、硬皮病、沙眼、月经过多、血管粘连、良性前列腺肥大(BPH)和子宫纤维瘤。
a.癌症或肿瘤
在具体的实施方案中，提供用于控制或治疗个体中癌症肿瘤(例如，富血管性癌症或肿瘤)的方法，其包括向个体施用微球或包含该微球的组合物。这样的癌症包括，但不限于(在解剖学上和主要的肿瘤部位)肝癌、卵巢癌、乳腺癌、肾癌、肺癌、胰腺癌、甲状腺癌、前列腺癌、子宫癌、皮肤癌癌、头和颈肿瘤、乳腺肿瘤、脑瘤、骨骼瘤、软组织瘤(例如肉瘤、脂肪瘤、恶性纤维组织细胞瘤)、血瘤(例如淋巴瘤)、卡波济氏肉瘤、和浅表形式的膀胱癌。在某些实施方案中，治疗或控制的方法可以是局部(或全身性)药物递送与微球(例如TACE)栓子作用联合的结果。
预期用本发明提供的组合物和方法控制和治疗的其它疾病及其症状包括，例如但不限于与肝、肾有关的肿瘤、急性淋巴母细胞性白血病、急性髓细胞样白血病、尤因肉瘤、妊娠期滋养细胞癌、霍奇金病、非霍奇金病、伯基特淋巴瘤弥漫性大细胞淋巴瘤、滤泡性混合细胞淋巴瘤、成淋巴细胞性淋巴瘤、横纹肌肉瘤、睾丸癌、肾母细胞瘤、肛门癌、膀胱癌、乳腺癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、毛细胞白血病、头和颈癌、脑膜瘤、神经纤维瘤(fibrosoma)、血管纤维瘤、肺(小细胞)癌、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、卵巢癌、脑肿瘤(星形细胞瘤)、宫颈癌、结肠癌、肝细胞癌、人大的肝细胞癌、卡波济氏肉瘤、肺(非小细胞)癌、黑素瘤、胰腺癌、前列腺癌、软组织肉瘤、乳腺癌、结肠癌(II期)、骨肿瘤、骨肉瘤、卵巢癌、睾丸癌、或其组合。
使用本发明提供的微球或组合物的栓塞形成治疗可以以至少三种主要方式使用，以帮助控制新生物：(1)确定性肿瘤治疗(通常是良性的)；(2)用于外科手术前栓塞形成；和(3)用于缓解栓塞形成。简而言之，有时可以通过单独的栓塞形成治疗来成功地治疗良性肿瘤。这样的肿瘤的实例包括血管原因的单纯性肿瘤(例如血管瘤)，内分泌性肿瘤例如甲状旁腺腺瘤，和良性骨肿瘤。
对于其它肿瘤(例如肾腺癌)，为了减少手术失血、缩短手术持续时间和减少肿瘤外科手术引起有活力的恶性细胞播散的危险，可以在外科切除术之前数小时或数天，施用外科手术前栓塞形成。许多肿瘤可以在外科手术前成功地栓塞，所述肿瘤包括例如鼻咽肿瘤、颈静脉球瘤、脑膜瘤、化学感受组织瘤和迷走神经的神经瘤。
为了延长晚期疾病的患者的存活时间，使用所述微球或组合物的栓塞形成也可以作为不能手术的恶性肿瘤的主要治疗模式使用。栓塞形成可以通过缓解使人不愉快的症状例如出血、静脉梗阻和气管压迫显著地改善恶性肿瘤患者的生活质量。在某些实施方案中，来自减缓肿瘤栓塞形成的益处可以在遭受恶性内分泌肿瘤的体液作用的患者中看到，其中类癌瘤及其它内分泌赘生物例如胰岛瘤和胰升糖素瘤的转移可以是生长迟缓的，但是由于其产生的内分泌综合征仍然引起极大痛苦。在某些实施方案中，栓塞形成治疗也可以在外科手术期间使用，以除去肿瘤或血管块或癌器官，或者预防或改善转移。
化学栓塞形成是化疗和栓塞形成或栓塞治疗的组合，典型地用于治疗癌症。类似地，放射栓塞形成是放射治疗和栓塞形成或栓塞治疗的组合。在某些实施方案中，本发明提供的微球可以作为独立治疗剂注射到靶区域，或者在血液继续灌注/流入靶向肿瘤的同时，使末端治疗微球分散使得微球逐渐进入肿瘤血液供应。向微球基质中加入化学治疗剂可以通过微球的末端栓子作用增加暴露于治疗的时间来提高治疗功效。
可以使用本文的微球组合物栓塞多种癌症或肿瘤。简而言之，肿瘤通常分成两种类型：良性的和恶性的。在良性肿瘤中，细胞可以保持其分化特征，而不会以完全不受控制的方式分裂。另外，所述肿瘤是局部化的和非转移性的。在恶性肿瘤中，细胞可以变成未分化的，不会对身体的生长和激素信号产生反应，以不受控制的方式倍增；所述肿瘤是侵袭性的，能够扩散到远处部位(转移)。良性和恶性肿瘤都可以使用本发明提供的微球栓塞、治疗、控制、预防或改善。
在某些实施方案中，本发明还提供了使用本发明提供的微球或组合物控制或治疗继发瘤(例如，继发性肝肿瘤)的方法。继发瘤或转移是一种起源于体内其它部位，但是随后扩散到远处器官的肿瘤。肿瘤转移的常规路线包括直接进入相邻结构中生长，经血管系统或淋巴系统扩散，以及循组织平面和身体间隙(腹膜液、脑脊液等)而行。
在本发明提供的方法的其它实施方案中，可以在外科手术期间使用栓塞形成治疗以除去肿瘤或血管块或癌器官。另外，治疗性栓塞形成治疗可用于治疗、控制、预防或改善转移。
在某些实施方案中，通过将栓子物质注射到供养肿瘤的血管来有意阻断该血管。特别地，在肿瘤的情况下，本发明提供的血管闭塞方法可用于抑制疼痛、限制外科手术失血及随后的栓塞形成、或者甚至引起肿瘤坏死和避免手术。
i.肝癌或肝肿瘤
在某些实施方案中，可以使用包括向个体施用微球或组合物的方法治疗或控制肝癌或肝肿瘤。良性肝肿瘤的代表性实例包括肝细胞腺瘤、海绵状血管瘤和局灶性结节性增生症。也可以治疗更少见且通常不会具有临床表现的其它良性肿瘤。这些包括胆管腺瘤、胆管囊腺瘤、纤维瘤、脂肪瘤、平滑肌瘤、间皮瘤、畸胎瘤、粘液瘤和结节再生性增生。
恶性肝肿瘤可以再分成两类：原发性的和继发性的。原发性肿瘤直接在其被发现的组织中产生。因此，原发性肝肿瘤最初来源于组成肝组织的细胞(例如肝细胞和胆细胞)。原发性肝恶性肿瘤的代表性实例包括肝细胞癌、胆管癌、血管肉瘤、囊腺癌、鳞状细胞癌及肝胚细胞瘤。例如可以使用本发明提供的组合物和方法治疗或以其它方式控制肝恶性肿瘤或其症状。
可以通过注射微球穿过小管或导管、穿线进入肝动脉进行动脉栓塞形成。例如，可以经由股动脉或肱动脉插入导管，通过在荧光镜指引下引导其穿过动脉系统，进而进入肝动脉。将该导管尽可能地推至肝动脉网中，以使其完全堵塞供应肿瘤的血管，同时尽可能地保护供应正常组织的动脉分支。这可以是例如肝动脉的节段分支，但是可能需要阻断整个肝动脉远侧至胃十二指肠动脉起始部，或者甚至多个独立动脉，这取决于肿瘤的程度及其单独血液供应。一旦达到期望的导管位置，所述动脉栓塞可以如下进行：通过将抗血管生成治疗组合物(例如，本发明提供的微球和任选的一种或多种另外的治疗剂)注射穿过动脉导管，直到需要阻断的动脉中血流停止，例如在观察血流停止5分钟之后。确证动脉阻塞的方法可以是，经由导管注射射线不穿透的造影剂，再用荧光镜或X射线胶片证明先前充满造影剂的血管不再含有造影剂。该相同的步骤可以重复用于需要闭合的每个供血动脉。
肝动脉是大多数肝肿瘤的主要血液来源，因此，微球可以阻断血液流向肿瘤，使其丧失需要存活的营养物和氧气。按类似的方法，动脉栓塞形成可以用于多种其它病症，包括例如但不限于急性失血、血管异常、中枢神经系统病症和脾功能亢进。在某些实施方案中，可以进行经动脉化学栓塞形成(TACE)和经动脉栓塞形成(TAE)治疗肝癌或肝肿瘤。TACE是一种TAE和局部化疗的组合治疗，所述局部化疗指包括获得经皮进入肝动脉，通常刺入右腹股沟的正常股动脉，使导管穿过腹主动脉，穿过腹腔干和肝总动脉，进入肝固有动脉(其供应肝脏)的介入性放射过程。
选择性动脉闭塞可以引起局部缺血性肿瘤坏死，同时对肝组织的损害最小。通过来自门静脉的优势血流仍然可保持肝组织的血液供应，同时使肝脏的损害最小。另外，同时施用的化疗剂以较高的浓度保持在血流中较长时期。所述栓塞治疗中断了动脉血流向肿瘤，防止了注射的化疗剂从肿瘤中清除。
TACE可以以两种方式发挥其有利作用。因为肝动脉供应大多数肿瘤，动脉栓塞形成中断了其血液供应，延缓其生长，直到被新血管生成所代替。进一步，聚焦施用化疗能够给予组织较高剂量，同时减少了全身性暴露，全身性暴露通常是剂量限制因素。在栓塞形成之后，化疗药物没有从肿瘤床清除的事实增强了该效果。因此，栓塞治疗和局部化疗的组合有协同抗肿瘤作用，具有高目标响应速率。另一个附加益处是使用组合治疗产生了较低的全身性药物水平，因此毒性更低。
在某些实施方案中，本发明还提供了使用本发明提供的微球或组合物控制或治疗继发性肝肿瘤的方法。继发性肝肿瘤是癌症患者的最常见死因之一，其无疑是肝肿瘤的最常见形式。事实上，任何恶性肿瘤都可以转移至肝脏，但很可能扩散到肝脏的肿瘤包括：胃癌、结肠癌和胰腺癌；黑素瘤；肺瘤、口咽瘤和膀胱膀胱瘤；霍奇金的非霍奇金淋巴瘤；乳腺瘤、卵巢瘤和前列腺瘤。上述每种原发性肿瘤具有可以通过动脉栓塞形成治疗的许多不同的肿瘤类型(例如，据报道，存在超过32种不同类型的卵巢癌).
ii.前列腺癌或前列腺肿瘤
在某些实施方案中，还提供使用本发明提供的微球或组合物控制或治疗前列腺癌或前列腺肿瘤或其症状的方法。
在一些实施方案中，将所述微球或组合物施用至前列腺周围的区域，例如前列腺动脉。例如，但不限于，可以将所述微球或组合物递送到滋养前列腺癌的血管。
可以经由注射器、导管、针及用于注射或灌注的其它工具施用微球或组合物。所述注射器、导管、针等可以插入到静脉或动脉中，例如股动脉或膀胱下动脉。
在某些实施方案中，将注射器、导管或针推至例如前列腺动脉口，并且在一个实施方案中，尽可能地推至使其完全阻塞供应前列腺癌的血管，同时尽可能地保护供应正常组织的多个动脉分支。
在本发明提供的方法的某些实施方案中，在栓塞形成之前，对待栓塞区域进行血管造影。然后，通过使本文的栓子物质回流穿过之前放置的导管来栓塞血管，直到观察到血流停止。所述导管可以经皮或通过外科手术插入。可以通过多个血管造影照片确认闭塞。
b.动静脉畸形
在进一步具体的实施方案中，提供用于控制或治疗个体中动静脉畸形或其症状的方法，其包括例如向个体施用微球或包含该微球的组合物以闭合动脉或静脉来矫正动静脉畸形。在一个实施方案中，可以经由股动脉或肱动脉插入导管，通过在荧光镜指引下引导其穿过动脉系统，进而进入供血动脉治疗动静脉畸形。将该导管可以尽可能地推至使其完全堵塞供应血管畸形的血管，同时尽可能地保护供应正常组织的多个动脉分支(理论上，将可能需要闭合单个动脉，但通常需要闭合多个独立动脉，这取决于血管畸形的程度及其单独血液供应)。一旦达到期望的导管位置，可以利用本发明提供的微球或组合物栓塞每个动脉。
c.子宫纤维瘤
在进一步具体的实施方案中，提供例如通过使用子宫纤维瘤栓塞形成(UFE)或子宫动脉栓塞形成(UAE)控制或治疗子宫纤维瘤或其症状的方法。子宫纤维瘤的原因未知。然而，它们通常引起大量经血、骨盆区域疼痛和压迫膀胱或肠道。
在某些实施方案中，为了治疗大量出血，包括与子宫纤维瘤有关的大量出血，可以使用本发明提供的微球和组合物的形成栓塞(例如UFE)。例如，可以通过子宫动脉的栓塞形成(例如，体内双侧髂动脉的分支)容易地治疗月经过多(月经的大量出血)。在某些实施方案中，本发明提供的组合物和方法用于控制或治疗子宫纤维瘤的症状，例如大量经血、骨盆痛或压迫和/或排尿功能障碍。
在一些实施方案中，可以经由股动脉或肱动脉插入导管，通过在X射线照相机(例如荧光镜)指引下引导其穿过动脉系统，进而进入每个子宫动脉。在某些实施方案中，可以使该导管尽可能地完全堵塞子宫的血管，同时尽可能地保护来源于子宫动脉供应正常组织的动脉分支。在某些实施方案中，可以栓塞每侧的单个子宫动脉，但是有时可能需要阻断多个独立动脉，取决于单独的血液供应。一旦达到期望的导管位置，可以通过施用如上所述的微球和组合物栓塞每个动脉。所述施用的微球阻断提供血流的动脉，引起纤维瘤萎缩，使患有纤维瘤的妇女的症状康复。在某些实施方案中，UAE也可以用于终止由于例如创伤、恶性妇科肿瘤或产后出血引起的严重骨盆出血。
d.良性前列腺肥大
在进一步具体的实施方案中，提供用于控制或治疗良性前列腺肥大(BPH)或其症状的方法。最常见的梗阻性泌尿症状是排尿踌躇、尿线减少、间隙性、不完全的排空感觉、夜尿、尿频和尿急。
在某些实施方案中，可以通过使用本发明提供的微球和组合物的栓塞形成，例如前列腺动脉栓塞形成(PAE)或经导管动脉栓塞形成(TAE)进行BPH的控制或治疗。
在一些实施方案中，可以在X射线照相机(例如荧光镜)的指引下，将导管(例如微导管)插入右和/或左膀胱下动脉。在某些实施方案中，可以使该导管尽可能地完全堵塞前列腺的的血管，同时尽可能地保护来源于前列腺动脉和供应正常组织的动脉分支。
在某些实施方案中，可以使用血管造影(例如，初始骨盆血管造影术或选择性数控减影血管造影术)连同栓塞形成一起评价动脉相和晚期期间的骼血管和前列腺动脉，或者评价向前列腺的血液供应。一旦达到期望的导管位置，可以通过施用如上所述的微球和组合物栓塞每个动脉。所述施用的微球可以阻断提供血流得动脉、减小前列腺大小和使BPH的症状康复。在某些实施方案中，还可以使用栓塞形成控制前列腺切除术或前列腺活组织检查之后的大量出血。
3.诊断成像
如上讨论的，本发明提供的微球可以连同包括如下的诊断成像、治疗成像和治疗药物递送一起使用：例如超声(US)、核磁共振(NMR)、计算机断层摄影术(CT)、电子自旋共振(ESR)、核医学成像、光学成像、弹性成像、用超声递送药物、射频(RF)和微波激光。
在某些实施方案中，本发明提供的微球是荧光镜透视检查可见的。即，在某些实施方案中，所述微球载有一种或多种合适的造影剂，例如离子或非离子造影剂，与微球结合或以其它方式包含微球。
在一些实施方案中，本发明提供的微球包括非离子造影剂。造影剂可以负载在微球上、与所述微球结合、被其所吸附、吸附在其上或者以其它方式包含在微球中或微球上。可选地，造影剂是用于微球的载体溶液。在具体的实施方案中，将造影剂例如非离子造影剂负载在微球之内(例如，通过混合或以其它方式使造影剂接触微球)。在其它的实施方案中，微球不包括造影剂，例如非离子造影剂。
非离子造影剂可以是X射线、CT、MRI造影剂或其组合。造影剂可以是顺磁性的或超顺磁性的。在某些实施方案中，造影剂是X射线造影剂(也称为荧光镜试剂或不透射线的试剂)或CT造影剂。在某些实施方案中，所述试剂包含碘。所述非离子造影剂可以是单体、二聚的或多聚的。
非离子造影剂的实例包括，但不限于甲泛葡胺、碘帕醇(IsovueTM orIopamironTM)、碘克沙醇(VisipaqueTM)、碘海醇(OmnipaqueTM)、碘普胺(UltravistTM)、碘比醇、碘美普尔、碘喷托、碘必乐、碘昔兰、碘曲仑、钆双胺、钆特醇、碘十醇、碘佛醇(OptirayTM)或其组合。在某些实施方案中，造影剂是碘帕醇。在具体的实施方案中，非离子型造影剂是碘克沙醇、碘海醇、碘普胺和碘佛醇。在另一个实施方案中，非离子型造影剂为钆双胺或钆特醇。
与本发明的增稳物组合使用的合适造影剂的实例包括，稳定的自由基，例如稳定的硝基氧，以及含有过渡元素、镧系元素和锕系元素的化合物，如果需要，这些元素可以是盐的形式存在，也可以共价或非共价结合于络合剂，包括其亲脂性衍生物，或者结合蛋白质大分子。过渡元素、镧系元素和锕系元素可以包括，例如，Gd(III)、Mn(II)、Cu(II)、Cr(III)、Fe(II)、Fe(III)、Co(II)、Er(II)、Ni(II)、Eu(III)和Dy(III)。在某些实施方案中，所述元素为Gd(III)、Mn(II)、Cu(II)、Fe(II)、Fe(III)、Eu(III)和Dy(III)。上述元素可以是盐的形式，包括无机盐和有机盐，所述无机盐例如锰盐，例如氯化锰、碳酸锰、乙酸锰，所述有机盐例如葡糖酸锰和羟基磷灰石锰。其它示例性的盐包括铁盐例如硫化铁，和三价铁盐例如氯化铁。
上述元素还可通过，例如，共价或非共价结合力与络合剂结合，所述络合剂包括其亲脂性衍生物，或者与蛋白质大分子结合。络合剂可以包括，例如，二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N′，N′，N′″-四乙酸(DOTA)、1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N′，N″-三乙酸(DOTA)、3，6，9-三氮杂-12-氧杂-3，6，9-三羧亚甲基-10-羧基-13-苯基十三烷酸(B-19036)、羟苄基乙二胺二乙酸(HBED)、N，N′-二(pyridoxyl-5-磷酸)乙二胺、N，N′-二乙酸(DPDP)、1，4，7-三氮杂环壬烷-N，N′，N”-三乙酸(NOTA)、1，4，8，11-四氮杂环十四烷-N，N′，N′，N′″-四乙酸(TETA)、kryptands(大环类络合物)和去铁铵。在某些实施方案中，所述络合剂为EDTA、DTPA、DOTA、DO3A和kryptands，例如DTPA。亲脂性络合物可以包括络合剂EDTA、DOTA的烷基化衍生物，例如N，N′-二-(羧基癸基氨甲基-N-2，3-二羟基丙基)乙二胺-N，N′-二乙酸酯(EDTA-DDP)；N，N′-二-(羧基十八烷基氨基甲基-N-2，3-二羟基丙基)乙二胺-N，N′-二乙酸酯(EDTA-ODP)；N，N′-二(羧基十二烷基氨甲基-N-2，3-二羟基丙基)乙二胺-N，N′-二乙酸酯(EDTA-LDP)；包括在美国专利号5,312,617中描述的那些，将其全部内容引入本文作为参考。蛋白质大分子可以包括，例如白蛋白、胶原、聚精氨酸、聚赖氨酸、聚组氨酸、γ-球蛋白和β-球蛋白。在某些实施方案中，所述蛋白质高分子是白蛋白、聚精氨酸、聚赖氨酸或聚组氨酸。因此，合适的络合物包括Mn(II)-DTPA、Mn(II)-EDTA、Mn(II)-DOTA、Mn(II)-DO3A、Mn(II)-krytands、Gd(III)-DTPA、Gd(III)-DOTA、Gd(III)-DO3A、Gd(III)-krytands、Cr(III)EDTA、Cu(II)-EDTA，或铁-去铁铵。在具体的实施方案中，所述络合物是Mn(II)-DTPA或Gd(III)-DTPA。
硝基氧是顺磁性造影剂，由于硝基氧分子中存在未成对电子，因而增强了MRI的T1和T2弛豫率。如本领域普通技术人员已知的，特定化合物作为MRI造影剂的顺磁效率至少特别地在某种程度上与顺磁性核或顺磁性分子中的未成对电子数相关，特别地，与未成对电子数的平方相关。例如，钆具有七个未成对电子，而硝基氧具有一个未成对电子。因此，钆通常是一种比硝基氧强得多的MRI造影剂。然而，有效相关时间是评价造影剂效率的另一个重要参数，该参数使硝基氧可能具有增强的弛豫。当转动速率减小时，例如将顺磁造影剂与大分子连接时，其转动将更加缓慢，从而能更有效地传递能量，以加速水质子的弛豫。然而，对于钆，其电子自旋弛豫时间很短，这将限制慢速旋转相关时间可以使弛豫增强的程度。然而，对于硝基氧，其电子自旋相关时间更加有利，通过减缓这些分子的旋转相关时间可导致弛豫的极大增强。可以将硝基氧包在微球的外周，例如通过制备其烷基衍生物，从而使得到的相关时间最佳化。而且，还可以将得到的对比介质看成一种磁性球体，即驰豫最大化的一种几何构型。
适用于本文的组合物的示例性的超顺磁造影剂包括经磁畴作用的金属氧化物和金属硫化物、亚铁类或铁类磁性化合物例如纯铁、磁性氧化铁例如磁石、γ-Fe2O3、Fe3O4、锰铁盐、钴铁盐和镍铁盐。然后，可以利用MR整体显象法进行身体快速成像，例如，用于血栓形成，如果期望，还可以施用超声帮助血栓溶解。
造影剂，例如如上所述的顺磁性造影剂和超顺磁性造影剂，可以作为微球和/或增稳物中的一种成分。对于囊泡，可以将造影剂俘获在其内部空腔中，并与微球一起作为溶液施用，其中可混入任何另外的增稳物，或者可以将造影剂包被在囊泡表面或囊泡膜上。可以在本发明的组合物中使用任一种或多种顺磁性试剂和/或超顺磁性试剂的混合物。如果期望，还可以将顺磁性试剂和超顺磁性试剂分别进行共施用。
如果期望，还可以将顺磁性试剂或超顺磁性试剂以烷基化形式或其它衍生物形式混入组合物中，特别地混入到微球的脂性壁中。特别地，硝基氧2，2，5，5-四甲基-1-吡咯烷氧自由基和2，2，6，6-四甲基-1-哌啶烷氧自由基可以在没有被甲基占据的环位置上，通过多种键与长链脂肪酸形成加合物，所述键包括例如乙酰氧键。
本发明提供的微球不仅可以作为如上所述超顺磁性试剂的有效载体，还可以提高造影剂的磁化作用。超顺磁性造影剂包括经磁畴作用的金属氧化物，特别是氧化铁，此外还包括氧化锰以及包含不同剂量的锰、钴、镍的氧化铁。这些试剂均为毫微球或微球，并且具有非常高的批量磁化性和横向弛豫率。较大的颗粒，例如具有直径约100nm的颗粒具有比R1弛豫高得多的R2弛豫。较小的颗粒，例如具有直径约10至15nm的颗粒的R2弛豫稍有降低，但R1和R2值更加均衡。更小的颗粒，例如具有直径约3至约5nm的单晶氧化铁颗粒具有较低的R2弛豫，但R1和R2弛豫率可能最为均衡。还可以用铁蛋白包囊非常高弛豫率的超顺磁性铁的核心。
可以简单地将氧化铁混入增稳物和/或微球中。在具体的实施方案中，可以将氧化铁混入到微球的壁中，例如吸附在微球体表面或俘获在微球内部。
E.试剂盒
本发明还提供了药物包装和试剂盒，其包括一个或多个装有一种或多种本发明提供的组合物成分的容器。所述试剂盒可以包括例如微球和一种或多种另外的组分，其中一种、两种、三种或多种所述组分可以在一个、两个、三个或多个小瓶中。在某些实施方案中，所述微球以干燥粉末的形式提供。在其它的实施方案中，所述微球在生物相容性载体中提供，例如呈乳剂或混悬剂。
在某些实施方案中，所述容器是注射器(例如，聚碳酸酯、聚丙烯或环烯烃聚合物(COP)注射器)。在具体的实施方案中，所述注射器具有低水分损失，对于本发明提供的试剂盒的预填充注射器实施方案而言，其可以引起贮存期限增加(例如，2至3年或更久)。在一个具体实施方案中，本发明提供的微球包含在无菌注射器中，例如无菌预填充注射器(例如，20cc注射器)，其任选地以剥离袋(peel away pouch)提供。在某些实施方案中，所述注射器包含在药学可接受的载体例如生理盐水(例如，非致热或无热原无菌生理盐水)中的约1ml、2ml、3ml或4ml的微球。
在其它的实施方案中，本发明提供的微球包含在小瓶中。在具体的实施方案中，所述小瓶是具有可以拧下的帽(例如，5ml玻璃小瓶)的玻璃小瓶，其任选地包装在包括一个或多个另外的小瓶中的剥离包装中。在具体的实施方案中，所述小瓶包含在药学可接受的载体，例如生理盐水(例如非致热或无热原无菌生理盐水)中的1ml或2ml的微球。
伴随这样的容器的可以是政府机构规定形式的注意事项，规定药品或生物制品的制备、使用或销售，反映产品的制造、使用或销售用于患者(例如人或其它哺乳动物)给药。伴随这样的容器的还可以是使用说明书。本文描述的任何方法的试剂均可以被包括作为试剂盒的组分。
在一种试剂盒形式中，本发明提供的微球存在于一个小瓶中的液体、生理学相容性溶液中。在另一种试剂盒形式中，本发明提供的微球以干燥形式存在于一个小瓶中。在包含多个小瓶中的多种组分的某些试剂盒形式中，可以在施用之前或施用同时，将所述小瓶的内含物一起混合。在某些实施方案中，在施用之前，将所述微球悬浮在合适的液体中，或者任选地提供包含可注射的溶液的第二个小瓶，在施用之前或施用同时，混合两个小瓶的内含物。
最后，在另一个试剂盒形式中，本发明提供的微球存在于一个小瓶中，第二个小瓶包含含有造影剂的药学可接受的溶液。然后，在施用之前或施用同时，将所述微球与造影剂一起混合。
通过说明而非限制的方式提供下列实施例。
实施例
除非另有说明，本发明实施使用本领域技术内的分子生物学、有机化学、生物化学和相关领域的常规方法。这些技术描述在本文引用的参考文献中，并在文献中详细阐述。参见，例如Maniatis等人(1982)Molecular  Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Sambrook等人(1989)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Sambrook等人(2001)Molecular Cloning： A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley & Sons(1987及每年更新)；Current Protocols in Immunology，JohnWiley & Sons(1987及每年更新)。
实施例1：超纯的二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体的合成
根据下述方案合成超纯的二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体：
简而言之，将丙烯酰氯溶于CH2Cl2中，并冷却至0℃。在Ti＝0-5℃下，滴加溶于CH2Cl2中的N，N-二乙基乙醇胺，接着滴加NaOH(约15％水溶液)。搅拌该反应混合物15分钟，分离各层。用水和NaHCO3溶液洗涤有机层，并经MgSO4干燥。过滤该悬浮液，在减压下浓缩，并通过BHT稳定化。
实施例2：二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体的HPLC分析
首先，如下制备标准溶液，采用选择的MBA作为内参照对照：
储备溶液
DEAE储备溶液：将称重约200mg(或250mg)的DEAE置于200mL(或250mL)参照烧瓶中，并将其溶于纯净水(Purelab)中。用1N HCl调节该溶液的pH至2。用水调节该溶液至浓度1000ppm(mg/L)。
MBA储备溶液：将称重约200mg(或250mg)的MBA置于200mL(或250mL)参照烧瓶中，并将其溶于纯净水中。然后，使该溶液超声粉碎15分钟，并使其恢复至室温。将该溶液调节至浓度1000ppm(mg/L)。
中间体溶液：通过用水稀释5mL的所述1000ppm溶液至最终体积50mL来制备中间体溶液。还制备20、40、60、80、100ppm溶液。
将注射溶液列在表1中。记录溶液的准确浓度。
表1.注射的溶液
如下制备待分析的样品。
储备溶液：将称重约200mg(或250mg)的DEAE置于200mL(或250mL)参照烧瓶中，并将其溶于纯净水(Purelab)中。用1N HCl调节该溶液的pH至2。用水调节该溶液至浓度1000ppm(mg/L)。制备并试验三种储备溶液。
中间体溶液：通过用水稀释5ml的所述1000ppm溶液至最终体积50mL来制备中间体溶液。
样品溶液：：通过将中间体溶液稀释至约60ppm(对于注射样品，至少5mL)来制备样品溶液。也测试该中间体溶液(100ppm)。记录准确浓度。
然后，将该溶液(标准溶液和样品溶液)转移到用于分析的注射器的支持器上的HPLC小瓶中。将HPLC的设置列在表2中。
表2.HPLC设置
参数 设置
  注射体积   20μL
  烘箱温度   30℃
  流动相   甲醇/水(0.1％TFA)10/90
  分析时间   6min
  波长   230nm
  参数   设置
  柱   C18；100x4.6mm，5μm.
  流速   1mL/min
将HPLC分析的结果显示在图1A中，显示使用溴化反应(右条形图，如制造商BioSepra提供的)和HPLC(左条形图)对从BioSepra获得的给定批次DEAE单体(T209，U088和U089)观察到的纯度灵敏性。
实施例3：二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体的溴化试验
将包含二乙基氨基乙基丙烯酰胺的试验样品(0.1g)加入到四氯化碳(2mL)中。逐滴加入溴在四氯化碳中的5％溶液，振摇直到溴颜色持续存在。溴化试验对存在的C＝C键灵敏，其可以显示出在试验样品中存在的二乙基氨基乙基丙烯酰胺的近似含量。
实施例4：超纯的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体的合成
根据下述方案合成超纯的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体：
简而言之，将丙烯酰氯溶于CH2Cl2中，并将其冷却至0℃。在Ti＝0-5℃下，滴加溶于CH2Cl2中的N-(三羟基)甲胺，接着滴加NaOH(约15％的水溶液)。搅拌该反应混合物2小时。在水中重结晶之后，除去N-三羟甲基甲基丙烯酰胺。
实施例5：N-三-羟甲基甲基丙烯酰胺单体的HPLC分析
首先，使用具有至少98％纯度的N-[三(羟甲基)甲基]丙烯酰胺(三丙烯醛)(由SAFC提供；来自制造商的纯度证书的信息)制备标准曲线。
储备溶液：将称重约200mg(或250mg)的三丙烯醛置于200mL(或250mL)参照烧瓶中，并将其溶于纯净水中。然后，使该溶液超声粉碎15分钟，并使其恢复至室温。将该溶液调节至浓度1000ppm(mg/L)。
中间体溶液：通过用水稀释5ml的所述1000ppm溶液至最终体积50mL来制备中间体溶液。
将注射溶液列在表3中。记录溶液的准确浓度。
表3.注射的溶液
 溶液  浓度(ppm)   中间体溶液体积   水体积   总体积
 标准1  20   1   4   5
 标准2  40   2   3   5
 标准3  60   3   2   5
 标准4  80   4   1   5
 标准5  100   5   0   5
如下制备待分析的样品：
储备溶液：将称重约200mg(或250mg)的三丙烯醛置于200mL(或250mL)参照烧瓶中，并将其溶于纯净水中。然后，使该溶液超声粉碎15分钟，并使其恢复至室温。将该溶液调节至浓度1000ppm(mg/L)。制备并检测三份溶液。
中间体溶液：通过用水稀释5ml的所述1000ppm溶液至最终体积50mL来制备中间体溶液。
样品溶液(每个溶液)：通过将所述中间体溶液稀释至约60ppm(对于注射样品，至少5mL)制备样品溶液。也检测中间体溶液(100ppm)。记录准确浓度。
然后，将溶液(标准溶液和样品溶液)在注射器支持下转移到HPLC小瓶中用于分析。将HPLC的设置列在表4中。
表4.HPLC设置
  参数   设置
  注射体积：   20μL
  烘箱温度   30℃
  流动相   甲醇/水20/80(0.2％TFA)
  分析时间   6min
  波长   230nm
  柱   C18；250x4.6mm，5μm.
  流速   1mL/min
将显示来自不同来源的三丙烯醛纯度的HPLC分析结果显示在图1B中。图1B描述使用溴化反应(右条形图，如制造商提供的)或HPLC(左条形图)观察到的两个不同批次的三丙烯醛(来自BioSepra的R426和R402)的纯度灵敏性。假设获得的重结晶三丙烯醛(TA-R)的纯度为100％来显示数据，并将其与在重结晶前来自SAFC的三丙烯醛(TA)单体相比较(见下文)。通过在水中重结晶TA(来自SAFC的三丙烯醛)制备TA-R，然后干燥。对重结晶的TA-R样品进行NMR 1H分析，NMR 1H谱没有检测出任何有机杂质(数据没有显示)。另外，对TA-R样品进行元素分析，以检查是否存在无机盐。100％纯的三丙烯醛的理论结果是C 47.99％，H 7.48％，N8.00％和O 36.53％。对于从SAFC获得的TA样品实测值是：C 46.76％，H 7.39％和N 7.86％，TA-R为48.14％，H 7.63％和N 8.07％，因此该假设使得TA-R样品接近100％纯。然后，通过HPLC分析检测R426、R402 TA和TA-R样品，记录在232nm的光谱。对于所有分析的样品，照片区域和浓度之间显示良好的线性(数据没有显示)。假设TA-R为约100％纯，则将每个线的梯度定义为每种三丙烯醛样品的HPLC纯度。将如上讨论的TA和TA-R样品的HPLC分析结果显示在图1B中。
实施例6：N-三-甲基甲基丙烯酰胺单体的溴化试验
将包含N-三羟甲基甲基丙烯酰胺的试验样品(0.1g)加入到四氯化碳(2mL)中。逐滴加入溴在四氯化碳中的5％溶液，振摇直到溴颜色持续存在。溴化试验对存在的C＝C键灵敏，其可以显示出在试验样品中存在的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺的近似含量。
实施例7：使用超纯的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体来制备微球
在搅拌下，将NaCl(58g)和乙酸钠(27.2g)溶解在-升烧杯内的水(300mL)中。加入甘油(400mL)，并用乙酸调节该溶液的pH至6。然后，在60℃下，在搅拌下加热该溶液，并向该溶液中加入三种单体。所述单体物质不是100％纯的，称重在下述步骤中使用的每种单体的含量，并调节存在于所述物质中的杂质的含量。假设所述单体是100％纯的，每种单体的量如下：
N，N-亚甲基二-丙烯酰胺：10g
二乙基氨基乙基丙烯酰胺：35g
N-三-羟甲基甲基丙烯酰胺：90g
猪的明胶(PB Leiner；Vilvoorde，Belgium)：20g
二乙基氨基乙基丙烯酰胺是由Pall BioSepra，France提供的。二乙基氨基乙基丙烯酰胺的纯度大于80％，符合Pall BioSepra′s的规格标准。
N-三羟甲基甲基丙烯酰胺是由Pall BioSepra和Sigma Aldrich FineChemicals(SAFC))提供的。根据suppliers的产品规格，Pall BioSepra和SAFC提供的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺的纯度分别大于76％和93％(参见表5)。将PALL Biosepra和SAFC提供的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺的其它比较数据提供在表5中。
表5：PALL Biosepra和SAFC提供的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺的其比较数据
当溶液澄清时，将明胶(25g)在水(250ml)中的溶液加入到该单体溶液中。过滤该溶液，并在搅拌下将其置于60℃(溶液A)下。制备过硫酸铵(3.5g)在水(101.6g)中的溶液(溶液B)。在10升的烧杯中，在60℃下，搅拌油(4L)和Arlacel(3.1g)(溶液C)。分别经由泵Q2和泵RHO，将溶液A和溶液B注射到置于溶液C中的进料环装置中。在完成注射之后，在60℃下，以125rpm搅拌该溶液30分钟。通过加入冷的水、冰和表面活性剂溶液中止反应。用水洗涤获得的微球几次，直到完全地除去油。将烧杯置于超声浴中10分钟，以减少粘着性微球的数量。然后，在37℃下，加热该微球，并加入300ml的戊二醛/1L微球，用于明胶交联。再次用水洗涤所述微球两次。然后，通过倾析回收微球，小心地洗涤、过筛并在高压灭菌器中的缓冲介质中灭菌。
实施例8：使用超纯的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体和超纯的二乙基 氨基乙基丙烯酰胺单体的微球制备
在搅拌下，将NaCl(58g)和乙酸钠(27.2g)溶解在1升烧杯内的水(300mL)中。接着，加入甘油(400mL)，并用乙酸调节该溶液的pH至6。
在搅拌下，在60℃下加热该溶液，并向该溶液中加入所述三种单体中的两种。所述单体物质不是100％纯的，称重在下述步骤中使用的每种单体的含量，并调节存在于所述物质中的杂质的含量。假设所述单体是100％纯的，每种单体的量如下：
N，N-亚甲基二-丙烯酰胺：10g
N-三-羟甲基甲基丙烯酰胺：90g
二乙基氨基乙基丙烯酰胺：35g
猪的明胶(PB Leiner；Vilvoorde，Belgium)：20g.
N-三羟甲基甲基丙烯酰胺是由Pall BioSepra和SAFC提供的。根据suppliers的产品规格，Pall BioSepra和SAFC提供的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺的纯度分别大于76％和93％(参见表5)。将PALL Biosepra和SAFC提供的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺的其它比较数据提供在表5中。
二乙基氨基乙基丙烯酰胺是由PALL Biosepra和SAFC提供的。根据suppliers的产品规格，Pall BioSepra和SAFC提供的二乙基氨基乙基丙烯酰胺的纯度分别大于80％和95％。将PALL Biosepra和SAFC提供的二乙基氨基乙基丙烯酰胺的其它比较数据提供在表6中。
表6.PALL Biosepra和SAFC提供的二乙基氨基乙基丙烯酰胺的比较数据
  DEAE丙烯酰胺规格标准  PALL Biosepra   SAFC
  IR光谱  与结构相符   与结构相符
  含水量  ＜5％   无
  纯度  ＞80％   ＞95％
  含氮量  11-14％   无
  NMR分析  无   与结构相符
  HPLC  无   有
  气相色谱  无   有
在制备之后，加入第三种单体二乙基氨基乙基丙烯酰胺。用水(17g)稀释二乙基氨基乙基丙烯酰胺(35g)。将该溶液置于冰冷的水浴中，并用HCl调节该溶液的pH至2。将该溶液加入到包含其它两种单体的溶液中。
当溶液澄清时，将明胶(25g)在水(250ml)中的溶液加入到上述单体溶液中。过滤该溶液，并在搅拌下将其置于60℃(溶液A)下。制备过硫酸铵(3.5g)在水(101.6g)中的溶液(溶液B)。在10升的烧杯中，在60℃下，搅拌油(4L)和Arlacel(3.1g)(溶液C)。分别经由泵Q2和泵RHO，将溶液A和溶液B注射到置于溶液C中的进料环装置中。在完成注射之后，在60℃下，以125rpm搅拌该溶液30分钟。通过加入冷的水、冰和表面活性剂的溶液中止反应。用水洗涤获得的微球几次，直到完全地除去油，并将烧杯置于超声浴中10分钟，以减少粘着性微球的数量。然后，在37℃下，加热该微球，并加入300ml的戊二醛/1L微球，用于明胶交联。再次用水洗涤所述微球两次。然后，通过倾析回收该微球，小心地洗涤、过筛并在高压灭菌器中的缓冲介质中灭菌。
实施例9：使用超纯单体的制备有色微球
用硼酸盐缓冲液(0.1M，pH 8)洗涤根据上述实施例7或8获得的微球(100mL)，然后，将其悬浮在赤藓红异硫氰酸盐溶液(50mL，5mg/mL)中。接着，搅拌该悬浮液至少15小时，之后，将其用中性缓冲液洗涤至无色的上清液。之后，校正该红色的微球并杀菌，其可以用于经皮栓塞形成。
实施例10：使用超纯的单体的不透射线制剂的制备
在实施例7或8的步骤之后，向初始单体中加入硫酸钡粉末(200g)。获得的微球对可见光和X射线都是不可穿透的。
实施例11：使用超纯单体的制备磁性微球
在实施例7或8的步骤之后，向初始单体溶液中加入50mg的磁铁矿(例如Fe3O4)。可选地，将根据实施例7和8获得的微球各自填充到16mm直径的层析柱中，并用生理学缓冲液洗涤。然后，以10mL/小时的流速给所述柱填充铁磁流体(非常小的磁铁矿颗粒)的胶体悬浮液。通过微球吸附和永久性俘获磁铁矿颗粒。得到的微球可用于常规栓塞形成方法，且具有磁性，例如可以以磁共振成像(MRI)检测。
实施例12：通过超声粉碎分离非粘着性微球
按照不同的方法处理由N-三羟甲基甲基丙烯酰胺、二乙基氨基乙基丙烯酰胺、N，N-亚甲基二-丙烯酰胺和TEMED制备的微球。在35KHz超声波浴中进行超声粉碎一次或两次，约10-15分钟。
图2A-2C显示超声粉碎减小了粘着性微球。图2A显示未交联的微球，在超声粉碎开始时的微球(左方形图)和超声粉碎开始15分钟之后的微球(右方形图)。采用超声粉碎使粘着性微球的百分数从约7％降低至约0.2％。图2B显示交联后的第二批微球(分成两部分)，在交联之前没有超声粉碎的微球(左方形图)或在交联之前超声粉碎的微球(右方形图)。在超声粉碎步骤之后，进行过筛。采用超声粉碎使粘着性微球的百分数从约3％降低至接近约0％。图2C显示未交联的微球，在超声粉碎开始时的微球(左方形图)和超声粉碎2×15min之后的微球(右方形图)。采用超声粉碎使粘着性微球的百分数从约9.2％降低至约1.6％。
总之，在所有的情况下，与没有超声粉碎(图2A-2C，左方形图)相比较，当采用超声粉碎时(图2A-2C，权利方形图)，所述微球显示出粘着性球更少。该方法没有观察到微球破裂。
表7和图3描述来自另一个试验的结果，进一步显示在超声粉碎之前(图3A)和明胶交联之后(图3B)粘着性微球(批次FM0904100)试验品的百分数减小。
表7
在超声粉碎步骤之后进行过筛，800μm、630μm、450μm或50μm筛上的体积百分数显示在表8和图3C中。
表8
 倾倒第1天  倾倒第2天  倾倒第3天  倾倒第4天  倾倒第5天   总计
  T800  18  14  38  33  40   143
  T630  16  14  35  37  30   132
  T450  13  21  35  37  30   135
  T50  3  13  35  36  30   80
  总体积  50  62  125  133  120   490
  T800  36％  23％  30％  25％  33％   29％
  T630  32％  23％  28％  28％  25％   27％
  T450  26％  34％  28％  27％  25％   28％
  T50  6％  21％  14％  20％  17％   16％
实施例13：单体的HR-MAS NMR分析
采用高分辨魔角自旋(“HR-MAS”)技术分析本文用于微球合成使用的起始原料。
样品的制备
将三丙烯醛、猪的明胶、DEAE-丙烯酰胺和MBA样品(每种约15mg)装填到HR-MAS旋筒中(参见图7)。然后，加入氘代溶剂以获得总体积50μl。
所述旋筒为在表9中提及的。
表9
  旋筒   样品   质量   溶剂  总体积(μL)
  1.280   三丙烯醛   15   D2O  50
  1.281   明胶   12   D2O  50
  1.282   MBA   15   D2O  50
  1.274   DEAE-丙烯酰胺   15   D2O  50
通过NMR光谱分析样品
在具有4mm HR-MAS探头的Bruker Avance I光谱仪上，记录在400MHz(1H)的NMR谱(1H，13C，2H lock)。
调整
在调节探头的魔角之后，对于每种样品进行下述调节：
探头调整和匹配(1H)
90°脉冲测量
B0均匀性调节(垫片)
采集
所有的试验都在室温下(298K)下进行。对于每种样品，记录1D 1HNMR谱。
处理将采集和工艺参数都概括在表10中。
表10
结果
乙烯残基和芳香族部分的典型信号在光谱中鉴定出。图4A-4D显示三丙烯醛、明胶、MBA和DEAE丙烯酰胺的一维1H NMR谱。图4E-4G显示三丙烯醛、MBA和DEAE丙烯酰胺的1H核的分布。明胶的1D 1H NMR谱由7.20至7.30ppm的峰组成，该峰可归属于例如氨基酸中存在的芳香族质子。
实施例14：微球的HR-MAS NMR分析
通过NMR光谱学分析根据实施例8使用不同来源(SAFC，PALLBiosepra)的三丙烯醛和DEAE丙烯酰胺制备的微球。
通过NMR光谱分析样品
微球样品(每个约3mg)由不同来源的三丙烯醛和DEAE丙烯酰胺制备。SAFC FMP 128微球样品是使用从SAFC获得的三丙烯醛和DEAE(三丙烯醛批次1443257，纯度96％；DEAE批次S85803-199，纯度98％)在实验台上制备的。PALL FMP 130微球样品是使用从PALL Biosepra获得的三丙烯醛和DEAE(三丙烯醛批次Y175；纯度90.9％；DEAE批次U089；纯度85％)在实验台上制备的。FM0903031-M1675微球样品是使用从SAFC获得的三丙烯醛(批次03211DJ；纯度95.2％)和从PALL Biosepra获得的DEAE(批次U089；纯度85.0％)制备的。FM0903021-M1654微球样品是使用从PALL Biosepra获得的三丙烯醛和DEAE(三丙烯醛批次W299；纯度88.2％；DEAE批次U089；纯度85.0％)制备的。纯度水平如制造商的说明书提供的。将四种样品的每种都装入旋筒HR-MAS中(参见图7)。然后，加入氘代(D2O)溶剂获得总体积50μL。
所述旋筒为在表11中提及的。
表11
  旋筒   样品   质量   溶剂  总体积(μL)
  1.270   SAFC FMP 128   3   D2O  50
  1.271   PALL FMP 130   3   D2O  50
调整
在调节探头的魔角之后，对于每种样品进行下述调节：
探头调整和匹配(1H)
90°脉冲测量
B0均匀性调节(垫片)
采集
所有的试验都在室温下(25℃)下进行。对于每种样品，记录一维1HNMR谱。
处理
将采集和工艺参数都概括在表12中。
表12
结果
结果显示在图5A-5J中。图5A-5D显示样品SAFC FMP 128和PALLFMP 130的NMR谱。图5E-5J显示样品SAFC FMP 128、PALL FMP130、FM0903031-M1675和FM0903021-M1654的NMR谱。
图5A是两个样品的NMR谱的叠加，其显示在所述谱中鉴定出的相应主峰(标记为A、B和C)之间的类似性。峰A、B和C及其它次峰的归属是基于实施例13的起始原料的HR-MAS NMR谱的分析。
峰A：鉴定在3.77ppm，其可能归属于例如共聚物中的三-羟甲基基团C(CH2OH)3)。
峰B：鉴定在3.2ppm，其可能归属于例如连接碱性氮原子中的CH2基团(CH2N(CH2CH3)2)。不希望受到任何理论的束缚，D2O中纯单体和微球之间在化学位移方面的不同表明胺在交联结构中是质子化的(铵)。
峰C：鉴定在1.3ppm，其可能归属于例如聚合结构中甲酰胺基团β位的基团(CH2-CHCONH)。使用峰表面积分的半定量分析方法进行峰B与峰A和峰C与峰A的相对积分比，将其概括在表13中。
表13
  样品   A   B   C
  PALL FMP 130   100   47.7   52.1
  SAFC FMP 128   100   57.4   62.5
不希望受到任何理论的束缚，用纯三丙烯醛和DEAE丙烯酰胺合成的微球的积分比较高，这表明其与纯度低的物质合成的微球相比，在合成中获得了较好的聚合效率。
图5B和5C显示9-5ppm(5B)和5-0ppm(5C)区域中的光谱。其余峰鉴定在5和9ppm之间，集中在7.3ppm，其可能归属于例如明胶中存在的芳香族质子。6.4和5.8ppm之间的峰可能归属于例如聚合期间过量丙烯酰胺的痕迹。图5D和表13显示峰B和C在化学位移(δ)方面的微小差异。
图5E显示四种不同样品的1H NMR谱的比较。1.15ppm的三重峰和在3.62ppm的四重峰鉴定为来自FM0903031-M1675和FM0903021-M1654的光谱。2.2ppm的单峰鉴定来自于FM0903031-M1675的光谱，其也存在于SAFC 128和PALL FMP 130的光谱中，但是强度弱得多(参见图5F)。
与主峰相比，这些共振线相对很细，其可能是由于存在小的有机分子。1.15ppm的三重峰和在3.62ppm的四重峰可能归属于例如存在乙醇或醚二乙基。对于分别来自于PALL FMP 130和SAFC FMP 128的FM0903031-M1675和FM0903021-M1654，峰B和C的化学位移相同(图5G)。表14概述了观察到的化学位移中的不同。
表14
  样品 δB(ppm) δC(ppm) Δ(δB)(Hz)* Δ(δC)(Hz)*
  PALL FMP 130 3.212 1.284 0 0
  SAFC FMP 128 3.192 1.276 8.00 3.20
  FM0903031-M1675 3.246 1.298 -13.60 -5.60
  FM0903021-M1654 3.246 1.298 -13.60 -5.60
*测量的Hz相对于样品PALL FMP 130的峰B和C的共振的不同
在FM0903031-M1675和FM0903021-M1654光谱(图5H)中鉴定的位于8.4ppm的峰。
采用半定量分析方法分析光谱。四个光谱的叠加(图5I)说明了峰B和C的强度和半高度处宽度的变化。使用计算机软件，对于每种光谱进行质量A、B和C的拆解，用于定量(图5J)。计算峰B和C的振幅值，并标准化成峰面积A，将其概括在表15中。
表15
  样品   A   B   C
  PALL FMP 130   100   47.7   52.1
  SAFC FMP 128   100   57.4   62.50
  FM0903031-M1675   100   49.5   62.30
  FM0903021-M1654   100   49.7   60.90
不希望受到任何理论的束缚，特别地可以如下解释不同样品之间观察到的峰B和C的不同：化学位移和半高度处宽度的不同可能归因于不同样品之间的残余各向异性度。即使在水中膨胀与旋转魔角允许均衡取代化学物和双级偶联的各向异性联合，也不能完全消除这些作用。对于NMR谱可观察到的这些剩余效应可能归因于不同样品中的交联度。可以通过聚合物的微观结构不同解释不同的表面。可以通过制备方法的不同或使用材料的不同解释在存在或不存在小有机分子下的不同。可以使用观察到的峰B和C在化学位移和半高度宽度方面的不同区分样品来源。
实施例15：向患有肝癌的患者施用微球
根据在Xu等人在Xu等人(2009)World J Gastroenterol 15(29)：3664-3669中改进的方法进行该研究。简而言之，在查看横断面图像之后，对患者进行栓塞形成(任选的TACE)。将French维管束鞘置于股动脉中，并将Mickaelson导管推入到腹动脉和上肠系膜动脉中。在快速顺序放射照相成像期间，将造影剂注射到所述动脉中。然后，定位供应肿瘤的动脉分支。仔细地检查静脉相门静脉的开放。将Tracker导管穿过Mickaelson导管推入供应肿瘤的动脉分支中。将多柔比星(约50mg)、丝裂霉素(约10mg)和碘化油(约4-15mL)的混合物注射到动脉分支中，直到达到止血。如果在该处理后2周，肿瘤没有收缩，则可以进行第二个栓塞形成。
然后，介入放射学医生进行动脉造影以鉴定供应肿瘤的肝动脉分支，并将更小的导管穿入这些分支中。这可以使肿瘤的化疗剂量的量最佳化。
当选择好供应肿瘤的血管时，将微球本身，或者在进行TACE时、交替的化疗剂量和根据实施例7或8制备的微球(或本发明提供的其它微球)的等份、或微球与化疗试剂的组合注射穿过所述导管。可以在一个血管供血的区域内给予全部微球和/或化疗剂量，或者可以将微球和/或化疗剂量分配到供应肿瘤的几个血管中。
实施例16：向患有前列腺癌的患者施用微球
将诊断患有前列腺癌的患者分成两组，试验组和对照组。对试验组的患者采用根据实施例7或8制备的微球(或本发明提供的其它微球)的进行栓塞形成。
对患有可见前列腺肿瘤的患者进行活组织检查。用栓塞形成处理诊断为癌症的前列腺肿瘤患者。在治疗前，记录前列腺癌肿瘤患者的前列腺癌肿瘤大小和血液PSA水平。
在栓塞形成过程之前，给予预防性单剂量的200mg环丙沙星。在局部麻醉下，通过右经股方法在局部麻醉下介入。进行初始骨盆血管造影术，评价动脉相和晚期相骼血管和前列腺动脉。使用5-Fr Cobra 2导管进行右内骼动脉和左内骼动脉的选择性数控减影血管造影术，以更好地评价前列腺的血液供应。然后，使用微导管(Embocath；Biosphere Medical，Rockland，ME，USA)进行右和左膀胱下动脉的超选择性导管插入，并通过人工注射3-5ml的造影剂进行血管造影，以确保该微导管尖端在前列腺动脉内部或在其口部。将根据实施例7或8制备的微球调整至直径300-500μm，用于栓塞形成。将每个2ml小瓶的微球稀释在20ml的50％碘化造影剂和50％生理盐溶液的混合物中。在荧光镜的指引下，将该混合物慢慢地注射。进行由膀胱下动脉的前列腺动脉栓塞形成至淤滞，而该混合物没有回流到不期望的动脉。在膀胱下动脉，继续用微导管人工进行血管造影，并且使用在髂内动脉前支具有5-Fr导管的泵检查前列腺的任何其它血液供应。然后，使用相同的技术进行对侧的栓塞形成。
每周测量的肿瘤大小并记录。计算肿瘤体积(肿瘤体积＝0-5(L+W)×L×W×.0.5236，其中L＝肿瘤长度，W＝宽度)。将在栓塞形成时的肿瘤体积作为将来比较肿瘤大小变化的参照。将每个肿瘤体积的每周变化记录为栓塞形成后基于原始测量的差异％。追踪血液PSA水平，并将其与在栓塞形成时的水平相比较。
实施例17：向患有动静脉畸形的患者施用微球
根据Gao等人(2009)Chinese Medical Journal 122(16)：1851-1856描述的改进方法使患有脑动静脉畸形(BAVM)的患者接受栓塞形成。简而言之，在没有全身肝素化下，在全身麻醉下，进行栓塞形成。在该过程期间，将收缩压控制在100至110mmHg之间。使用经股方法，使用标准同轴技术进行导管插入。经由压力袋，用包含2500U肝素/L的盐水冲洗指引导管。用导流技术和使用0.010-英寸或0.008-英寸线(Silverspeed或Mirage；ev3；USA)的导线技术的组合进行DMSO相容性微导管(UltraFlow或Marathon；ev3；USA)引导向靶点。一旦所述微导管尖端位于期望的位置，如下注射根据实施例7或8制备的微球(或本发明提供的其它微球)：1)用5ml的生理盐水冲洗微导管；2)将0.25ml的DMSO注射到该微导管中以充满无效腔；3)将微球抽吸到1ml注射器中，并将其中的0.25ml在40秒内注射以充满该微导管和代替无效腔中的DMSO；4)然后，在荧光镜检查下，继续缓慢注射所述微球溶液。
在栓塞形成之后，在重病监护病房严格监测患者血压48小时。在微导管粘着动脉支流的少见事件中，在静脉内施用肝素(750-1000U/小时)72小时，接着以250mg/d的剂量口服阿司匹林3个月。然后，每年用MRI监测BAVM病灶大小。如果在3年之后，AVM仍然没有闭塞，应考虑放射外科手术。
实施例18：向良性前列腺肥大的猪模型施用微球
根据在Sun等人(2008)Radiology 246：783-789描述的改进方法进行该研究。简而言之，将猪随机地分成栓塞形成组和对照组。在禁食24小时之后，向每只雄性猪肌肉内预施用0.1mg地西泮/公斤体重、10mg/kg氯胺酮和0.01mg/kg阿托品。用2mg/kg的异丙酚(i.v.)麻醉，并用2.0％-2.5％的氟烷保持麻醉。在气管内插管之后，将每只猪与麻醉系统和呼吸机相连。将腹股沟区域和小腹剃毛，并以无菌方式盖上单子。
用5-F引导鞘经皮获得股骨动脉入路。进行骨盆血管造影术，将5-FCobra导管插入主动脉，并从对侧髂外动脉将该导管尖端形成Waltman环。采用导路图(road map guidance)，获得双侧髂内动脉的选择性导管插入。进行两个动脉的血管造影。然后，使对照组从麻醉中恢复。
在栓塞形成组中进行前列腺选择性栓塞形成。在全身分布肝素(150IU的肝素/千克体重)之后，将3-F灌注导管穿过Cobra导管同轴插入，并选择性地置于膀胱下动脉的前列腺分支中。通过人工注射1mL的造影剂进行超选择性血管造影，以确保微灌注导管的尖端位于期望的部位。将根据实施例7或8制备的微球(或本发明提供的其它微球)调整至直径500-700μm。将包含2.0mL的微球颗粒的每小瓶微球稀释到20mL的50％碘化造影剂加50％生理盐溶液的混合物中。采用荧光镜引导慢慢地注射该混合物。一旦血流停止，立即停止栓塞形成，不会使该混合物回流到不期望的动脉。继续进行血管造影。接着，通过使用相同的技术在对侧进行栓塞形成。在照料下，使所述动物从麻醉中恢复。在栓塞形成之后，检查所有动物，每天两次，检查72小时，然后每天一次，检查1周，以检查与栓塞形成有关的可能并发症。
实施例19：向患有子宫纤维瘤的患者施用微球
根据在Pelage等人(2000)Radiology 215：428-431描述的改进方法进行子宫动脉栓塞形成(UAE)。简而言之，由介入进行UAE，包括用微粒栓子完全闭塞一个或两个子宫动脉，以引起子宫纤维瘤的局部缺血性坏死。该动脉的闭合被认为是持久的，从而阻断了向纤维瘤的血液供应，但不会对以其它方式对正常子宫有任何持久的副作用。在局部麻醉下进行UAE，有时采用清醒性镇静、硬膜外或脊柱麻醉。也可以施用预防性抗生素。将4或5French直径的维管鞘直接插入妇女的股动脉，然后，向对侧子宫动脉选择性地插入导管。接着，将该导管操控至同侧子宫动脉，并重复该过程。
在该研究中，将根据实施例7或8制备的微球(或本发明提供的其它微球)调整至直径700-900μm，并施用。通过血管造影确认子宫血管闭塞，除去导管。将该妇女的卵巢暴露于约20rad(20cGy)的电离辐射。成功的UAE完全闭合子宫血管。正常子宫肌膜(子宫的肌肉)快速建立从卵巢和阴道循环穿过侧副管的新的血液供应。
上述本文的实施方案仅用于示例，本领域技术人员将认识到，使用常规实验就能够确定本文描述的具体方法的多种等同物。认为所有这些等同物都在本发明的范围内，并由下列权利要求所覆盖。而且，如在本说明书和权利要求书中使用的，除非内容另有清楚地说明，单数形式“一个”和“所述”包括复数形式。因此，例如，提及“药物”包括两种或多种这样的微球的混合物。另外，普通技术人员将认识到，为了解释和主张，必须以某些特定顺序列出操作顺序，但本发明预期所述特定顺序以外的各种变化。

Claims (16)

1.一种制备微球的方法，其包括：
(a)制备包含下述成分的水溶液：
(i)N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体，
(ii)二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体，
(iii)N,N-亚甲基二-丙烯酰胺单体，和
(iv)明胶，
其中所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体和/或所述二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体是超纯的单体；
(b)在搅拌之前或搅拌同时，经由进料环将所述水溶液加入到具有低水混容性的液体有机相中；从而得到包含下述共聚物的微球，该共聚物含有N-三羟甲基甲基丙烯酰胺、二乙基氨基乙基丙烯酰胺和N,N-亚甲基二-丙烯酰胺单体单元；
(c)任选地对该微球进行超声粉碎；和
(d)交联明胶。
2.权利要求1的方法，其中所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体单元包含小于9％的杂质，和/或所述二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体单元包含小于2％的杂质。
3.权利要求1或2的方法，其中所述微球是超纯的微球。
4.权利要求3的方法，其中(i)所述超纯的微球包小于等于10％、小于等于9％、小于等于8％、小于等于7％、小于等于6％、小于等于5％、小于等于4％、小于等于3％、小于等于2％或小于等于1％的杂质，(ii)所述超纯的微球包含大于等于90％、大于等于91％、大于等于92％、大于等于93％、大于等于94％、大于等于95％、大于等于96％、大于等于97％、大于等于98％或大于等于99％重量的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺、二乙基氨基乙基丙烯酰胺、N,N-亚甲基二-丙烯酰胺和明胶，或(iii)(i)和(ii)的组合。
5.权利要求1的方法，其中所述超声粉碎是在超声波浴中进行的。
6.权利要求1的方法，其中所述方法不包括过筛所述微球。
7.通过权利要求1至6中任一项的方法制备的微球。
8.权利要求7的微球，其中所述微球在1H NMR谱中显示在3.5ppm至4ppm的第一个峰、3ppm至3.5ppm的第二个峰和1ppm至1.5ppm的第三个峰；和其中
(i.)所述第二个峰与所述第一个峰的积分比为0.50至0.65，
(ii.)所述第三个峰与所述第一个峰的积分比为0.61至0.75，或
(iii.)其组合。
9.权利要求7或8的微球，其中所述微球是大小均匀的。
10.权利要求7的微球，其中所述微球的直径为1μm至2000μm、40μm至120μm、100μm至300μm、300μm至500μm、500μm至700μm、700μm至900μm或900μm至1200μm。
11.权利要求7的微球，其中小于1％的微球是聚集的微球。
12.权利要求7至11中任一项的微球用于制造在个体中形成栓塞的药物的用途。
13.权利要求7至11中任一项的微球用于制造控制或治疗个体中血管生成依赖性疾病的药物的用途。
14.权利要求13的用途，其中所述血管生成依赖性疾病是动静脉畸形、子宫纤维瘤或良性前列腺肥大。
15.权利要求14的用途，其中所述血管生成依赖性疾病是癌症或肿瘤。
16.权利要求15的用途，其中所述癌症或肿瘤是肝癌或前列腺癌或肿瘤。
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