KR20240042634A - 신규한 생체적합성 영상화 입자, 이의 합성 및 영상화 기술에서의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생분해성 폴리카테콜아민 또는 폴리세로토닌 매트릭스 내에서 서브마이크로미터 크기의 클러스터로 조립된 초상자성 산화철(SPIO)을 포함하는 신규한 생체적합성 영상화 입자에 관한 것이다.
이들 입자는, 산화철의 마이크로입자와 콘트라스트를 제공하고 MPS 세포의 산성 리소좀 구획에 도달하면 분리된 SPIO 입자로 빠르게 분해되어 이의 소화가 가능하게 함으로써, 종래 기술로부터 독성 및 신뢰할 수 없는 신호 문제를 극복할 수 있다.
따라서, 본 발명은 100 nm 내지 2000 nm에 포함되는 유체역학적 직경을 갖는 입자를 제공하며, 상기 입자는 폴리카테콜아민 또는 폴리세로토닌의 매트릭스 내에 매립된 산화철의 나노입자를 포함하고, 각각의 산화철 나노입자는 폴리카테콜아민 또는 폴리세로토닌과 상이한 중합체에 의해 코팅된다.

Description

신규한 생체적합성 영상화 입자, 이의 합성 및 영상화 기술에서의 용도

지난 수십 년 동안 예방 및 급성 치료 분야에서 상당한 진전이 있었음에도 불구하고, 허혈성 뇌졸중 유병률은 인구 노령화로 인해 증가하고 있으며 2025년까지 유럽에서 연간 130만 명에게 영향을 미칠 것으로 예상된다. 뇌졸중을 신속하게 관리하면 환자 절반의 생명을 구할 수 있지만, 이로 인해 발생하는 뇌 손상은 생존자에게 종종 극적으로 남아 있으며, 허혈성 뇌졸중은 성인 후천성 장애의 주요 원인이다.

허혈성 뇌졸중의 급성기에 대한 현재의 치료법은 이의 효소분해를 촉진하는 약물을 주입해 뇌순환을 방해하는 혈전을 제거하거나(혈전용해술), 2015년부터 카테터 삽입술을 통해 기계적으로 제거하는(혈전절제술) 방식으로 진행된다. 그러나, 폐색된 주요 혈관의 재개통이 성공적으로 이루어지더라도 하류 미세순환은 종종 폐색된 상태로 남아 있다.²

이러한 불완전한 미세혈관 재관류를 설명하는 메커니즘은 완전히 이해되지는 않았지만, 본 발명자들은 이것이 미세혈전에 의한 폐쇄로 인한 것이며, 미세혈관 내강의 협착을 유도하는 허혈의 염증성 결과에 의해 악화된다는 것을 알고 있다.³ 몇몇 전임상 및 임상 연구에서는 이러한 미세혈전의 존재를 인지 저하 및 치매와 연관지었다.⁴ 허혈성 뇌졸중 치료에서 혈전제거술의 시행에 대한 최근의 후향적 분석에서도 불완전한 미세혈관 재관류의 중요성이 강조되고 있다. 성공적인 혈전제거술로 혜택을 받는 환자의 3분의 1 이상이 성공적인 재개통이 신속하게 이루어졌음에도 불구하고 기능적 독립성을 회복하지 못한다.⁵

따라서, 허혈성 뇌졸중의 미세혈전은 영구적인 후유증을 겪고 있는 허혈성 뇌졸중에서 생존한 환자에게 특히 중요한 문제이며 따라서 상당한 인적, 사회적 및 경제적 비용을 나타낸다. 이러한 우려에도 불구하고, 허혈성 뇌졸중에 미세혈관 혈전증이 미치는 영향은 현재 임상 실무에서 적절하게 고려되지 않고 있다. 주요 장애물은 뇌졸중 환자의 뇌 내 미세혈전 진단을 위한 신뢰할 수 있는 방법이 없다는 것이다. 경두개 도플러의 미세색전 신호로 그 존재를 평가하거나 확산 강조 MRI에서 유발하는 미세 병변을 식별하는 것이 가능하다.⁶ 그러나, 이는 이의 실제 검출보다는 결국 미세혈전에 의해 유발되는 생리학적 장애에 의존하므로 진단 민감도가 매우 낮다.

뇌 내 미세혈전의 존재를 구체적이고 비침습적으로 밝히는 새로운 접근법은 허혈성 뇌졸중 진단을 크게 개선할 수 있다.

산화철 미립자(MPIO)를 이용한 분자 영상화 기술(molecular imaging technique)은 현재 자기공명영상(MRI)에 의해 혈관 염증을 밝히기 위한 전임상 환경에서 널리 사용되어 왔다.^7-9 MPIO는 표적화된 질병 에피토프 발현의 영역에 축적되고 이의 초상자성 특성 덕분에 T₂* 가중 MRI에서 병리학을 밝혀낸다. 이 기술은 경동맥¹⁰ 및 폐 색전증¹¹의 이미지 혈전증에도 적용되었지만, 현재까지 이러한 도구 중 어느 것도 뇌 내 미세혈관 혈전증을 밝혀내는 능력을 보여주지 못했다.

더욱이, 분자 MRI 전략이 환자 치료에 대한 큰 약속임에도 불구하고, 이 연구에 사용된 MPIO의 독성으로 인해 인간에서의 이의 사용은 배제된다. 직경 1마이크로미터의 철 입자는 단핵 식세포계로부터의 조직에 축적되어 분해되지 않아 리소좀 기능 장애 및 조직 공포증을 유발하며 이는 간 기능 장애를 유발하는 허용할 수 없는 위험을 나타낸다.¹²

반면에, 더 작은 직경(10 부터~150 nm까지)을 나타내는 유사한 초상자성 산화철(SPIO) 입자는 이미 인간 투여용으로 승인되었으며 혈액 풀(blood pool) T₂* 중량 MRI 조영제로 사용된다. 연구에 따르면 혈류에 주입된 SPIO는 단핵구 식세포계(MPS)의 세포에 의해 흡수되어 이의 리소좀에서 소화되고 철분 함량은 최종적으로 유기체에 의해 대사되는 것으로 나타났다.¹³

이러한 이유로, 많은 연구자들이 이러한 생체적합성 SPIO를 분자 영상 응용 분야에 사용하려고 시도했지만 콘트라스트(contrast)가 너무 낮아 T₂* 강조 MRI에서 신뢰할 수 있는 신호를 제공할 수 없었다. 초상자성 조영제(블루밍(blooming) 효과)를 감지(detect)하는 데 사용되는 감수성 가공물(artefact)의 특성상 안정적인 감지를 위해서는 복셀(voxel) 내 최소 철 농도가 필요하다. 따라서, 산화철의 대사를 허용하려면 더 작은 직경이 필요하지만 신뢰할 수 있는 분자 영상화를 보장하려면 더 큰 직경이 필요하다.

이러한 독성 및 신뢰할 수 없는 신호 문제는 생분해성 폴리카테콜아민 또는 폴리세로토닌 매트릭스 내에서 서브마이크로미터 크기의 클러스터로 조립된 SPIO 입자를 포함하는 신규한 산화철 플랫폼을 개발한 발명자들에 의해 성공적으로 극복되었다. 클러스터는 MPIO와 유사한 콘트라스트를 제공하며 MPS 세포의 산성 리소좀 구획에 도달하면 분리된 SPIO 입자로 빠르게 분해되어 이의 소화가 가능하게 한다.

본 발명의 첫 번째 대상은 100 nm 내지 2000 nm, 바람직하게는 200 nm 내지 1500 nm, 더 바람직하게는 300 nm 내지 1000 nm, 더 바람직하게는 500 nm 내지 1000 nm에 포함되는 유체역학적 직경을 갖는 입자이며,

상기 입자는 폴리카테콜아민 또는 폴리세로토닌의 매트릭스 내에 매립된(embedded) 산화철의 코팅된 나노입자를 포함하며,

상기 코팅된 산화철 나노입자 각각은 폴리카테콜아민 또는 폴리세로토닌과 상이한 중합체에 의해 코팅된다.

일 구현예에서, 본 발명에 따른 입자는 200 nm 내지 2000 nm, 바람직하게는 250 nm 내지 1500 nm, 더 바람직하게는 300 nm 내지 1200 nm, 더 바람직하게는 300 nm 내지 1000 nm에 포함되는 유체역학적 직경을 갖는다.

일 구현예에서, 본 발명에 따른 입자는 200 nm 내지 1000 nm, 바람직하게는 300 nm 내지 1000 nm, 더 바람직하게는 500 nm 내지 1000 nm, 더 바람직하게는 700 nm 내지 1000 nm에 포함되는 유체역학적 직경을 갖는다.

어떤 이론에 얽매이려는 의도 없이, 본 발명자들은 200 내지 2000nm 범위 내의 유체역학적 직경이 신호를 얻도록 한다고 믿는다. 또한, 본 발명자들은 혈전의 가시화의 맥락에서 환자에 대한 혈전 효과와 같은 해로운 효과를 피하는 위험을 고려하여, 유체역학적 직경이 2000 nm 미만인 입자를 사용하는 것이 바람직하며, 안전성의 이유로 1000 nm 미만인 입자를 사용하는 것이 바람직하다는 것을 또한 고려한다. 전술한 내용을 고려하여, 본 발명자들은 임상 상황에서 해로운 효과의 위험을 피하면서 만족스러운 신호를 갖도록 허용하는 유체역학적 직경의 최적 범위가 약 700 nm 내지 약 1000 nm 사이에 포함될 것이라고 믿는다.

본 명세서에서 사용된 "~과 ... 사이에 포함된다"라는 표현은 언급된 범위의 경계를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "유체역학적 직경"은 측정되는 입자와 동일한 속도로 확산되는 가상의 단단한 구체의 직경을 의미한다. 이는 용액 상태의 입자 크기를 반영하며 문제의 입자에 적용된 코팅이나 표면 변형을 포함한다.

본 발명의 입자의 유체역학적 직경은 당업자에게 공지된 임의의 방법에 따라 결정될 수 있다. 특히, 이는 예를 들면, 세포의 온도가 25℃에서 일정하게 유지되는, 173°의 고정된 산란 각도에서 633 nm 레이저가 장착된 NanoZS® 장치(Malvern Instruments, Worcestershire, UK)를 사용하여 동적 광 산란(DLS)에 의해 결정될 수 있다. 이 측정을 위해 입자는 물 1mL당 철 20μg~200μg의 농도로 물에 현탁시켜진다.

유체역학적 직경을 결정하기 위한 다른 공지된 방법은 입자 추적 분석(PTA) 또는 이의 변이 나노입자 추적 분석(NTA)이다.

본 발명의 입자는 나노입자의 작은 직경으로 인한 산화철의 대사와 폴리카테콜아민 또는 폴리세로토닌의 생분해성 매트릭스 내의 나노입자 집합체인 최종 입자의 더 큰 직경 덕분에 신뢰할 수 있는 분자 영상화를 결합할 수 있다. 게다가, 본 발명자들은 폴리도파민 매트릭스를 갖는, 본 발명의 입자가, 혈장과 혼합되지 않은 경우, 혈소판을 인식할 수 없다는 것을 시험관 내에서 입증하였다. 어떠한 이론에 얽매이려는 의도없이, 본 발명자들은 혈장 내에 위치하는 경우, 본 발명의 입자의 폴리카테콜아민 또는 폴리세로토닌의 매트릭스가 혈장과 상호작용하고, 대체로 특정 혈장 단백질에 결합하여 본 발명의 입자 주변에 혈장 단백질 코로나를 형성시키는 것으로 믿는다. 본 발명의 입자를 주입한 후 혈장 내에서 그 자리에서 형성되는 이러한 혈장 단백질 코로나가 미세혈전에 대한 본 발명의 입자의 표적화에 역할을 하는 것으로 본 발명자들은 믿고 있다.

본 발명의 입자에 혼입된 산화철 나노입자는 화학식 Fe₂O₃의 마그헤마이트, 화학식 Fe₃O₄의 자철석 또는 Fe₂O₃와 Fe₃O₄의 혼합물 중에서 선택될 수 있다. 이러한 다양한 유형의 산화철은, 초상자성과 생체 적합성이 둘 다 있어서, 특히 자기 공명 영상(MRI)의 조영제 또는 자기 입자 영상(MPI)의 트레이서(tracer)로 사용할 수 있다.

본 발명의 맥락에서, "생체 적합성"이라는 용어는 예를 들어, 생체 내에서 이러한 조직과 접촉될 때 살아있는 조직에 중대한 해를 끼치지 않는 물질을 지칭한다. 특정 구현예에서, 물질은 세포에 독성이 없다면 "생체적합성"이다. 특정 구현예에서, 물질을 시험관 내에서 세포에 첨가하면 20% 이하의 세포 사멸이 발생하고/하거나 생체 내 투여가 심각한 염증이나 기타 부작용을 유발하지 않는 경우 물질은 "생체적합성"이다.

이러한 나노입자는 일반적으로 폴리카테콜아민이나 폴리세로토닌과 다른 중합체로 코팅된다. 특히, 상기 코팅 중합체는 덱스트란, 카르복시덱스트란, 또는 카르복시메틸덱스트란과 같은 덱스트란, 또는 폴리에틸렌 글리콜로부터 선택된다. 주목할 점은 상업적으로 이용 가능하고 FDA 승인을 받은 코팅 산화철 나노입자, 예를 들어, Vivotrax®라는 브랜드로 Magnetic Insight에 의해 전임상 시장에서 판매되는 Bayer의 Resovist®가 이용 가능하고 본 발명의 입자에 통합되기에 매우 적합하다는 것이다. 다른 상용가능한 코팅된 산화철 나노입자, 예를 들어, SINEM® 또는 Guerbet로부터의 Endorem®, 또는 nanomag®-D를 쉽게 이용할 수 있다.

본 발명의 입자에 혼입된 코팅된 산화철 나노입자의 직경은 바람직하게는 5 내지 175 nm, 더욱 바람직하게는 30 내지 150 nm, 훨씬 더 바람직하게는 50 내지 75 nm에서 선택된다.

본 발명의 입자의 중합체 매트릭스는 폴리카테콜아민 또는 폴리세로토닌으로부터 선택된다.

특히, 본 발명의 입자 내의 생분해성 폴리카테콜아민 매트릭스는 폴리도파민(PDA), 폴리노르에피네프린(PNE) 또는 폴리에피네프린(PEP) 중에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 폴리도파민이다. 폴리세로토닌(PST)도 이러한 생분해성 매트릭스로 사용될 수 있다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "생분해성"은 세포 내로 도입될 때, 세포에 대한 상당한 독성 영향 없이 세포가 재사용 또는 폐기할 수 있는 성분으로 분해되는(예를 들어, 세포 기계에 의해, 효소 분해에 의해, 가수분해에 의해, 및/또는 이들의 조합에 의해) 물질을 지칭한다. 특정 구현예에서, 생분해성 물질의 분해에 의해 생성된 성분은 생체적합성이므로 생체 내에서 상당한 염증 및/또는 다른 부작용을 유도하지 않는다. 일 구현예에서, 생분해성 고분자 물질은 그 성분 단량체로 분해된다.

생분해성 외에도, 이러한 다양한 유형의 중합체는 본 발명의 입자 합성뿐만 아니라 그 적용에도 많은 이점을 갖는다. 이들은 합성을 촉진하는, 자가중합하는 능력을 가지고 있다. 이는 산화철과 강한 결합을 형성하여 초음파 처리 하에서도 안정적인 입자를 얻도록 하여 클러스터를 파괴하거나 공액 리간드를 분리하지 않고 응집된 입자를 분산시키도록 한다.

실제로, 다양한 리간드는 Michael 첨가 또는 Schiff 염기 반응을 통해 폴리카테콜아민 또는 폴리세로토닌과 고밀도로 접합될 수 있다(Lee, H. et al., Adv Mater. 2009, 21, 431-434). 본 발명의 입자 표면에 다량의 표적화 부분을 접합시키는 능력은 표적에 대한 결합을 최대화하고 더 높은 민감도에 도달하는데 유리할 수 있다.

폴리카테콜라민과 폴리세로토닌은 또한 친수성이며 생리학적 pH에서 음전하를 띠므로 코팅된 입자에 음의 제타 전위(zeta-potential)를 제공하고 용액에서 이의 응집을 방지한다.

이들 중합체는 또한 산화철을 산화 반응으로부터 보호하는 항산화 특성을 갖고 있는데, 이는 산화된 형태의 마그헤마이트에 비해 마그네타이트를 사용하면 더 나은 상자성 효과가 얻어지기 때문에 유리하다.

이러한 모든 중합체는, 특히 분자 영상화에 사용하기 위한 항체와 함께, 추가 기능화를 가능하게 하는 유리 아민 그룹 뿐만 아니라 말단 아민화를 갖는 중합체 사슬 또는 약물 전달 적용을 위한 다양한 치료 분자와 같은 기타 기능성 모이어티(functional moiety)도 갖는다. 항체로 본 발명의 입자를 기능화하는 경우, 최종 입자의 용해도 및 안정성을 개선하기 위해 제조 과정 중에, 예를 들어 글리신으로 최종 코팅을 수행할 수 있다.

중합체 매트릭스의 특성은 또한 가시화될 부위를 표적화할 수 있도록 한다. 특히, 미세혈전의 경우, 본 발명자들은 미세혈전의 가장자리에서, 본 발명의 입자의 기계적 유지를 이중 광자 현미경으로 관찰할 수 있었다.

본 발명의 입자는 다분산 지수가 0.1 내지 0.4, 바람직하게는 0.15 내지 0.35인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 입자의 다분산 지수는 당업자에게 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 결정될 수 있다. 특히, 본 발명의 입자의 다분산 지수는 예를 들어 유체역학적 직경의 측정에 사용된 것과 동일한 장치 및 측정 조건을 사용하여 동적 광산란(DLS)에 의해 결정될 수 있다.

본 발명의 맥락에서, "다분산 지수"라는 용어는 크기에 기초한 샘플의 이질성의 척도를 지칭한다. 다분산성은 샘플의 크기 분포, 또는 단리(isolation) 또는 분석 중 샘플의 응집으로 인해 발생할 수 있다.

본 발명의 입자는 또한 -50 내지 -20 mV, 바람직하게는 -45 내지 -25 mV 범위의 제타 전위를 특징으로 할 수 있다.

제타 전위는 당업자에게 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 결정될 수 있다. 특히, 본 발명의 입자의 제타 전위는 1mM 염화나트륨 용액에 현탁된 입자에 대해 수행된 측정을 사용한 전기영동 광 산란(ELS)에 의해 결정될 수 있다.

본 발명의 맥락에서, "제타 전위"라는 용어는 입자 표면에 부착되어 남아 있는 유체로부터 이동성 유체를 분리하는 경계면에서의 전위를 지칭한다.

본 발명의 또 다른 대상은 본 발명에 따른 입자의 현탁액이다. 이러한 입자 현탁액은 위에서 설명한 본 발명의 입자가 현탁되는 수용액, 예를 들어 물, 식염수, 글리세롤 또는 만니톨 중에서 선택될 수 있는 용매를 함유한다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "현탁액"은 액체와 미세하게 분산된 고체 물질을 포함하는 물질의 불균일 혼합물을 지칭한다.

본 발명에 따른 입자의 현탁액에서의 입자는 바람직하게는, 250 nm 내지 1000 nm, 바람직하게는 300 nm 내지 1000 nm, 더 바람직하게는 500 nm 내지 900 nm, 더 바람직하게는 600 nm 내지 800 nm에 포함되는 평균 유체역학적 직경을 갖는다.

일 구현예에서, 본 발명에 따른 입자의 현탁액은 200 nm 내지 2000 nm, 바람직하게는 250 nm 내지 1500 nm, 더 바람직하게는 300 nm 내지 1200 nm, 더 바람직하게는 300 nm 내지 1000 nm에 포함되는 평균 유체역학적 직경을 갖는다.

일 구현예에서, 본 발명에 따른 입자의 현탁액은 200 nm 내지 1000 nm, 바람직하게는 300 nm 내지 1000 nm, 더 바람직하게는 500 nm 내지 1000 nm, 더 바람직하게는 700 nm 내지 1000 nm에 포함되는 평균 유체역학적 직경을 갖는다.

본 발명의 또 다른 대상은 다음 단계를 포함하는 본 발명의 입자 현탁액을 제조하는 방법이다:

a) 코팅된 산화철 나노입자와 카테콜아민 또는 세로토닌의 용액을 교반하에 혼합함으로써, 카테콜아민 또는 세로토닌의 자가-중합을 일으키고, 중합된 카테콜아민 또는 세로토닌의 매트릭스에 매립된 코팅된 산화철 나노입자를 함유하는 입자를 형성하는 단계;

b) 상기 중합을 종료하는 단계;

c) 생성된 반응 혼합물을 처리하여 원하는 크기의 최종 입자를 얻는 단계;

d) 입자 현탁액을 회수하는 단계.

중합 단계 a)는 당업자에게 공지된 임의의 적합한 방법에 따라 수행될 수 있다. 특히, 본 발명의 방법의 단계 a)는 수용액 중의 코팅된 산화철 나노입자 현탁액을 카테콜아민, 특히 도파민, 노르에피네프린 또는 에피네프린 또는 세로토닌의 용액과 혼합함으로써 수행될 수 있다. 이 단계는 임의의 적합한 염기성 용액, 특히 TRIS 완충제와 같은 완충제의 존재에 의해 보장될 수 있는 7 이상의 염기성 pH에서 수행된다.

단계 a) 동안 수행되는 일정한 교반은 반응 혼합물의 침강을 방지할 수 있게 해준다. 이러한 침전으로 인해 추가 처리가 불가능한 페이스트 형태의 하나의 큰 응집체가 형성된다.

코팅된 산화철 나노입자 현탁액은 전형적으로 0.5 내지 10 mg Fe/ml, 구체적으로 1.5 mg Fe/ml의 농도를 가질 수 있다. 코팅된 산화철 나노입자는 일반적으로 수용액, 예를 들어 NaCl 수용액에 현탁되어 있다. 이러한 NaCl 수용액은 일반적으로 중량/부피 0.9%, 즉 물 1ml당 NaCl 9mg의 농도로 사용될 수 있다.

카테콜아민 또는 세로토닌은 일반적으로 TRIS 완충액과 같은 완충액에 5 내지 100mM, 구체적으로 25mM 농도로 존재할 수 있다.

단계 a)에서, 코팅된 산화철 나노입자 현탁액과 카테콜아민 또는 세로토닌의 용액은 전형적으로 0.1 내지 0.5, 바람직하게는 0.2 내지 0.4, 더 바람직하게는 약 0.3의 Fe/(카테콜아민 또는 세로토닌) 질량비로 혼합된다. 예를 들어, 4.8mg의 카테콜라민 또는 세로토닌에 대해 1.5mg의 철의 질량비를 사용할 수 있다. 몰비를 사용하는 경우, 코팅된 산화철 나노입자 현탁액과 카테콜아민 또는 세로토닌의 용액은 전형적으로 Fe/(카테콜아민 또는 세로토닌) 0.7 내지 1.1, 바람직하게는 0.8 내지 1, 더욱 바람직하게는 약 0.9의 몰비로 혼합될 수 있다. 예를 들어, 31mmol의 카테콜아민 또는 세로토닌에 대한 27mmol의 철의 몰비가 사용될 수 있다.

본 발명의 방법의 단계 a)는 폴리카테콜아민 또는 폴리세로토닌 매트릭스 내에 코팅된 산화철 나노입자의 응집체를 형성하는 것을 포함한다. 이는 전형적으로 단계 a)의 반응 혼합물을 실온에서 1 내지 48시간, 바람직하게는 24시간 동안 교반함으로써 수행될 수 있다.

중합 반응의 종결 단계 b)는 전형적으로 획득된 혼합물을 pH 8 내지 10, 약 9, 전형적으로 아민기가 없는 완충액, 예를 들어 인산염 완충액의 용액으로 세척함으로써 수행될 수 있다.

이 세척 단계는 반응 매질을 교체하는 것으로 구성된다. 단계 a)로부터의 용매는 먼저 분리 자석 또는 원심분리 단계를 사용하여 용매로부터 입자를 분리함으로써 제거되며, 이로써 입자는 바닥층에 유지되고 용매는 상등액으로 유지된다. 그런 다음 용매를 제거하고 세척 용액으로 대체한다. 이 작업은 a) 단계의 용매가 완전히 제거되고 세척 용액으로 대체되도록 여러 번 수행할 수 있다.

이 단계에서는 세척 단계에서 카테콜아민이나 세로토닌의 단량체가 용매와 함께 제거되므로 중합 반응이 종료된다. 그런 다음, 반응 혼합물에 더 이상 단량체가 없으면 중합 반응이 종료된다.

종료 단계 b)는 또한 반응 혼합물에 산성 pH를 얻기 위해 산을 첨가하거나, 중합 억제제를 첨가함으로써 수행될 수도 있다.

단계 b) 후에 얻은 조(crude) 혼합물은 상기 향후 처리 단계 c)를 촉진하기 위해 단계 c)의 최종 처리 전 적어도 몇 시간 동안 실온에서 교반 없이 보관될 수 있다.

단계 c)의 처리가 초음파 처리에 의해 수행되는 경우, 단계 b) 후에 얻은 조 혼합물은 실온에서 교반 없이 8 내지 3시간, 바람직하게는 12 내지 30시간, 더욱 바람직하게는 24시간 보관될 수 있다;

단계 c)의 최종 처리는 예를 들어 단계 b)로부터 생성된 용액을 0.5 내지 30분, 바람직하게는 15분 동안 초음파 처리하여 수행하여 원하는 크기의 최종 입자를 얻을 수 있다.

이 단계는 초음파 처리기 프로브와 같은 임의의 고전적인 초음파 처리기를 사용하여 고강도, 예를 들어 200 내지 300mV, 우선적으로 약 250mV에서 수행될 수 있다.

처리 단계 c)는 단계 b)로부터 생성된 반응 혼합물, 즉 세척 용액, 일반적으로 인산염 완충액 중 입자의 현탁액에 대해 수행된다.

이 단계에서, 분리 자석이나 원심분리 단계를 다시 사용하여 원하는 크기의 입자를 바닥층에 유지하고 더 작은 입자는 상등액과 함께 폐기할 수 있다.

최종 단계 d)는 본 발명의 입자 현탁액을 회수하는 것으로 구성된다. 그런 다음 이러한 입자는 방법 b) 단계의 세척 용액이나 물 또는 식염수에 약 3~10℃의 저온에서 보관할 수 있다. 본 발명의 입자는 응집체의 형성을 제한하기 위해 일정하고 느린 교반으로 우선적으로 저장된다.

환자에게 주입하기 전에, 현탁액을 균질화하기 위해 본 발명의 입자를 5 내지 30℃, 바람직하게는 8℃의 온도에서 교반, 바람직하게는 격렬한 교반하에 둘 수 있다.

본 발명의 또 다른 대상은 입자의 현탁액 또는 본 발명에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 입자이다.

본 발명의 또 다른 대상은 단계 d) 후에 얻은 현탁액의 용매를 제거하여 상기 입자를 분리하는 추가 단계 후에 본 발명에 따른 방법에 의해 얻은 입자이다.

본 발명은 또한 본 발명의 입자 또는 본 발명의 방법에 의해 얻은 입자와 유리 아민 또는 티올기를 포함하는 분자, 구체적으로 단백질, 펩티드, 나노바디 또는 단일클론 항체를 포함하는 접합체, 또는 방사성표지된 금속을 포함하는 분자에 관한 것이다. 일 구현예에서, 접합체는 본 발명의 입자 또는 본 발명의 방법에 의해 얻어진 입자 및 적어도 유리 아민 또는 티올기를 포함하는 분자, 구체적으로 단백질, 펩티드, 나노바디 또는 단일클론 항체, 방사성 표지된 금속, N-아세틸 시스테인과 같은 작은 분자를 포함하는 분자를 포함한다. 보다 구체적으로, 적어도 유리 아민 또는 티올기 단백질을 포함하는 분자는 펩티드, 나노바디, 단일클론 항체, 방사성 표지된 금속 또는 N-아세틸 시스테인을 포함하는 분자일 수 있다. 보다 구체적으로, 적어도 하나의 유리 아민 또는 티올 그룹을 포함하는 단백질의 분자는 펩타이드, 나노바디 또는 단일클론 항체일 수 있다. 바람직하게는, 적어도 하나의 유리 아민 또는 티올기를 포함하는 단백질 분자는 단일클론 항체일 수 있다.

일 구현예에서, 적어도 유리 아민 또는 티올기를 포함하는 분자는 적어도 유리 아민 또는 티올기를 포함하는 링커(linker)로 변형된 분자일 수 있다. 즉, 분자는 유리 아민 또는 티올 그룹이 링커 부분에 의해 유지되는 분자이다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "링커" 또는 링커 모이어티"는 분자를 본 발명의 입자 또는 본 발명의 방법에 의해 얻은 입자에 연결시키는 연결자를 의미한다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "접합체"는 함께 연결된 2개 이상의 분자로 구성된 분자를 의미한다. 본 발명의 접합체는 전형적으로 단백질, 펩티드, 나노바디 또는 단일클론 항체에 연결된 본 발명에 따른 입자로 구성된다. 본 발명의 입자는 또한 구체적으로 양전자 방출 단층촬영(PET) 영상 기술에서의 사용과 관련하여 구리⁶⁴ 또는 갈륨⁶⁸과 같은 방사성 표지된 금속에 연결될 수 있다.

본 발명에 따라 또는 본 발명의 방법에 의해 수득되는 입자의 양은 접합체의 총 몰량에 대하여 50% 내지 99%, 특히 65% 내지 95%, 더욱 특히 80% 내지 90%, 여전히 더욱 특히 80% 내지 90%의 몰로 포함될 수 있다.

특히, 상기 단일클론 항체는 면역글로불린(Igg), 혈관-세포 부착분자 1(VCAM-1), 세포간 부착분자 1(ICAM-1), P-셀렉틴(P-Selectin), E-셀렉틴(E-Selectin) 또는 세포 부착분자 1(MADCAM-1) 내 점막 어드레스(mosmic address) 중에서 선택될 수 있다.

특히, 유리 아민 또는 티올기를 포함하는 분자는 섬유소용해제일 수 있다. 일 구현예에서, 섬유소용해제는 본 발명의 입자, 또는 적어도 유리 아민 또는 티올 기를 갖는 링커 모이어티에 의해 본 발명의 방법으로 얻은 입자에 결합된다.

특히, 유리 아민 또는 티올기를 포함하는 분자는 조직 플라스미노겐 활성화제 또는 이의 단편, 예를 들어 알테플라제, 레테플라제 또는 테넥테플라제와 같은 재조합 조직 플라스미노겐 활성화제(rtPA)일 수 있는 단백질이다. 일 구현예에서, 조직 플라스미노겐 활성화제일 수 있는 단백질 또는 이의 단편은 본 발명의 입자, 또는 적어도 유리 아민 또는 티올 기를 갖는 링커 모이어티에 의해 본 발명의 방법에 의해 얻은 입자에 결합된다.

이어서, 접합체는 방법의 단계 b)로부터의 세척 용액 또는 물 또는 식염수 중에 약 3 내지 10℃의 저온에서 보관될 수 있다. 본 발명의 입자는 응집체의 형성을 제한하기 위해 일정하고 느린 교반으로 우선적으로 저장된다.

환자에게 주사하기 전에, 본 발명의 접합체는 현탁액을 균질화하기 위해 5 내지 30℃, 바람직하게는 8℃의 온도에서 교반, 바람직하게는 격렬한 교반 하에 놓일 수 있다.

생체내 영상 방법에 사용되기 위해, 본 발명의 입자 또는 본 발명의 방법에 의해 얻은 입자는 영상 단계 전에 우선적으로 주사를 통해 환자에게 투여되어야 한다. 이러한 주사는 전형적으로 정맥내에서, 예를 들어 암 정맥내 카테터(대조약 투여를 위해 고전적으로 사용됨)를 통해, 또는 또한 동맥 내 경로를 통해 수행될 수 있다.

따라서, 본 발명의 다른 대상은 본 발명의 입자 또는 결합체 또는 본 발명의 입자의 현탁액 또는 본 발명의 방법에 의해 얻어지는 입자 또는 현탁액이 생체 내 영상 방법에 사용되는 것이다.

본 발명의 입자 및 접합체와 본 발명의 방법에 의해 얻은 입자는 영상화 분야에서 다양한 용도를 갖는다.

특히, 자기공명영상(MRI), 자기입자영상(MPI), 광음향영상(photoacoustic imaging) 또는 양전자방출단층촬영(positron emission tomography, PET)과 같은 영상기법에 사용될 수 있다. 이들은 구체적으로 자기공명영상(MRI), 자기입자영상(MPI) 및 광음향영상(photoacoustic imaging)에 적합하다.

광음향 영상화의 맥락에서, 본 발명의 입자들의 흡수 스펙트럼은 특히 양호한 시각화를 얻기 위해 적응된다. 실제로, 폴리도파민은 대부분 근적외선(약 700nm 파장)에서 흡수되며, 대부분 원적외선(약 900nm 파장)에서 흡수되는 산소화 헤모글로빈과 잘 구별된다.

양전자 방출 단층 촬영(PET)의 맥락에서, 본 발명의 입자 또는 본 발명의 방법에 의해 얻어진 입자는 접합 및/또는 방사성 표지 단계 후에 사용될 수 있다. 이어서, 방사성 표지된 금속, 예컨대 Copper⁶⁴, 또는 Gallium⁶⁸을 사용할 수 있다.

이 모든 기술은 생체 내 진단에 사용될 수 있다. 본 발명의 입자 및 접합체의 작용 방식 및 본 발명의 방법에 의해 얻어진 입자는 모든 유형의 혈관내 영상에 적합하게 한다. 이들은 구체적으로 혈관 염증의 바이오마커(예를 들어, VCAM-1, P-셀렉틴, MADCAM-1)를 표적으로 하는 항체에 대한 사전 커플링과 함께, 임의의 기능성 모이어티에 대한 사전 커플링 없이 또는 예를 들어 뇌, 심장, 폐, 신장 및 장 점막에서의 혈관 염증의 진단에 사용될 수 있다.

본 발명자들에 의해 수행된 실험들은, 마이크로트롬비(microthrombi)에서의 그들의 특이적인 보유로 인해, 본 발명의 입자 및 접합체들 및 본 발명의 방법에 의해 얻어진 입자들이 특정 표적화 모이어티의 필요 없이 마이크로 순환 내에서 마이크로 색전을 표적화하는 것이 효율적이라는 것을 증명한다.

실험은 또한 본 발명의 입자 및 접합체와 본 발명의 방법에 의해 얻어진 입자들이 혈전용해를 모니터링하는 데 효율적이라는 것을 증명하였다: 이들은 혈전용해가 투여되어야 하는 상황을 식별하고 후속적으로 혈전용해 치료의 효능을 검증할 수 있다.

본 발명의 입자 및 접합체 및 본 발명의 방법에 의해 얻어진 입자는, 전신에 존재하는 미세혈전을 MRI 스캔 상에서 밝히는 데 있어서, 파종성 혈관내 응고(DIC)라고 불리는 상태의 맥락에서, 매우 유용한 것으로 나타났다. DIC는 응고 시스템을 방해하는 다른 질환(암, 패혈증, 감염성 질환 등) 또는 사건(장기 이식, 외상 등)에 반응하여 일반적으로 발생하는 작은 혈관의 혈전증을 특징으로 하는 질환이다.²¹ 예를 들어 이는 COVID-19와 같은 전염병과 관련된 폐렴 환자에서 확인된 심각한 합병증 중 하나이다.²² 현재 DIC 진단 방법은 혈액 내 응고 조절 장애를 감지하는 데 국한되어 있다.²³

본 발명의 입자 및 접합체와 본 발명의 방법에 의해 얻은 입자는 또한 허혈-재관류 상황에서 형성된 미세혈전을 밝히는 데 효율적이다. 60분간의 허혈 동안 중대뇌동맥을 막고 있는 필라멘트의 갑작스러운 제거는 응고 시스템을 촉발시킨다. 이러한 갑작스러운 재관류 상황은 혈관내 혈전제거술(EVT)을 받는 허혈성 뇌졸중 환자에게서 흔히 발생한다.²⁴

본 발명은 또한 본 발명의 입자 또는 접합체 또는 본 발명의 입자의 현탁액, 또는 본 발명의 방법에 의해 얻은 입자 또는 현탁액을 사용하는 생체 내 진단 방법에 관한 것이다.

본 발명의 다른 대상은, 예를 들어, 주사에 의해 환자에게 본 발명의 입자 또는 결합체 또는 본 발명의 입자의 현탁액을 포함하는 조성물, 또는 본 발명의 방법에 의해 수득되고 영상화 단계를 포함하는 입자 또는 현탁액을 투여한 것을 특징으로 하는 영상화 방법이다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "환자"는 의료 치료를 기다리고 있거나 받고 있거나 의료 시술의 대상이거나 대상이 될 온혈 동물, 더욱 바람직하게는 인간을 의미한다.

여기서 "인간"이라는 용어는 성별과 모든 발달 단계(예: 신생아, 유아, 청소년, 청소년, 성인)의 대상을 의미한다. 일 구현예에서, 인간은 청소년 또는 성인, 바람직하게는 성인이다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "투여" 또는 이의 변형 (예를 들어, "투여")이란, 상태, 증상, 또는 질병이 치료, 감쇠, 가시화 또는 진단될 환자에게 단독으로 또는 약학적으로 허용가능한 조성물의 일로서, 활성제 또는 활성 성분을 제공하는 것을 지칭한다.

본 발명의 또 다른 대상은 본 발명의 입자 또는 접합체 또는 본 발명의 입자의 현탁액, 또는 본 발명의 방법에 의해 얻은 입자 또는 현탁액을 함유하는 조성물이다. 이 조성물은 임의로 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 부형제, 담체, 희석제 및/또는 보조제를 함유할 수 있다.

이러한 조성물은 용매, 예를 들어 만니톨 0.3 M의 용액 중 본 발명의 입자 또는 접합체 또는 본 발명의 방법에 의해 얻은 입자의 현탁액을 함유할 수 있다.

주사하기 전에, 본 발명의 입자는 인간 환자에게 주사할 수 있는 임의의 생리학적 매질에 현탁될 수 있다. 그러한 생리학적 매질의 예는 만니톨 또는 글리세롤이다.

본 발명의 맥락에서, "약학적으로 허용되는"이라는 용어는 서로 상용성이 있고 환자에게 해롭지 않은 약학적 조성물의 성분을 의미한다.

본원에 사용된 용어 "부형제"는 제약 조성물 또는 의약에서 활성 제제 또는 활성 성분과 함께 제제화된 물질을 의미한다. 치료 용도로 허용되는 부형제는 당업계에 잘 알려져 있다. 부형제의 선택은 의도된 투여 경로 및 표준 약학 관행과 관련하여 선택될 수 있다. 부형제는 수용자에게 해롭지 않다는 의미에서 허용 가능해야 한다. 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 부형제는 예를 들어 결합제, 희석제, 담체, 윤활제, 붕해제, 습윤제, 분산제, 현탁제 등일 수 있다.

본 발명의 또 다른 대상은 본 발명의 입자 또는 접합체 또는 본 발명의 입자 현탁액, 또는 본 발명의 방법에 의해 얻은 입자 또는 현탁액의 영상화 방법에서 조영제 또는 추적자로서의 용도이다.

도 1. 폐색성 미세혈전 부위에 특이적으로 축적되는 1μm의 정맥내 주사된 미세입자의 개략도 및 사진.
A. 실험 설계 계획. 중대뇌동맥에 트롬빈(1μL, 1U/μL)을 주입하여 허혈성 뇌졸중을 유발했다. 이중광자 현미경 검사는 하류 미세순환에 대해 수행되었다. 뇌 미세혈관은 이미지( B , C 및 F )에서 흰색으로 표시된 647 nm 채널에서 볼 수 있다. 백혈구와 혈소판은 로다민 6G(1 mg/mL)의 정맥 주사로 표지되었으며, 이미지( B , D 및 F )에서 빨간색으로 표시된 558 nm 채널의 세동맥 내 미세혈전의 존재를 나타낸다. FITC 형광 미립자(ref)를 정맥내 주사하고 미세혈전 영역에서의 이의 축적이 영상( E 및 F )에서 녹색으로 표시된 488nm 채널에서 관찰되었다. 스케일 바 B: 100μm, C, D, E 및 F: 20μm.
도 2. 폴리도파민 매트릭스를 갖는 본 발명의 입자의 도식적 표현 및 이의 제조 방법의 단순화된 표현.
도 3. 트롬빈 유발 혈전색전성 허혈성 뇌졸중 모델에서 본 발명의 입자를 사용한 미세혈전의 분자 MRI의 개략도 및 사진.
A. 허혈성 뇌졸중 유도 후 15분 동안 수행된 3D T2* 가중치 획득의 관상면, 시상면 및 횡단면. B. 동일한 3D T2* 가중 획득의 해당 관상면, 시상면 및 횡단면은 PHysIOMIC 조영제(1.5mg Fe/kg) 정맥 주사 후 1분, 허혈성 뇌졸중 유도 후 25분에 수행되었다. C. PHysIOMIC 주입 전과 주입 후 동측 뇌 영역의 신호 무효 정량화(n=5). D. 녹색으로 표시된 PHysIOMIC 신호 흡수의 3D 재구성. E. 주입 전 신호 흡수 대 PHysIOMIC 주입 후 1시간, 6시간, 12시간, 18시간 및 24시간의 신호 흡수 동역학. F. PHysIOMIC 주입 후 시간에 대한 동측 뇌 영역의 신호 무효 정량화. 병변 크기는 식염수( G ) 대 PHysIOMIC( H ) 주입 후 T2 가중치 시퀀스에서 뇌졸중 후 24시간에 측정되었다. I. 생리식염수를 주사한 동물과 PHysIOMIC을 주사한 동물의 24시간 시점의 평균 병변 크기. J. PHysIOMIC 마이크로입자의 국소화는 뇌졸중 후 1시간에 뇌의 조직학적 부분에서 연구되었다. PERLS 염색은 철의 존재를 파란색으로 나타내고 미세혈전 주위에 PHysIOMIC 산화철 미세입자의 존재를 확인했다.
도 4. 본 발명의 입자를 사용하여 분자 MRI로 모니터링한 미세혈전의 혈전용해 개략도 및 사진.
A. 혈전용해 프로토콜 개략도. MCA에 트롬빈(1μL, 1U/μL)을 주입하여 허혈성 뇌졸중을 유발했다. 10분 후 PHysIOMIC 조영제를 정맥 주사했다(1.5mg Fe/kg). 뇌졸중 유발 후 12분에 PHysIOMIC 입자가 주입되고 형성된 미세혈전을 확인하기 위해 첫 번째 3D T ₂ * 가중 MRI 획득이 수행되었다. 그런 다음 조직형 플라스미노겐 활성화제(tPA, Actilyse, 10mg/kg) 대 식염수 대조군(n=4)의 정맥 주사를 통해 뇌졸중 유도 후 20분 후에 혈전용해가 시작되었다. 총 200 μL를 주입했는데, 20 μL는 초기 볼루스로 주입하고 180 μL는 느린 관류 속도로 주입했다. 뇌졸중 유발 1시간 후, 남은 미세혈전의 양을 측정하기 위해 두 번째 3D T ₂ * 강조 MRI 촬영을 수행했다. 뇌졸중 후 24시간에 T ₂ 강조 MRI 촬영을 수행하여 뇌 병변의 크기를 측정했다. 3D T ₂ * 가중 MRI 획득의 연속적인 관상 단면은 식염수( B ) 또는 tPA( C )를 사용한 혈전용해 전후에 표시된다. 동측 뇌 영역의 신호 무효 정량화(n=4). E. 식염수 또는 tPA를 이용한 혈전용해 치료 후 24시간에 뇌 병변을 보여주는 T ₂ 강조 MRI 획득. G. 24시간에 측정된 평균 병변 크기.
도 5. 본 발명의 입자를 사용한 다른 모델에서 뇌 미세혈관 혈전증의 분자 MRI의 개략도 및 사진.
A. 2 μg의 스타우로스포린을 유리 마이크로피펫을 이용한 입체축 주사를 통해 오른쪽 선조체에 주입하여 국소 세포사멸을 유도하여 혈전증을 형성했다. PHysIOMIC 미세입자 주입 전후에 수행된 3D T ₂ * 가중 획득의 관상 섹션이다. 신호 무효 정량화는 오른쪽 선조체 영역의 신호 흡수를 확인했다. B. 모노필라멘트를 외경동맥(ECA)을 통해 삽입하고 분기점에서 중대뇌동맥(MCA)을 폐색하도록 부드럽게 전진시켰다. 수술 상처를 봉합하고 필라멘트를 60분 동안 제자리에 두었다. 그런 다음 필라멘트를 제거하여 혈류를 복원했다. PHysIOMIC 미세입자 주입 전후에 수행된 3D T ₂ * 가중 획득의 관상 섹션에서 미세혈관 혈전증의 존재가 밝혀졌다.
도 6. A. SPIO 및 PHysIOMIC 현탁액의 투과 전자 현미경 관찰. B. 강도로 측정된 유체역학적 크기 분포를 보여주는 SPIO 및 PHySIOMIC 현탁액의 동적 광산란 분석. C. 평균 유체역학적 크기, 다분산 지수 및 제타 전위의 평균 값이 표시됩니다(n=3).
도 7. 혈전용해된 마우스에서 PHySIOMIC에 의해 유발된 저신호 감소. A. 혈전용해 프로토콜 계획. MCA에 트롬빈(1μL, 1U/μL)을 주입하여 허혈성 뇌졸중을 유발했다. 10분 후 PHysIOMIC 조영제를 정맥 주사했다(1.5mg Fe/kg). 뇌졸중 유발 20분 후, 형성된 미세혈전을 확인하기 위해 첫 번째 3D T₂* 강조 MRI 촬영이 수행되었다. 그런 다음 조직형 플라스미노겐 활성화제(tPA, Actilyse, 10 mg/kg) 대 식염수 대조군(n=4)의 정맥 주사를 통해 뇌졸중 유도 후 30분 후에 혈전용해가 시작되었다. 총 200 μL를 주입했는데, 20 μL는 초기 볼루스로 주입하고 180 μL는 느린 관류 속도로 주입했다. 뇌졸중 유도 후 70분에 두 번째 3D T₂* 강조 MRI 촬영을 수행하여 남아 있는 미세혈전의 양을 측정했다. 뇌졸중 후 24시간에 T₂ 강조 MRI 촬영을 수행하여 뇌 병변의 크기를 측정했다. B. 폐색 후 10분 후에 PHySIOMIC을 주입하고 조직형 플라스미노겐(tPA, 10 mg/kg) 또는 식염수로 처리하기 전후에 T₂* 가중치 시퀀스를 획득했다. C. tPA 처리 전후의 tPA 처리 마우스의 3D 재구성. D. 유도된 저신호의 정량화는 치료군(n = 8)에서 감소를 나타낸다. E. 비행 시간 가중 MRI 시퀀스 및 평균 혈관 조영 점수(n=8)로부터 얻은 대표적인 자기 공명 혈관 조영술.
도 8A. PHysIOMIC 미세입자는 전신 MRI에서 간과 비장의 생체분포와 생분해를 보여준다.
도 8B. T2 강조 영상은 PHySIOMIC 및 USPIO 4mg/kg 주입 전후에 획득되었으며 세로 방향으로 2, 7, 31일에 간 및 비장의 저신호가 감소했다. B. 간 및 비장의 T2 값 정량화.
도 8C. 4 mg/kg의 PHysIOMIC 주입 후 2, 7, 31일 후의 간 단면의 투과 전자 현미경(TEM) 영상.

실시예

다음 연구는 FDA 승인 SPIO(resovist®, Bayer)의 자가 조립으로부터 얻은 발명에 따른 조영제 합성에 대해 설명하고 있으며, 조영제의 정맥 주사 덕분에 T₂*가중 MRI 시퀀스 상에서 뇌 미세혈관 혈전증을 밝힐 수 있는 방법을 보고한다. 이 진단 도구의 영상화 능력은 다른 경로를 통해 유도된 뇌의 미세혈관 혈전증의 존재를 특징으로 하는 3가지 마우스 모델에서 연구되었다. 미세혈전은 이중광자 현미경으로 검사되었으며 미세혈전 가장자리에 입자의 기계적 유지가 관찰되었다. 마지막으로, 이 연구는 본 발명에 따른 조영제가 미세혈전을 용해시키는 데 효율적으로 조직형 플라스미노겐을 사용한 혈전용해 요법을 모니터링하는 데 사용될 수 있음을 입증한다.

다음 부분에서, 본 발명에 따른 입자의 예는 "물리학적 특성(PHysIOMIC)"이라는 용어로 표시된다.

실시예 1

재료 및 방법

PHysIOMIC의 준비

입자의 합성 및 분석.

PhysIOMIC은 폴리도파민 구조로 구성된 간암종16을 탐지하기 위한 임상 영상화용으로 승인된 SPIO 나노입자와 유사한 생체 적합성 및 초상자성 산화철(SPIO) 나노입자(이 예에서는 VivoTrax™, Magnetic Insight, Inc., Alameda, CA)의 집합체이다. 간략하게, NaCl의 0.9% 수용액(1.5mg Fe/mL)에 있는 SPIO 나노입자 현탁액을 TRIS 완충액 10mM pH 8.8에 있는 카테콜 아민(25mM, 도파민, 세로토닌 또는 노르에피네프린) 용액과 혼합한다.

도파민 용액은 물 중 10mg/mL의 도파민 염산염(Sigma-Aldrich)으로부터 제조하고 TRIS 완충액 4.8mM pH 8.8에 최종 농도 4.8mg/mL를 첨가했다.

세로토닌 용액은 물 중 20mg/mL의 세로토닌 염산염으로부터 제조되었으며 암모니아(1.3% v/v)가 보충된 TRIS 완충액 4.8mM pH 8.8에 최종 농도 5.3mg/mL로 첨가되었다.

노르에피네프린 용액은 물 중 40mg/mL의 노르에피네프린 중타르산염으로부터 제조되었으며 암모니아(2.6% v/v)가 보충된 TRIS 완충액 10mM pH 8.8에 최종 농도 8mg/mL에 첨가되었다.

카테콜아민을 폴리도파민(PDA), 폴리세로토닌(PST) 또는 폴리노레피네프린(PNE)으로의 중합은 2시간 동안 울트라 터랙스 교반(9500rpm; IKA Instruments) 하에서 발생하고 상온에서 24시간 동안 일정하게 교반 하에서 반응을 지속한다. 중합을 중지하기 위해, 분리 자석(PureProteome™ Magnetic Stand, Millipore)을 사용하여 나노입자 집합체를 PB 10mM pH 8.8에서 세척한다. 그런 다음 용액을 15분 동안 고강도로 초음파 처리하여 원하는 크기의 입자를 얻는다. PHysIOMIC은 주입할 때까지 -4℃에서 교반 상태로 유지된다.

본 발명의 입자의 개략도는 폴리도파민 PHysIOMIC 입자에 대해 도 2에 표시되어 있다.

PHysIOMIC은 공초점 현미경(Leica, SP5)으로 관찰되었다. 카테콜 아민의 중합체는 빛 반사 특성을 갖는 물질이다. 488nm 채널에서 488nm 레이저의 반사로부터 3가지 유형의 PHysIOMIC이 관찰되었다.

고정된 산란각 173°에서 633nm 레이저가 장착된 NanoZS® 장치(Malven Instruments, UK 우스터셔)를 사용하여 PHysIOM 현탁액의 평균 유체역학적 직경, 다분산 지수(PDI) 및 부피별 직경 분포를 결정하기 위해 DLS(Dynamic Light Scattering)를 사용하였다. 셀(cell)의 온도는 25℃로 일정하게 유지되었으며 모든 희석은 순수한 물에서 수행되었다. 측정은 3회 수행되었다.

총 철분은 수정된 버전의 페로진 비색 분석법을 사용하여 정량화되었다. 500 μL의 2N HCL을 500 μL의 샘플 용해물에 첨가했다. 철 표준은 분석 등급의 FeCl₂를 사용하여 준비되었다. 그런 다음 샘플을 밤새 배양했다. 그런 다음 샘플을 철 검출 시약(5mM 페로진 37.5μL, 아세트산암모늄 30% 60μL 및 아스코르브산 30% 30μL, Sigma-Aldrich)과 혼합했다. 동일한 부피의 테스트 샘플과 표준 샘플을 96웰 마이크로플레이트에 이중으로 분취하고 마이크로플레이트 판독기(ELx808 Absorbance Reader, Biotek Instruments)를 사용하여 560nm에서 흡광도를 판독했다.

마우스(Mouse)

모든 연구는 1986년 11월 24일 유럽 공동체 위원회(86/609/EEC 지침) 및 프랑스 동물 실험에 관한 법률(법률 제87-848호)에 따라 수컷 스위스 마우스(8-10주; 체중 35-45g; CURB, 캉, 프랑스)를 대상으로 수행되었으며 노르망디 지역 윤리 위원회(CENOEXA)에 의해 검증되었다. 마우스를 12시간 명/12시간 암 주기로 온도 조절실에 가두었고 음식과 물은 자유롭게 섭취했다. 수술 동안, 마우스는 70%/30% 가스 혼합물(NO2/O2)에서 이소플루란 5%로 깊게 마취되었고 50%/50% 가스 혼합물(NO2/O2)에서 2% 이소플루란으로 마취 상태를 유지했다. 피드백 조절 가열 시스템을 사용하여 수술 과정 전반에 걸쳐 직장 온도를 37±0.5℃로 유지했다. PHysIOMIC의 정맥내 투여를 위해 카테터를 마우스의 꼬리 정맥에 삽입했다. 수술 후, 동물은 깨끗하고 가열된 케이지에서 회복되도록 허용되었다.

마우스 모델

트롬빈 또는 AlCl3로 인한 중대뇌동맥 폐쇄(MCAO)

Orset et al1⁷에 기술된 바와 같이, 마우스를 정위 장치에 놓고 오른쪽 눈과 오른쪽 귀 사이의 피부를 절개하고 측두 근육을 수축시켰다. 작은 개두술을 시행하고 경막을 절제하고 중대뇌동맥(MCA)을 노출시켰다. 고객이 만든 유리 마이크로피펫을 MCA의 루멘에 도입하고 1μL의 정제된 마우스 알파-트롬빈(1 UE; Stago BNL)을 공압 주입하여 혈전의 현장 형성을 유도했다. 주사 후 10분 후에 피펫을 제거했는데, 이때 혈전이 안정되었다. AlCl3 MCAO의 경우 MCA를 노출시키고 AlCl3(Sigma-Aldrich)를 동맥에 국소적으로 적용했다(이전에 설명한 대로18). 혈전용해 시술 동안을 제외하고, 뇌혈류 속도는 광섬유 프로브(Oxford Optronix)를 사용하여 레이저 도플러 유량계로 측정했다. 동물을 동일한 농도의 기체 마취에 노출시키기 위해 MCAO 후 모든 동물을 1시간 동안 마취 상태로 유지했다. 미세혈전증에 대한 혈전 용해 효과를 연구하기 위해 마우스에 알파-트롬빈 주사 후 40분에 걸쳐 10% 볼루스 및 90% 관류로 tPA(10mg/kg in 200μL, Actilyse)를 정맥 투여했다. 대조군에는 동일한 조건에서 동일한 양의 식염수를 투여했다.

관내 필라멘트(intraluminal filament)로 인한 일시적인 중대뇌동맥 폐색

관내 필라멘트 일시적 중간 대뇌 동맥 폐색(tMCAO) 모델은 이전에 설명한 프로토콜에 따라 마우스에서 수행되었다.¹⁹ 마우스를 앙와위 자세로 놓고 목에 정중선 절개를 수행했다. 오른쪽 경동맥 분기점이 노출되었고 외부 경동맥(ECA)이 응고되었다. 6-0 모노필라멘트(직경 0.09-0.11mm, 길이 20mm; Doccol, MA, USA)를 ECA를 통해 삽입하고 부드럽게 전진하여 분기점에서 MCA를 폐색했다. 수술 상처를 봉합하고 필라멘트를 60분 동안 제자리에 두었다. 그런 다음 필라멘트를 제거하여 혈류를 회복시키고 내부 경동맥을 결찰했다.

스타우로스포린의 정위 주사

단백질 키나제 억제제인 스타우로스포린(1 μL 부피의 2 μg; Alfa Aesar™)의 일방적인 스트리아탈 주사는 마우스를 입체축 프레임에 위치시킨 후 시행되었다: 0.5 mm 전방, 2.0 mm 측방, 3.0 mm 복부. 스타우로스포린 용액은 유리 마이크로 피펫(15 mm/ μL로 보정)을 사용하여 주입하였다.

자기 공명 영상(MRI)

모든 실험은 표면 코일이 있는 Pharmascan 7 T/12 cm 시스템(독일 Bruker)에서 수행되었다. TE/TR 9/50 ms 및 PhySIOMIC 조영제 주입 전후에 15°의 플립각(flip angle)을 갖는 유동 보상(GEFC, 93 x 70 x 70 μm의 공간 해상도가 70 μm의 등방성 해상도로 보간됨)을 사용한 3D T₂* 가중치 구배 에코 영상을 수행했다. PHysIOMIC 현탁액을 (1.5 mg Fe/mL)의 농도로 제조하고 꼬리 정맥 카테터를 통해 단일 볼루스로 1.5 mg/kg의 정맥내로 천천히 주입했다. 뇌 병변은 다중 슬라이스 다중 에코(MSME) 시퀀스(70 x 70 x 500 μm3 공간 해상도의 TE/TR 50/3000ms)를 사용하여 획득한 T2 강조 영상에서 측정되었다.

영상 분석

MCA MRA의 분석은 점수를 사용하여 실험 데이터에 대해 맹검으로 수행되었다: 2: 정상 모양, 1: 부분 폐색, 0: MCA의 완전 폐색. ImageJ 소프트웨어(v1.45r)를 사용하여 T2 가중치 이미지에서 병변 크기를 정량화했다. 이 연구에서 제시된 모든 T₂* 가중치 영상은 연속 슬라이스의 최소 강도 투영(? μm의 Z 분해능 수득)이다. 3D T₂* 강조 이미지의 신호 공백 정량화 및 PhysSIOMICs로 유발된 저신호의 3D 표현은 ImageJ 소프트웨어의 자동 Otsu 임계값 지정을 사용하여 실현되었다. 결과는 MPIO로 인한 신호 공극의 부피를 관심 구조의 부피(%)로 나눈 값으로 표시된다. 관류 지수(ΔR2* 피크 비율)는 ImageJ에서도 자체 생성된 매크로를 사용하여 이전에 설명한 대로 동측 및 반대측 ΔR2*의 비율을 측정하여 계산되었다.

생체 내 2광자 현미경 검사

2광자 실험에 사용된 마취된 마우스는 백혈구 롤링 및 접착의 생체 내 피질 검출을 위해 얇은-두개골 두개골 창(thin-skull cranial window)을 받았다. 두부 피부를 열어 두개골을 노출시키고 오른쪽 두정골을 드릴로 완전히 연마하여 얇은 뼈층만 남기고 투명하게 피질뇌혈관을 시각화하였다. 마취된 마우스를 정위 장치에 배치하고 수성 매체를 얇은 두개골 창과 X25 몰입형 대물렌즈 사이에 배치했다. Rhodamine 6G(1mg/kg, Sigma Aldrich) 100μl와 NH2-Cy5(5mg/ml, Lumiprobe) 100μl를 꼬리 정맥에 주입하여 순환 백혈구를 염색하고 혈관 내강을 시각화했다. 획득은 840nm 2광자 여기 파장(Coherent Chameleon, USA)에서 Leica TCS SP5 MP 현미경을 사용하여 수행되었다. 광전자 증배관(PMT) 2(기록 용량: 500-550nm, 이득(gain) 850V, 오프셋 0) 및 PMT3(기록 용량: 565-605nm, 이득 850V, 오프셋 0)이 사용되었다. 펄스 레이저 특성은 다음과 같다: 이득 23%; 트랜스 17%; 50% 오프셋. 멜라민 수지(100μL, Sigma Aldrich)를 기반으로 한 FITC 표시 미세입자(FITC = Fluorescein isothiocianate)를 정맥내 주입하고 미세혈전 영역에서 상호 작용을 관찰했다.

면역조직화학 및 조직학적 염색

깊이 마취된 마우스에 생리식염수(8 mL/min)의 연동 펌프를 사용하여 고정액(인산염 완충액 중 4% 파라포름알데히드)을 식염수로 경심 관류시켰다. 뇌와 간을 사후 고정(24시간, 4℃)하고 동결 보호(20% 자당, 24시간, 4℃)한 후 Tissue-Tek(Miles Scientific)에서 동결했다. 관상 뇌 절편(10μm)을 Perls의 프러시안 블루(Prussian Blue) 및 핵 레드(Leica Biosystems, Iron Kit 염색)로 염색하여 PhysIOMICs 입자의 철(Fe3+) 잔류물을 검출하고 식별했다. 이미지는 Leica DM6000 현미경 결합형 Coolsnap 카메라를 사용하여 디지털 방식으로 캡처되었으며 MetaVue 5.0 소프트웨어로 시각화되었으며 QuPath 및 ImageJ를 사용하여 추가 처리되었다. 모든 분석은 실험 그룹에 대해 맹검으로 수행되었다.

통계 분석

모든 결과는 평균 ± SEM으로 표시된다. GraphPad Prism V8 (GraphPad 소프트웨어)을 사용하여 통계 분석을 수행했다. 확률 값 p < 0.05이면 차이가 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.

결과

미세혈전에서 입자의 특정 보유(specific retention)

중대뇌동맥 내 트롬빈 주사를 통해 유도된 허혈성 뇌졸중 마우스 모델에서, 본 발명자들은 생체내 이중광자 현미경으로 주사 부위로부터 하류 영역의 피질 미세순환을 검사했다(도 1). 그들은 혈소판과 백혈구의 Rhodamine 6G 라벨링에 의해 입증된 것처럼 이 특정 영역에서 미세혈관 혈전증의 존재를 확인했다. 그들은 1μm 입자로 표시된 FITC를 정맥내 주입하고 미세혈전 부위에서 특정 보유를 관찰했다. 이 실험은 1μm 직경의 입자가 특정 표적화 부분이 필요 없이 미세순환 내에서 미세색전을 표적화하는 데 효율적이라는 것을 나타낸다.

허혈성 뇌졸중에서 미세혈전의 분자 영상화

본 발명자들은 중뇌동맥 내에서 트롬빈 주입을 통해 유도된 허혈성 뇌졸중 마우스 모델에서 PHysIOMIC 입자의 영상 능력을 시험하였다; 다운스트림 피질 미세 순환에서 미세혈관 혈전증이 형성되는 것을 특징으로 하는 모델. PHysIOMIC을 주입하면 T2* 가중치 MRI 획득에서 이러한 미세혈전의 존재가 다시 드러났다(도 3). 뇌졸중 후 24시간에 측정된 병변 면적에 해당하는 전체 허혈성 부위는 저신호 흡수가 특징이다. 이 신호는 이 모델에서 관찰된 자발적 재관류에 해당하는 운동 프로필에 따라 주입 후 시간이 지남에 따라 감소한다. 중요한 것은, PHysIOMIC 주사가 병변 크기 측면에서 뇌졸중 결과를 악화시키지 않는다는 것이다. 조직학적 단면에 대한 관찰을 통해 미세혈전 가장자리에서 PHysIOMIC의 위치가 확인되었다.

PHysIOMIC은 재조합 조직형 플라스미노겐 활성제(tPA, Actylise, 10mg/kg) 주입 후 미세혈전의 혈전용해를 모니터링하는 데 효율적이었다(도 4). tPA를 사용한 혈전용해는 미세혈전 신호의 양을 크게 감소시킨 반면 식염수는 방해하지 않았다. T2 강조 MRI 획득에 의한 24시간 측정의 병변 크기는 tPA 치료군에서 더 작았다. 본 실험은 PHysIOMIC 조영제가 혈전용해제를 투여해야 하는 상황을 식별할 수 있으며, 그에 따라 혈전용해요법의 유효성을 검증할 수 있음을 확인한다.

세포사멸과 허혈-재관류에 의해 유도된 뇌 미세혈전의 분자 영상화

PHysIOMIC은 선조체에 스타우로스포린을 주입하여 혈전증이 유도된 모델에서 뇌 미세혈전을 나타내는 데 효율적이었다(도 5). 주사 부위 주변 영역에서 신호 공백이 관찰되었다. 세포사멸과 관련된 이러한 혈전증 상황은 여러 병리와 관련이 있으며 파종성 혈관내 응고(DIC)라는 상태와 유사성을 나타낸다. DIC는 일반적으로 응고 시스템을 방해하는 다른 장애(예: 암, 패혈증, 감염성 질환) 또는 사건(예: 장기 이식, 외상)에 대한 반응으로 발생하는 소혈관의 혈전증을 특징으로 하는 상태이다.21 예를 들어 이는 코로나19와 같은 전염병과 관련된 폐렴 환자에서 확인된 심각한 합병증 중 하나이다.22 현재 DIC 진단 방법은 혈액 내 응고 조절 장애를 감지하는 데 국한되어 있다.23 PHysIOMIC 조영제는 이러한 맥락에서 매우 유용할 수 있으며 MRI 스캔을 통해 몸 전체에 존재하는 미세혈전을 드러낸다.

PHysIOMIC은 또한 허혈-재관류의 맥락에서 형성된 미세혈전을 밝히는 데 효율적이었다. 60분간의 허혈 동안 중대뇌동맥을 막고 있는 필라멘트의 갑작스러운 제거는 응고 시스템을 촉발시킨다. 이러한 갑작스러운 재관류 상황은 혈관내 혈전제거술(EVT)을 받는 허혈성 뇌졸중 환자에게서 흔히 발생한다.²⁴

실시예 2

재료 및 방법

입자의 유체역학적 직경 결정

고정된 산란각 173°의 633nm 레이저가 장착된 Nano ZS 장치(Malver Instruments, UK Worcester, UK)를 사용하여 구현예 1의 PHysIOM 입자 및 실시예 1에 따라 제조된 PHysIOM 입자의 제조에 사용된 SPIO의 평균 유체역학적 직경, 다분산 지수 및 부피별 직경 분포를 결정하기 위해 동적 광산란을 사용하였다. 셀의 온도는 25℃로 일정하게 유지되었으며, 모든 희석은 순수한 물에서 수행되었다. 측정은 3회 수행되었다.

제타 전위 측정

제타 전위 분석은 DTS 1070 셀이 장착된 Nano ZS 장치를 사용하여 1 mM NaCl에서 1/100 희석 후 실현되었다. 모든 측정은 25℃에서 유전 상수 78.5, 굴절률 1.33, 점도 0.8872 센티푸아즈, 셀 전압 150V로 3회 수행되었다. 제타 전위는 Smoluchowski 방정식을 사용하여 전기영동 이동도로부터 계산되었다.

생체분포 연구

마우스를 이소플루란(1.5~2.0%)으로 마취하고 37℃로 유지했으며 PHysIOMIC 또는 SPIO 현탁액을 정맥 주사했다(4mg/kg). 주사 후 1시간, 24시간, 7일, 1개월 및 6개월에 마우스에 식염수를 관류하고 약 1mm3의 작은 간 조각을 0.1M 카코딜레이트 완충액(pH 7.4)에 2.5% 글루타르알데히드로 고정한 채 수집했다.

전신 MRI

용적 코일 공진기(volume coil resonator)가 있는 BioSpec 7-T TEP-MRI 시스템(Bruker, Germany)을 사용하여 실험을 수행했다. 마우스를 이소플루란(1.5~2.0%)으로 마취하고 통합된 열 동물 홀더를 통해 37℃로 유지했으며, 영상화 과정에서 호흡률을 모니터링했다. T2 가중(RARE 시퀀스, TR/TE = 3000ms/50ms) 및 T₂* 가중 시퀀스[FLASH(빠른 저각 샷(FLASH) 시퀀스, TR/TE = 50ms/3.5ms)를 포함한 전신 스캔 ]는 SPIO 및 PHysIOMIC 입자(4mg/kg)를 정맥 주사하기 전, 20분, 24시간, 7일, 1개월, 6개월 후에 수행되었다. 간, 비장, 신장 및 척추 주위 근육의 관심 영역을 그려 신호 강도 비율을 측정했다. 비율은 관심 기관의 신호 강도를 척추 주위 근육의 신호 강도로 나누어 계산했다(n=7).

투과 전자 현미경 검사

현탁액에서 SPIO 또는 PHysIOMIC을 관찰하기 위해 친수화된 400-메쉬 그리드(400-mesh grid)에 입자 방울을 침착했다. 간 절편을 관찰하기 위해, 생체분포 연구에서 수확한 작은 조각을 에탄올(70~100%)의 진행욕조에서 탈수하고 수지 EMbed 812에 매립했다. 60℃에서 20시간 동안 중합한 후, 커버슬립을 세포의 수지 블록에서 분리하고 28시간 동안 중합을 계속했다. 초박편을 수집하여 우라닐 아세테이트 및 구연산납과 대조했다. SPIO, PHysIOMIC 및 간 단면은 TEM JEOL 1011을 사용하여 관찰하였고, 이미지는 Camera MegaView 3 및 AnalySIS FIVE 소프트웨어를 사용하여 촬영했다.

결과 및 토의

투과 전자 현미경 검사는 PHysIOMIC 입자가 753.7 ± 47.5 nm의 평균 직경을 나타내며 클러스터화된 SPIO로 구성되어 하기 도 6 및 표 1에 나타낸 바와 같이 78.5 ± 11.3 nm의 평균 직경을 나타냄을 보여준다:

	PHysIOMIC	SPIO
유체역학적 크기 (nm)	753.7 ±47.5	78.53 ± 11.3
다분산 지수 (Polydispersity index)	0.2189 ± 0.1888	0.2214 ± 0.0383
제타 전위 (mV)	-36.37 ± 2.450	-11.09 ± 1.564

폴리도파민 매트릭스의 존재는 -11.09 ± 1.56 mV에 비해 PHysIOMIC의 전위 제타를 -36.37 ± 2.45 mV로 약간 감소시켜 혈액 순환에 유리한 프로필을 제공한다.

PHysIOMIC은 재조합 조직형 플라스미노겐 활성제(tPA, Actylise, 10mg/kg) 주입 후 미세혈전의 혈전용해를 모니터링하는 데 효율적이었다(도 7). tPA를 이용한 혈전용해는 미세혈전 신호의 양을 크게 감소시켰으나 식염수는 방해하지 않았다. 급성 환경에서 허혈성 뇌졸중 후 및 뇌졸중 후 24시간의 평균 혈관 조영 점수는 혈전용해 요법의 유익한 효과를 확인한다. 본 실험은 PHysIOMIC 조영제가 혈전용해제를 투여해야 하는 상황을 식별할 수 있으며, 그에 따라 혈전용해 요법의 유효성을 검증할 수 있음을 확인한다.

생체 분포 연구는 정맥 주사 후 음성 신호 흡수에서 볼 수 있듯이 SPIO 및 PHysIOMIC 입자 모두 간과 비장에 강한 축적이 있음을 나타낸다(도 8). 두 유형의 입자 모두 주입 후 7일부터 명확한 분해가 관찰될 수 있다. 이는 PHysIOMIC의 폴리도파민 매트릭스가 SPIO 입자의 생분해성을 방해하지 않음을 확인한다. 따라서 인간 사용이 검증된 모든 생체적합성 SPIO는 PHysIOMIC 입자 준비의 후보가 될 수 있다. PHysIOMIC 입자를 주입한 후 서로 다른 시간에 간 섹션을 투과 전자 현미경으로 관찰한 결과, 입자가 시간이 지남에 따라 분해되는 쿠퍼 세포의 리소좀 구획 내에 축적된다는 것이 확인되었다.

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Claims (14)

1. 200 nm 내지 2000 nm, 바람직하게는 200 nm 내지 1500 nm, 더 바람직하게는 300 nm 내지 1000 nm, 더 바람직하게는 500 nm 내지 1000 nm에 포함되는 유체역학적 직경을 갖는 입자로서,
   상기 입자는 폴리카테콜아민(polycathecolamine) 또는 폴리세로토닌(polyserotonine)의 매트릭스 내에 매립된(embedded) 산화철의 코팅된 나노입자를 포함하며,
   산화철의 코팅된 나노입자 각각은 폴리카테콜아민 또는 폴리세로토닌과 상이한 중합체에 의해 코팅되는, 입자.
2. 제1항에 있어서,
   산화철은 화학식 Fe₂O₃의 마그헤마이트(maghemite), 화학식 Fe₃O₄의 자철석(magnetite) 또는 Fe₂O₃와 Fe₃O₄의 혼합물 중에서 선택되는, 입자.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   폴리카테콜아민은 폴리도파민(PDA), 폴리노르에피네프린(PNE) 또는 폴리에피네프린(PEP) 중에서 선택되는, 입자.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
   산화철의 코팅된 나노입자는, 덱스트란(dextran), 카르복시덱스트란(carboxydextran), 또는 카르복시메틸덱스트란(carboxymethyldextran)과 같은 덱스트란(dextran), 또는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)로부터 선택되는 중합체에 의해 코팅되는, 입자.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 입자의 현탁액.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 입자 현탁액을 제조하는 방법으로,
   a) 코팅된 산화철 나노입자와 카테콜아민(catecholamine) 또는 세로토닌(serotonine)의 용액을 교반하에 혼합함으로써, 카테콜아민 또는 세로토닌의 자가-중합을 일으키고, 중합된 카테콜아민 또는 세로토닌의 매트릭스에 매립된 코팅된 산화철 나노입자를 함유하는 입자를 형성하는 단계;
   b) 상기 중합을 종료하는 단계;
   c) 생성된 반응 혼합물을 처리하여 원하는 크기의 최종 입자를 얻는 단계;
   d) 입자 현탁액을 회수하는 단계;를 포함하는 제조 방법.
7. 제6항에 따른 제조 방법에 따라 얻을 수 있는 입자의 현탁액 또는 입자.
8. 제1항 내지 제4항 또는 제7항 중 어느 한 항에 따른 입자를 포함하고,
   유리 아민(free amine) 또는 티올기(thiol groups)를 포함하는 분자, 또는 방사성표지된 금속(radiolabelled metal)을 포함하는 분자를 포함하는, 접합체.
9. 제8항에 있어서,
   유리 아민 또는 티올기를 포함하는 분자는, 단백질, 펩티드, 나노바디, 또는 단일클론 항체로부터 선택되는, 접합체.
10. 생체 내 영상 방법에서 사용되는, 제1항 내지 제4항 또는 제7항 중 어느 한 항에 따른 입자, 또는 제5항에 따른 입자의 현탁액, 또는 제8항 또는 제9항에 따른 접합체.
11. 제10항에 있어서,
    상기 영상 방법은 자기공명영상(MRI), 자기입자영상(MPI), 광음향영상(photoacoustic imaging), 또는 양전자방출단층촬영(positron emission tomography, PET)로부터 선택되는, 제1항 내지 제4항 또는 제7항 중 어느 한 항에 따른 입자, 또는 제5항에 따른 입자의 현탁액, 또는 제8항 또는 제9항에 따른 접합체.
12. 환자에게 제1항 내지 제4항 또는 제7항 중 어느 한 항에 따른 입자, 또는 제5항에 따른 입자의 현탁액, 또는 제8항 또는 제9항에 따른 접합체를 포함하는 조성물이 투여되고, 영상화 단계를 포함하는, 영상화 방법.
13. 제1항 내지 제4항 또는 제7항 중 어느 한 항에 따른 입자, 또는 제5항에 따른 입자의 현탁액, 또는 제8항 또는 제9항에 따른 접합체를 포함하는 조성물.
14. 제1항 내지 제4항 또는 제7항 중 어느 한 항에 따른 입자, 또는 제5항에 따른 입자의 현탁액, 또는 제8항 또는 제9항에 따른 접합체의, 영상화 방법에서 조영제 또는 추적자로서의 용도.