JP6959661B2 - 抗癌剤を担持したヒト血清アルブミンナノ粒子を利用した肝動脈化学塞栓術用組成物およびその製造方法 - Google Patents

抗癌剤を担持したヒト血清アルブミンナノ粒子を利用した肝動脈化学塞栓術用組成物およびその製造方法 Download PDF

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Description

本発明は、肝動脈化学塞栓術に関し、抗癌剤を効果的に担持する生体タンパク質であるヒト血清アルブミンベースのナノ粒子を開発して、肝動脈化学塞栓術の効果を飛躍的に上昇させることに関する。
最近、映像技術が発展するに伴い、体内に隠れている癌の正確な位置を探し出して、放射線照射、内視鏡手術など様々な方法で除去することができるようになった。しかしながら、癌の位置を正確に発見しても、癌が全体臓器に広まっていたり、他の臓器に付いている場合等の色々な理由によって手術的除去が不可能な場合がある。肝癌、すい臓癌等の場合、発見しても、手術的根治が不可能な場合が多い。
現在、肝腫瘍の治療に最も多く実施されている施術である化学塞栓術は、肝腫瘍に栄養を供給する動脈を探して抗癌剤を投与した後、血管を遮断する治療法である。肝組織は、小腸および大腸等を回って出る門脈と大動脈から直接出る肝動脈を通じて酸素と栄養を供給されるが、正常な肝組織は、主に門脈から、腫瘍組織は、主に肝動脈から血液を供給される。したがって、腫瘍に栄養を供給する肝動脈に抗癌剤を投与し、血管を遮断すると、正常な肝組織に害を与えることなく、腫瘍だけを選択的に壊死させることができる。このような治療法は、癌の進行程度による制約がないため、適用範囲が広く、治療対象の制限が少ないなど長所が多いので、現在肝癌治療率の向上に最も大きく寄与している方法である。化学塞栓術は、まず、鼠蹊部に位置する大腿動脈にカテーテルを挿入して肝動脈に接近した後、血管造影剤を注射して腫瘍の位置、サイズおよび血液供給様相など治療に必要な情報を得、治療方針が決定されると、太さが約１ｍｍ程度の細い管をカテーテルに挿入して、標的となる動脈を探して施術する。
ただし、従来の肝動脈化学塞栓術によれば、塞栓物質が一定時間以後に洗われてしまうという限界があり、血管に沿って循環しつつ、薬物を全身に拡散させて、正常細胞の死滅のような副作用を伴うという問題点がある。
これを解決するために、本発明者らは、現在肝動脈化学塞栓術に使用される抗癌剤であるアドリアマイシンの代わりに、アドリアマイシンを効果的に担持する生体タンパク質であるヒト血清アルブミンベースのナノ粒子（サイズ；約１００〜３００ｎｍ）を開発して、肝動脈化学塞栓術に適用することによって、肝動脈化学塞栓術の効果が飛躍的に上昇することを確認し、本発明を完成した。
本発明は、従来の肝動脈化学塞栓術に使用された物質が、塞栓術の施行後に塞栓物質が一定時間以後に洗われてしまうという限界を示すところ、これを解決し、同時に、持続的な薬物放出によって薬効を長時間持続させて、抗癌治療の効果を向上させるための発明である。
また、本発明は、前記の限界によって、血管に沿って循環しつつ、薬物を全身に拡散させて、正常細胞の死滅のような副作用を伴うという問題点があるところ、これを解決するためのものである。
具体的に、本発明は、現在肝動脈化学塞栓術に使用される抗癌剤の代わりに、抗癌剤を効果的に担持する生体タンパク質であるヒト血清アルブミンベースのナノ粒子（サイズ；約１００〜３００ｎｍ）を開発して、肝動脈化学塞栓術に適用される新しい組成物およびその製造方法を提供することにある。
本発明の一具現例は、塞栓物質と；水溶性抗癌剤を担持するヒト血清アルブミンナノ粒子と；を含む、肝動脈塞栓術用組成物を提供する。
本発明の他の具現例は、塞栓物質と；マイクロバブルと；前記マイクロバブルの表面に結合され、水溶性抗癌剤を担持するヒト血清アルブミンナノ粒子と；を含む、肝動脈塞栓術用組成物を提供する。
好ましくは、前記塞栓物質は、リピオドールである。
前記水溶性抗癌剤は、マイトマイシン、シスプラチン、アドリアマイシン、およびゲムシタビンよりなる群から選ばれる一つ以上であってもよい。
前記塞栓物質対ナノ粒子の体積比は、１：１〜４：１であってもよい。
また、前記塞栓物質対ナノ粒子とマイクロバブルとの体積比は、１：１〜４：１である。
前記水溶性抗癌剤の濃度は、１〜２０ｍｇ／ｍＬであってもよい。
前記ナノ粒子の濃度は、１０〜５０ｍｇ／ｍＬであってもよい。
本発明の他の具現例は、水溶性抗癌剤を担持するヒト血清アルブミンナノ粒子をコンピュータ断層造影剤およびＸ線造影剤に分散させる段階と；前記分散したナノ粒子と塞栓物質を混合する段階と；を含む、肝動脈塞栓術用組成物の製造方法を提供する。
本発明のさらに他の具現例は、水溶性抗癌剤を担持するヒト血清アルブミンナノ粒子をコンピュータ断層造影剤およびＸ線造影剤に分散させる段階と；前記分散したナノ粒子をマイクロバブルと混合する段階と；前記ナノ粒子とマイクロバブルの混合物と塞栓物質を混合する段階と；を含む、肝動脈塞栓術用組成物の製造方法を提供する。
前記コンピュータ断層造影剤およびＸ線造影剤は、イオパミドール（Ｉｏｐａｍｉｄｏｌ）およびパミレイ（Ｐａｍｉｒａｙ）よりなる群から選ばれる一つ以上であってもよい。
また、前記ナノ粒子は、下記段階を含む方法により製造され得る。
ヒト血清アルブミンと水溶性抗癌剤の混合物を製造する段階と；前記製造した混合物の酸度（ｐＨ）を調節する段階と；前記酸度を調節した混合物を脱溶媒和物質（ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ ｍａｔｅｒｉａｌ）で滴定する段階と；前記滴定した混合物に粒子安定化物質を添加する段階と；前記粒子安定化物質を添加した後、脱溶媒和物質を気化させる段階と；前記気化した混合物を遠心分離する段階。
他方で、前記ナノ粒子の製造方法は、下記段階を含むことができる。
ヒト血清アルブミンを蒸留水に溶解させる段階と；前記溶解させた物質の酸度を調節する段階と；前記酸度を調節した物質を脱溶媒和物質で滴定する段階と；前記脱溶媒和物質で滴定した混合物に粒子安定化物質を添加する段階と；前記脱溶媒和物質を気化させる段階と；前記気化した混合物を遠心分離する段階と；前記遠心分離した物質に水溶性抗癌剤を添加して反応させる段階。
または、前記ナノ粒子の製造方法は、下記段階を含むことができる。
ヒト血清アルブミンを蒸留水に溶解させる段階と；前記溶解させた物質の酸度を調節する段階と；前記酸度を調節した物質に２−イミノチアゾリジン（２−ｉｍｉｎｏ−ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅ）を添加する段階と；前記２−イミノチアゾリジンを添加する段階後、遠心分離する段階と；前記遠心分離後、水溶性抗癌剤を添加する段階と；前記水溶性抗癌剤の添加後、脱溶媒和物質で滴定する段階。
または、前記ナノ粒子の製造方法は、下記段階を含むことができる。
水溶性抗癌剤をクロロホルムに溶解させる段階と；前記溶解させた物質にヒト血清アルブミンを添加する段階と；前記ヒト血清アルブミンを添加した後、ボルテックスする段階と；前記ボルテックスする段階後、超音波処理する段階と；前記超音波処理する段階後、クロロホルムを蒸発させる段階と；前記蒸発させた物質を遠心分離する段階。
また、前記ナノ粒子の製造方法は、真空状態で凍結乾燥させて、パウダー剤形のナノ粒子を形成する段階をさらに含むことができる。
本発明は、従来の発明に比べて肝動脈化学塞栓術の効果を飛躍的に上昇させた。具体的に、ヒト血清アルブミンナノ粒子は、薬物を効果的に細胞に集中浸透させると共に、粒子から持続的な薬物を放出する効果を利用して、長期間治療効果を誘導することができる。
また、肝癌患者は、一般的にアルブミンを作ることができないが、本発明の場合、ヒト血清アルブミンベースのナノ粒子を使用することによって、肝癌患者にアルブミンを注入する効果まで誘導することができるので、腹水の誘発を抑制することができるという効果がある。
アドリアマイシンを担持したヒト血清アルブミンナノ粒子１のサイズ分布を示すグラフである。 アドリアマイシンを担持したヒト血清アルブミンナノ粒子２のサイズ分布を示すグラフである。 アドリアマイシンを担持したヒト血清アルブミンナノ粒子３のサイズ分布を示すグラフである。 ドセタキセルを担持したヒト血清アルブミンナノ粒子のサイズ分布を示すグラフである。 パクリタキセルを担持したヒト血清アルブミンナノ粒子のサイズ分布を示すグラフである。 グループ１の時間による薬物放出挙動の分析を示すグラフである。 グループ２の時間による薬物放出挙動の分析を示すグラフである。 グループ２の蛍光イメージ（赤色：アドリアマイシン）を示す写真である。 肝動脈化学塞栓術による３日、７日後の抗癌効果を比較分析した写真である。 インビトロ放出を全て終えた状態でのアドリアマイシン担持ヒト血清アルブミンナノ粒子を利用して細胞生存率試験を行った結果を示す写真である。 本発明の一具現例による剤形のＤＩＣイメージを示す。 本発明の一具現例による剤形の肝癌治療効能データを示す。
まず、本発明の実施のために必要な概念について簡略に説明する。
蒸留水の種類は、何回精製した蒸留水であるかによって１次、２次、３次蒸留水に分けられる。本願発明に使用される蒸留水は、３次蒸留水であって、有機物およびイオンを除去した水である。有機物に対する影響が大きい生物学関連発明であるから、３次蒸留水を使用したものである。
肝臓は、肝動脈と門脈から二重血流の供給を受ける器官である。正常な肝組織は、７０〜８０％の血流と５０％の必要酸素量を門脈から供給されるのに対して、肝細胞癌は、大部分が多血管性腫瘍であって、９０％以上の血液を肝動脈から供給される。したがって、肝動脈を介して治療物質を注入すると、正常な肝組織に比べて肝細胞癌に高濃度で投与され、塞栓物質を注入して、肝動脈血流を非選択的に遮断したときにも、肝細胞癌にのみ激しい虚血がもたらされるので、比較的選択的な腫瘍治療が可能である。これが、肝動脈を介した肝細胞癌治療法に共通して適用される理論的根拠である。
具体的に、本発明について記述すると、前記課題を解決するために、本発明は、塞栓物質と抗癌剤を担持したヒト血清アルブミンを含む肝動脈塞栓術用組成物を提供する。
本発明によれば、アドリアマイシンを担持するヒト血清アルブミンナノ粒子が担持した抗癌剤を粒子から持続的に放出する効果とともに、ナノサイズ粒子の癌腫瘍周辺の血管壁と癌細胞に過発現したレセプター（例えば、ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ６０）を利用したトランスサイトーシス（Ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ）機作により癌腫瘍組織および癌細胞内に効率的に浸透させる効果により、従来の肝動脈化学塞栓術の短所である正常組織への抗癌剤の曝露を最小化し、長期間治療効果を誘導できる相乗効果を起こす。
前記塞栓物質に使用されるものは、油性造影剤であって、特にリピオドールであることが好ましい。
前記抗癌剤は、難溶性抗癌剤または水溶性抗癌剤であってもよい。
前記水溶性抗癌剤は、マイトマイシン、シスプラチン、アドリアマイシンであることを特徴とする。
前記水溶性抗癌剤は、ヒト血清アルブミンと静電的引力により結合することを特徴とする。
前記難溶性抗癌剤は、ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、カンプトテシン（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、タモキシフェン（Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイプロリド（Ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）、フルタミド（Ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）、ビンクリスチン（Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビノレルビン（Ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、バルルビシン（Ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎ）、メクロレタミン（Ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、ブスルファン（Ｂｕｓｕｌｆａｎ）等であり、ヒト血清アルブミンとは、疎水性−疎水性引力により結合することを特徴とする。
前記塞栓物質と抗癌剤を担持したヒト血清アルブミンナノ粒子との体積比は、１：１〜４：１であることを特徴とする。
一方、前記課題を解決するために、水溶性抗癌剤を担持したヒト血清アルブミンナノ粒子の第一の製造方法は、ヒト血清アルブミンと抗癌剤を３次蒸留水に溶かして混合物を製造する段階と；前記製造された混合物の酸度（ｐＨ）を調節する段階と；前記酸度を調節した混合物を脱溶媒和物質で滴定する段階と；前記滴定した混合物に粒子安定化物質を添加する段階と；前記粒子安定化物質を添加した後、脱溶媒和物質を気化させる段階と；前記気化した混合物を遠心分離する段階と；を含む。
他方で、ヒト血清アルブミンを３次蒸留水に溶解させる段階と；前記溶解させた物質の酸度を調節する段階と；前記ｐＨを調節した物質を脱溶媒和物質で滴定する段階と；前記脱溶媒和物質で滴定した混合物に粒子安定化物質を添加する段階と；前記粒子安定化物質を添加した後、脱溶媒和物質を気化させる段階と；前記気化した混合物を遠心分離する段階と；前記遠心分離した物質に抗癌剤を添加して反応させる段階と；を含む。
前記抗癌剤の濃度は、１〜２０ｍｇ／ｍＬであることを特徴とする。
前記ヒト血清アルブミンの濃度は、１０〜５０ｍｇ／ｍＬであることを特徴とする。
前記酸度を調節する段階は、酸度が８〜８．５であることを特徴とする。
前記脱溶媒和物質は、エタノールであり、前記粒子安定化物質は、アルデヒド系、アミン系、カルボキシル系、チオールであることを特徴とする。
前記遠心分離段階は、１０，０００〜１５，０００ｒｐｍで８〜１２分間遠心分離することを特徴とする。好ましくは２〜４回遠心分離することを繰り返した方が良い。
一方、前記課題を解決するために、水溶性抗癌剤を担持したヒト血清アルブミンナノ粒子の第三の製造方法として、ヒト血清アルブミンを３次蒸留水に溶解させる段階と；前記溶解させた物質の酸度を調節する段階と；前記酸度を調節した物質に２−イミノチアゾリジンを添加する段階と；前記２−イミノチアゾリジンを添加する段階後、遠心分離する段階と；前記遠心分離する段階後、抗癌剤を添加する段階と；前記抗癌剤を添加する段階後、脱溶媒和物質で滴定する段階と；を含む肝動脈塞栓術用組成物の製造方法を提供することができる。
前記抗癌剤は、水溶性抗癌剤であり、具体的には、マイトマイシン、シスプラチン、アドリアマイシンであることが好ましく、その濃度は、１〜１０ｍｇ／ｍＬであることを特徴とする。
前記ヒト血清アルブミンナノ粒子の濃度は、１０〜５０ｍｇ／ｍＬであることを特徴とする。
前記酸度を調節する段階は、酸度が８〜８．５であることを特徴とする。
前記２−イミノチアゾリジンを添加する段階に使用される２−イミノチアゾリジンの量は、ヒト血清アルブミンと２−イミノチアゾリジンのモル比が１：１０〜３０であることを特徴とする。
前記遠心分離段階は、３，０００〜５，０００ｒｐｍで２〜４分間遠心分離することを特徴とする。
一方、前記課題を解決するために、難溶性抗癌剤を担持したヒト血清アルブミンナノ粒子の製造方法は、抗癌剤をクロロホルムに溶解させる段階と；前記溶解させた物質にヒト血清アルブミンを添加する段階と；前記ヒト血清アルブミンを添加後、ボルテックスする段階と；前記ボルテックスする段階後、超音波処理する段階と；前記超音波処理する段階後、クロロホルムを蒸発させる段階と；前記蒸発させた物質を遠心分離する段階と；を含む。
前記抗癌剤は、難溶性抗癌剤であり、具体的には、ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、カンプトテシン（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、タモキシフェン（Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイプロリド（Ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）、フルタミド（Ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）、ビンクリスチン（Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビノレルビン（Ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、バルルビシン（Ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎ）、メクロレタミン（Ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、ブスルファン（Ｂｕｓｕｌｆａｎ）等であることが好ましく、その濃度は、１〜１０ｍｇ／ｍＬであることを特徴とする。
前記ヒト血清アルブミンナノ粒子の濃度は、１０〜５０ｍｇ／ｍＬであることを特徴とする。
前記遠心分離段階は、１０，０００〜１５，０００ｒｐｍで８〜１２分間遠心分離し、この過程を２〜４回繰り返すことを特徴とする。
前記４種類の方法を利用して水溶性抗癌剤または難溶性抗癌剤を担持したヒト血清アルブミンナノ粒子を製造した。
このようなヒト血清アルブミンナノ粒子は、そのサイズが１００〜３００ｎｍ、好ましくは２００ｎｍであることを特徴とする。
また、これを肝動脈化学塞栓術に適用するためには、溶媒をヒト血清アルブミンおよびＸ線造影剤に交替しなければならない。したがって、粒子を凍結乾燥させて、パウダー剤形に剤形を変化させるために、１〜５％の低温保護物質を添加した後、−７０℃以下で予め凍結させた後、−７０℃で真空状態で凍結乾燥させて、パウダー剤形に剤形を変化させる。この際に使用される低温保護物質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、スクロース、デキストラン等を使用することができる。
凍結乾燥した抗癌剤含有ヒト血清アルブミン粒子を再分散させるためのヒト血清アルブミンおよびＸ線造影剤は、イオパミドール（Ｉｏｐａｍｉｄｏｌ）、パミレイ（Ｐａｍｉｒａｙ）等があり、比重によって多様に選択することができる。比重の選択は、リピオドールと抗癌剤含有ヒト血清アルブミンナノ粒子がエマルジョンに均一に分散し得る比重の造影剤を選択して、パウダー剤形の抗癌剤含有ヒト血清アルブミンナノ粒子を溶解させる。
凍結乾燥した抗癌剤含有ヒト血清アルブミン粒子を胃の造影剤に再分散させた後、リピオドールと１：１〜４の比率（Ｖｏｌ：Ｖｏｌ）で混合した後、３ウェイポンピングを用いて抗癌剤含有ヒト血清アルブミン粒子／リピオドールエマルジョンを製造する。
本発明の他の具現例は、塞栓物質と；マイクロバブルと；前記マイクロバブルの表面に結合され、水溶性抗癌剤を担持するヒト血清アルブミンナノ粒子と；を含む、肝動脈塞栓術用組成物を提供する。このようにマイクロバブルにナノ粒子を結合させることによって、マイクロバブルを利用した造影効果まで得ることができるので、好ましい。
本発明の他の具現例は、水溶性抗癌剤を担持するヒト血清アルブミンナノ粒子をヒト血清アルブミンおよびＸ線造影剤に分散させる段階と；前記分散したナノ粒子をマイクロバブルと混合する段階と；前記ナノ粒子とマイクロバブルの混合物と塞栓物質を混合する段階と；を含む、肝動脈塞栓術用組成物の製造方法を提供する。
前記肝動脈塞栓術用組成物およびその製造方法に関する具体的な構成については、上記で検討したことと同じ内容を適用することができる。
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、ただ本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例により制限されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって自明だろう。
［製造例１］
（親水性抗癌剤の一つであるアドリアマイシンを担持したヒト血清アルブミンナノ粒子の製造方法１）
アドリアマイシンを担持したヒト血清アルブミンナノ粒子は、タンパク質が極性の差によって凝集する効果を利用して製造され得る。さらに、陽電荷を呈するアドリアマイシンと陰電荷を呈するヒト血清アルブミンの特性を利用して静電的結合を誘導することによって、さらに効果的にアドリアマイシンを担持することができる。実験方法によってアドリアマイシンを担持したヒト血清アルブミンナノ粒子は、三つの形態で製作することができる。
（１．１製造方法）
１５０ｍｇのヒト血清アルブミンと５ｍｇのアドリアマイシンを３ｍＬの３次蒸留水に溶かした後、アドリアマイシンが効果的にヒト血清アルブミンと結合され得るように、約２時間撹拌を行う。その後、ヒト血清アルブミン、アドリアマイシン混合液にｐＨを約８．０〜８．５に調節するために、ｐＨメーターを利用してＮａＯＨを添加しながら調節する。その後、アドリアマイシンが結合したヒト血清アルブミンが、ナノメートルのサイズに凝集し得るように、エタノールを滴定する。凝集することは、溶液の混濁度の変化により観察することができる。５ｍＬを滴定した結果、溶液の混濁度が変わることを観察した後、凝集したアドリアマイシンが結合したヒト血清アルブミンを架橋結合（クロスリンク）させて安定化を誘導するために、グルタルアルデヒドを添加する。添加したグルタルアルデヒドは、８％の溶液で１０μｌが添加される。アドリアマイシンを担持したヒト血清アルブミンナノ粒子の安定性は、グルタルアルデヒドの添加量によって調節することができる。その後、一晩中架橋を行って、十分に反応させると同時に、滴定したエタノールを気化させる過程を行う。十分に反応して安定化したアドリアマイシンを担持したヒト血清アルブミンナノ粒子だけを取得するために、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行って、粒子化しないアドリアマイシンが結合したヒト血清アルブミンを除去しつつ、３回繰り返して純度を高める。
アドリアマイシンを担持したヒト血清アルブミンナノ粒子のサイズは、動的光散乱法（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ：ＤＬＳ）方法を利用して測定することができ、電子顕微鏡イメージを通じてナノ粒子形態のモルフォロジー（ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）を観察することができる。また、アドリアマイシンを担持したヒト血清アルブミンナノ粒子に担持されたアドリアマイシンの定量分析は、最初投与したアドリアマイシンの量と担持されないアドリアマイシンとの差により算出することができ、担持されないアドリアマイシンは、ＨＰＬＣを利用して定量分析することができる。
（１．２特徴分析）
動的光散乱法（ＤＬＳ）方法で粒子のサイズを分析した結果、２００．４±５０．７ｎｍのサイズを示しており、サイズ分布も、やはり均一な粒子分布を示している。また、粒子内担持されたアドリアマイシンの効果は、約８９．６４％の担持効果を示している。
［製造例２］
［親水性抗癌剤の一つであるアドリアマイシンを担持したヒト血清アルブミンナノ粒子の製造方法２］
（２．１製造方法）
本アドリアマイシンを担持したヒト血清アルブミンナノ粒子２は、上記で開発されたアドリアマイシンを担持したヒト血清アルブミンナノ粒子１から若干変化した剤形で安定化させるために投与されたグルタルアルデヒドの代わりに、ジスルフィド結合を誘導して製作された剤形である。ジスルフィド結合は、ヒト血清アルブミンにチオール基を２−イミノチアゾリジンを反応させて誘導して行われる。チオール基を誘導するために、まず１５０ｍｇのヒト血清アルブミンを３ｍＬの３次蒸留水に溶かした後、ｐＨを８．０〜８．５に調節する。その後、２−イミノチアゾリジンを６ｍｇを入れて１時間の間反応させて、ヒト血清アルブミンにチオール基を導入する。十分に反応させた後、導入されない２−イミノチアゾリジンを除去するために、３０００Ｄａメンブレンを利用して遠心分離を４，０００ｒｐｍで３分間行うことによって除去する。分離しないチオール基が誘導されたヒト血清アルブミンに５ｍｇのアドリアマイシンを添加して１時間の間撹拌して、効果的にチオール基が誘導されたヒト血清アルブミンに結合する。その後、エタノールを約５ｍＬを滴定して一晩中撹拌する。
その後、アドリアマイシンが担持されたヒト血清アルブミンナノ粒子の純度を高めて採取する過程および分析方法は、アドリアマイシンを担持したヒト血清アルブミンナノ粒子１の工程と同一である。
（２．２特徴分析）
動的光散乱法（ＤＬＳ）方法で粒子のサイズを分析した結果、１９３．８±６９．７ｎｍのサイズを示しており、サイズ分布も、やはり均一な粒子分布を示している。また、粒子内担持されたアドリアマイシンの効果は、約７０．３５％の担持効果を示している。
［製造例３］
（親水性抗癌剤の一つであるアドリアマイシンを担持したヒト血清アルブミンナノ粒子の製造方法３）
（３．１製造方法）
アドリアマイシンを担持したヒト血清アルブミンナノ粒子３の場合、アドリアマイシンがヒト血清アルブミンに効果的に静電的力により結合する性質を利用して担持させる方法で製造される。まず、アドリアマイシンが担持されていないヒト血清アルブミンナノ粒子を製造するために、１５０ｍｇのヒト血清アルブミンを３ｍＬの３次蒸留水に溶解させて、持続的に撹拌を行う。十分に溶かした後、ＮａＯＨを利用してｐＨを８．０〜８．５に調節する。その後、ヒト血清アルブミンを凝集させるために、エタノールを約５ｍＬ滴定した後、架橋結合させるために、８％グルタルアルデヒドを１０μｌ添加して一晩中撹拌を行う。十分に一晩中架橋結合反応をさせた後、製作されたヒト血清アルブミンナノ粒子だけを取得するために、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離させて、粒子化しないヒト血清アルブミンを除去する。取得されたヒト血清アルブミンナノ粒子にアドリアマイシンを担持させるために、アドリアマイシン５ｍｇをヒト血清アルブミンナノ粒子に添加して１時間反応させる。
（３．２特徴分析）
動的光散乱法（ＤＬＳ）方法で粒子のサイズを分析した結果、２４６．９±７９．３ｎｍのサイズを示しており、サイズ分布も、やはり均一な粒子分布を示している。また、粒子内担持されたアドリアマイシンの効果は、約４５．９５％の担持効果を示している。
［製造例４］
（難溶性抗癌剤（ドセタキセル；Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）を担持したヒト血清アルブミンナノ粒子の製造方法）
疎水性抗癌剤を効果的に担持するヒト血清アルブミンナノ粒子の製造方法は、下記の通りである。疎水性抗癌剤であるドセタキセルを１０ｍｇ／ｍＬの濃度でクロロホルムに溶解させて、ストック溶液を製造する。また、ヒト血清アルブミン溶液を５０ｍｇ／ｍＬの濃度で３ｍＬを製造した後、以前に準備したドセタキセルストック溶液を１００〜２００μｌを追加して、高速でボルテックスする。ボルテックスして、小さいサイズのクロロホルムに溶けているドセタキセルエマルジョンを製造した後、引き続いて、超音波処理を１００％振幅で、１サイクルの条件で２分間行うことによって、内部に抗癌剤溶液を担持し、ヒト血清アルブミンシェルで構成されたエマルジョンを製造する。製造されたエマルジョンがＨＳＡでコーティングされたことを確認した後、真空状態で一晩中クロロホルムを蒸発させる。この際、重要なことは、クロロホルムが早く気化して爆発するのを防止しなければならない。クロロホルムが完全に除去された後、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、粒子化しないヒト血清アルブミンとドセタキセルを除去する。この過程を３回繰り返して、確実に製造されたドセタキセルが含有されたヒト血清アルブミンナノ粒子だけを取得する。
［製造例５］
（難溶性抗癌剤（パクリタキセル；Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）を担持したヒト血清アルブミンナノ粒子の製造方法）
疎水性抗癌剤を効果的に担持するヒト血清アルブミンナノ粒子の製造方法は、下記の通りである。疎水性抗癌剤であるパクリタキセルを１０ｍｇ／ｍＬの濃度でクロロホルムに溶解させて、ストック溶液を製造する。また、ヒト血清アルブミン溶液を５０ｍｇ／ｍＬの濃度で３ｍＬを製造した後、以前に準備したパクリタキセルストック溶液を１００〜２００μｌを追加して、高速でボルテックスする。ボルテックスして、小さいサイズのクロロホルムに溶解したパクリタキセルエマルジョンを製造した後、引き続いて超音波処理を１００％振幅で、１サイクルの条件で２分間行うことによって、内部に抗癌剤溶液を担持し、ヒト血清アルブミンシェルで構成されたエマルジョンを製造する。製造されたエマルジョンがＨＳＡでコーティングされたことを確認した後、真空状態で一晩中クロロホルムを蒸発させる。この際、重要なことは、クロロホルムが早く気化して爆発するのを防止しなければならない。クロロホルムが完全に除去された後、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、粒子化しないヒト血清アルブミンとパクリタキセルを除去する。この過程を３回繰り返して、確実に製造されたパクリタキセルが含まれたヒト血清アルブミンナノ粒子だけを取得する。
［実験例１−薬物放出挙動実験分析］
肝動脈化学塞栓術に適用されて、アドリアマイシンが結合したヒト血清アルブミンナノ粒子が十分に長時間薬物を放出して薬効を持続させる効果を検証するために、まず、インビトロでアドリアマイシンが結合したヒト血清アルブミンナノ粒子１、２、３の薬物放出挙動を分析する。また、肝動脈化学塞栓術で施行される方法と同じ方法で塞栓物質であるリピオドールと比率別に混合して、エマルジョンの形態で変化させて放出されるアドリアマイシンを定量分析することによって、薬物放出挙動を測定する。
（１．１実験方法）
アドリアマイシンが結合したヒト血清アルブミンナノ粒子から放出されるアドリアマイシンを分析するために、２０００Ｄａサイズの透析膜（ｄｉａｌｙｓｉｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ）に製造された試料を１ｍＬ（アドリアマイシン含有量：５ｍｇ）注入して、完全に密封する。これを１０ｍＬのリン酸緩衝食塩水が入っているチューブに入れ、３７℃で振とうして、指定された時点に透析膜を１０ｍＬのリン酸緩衝食塩水が入っているチューブに移して、時点ごとに試料を取得する。準備された試料のグループは、下記の通りである。
グループ１．−フリーのアドリアマイシンのリン酸緩衝食塩水溶液（ｆｒｅｅ ＤＯＸ（ＰＢＳ））または造影剤溶液（ｆｒｅｅ ＤＯＸ（Ｐａｍｉｒａｙ））
−１：４の体積比として、フリーのアドリアマイシン＆リピオドール（ｆｒｅｅ ＤＯＸ（１：４））
−リン酸緩衝食塩水（ＤＯＸ−ＨＳＡ−ＮＰｓ（ＰＢＳ））または造影剤（ＤＯＸ−ＨＳＡ−ＮＰｓ（Ｐａｍｉｒａｙ））内に、アドリアマイシンが担持されたヒト血清アルブミンナノ粒子
−１：４（ＤＯＸ−ＨＳＡ−ＮＰｓ（１：４））の体積比として、アドリアマイシンが担持されたヒト血清アルブミンナノ粒子＆リピオドール
グループ２．−１：１、１：２、１：３および１：４の体積比として、アドリアマイシンが担持されたヒト血清アルブミンナノ粒子＆リピオドール
（１．２実験結果）
図６は、グループ１に対する薬物放出挙動を分析した結果を示す。フリーアドリアマイシン群（ｆｒｅｅ ＤＯＸ）の場合、３時間以内に大部分薬物が放出される結果を示し、比重の高い造影剤（ｐａｍｉｒａｙ）に分散したフリーアドリアマイシン群（ｆｒｅｅ ＤＯＸ（Ｐａｍｉｒａｙ））の場合、若干薬物放出時間を遅延させる結果を導き出す。また、リピオドールと混合されてエマルジョンになった形態のフリーアドリアマイシン群（ｆｒｅｅ ＤＯＸ（１：４））の場合、リピオドールに包んでいるエマルジョンの形態でｆｒｅｅ ＤＯＸ（ＰＢＳ）群とｆｒｅｅ ＤＯＸ（Ｐａｍｉｒａｙ）群より薬物放出の速度を減少させて持続的放出効果を示す。
フリーアドリアマイシン群と比較してアドリアマイシンが担持されたヒト血清アルブミンナノ粒子群は、基本的にヒト血清アルブミンナノ粒子の特性によって、全部長時間持続放出効果を誘導できる物質であり、全部持続的薬物放出効果を示す。大部分が短時間内に放出するフリーアドリアマイシン群とは反対に、アドリアマイシンが担持されたヒト血清アルブミンナノ粒子群は、初期に放出される薬物の量は、すべて１ｍｇ以内の非常に微々たる状態で、持続的に薬物を放出させて長期間治療効果を期待できる剤形と判断される。特に、リピオドールと１：４比率で混合されてエマルジョンになったアドリアマイシン担持ヒト血清アルブミンナノ粒子は、初期時点にほとんど放出効果を示さず、徐々に持続放出する効果が最も優れているので、長期間の薬効を期待することができる。
肝動脈化学塞栓術への適用のために、リピオドールとの最適な混合比率を導き出すために、リピオドールとの混合比率を１：１、１：２、１：３、１：４に調節した結果、図７に示すように、１：３と１：４の比率が最適な比率で導き出された。１：１、１：２比率のエマルジョンは、１：３、１：４の比率と比較して短時間内に薬物がさらに放出される結果を導き出した。さらに、図８から分かるように、１：１、１：２比率のエマルジョンは、リピオドールが外部でアドリアマイシン担持ヒト血清アルブミンナノ粒子を包む形態のエマルジョンでなく、アドリアマイシン担持ヒト血清アルブミンナノ粒子が外部でリピオドールを包む形態であって、塞栓効果を大きく期待できない剤形である。したがって、塞栓効果および薬物の持続放出効果を最大化させることができる剤形は、１：４比率のエマルジョンであると結論が導き出される。
［実験例２−疾病動物モデルを利用した肝動脈化学塞栓術による抗癌効果分析］
開発されたアドリアマイシンが担持されたヒト血清アルブミンナノ粒子とリピオドールを、１：４の比率で混合させたエマルジョンと現在肝動脈化学塞栓術で実施される方法で、アドリアマイシンをリピオドールと１：４比率で混合させたエマルジョンの抗癌効果を、動物実験を通じて検証する。動物モデルは、ＶＸ２ ｃａｒｃｉｎｏｍａウサギモデルであって、肝臓に直接癌細胞を移植して成長させながら、肝癌疾病動物モデルを作製評価する。
（２．１実験方法）
ＶＸ２ ｃａｒｃｉｎｏｍａウサギモデルを利用してウサギの動脈までＸ線映像を見ながら、カテーテルを位置させた後、それぞれフリーアドリアマイシン＆リピオドールエマルジョン（１：４比率）とアドリアマイシンが担持されたヒト血清アルブミンナノ粒子＆リピオドールエマルジョン（１：４比率）を２００μｌ注入して、肝動脈化学塞栓術を実施する。この際、それぞれ伝達されるアドリアマイシンの含量は、１ｍｇと同一であり、リピオドールも、やはり同じ用量で注入されることによって、塞栓術による抗癌効果の影響を同一に調節する。それぞれの試料を注入した後、３日後、７日後に腫瘍を採取して抗癌効果を分析する。実験群は、下記の通りである。
グループ−アドリアマイシンが担持されたヒト血清アルブミンナノ粒子＆リピオドールエマルジョン（１：４比率）３日後採取（００１）
−アドリアマイシンが担持されたヒト血清アルブミンナノ粒子＆リピオドールエマルジョン（１：４比率）７日後採取（００２）
−フリーアドリアマイシン＆リピオドールエマルジョン（１：４比率）３日後採取（００３）
−フリーアドリアマイシン＆リピオドールエマルジョン（１：４比率）７日後採取（００４）
（２．２実験結果）
図９は、それぞれ３日後、７日後の抗癌効果を示している。フリーアドリアマイシンとアドリアマイシンが担持されたヒト血清アルブミンを塞栓術に適用した場合、二つの群がいずれも効果的に肝癌細胞を死滅させる結果を示す。しかしながら、フリーアドリアマイシンを処理した場合、７日後の結果（００４）に基づいて末梢部位に生存した癌細胞を見ることができるが、アドリアマイシンが担持されたヒト血清アルブミンを処理した群（００１と００２）の場合、すべて効果的に肝癌細胞を死滅させた結果が得られ、肝動脈化学塞栓術による効果が最大化されたことを示す。さらに、薬物の持続放出による効果が期待され、長期間抗癌効果が期待される。
［実験例３］
（インビトロ放出を終えた状態での細胞生存率試験実施結果のデータ分析）
上記の実験は、インビトロ放出を全て終えた状態でのアドリアマイシン担持ヒト血清アルブミンナノ粒子を利用して、細胞生存率試験を行った結果である。図１０の左側写真から分かるように、放出がこれ以上進行されない時点でのアドリアマイシン担持ヒト血清アルブミンナノ粒子は、赤色を示し、依然としてアドリアマイシンを担持していることが分かる。
この際の粒子を利用して抗癌効果を定量分析した結果が、図１０の中間のグラフであり、依然としてアドリアマイシンを担持した状態で存在する粒子は、細胞内に入ったときに分解されて、依然として抗癌効果を有していることから、癌細胞の死滅を誘導したことが分かる。
図１０の右側写真の蛍光イメージに基づいて、細胞核でアドリアマイシンが検出されることを立証した。すなわち、細胞内でアドリアマイシン担持ヒト血清アルブミンナノ粒子が分解されて、担持しているアドリアマイシンを溶出させ、溶出したアドリアマイシンが細胞核に浸透して、抗癌効果を誘発したことが分かる。
したがって、アドリアマイシン担持ヒト血清アルブミンナノ粒子は、粒子から溶出されるアドリアマイシンが抗癌効果を示すと共に、粒子が細胞内に浸透した後、アルブミン粒子が分解されながら、アドリアマイシンが２次的に溶出することで、抗癌効果を示すことが分かる。
［製造例６−マイクロバブルの製造］
脂質としては、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨＳ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ｎ［ポリ（エチレングリコール）］２０００−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）をモル比で９：１になるように比率を調整した後、クロロホルムに溶かした後、ロータリーエバポレーターを利用してクロロホルムを完全に蒸発させて、脂質薄膜を形成する。
引き続いて、０．０１Ｍのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を脂質薄膜に添加し、温度を５５〜６０℃に維持しながら、脂質を溶かす。その後、Ｃ３Ｆ８ガスを、混合液が入った容器に入れて充填した後、４５秒間機械的撹拌を加えて、マイクロバブルを作製する。
［製造例７−ａｌｂ−ＭＢ−ＴＡＣＥの形成］
（７．１．製造方法）
１．ドキソルビシン・ＨＣｌがローディングされたヒト血清アルブミンナノ粒子（ＤＯＸ−ＨＳＡ ＮＰｓ）ペレットを一定の濃度になるように（例えば、６．２５ｍｇ／ｍｌ）造影剤であるパミレイ（Ｐａｍｉｒａｙ）に分散させる。ナノ粒子が十分に分散し得るようにボルテックスを利用する。
２．マイクロバブル（０．５ｍｇ／ｍｌあるいは１ｍｇ／ｍｌ）を製作して５ｍｌのシリンジに入れ、マイクロバブルが入っているガラスバイアルに１ｍｌのＰＢＳを追加に入れて、残ったマイクロバブルを回収した後、５ｍｌのシリンジに入れる。
３．マイクロバブルが入っている５ｍｌのシリンジを遠心分離機に入れ、（２２５×ｇ、１０分）の条件で上層部にマイクロバブルが集まるようにする。その後、最上層部のマイクロバブルを残して、シリンジ内の溶液を捨てる。
４．使用する量だけのＤＯＸ−ＨＳＡ ＮＰｓとマイクロバブルを混ぜて十分な反応が起こるようにピペッティングする。その後、常温で１時間反応させる。
５．ａｌｂ−ＭＢ−ＴＡＣＥ剤形を形成するために、パミレイ（Ｐａｍｉｒａｙ）に溶けているＤＯＸ−ＨＳＡ ＮＰｓ−ＭＢを一定量のｅ−ｔｕｂｅあるいはガラスバイアルに入れ、リピオドールも、比率に合わせて同じ１．５ｍｌのプラスチックチューブあるいはガラスバイアルに入れてボルテックスする。肉眼で相分離なしに十分に混ざったことを確認しつつ、１５〜２０秒間ボルテックスする。（例えば、ＤＯＸ−ＨＳＡ ＮＰｓ−ＭＢｓの入ったパミレイ：リピオドール＝１：２ ｖ／ｖ）。
（７．２．特徴分析）
前記ａｌｂ−ＭＢ−ＴＡＣＥ剤形に対するＤＩＣイメージおよび模式図を図１１に示す。また、全５回以上ＤＩＣイメージを得た後、顕微鏡プログラムで各倍率に対するスケールバーを利用して剤形の平均のサイズを得た結果、１７．６９±６．８３μｍの平均直径を有していた。
［実験例４−疾病動物モデルを利用した肝動脈化学塞栓術による抗癌効果の分析］
前記開発されたａｌｂ−ＭＢ−ＴＡＣＥ剤形エマルジョンの抗癌効果を、動物実験を通じて検証した。動物モデルは、ＶＸ２ ｃａｒｃｉｎｏｍａウサギモデルであって、肝臓に直接癌細胞を移植して成長させながら、肝癌疾病動物モデルを作製評価する。
（４．１実験方法）
ａｌｂ−ＭＢ−ＴＡＣＥ剤形のエマルジョンは、ウサギ１匹当りＤＯＸ ０．５ｍｇ投与を目標として作製された。前記剤形をウサギに注入後、すぐに成人用コンベックスプローブ（中心周波数１．８ＭＨｚ）を利用して、超音波を１５分間加えた。
（４．２実験結果）
動物モデルに対するａｌｂ−ＭＢ−ＴＡＣＥの治療効能評価として、腫瘍容積変化（容積抑制率）の結果を図１２に示す。図１２で、何も処理しない対照群は、初期に比べて腫瘍体積が約３８０％増加したことが分かる。これと比較して、ａｌｂ−ＭＢ−ＴＡＣＥの初期対比腫瘍体積の増加は、約２０％未満であって、ほとんど起こらないことが分かる。

Claims (15)

  1. ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル（ｅｔｈｉｏｄｉｚｅｄ ｏｉｌ）と；
    陽電荷を有する水溶性抗癌剤を担持するヒト血清アルブミンナノ粒子と；
    を含み、前記陽電荷を有する水溶性抗癌剤を担持するヒト血清アルブミンナノ粒子が、ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステルに対して混合されてヨードケシ油脂肪酸エチルエステルに含まれた混合物の形態をとり、
    前記ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル対前記ヒト血清アルブミンナノ粒子の体積比が、３：１〜４：１である、肝動脈塞栓術用組成物。
  2. ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル（ｅｔｈｉｏｄｉｚｅｄ ｏｉｌ）と；
    マイクロバブルと；
    陽電荷を有する水溶性抗癌剤を担持するヒト血清アルブミンナノ粒子
    を含み、前記ヒト血清アルブミンナノ粒子が前記マイクロバブルの表面に結合され；
    前記マイクロバブルにおいて、前記陽電荷を有する水溶性抗癌剤を担持するヒト血清アルブミンナノ粒子が前記ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステルとの混合物の形態で前記マイクロバブルの表面に結合し、
    前記マイクロバブルが前記ヨードケシ油脂肪酸エチルエステルに含まれた混合物の形態をとり、
    前記ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル対前記ヒト血清アルブミンナノ粒子の体積比が、３：１〜４：１である、
    肝動脈塞栓術用組成物。
  3. 前記陽電荷を有する水溶性抗癌剤は、マイトマイシン、シスプラチン、アドリアマイシン、およびゲムシタビンよりなる群から選ばれる一つ以上である、請求項１又は２に記載の肝動脈塞栓術用組成物。
  4. 前記ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル対ナノ粒子とマイクロバブルの体積比が、２：１である、請求項２に記載の肝動脈塞栓術用組成物。
  5. 前記陽電荷を有する水溶性抗癌剤の濃度は、１〜２０ｍｇ／ｍＬである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の肝動脈塞栓術用組成物。
  6. 前記ナノ粒子の濃度は、１０〜５０ｍｇ／ｍＬである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の肝動脈塞栓術用組成物。
  7. 肝動脈塞栓術用組成物の製造方法であって、
    陽電荷を有する水溶性抗癌剤を担持するヒト血清アルブミンナノ粒子をコンピュータ断層造影剤およびＸ線造影剤に分散させる段階と；
    前記分散したナノ粒子とヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル（ｅｔｈｉｏｄｉｚｅｄ ｏｉｌ）を混合する段階と；
    を含み、
    前記水溶性抗癌剤を担持するヒト血清アルブミンナノ粒子が、前記ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステルに対して混合されてヨードケシ油脂肪酸エチルエステルに含まれた混合物の形態をとり、
    前記ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル対前記ヒト血清アルブミンナノ粒子の体積比が、３：１〜４：１である、
    肝動脈塞栓術用組成物の製造方法。
  8. 肝動脈塞栓術用組成物の製造方法であって、
    陽電荷を有する水溶性抗癌剤を担持するヒト血清アルブミンナノ粒子をコンピュータ断層造影剤およびＸ線造影剤に分散させる段階と；
    前記分散したナノ粒子をマイクロバブルと混合する段階と；
    前記ナノ粒子とマイクロバブルの混合物を、ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル（ｅｔｈｉｏｄｉｚｅｄ ｏｉｌ）と混合する段階と；
    を含み、
    前記マイクロバブルにおいて、前記陽電荷を有する水溶性抗癌剤を担持するヒト血清アルブミンナノ粒子が前記ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステルとの混合物の形態で前記マイクロバブルの表面に結合し、
    前記マイクロバブルが前記ヨードケシ油脂肪酸エチルエステルに含まれた混合物の形態をとり、
    前記ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル対前記ヒト血清アルブミンナノ粒子の体積比が、３：１〜４：１である、
    肝動脈塞栓術用組成物の製造方法。
  9. コンピュータ断層造影剤およびＸ線造影剤は、イオパミドール（Ｉｏｐａｍｉｄｏｌ）およびパミレイ（Ｐａｍｉｒａｙ）（登録商標）よりなる群から選ばれる一つ以上である、請求項７または８に記載の肝動脈塞栓術用組成物の製造方法。
  10. 前記陽電荷を有する水溶性抗癌剤は、マイトマイシン、シスプラチン、アドリアマイシン、およびゲムシタビンよりなる群から選ばれる一つ以上である、請求項７または８に記載の肝動脈塞栓術用組成物の製造方法。
  11. 前記ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル対ナノ粒子とマイクロバブルの体積比は、２：１である、請求項８に記載の肝動脈塞栓術用組成物の製造方法。
  12. 前記ナノ粒子は、下記段階を含む方法により製造される、請求項７または８に記載の肝動脈塞栓術用組成物の製造方法：
    ヒト血清アルブミンと陽電荷を有する水溶性抗癌剤の混合物を製造する段階と；
    前記製造した混合物の酸度（ｐＨ）を調節する段階と；
    前記酸度を調節した混合物を脱溶媒和物質で滴定する段階と；
    前記滴定した混合物に粒子安定化物質を添加する段階と；
    前記粒子安定化物質を添加した後、脱溶媒和物質を気化させる段階と；
    前記気化した混合物を遠心分離する段階。
  13. 前記ナノ粒子は、下記段階を含む方法により製造される、請求項７または８に記載の肝動脈塞栓術用組成物の製造方法：
    ヒト血清アルブミンを蒸留水に溶解させる段階と；
    前記溶解させた物質の酸度を調節する段階と；
    前記酸度を調節した物質を脱溶媒和物質で滴定する段階と；
    前記脱溶媒和物質で滴定した混合物に粒子安定化物質を添加する段階と；
    前記脱溶媒和物質を気化させる段階と；
    前記気化した混合物を遠心分離する段階と；
    前記遠心分離した物質に陽電荷を有する水溶性抗癌剤を添加して反応させる段階。
  14. 前記ナノ粒子は、下記段階を含む方法により製造される、請求項７または８に記載の肝動脈塞栓術用組成物の製造方法：
    ヒト血清アルブミンを蒸留水に溶解させる段階と；
    前記溶解させた物質の酸度を調節する段階と；
    前記酸度を調節した物質に２−イミノチアゾリジンを添加する段階と；
    前記２−イミノチアゾリジンを添加する段階後、遠心分離する段階と；
    前記遠心分離後、陽電荷を有する水溶性抗癌剤を添加する段階と；
    前記陽電荷を有する水溶性抗癌剤の添加後、脱溶媒和物質で滴定する段階。
  15. 前記ナノ粒子の製造方法は、真空状態で凍結乾燥させてパウダー剤形のナノ粒子を形成する段階をさらに含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の肝動脈塞栓術用組成物の製造方法。
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