CN102170853B

CN102170853B - 制备稳定的单层脂质体混悬液的组合物和方法

Info

Publication number: CN102170853B
Application number: CN200980139560.2A
Authority: CN
Inventors: P·M·安德森
Original assignee: Access Business Group International LLC
Current assignee: Access Business Group International LLC
Priority date: 2008-10-03
Filing date: 2009-09-22
Publication date: 2016-07-06
Anticipated expiration: 2029-09-22
Also published as: WO2010039490A2; KR20110073495A; TW201018498A; HK1160385A1; CN102170853A; KR101705912B1; WO2010039490A3; US20100086573A1; JP5706326B2; US9445975B2; TWI537009B; JP2012504620A

Abstract

描述用于制备和使用稳定的透明至半透明单层脂质体混悬液的组合物和方法。混悬液包括具有大量平均粒度为约50nm-约290nm的均匀单层脂质体颗粒的脂质体制剂。使颗粒悬浮于密度为约0.95g/cc-约1.25g/cc的占脂质体混悬液重量约30％-约75％的外相组合物中。脂质体制剂由包括油溶性组合物和水溶性组合物的脂质体水溶液形成。油溶性组合物的浓度为约5％-约33％脂质体溶液重量，水溶性组合物的浓度为约67％-约95％脂质体溶液重量。

Description

制备稳定的单层脂质体混悬液的组合物和方法

本发明总体涉及用于制备包含或不包含活性剂的稳定、透明至半透明单层脂质体混悬液的组合物和方法，用于美容、治疗或诊断用途。

背景

脂质体是闭合式、通常为球形的小泡，具有由磷脂双层组成的膜，能够将水溶性、亲水分子包入其水性核心内并将油溶性、疏水分子埋入双层的疏水区。脂质体通常是小颗粒，约25nm-1000nm之间，由多种磷脂组成，包括具有混合脂链的天然衍生的磷脂，如蛋磷脂酰乙醇胺，或者纯组分如DOPE(dioleolylphosphatidylethanolamine)。通过提供使活性化合物沉积入皮肤固有层的载体机制，脂质体广泛用于局部药物制剂。应用该技术的优点包括控制释放、选择性递送、提高生物利用度和稳定性，和增加所需活性剂的吸收。此外，脂质体对皮肤具有强大的亲和力和相容性，因为其与内部皮肤细胞周围的细胞外脂类的化学相似性。脂质体的脂双层可与其它双层如细胞膜融合，从而递送脂质体内容物。

脂质体的商品化发展受稳定性、澄清度差和贮存期短的困扰。脂质体小泡容易融合一起或凝聚，特别是当它们长时间暴露于表面活性剂、溶剂、不良的pH条件、提高的温度，或甚至水时。

概述

本文描述用于制备稳定的透明至半透明脂质体混悬液的组合物和方法。本发明的前提是发现可使脂质体组分的具体组合分散在外相组合物中，以便脂质体混悬液在包含或不包含活性剂的情况下在各种提高或降低的温度下保持具有稳定性的均匀大小颗粒的单峰分布至多一年或以上。具体来讲，通过减小分散的脂质体颗粒分布的平均直径，使分散的脂质体颗粒与外相组合物之间的密度差最小，增加外相组合物的粘度，在小泡的双层膜中建立刚度，可提高脂质体混悬液的稳定性、澄清度和贮存期，不需要牺牲脂质体颗粒的结构完整性或生物活性。

一方面，稳定的单层脂质体混悬液包括悬浮于外相组合物中的脂质体制剂，在21℃(摄氏度)和10sec^-1剪切速率下密度为约0.95g/cc-约1.25g/cc，粘度为约2.5cP(厘泊)-约40,000cP。外相组合物的量占脂质体混悬液重量约30％-约75％。脂质体混悬液的屈光指数为约1.30-约1.45，在约4℃-约50℃温度下纯净形式颗粒均匀分布稳定至少30天，或者在21℃稳定至少180天，或者两者均可。脂质体混悬液包括大量平均粒度为约50nm-约290nm的单层脂质体颗粒。脂质体制剂用脂质体水溶液形成，包括油溶性组合物和水溶性组合物。油溶性组合物的浓度为约5％-约33％脂质体溶液重量，水溶性组合物的浓度为约67％-约95％脂质体溶液重量。油溶性组合物包含偶合剂、至少一种磷脂、至少一种刚度增强剂和抗氧化剂。

在另一个实施方案中，脂质体制剂用油溶性组合物形成，包括一种或多种卵磷脂制剂、丁二醇、神经酰胺IIIB、β-谷甾醇和生育酚。在此实施方案中，脂质体混悬液包括浓度为约35％-约75％脂质体混悬液的甘油。

另一方面，制备稳定的单层脂质体混悬液的方法包括：(a)制备含有偶合剂、至少一种磷脂、刚度增强剂和抗氧化剂的油溶性组合物；(b)制备水溶性组合物；(c)将水溶性组合物与油溶性组合物合并以形成多层、多泡脂质体制剂；(d)将多层、多泡脂质体制剂转化为单层脂质体制剂；和(e)将单层脂质体制剂加入在21℃和10sec^-1剪切速率下密度为约0.95g/cc-约1.25g/cc和粘度为约2.5cP-约40,000cP的外相组合物内以形成脂质体混悬液，该混悬液包含大量各自平均粒度为约50nm-约290nm的单层脂质体颗粒，其中脂质体混悬液的屈光指数为1.30-1.45，在约4℃-约50℃以纯净形式颗粒均匀分布保持其稳定性至少30天，或者在21℃保持至少180天，或两者均可。

又一方面，制备美容制剂的方法包括将本发明的脂质体混悬液与适合美容的基体合并以形成采用霜剂、洗剂、凝胶、浆液、补剂、乳液、糊剂或喷雾剂形式的美容制剂。

本发明脂质体混悬液的特征在于提高的稳定性和生物活性谱，可用于多种美容、治疗或诊断应用中的任何一种，其中使用脂质体。

此外，公开的脂质体混悬液的半透明性提供在美学观点上超过现有技术使用的较不透明制剂的优越外观。

附图简述

图1A是用Zeiss-902透射式电子显微镜(TEM)放大30,000×采集的表2实施方案的脂质体混悬液的电子显微照片；图1B和1C是放大180,000×的图1A脂质体混悬液的TEM显微照片。在图1B和1C中用箭头标识例示性脂双层。

图2是在19个月贮存期后图1A-1C描述的脂质体制剂的另一个实施方案的粒度分析。

图3是用NanotracN150SubmicronParticleSizeAnalyzer通过动态激光散射在环境温度条件下，在2.5个月贮存期后，表4实施方案脂质体混悬液的粒度分析。

图4是在环境温度条件下，在2.5个月贮存期后，表4实施方案脂质体混悬液的粒度分析。

图5是在环境温度条件下，在19个月贮存期后，表4实施方案脂质体制剂的粒度分析。

图6是在环境温度条件下，在2.5个月贮存期后，表5脂质体混悬液的粒度分析。

图7是在环境温度条件下，在2.5个月贮存期后，表6脂质体混悬液的粒度分析。

图8是用Zeiss-902电子显微镜放大11,430×采集的脂质体霜剂TEM显微照片。用箭头标识脂质体。

图9是用Zeiss-902电子显微镜放大30,000×采集的脂质体霜剂TEM显微照片。用箭头标识脂质体。

详述

为了清楚和连贯地理解说明书和权利要求，提供以下定义。

术语“脂质体溶液”指在悬浮于外相组合物之前脂质体颗粒或小泡在浓缩、水溶液中的制剂。

术语“脂质体制剂”指脂质体颗粒或小泡的制剂。脂质体制剂可以是包含脂质体颗粒在水溶液中的脂质体溶液(例如在悬浮于外相组合物中之前)或者可以是用脂质体溶液制备的冻干(冷冻干燥)脂质体颗粒或小泡的制剂。

术语“脂质体溶液”指在冻干或悬浮于外相组合物中之前包含脂质体颗粒或小泡在水溶液中的脂质体制剂。

术语“脂质体混悬液”指悬浮于外相组合物中的脂质体制剂。

术语“偶合剂”指适合使不同极性的不混溶相溶解和完成和保留脂质体制剂或脂质体混悬液稳定性的连接介质。

术语“刚度增强剂”指当包埋在脂双层中时发挥减少脂肪酸链的移动或流动并促进其包装作用的神经鞘脂、神经酰胺或甾醇。

除非另外说明，在本公开引用的所有比例和百分数都是指重量。而且，在本专利各处引用的所有文献、专利和公开申请的内容通过引用由此结合到本文中。

一方面，本发明提供包括脂质体制剂在内的稳定的半透明单层脂质体混悬液，包含大量平均粒度为约50-约290nm的单层脂质体颗粒，其中使脂质体制剂悬浮于包含约30％-约75％脂质体混悬液重量的外相组合物中。外相组合物在21℃和10sec^-1剪切速率下密度为约0.95g/cc-约1.25g/cc，粘度为约2.5cP-约40,000cP。脂质体混悬液的屈光指数为约1.30-约1.45，在约4℃-约50℃温度下以纯净形式稳定至少30天，或在21℃稳定至少180天，或者两者均可。

脂质体制剂和混悬液

脂质体制剂包括在脂质体水溶液中的大量脂质体颗粒或小泡或者来自脂质体溶液的大量冻干(冷冻干燥)脂质体颗粒。在脂质体制剂中的脂质体颗粒或小泡可以是多层、多泡形式或者它们可以是基本单层形式。将脂质体制剂加入外相组合物中以形成本发明的脂质体混悬液，如下文进一步描述。在脂质体制剂中的脂质体颗粒用由油溶性组合物和水溶性组合物组成的脂质体水溶液形成。

油溶性组合物

油溶性组合物包括偶合剂、磷脂或磷脂混合物、刚度增强剂和抗氧化剂。在本发明脂质体混悬液中的油溶性组合物将通常包含大量正常存在于天然细胞膜中的脂类，包括磷脂、神经酰胺、神经鞘脂、胆甾醇和甘油三酯，或者其它脂类如来自植物的植物甾醇。油溶性组合物的浓度为约5％-约33％脂质体水溶液重量，水溶性组合物的浓度为约67％-约95％脂质体水溶液重量。

偶合剂

在本发明脂质体混悬液中的油溶性组合物将包含至少一种偶合剂。偶合剂包括适合使不同极性的不混溶相溶解(例如暂时或优先地)和保持脂质体制剂或脂质体混悬液稳定性的连接介质。偶合剂可具有在23℃介电常数为约10.5或更大的特征，将其加入本发明的脂质体制剂或混悬液中以促进优先或“暂时”溶解和完成和保持脂质体稳定性。偶合剂例如乙二醇可以既包括烃也包括羟基部份，可将其分别用于例如同时溶解疏水或亲水化合物。

偶合剂允许在较高温度下优先溶解油相组分，包括磷脂和刚度增强剂，从而在脂质体溶液中形成脂质体结构的过程中偶合剂移行入双层膜组分内，接着在冷却后，由于其亲水性而在环境温度条件下移行返回水相内。因此，偶合剂可具有“暂时增溶剂”的特征，在高温下能够溶解油溶性组分包括脂类和非极性物质，在较低、环境温度下能够溶解水溶性组分包括极性物质(和在这些低温条件下不能溶解脂类或能力下降)。因此，偶合剂具有温度依赖性“变化的”或暂时的功能，以促进双层膜形成，包括产生粗制的多层、多泡脂质体结构的液化形式的温度相组合，所述多层结构在高剪切条件下可有效地加工成单层结构。低温避免削弱活性物质的生物活性和减小例如高剪切/高压设备伴随的过热的作用。

与偶合剂相反，可溶解双类脂膜的其它油溶性增溶剂，如乙醇，可削弱脂质体稳定性，当加工脂质体溶液通过高压装置包括微流化装置时可产生爆炸危害。而且，在高于约3％的浓度，乙醇可破坏胶体系统的密度平衡，降低外相的粘度，以致对胶体稳定性产生负面影响和/或导致胶凝剂结构塌陷。

申请人已经意外地发现掺入偶合剂不仅促进油溶性组分溶解，还可发挥稳定性增强剂的功能，无论是否包含油溶性活性物质。具体来讲，申请人已发现缺乏偶合剂、但在其它组成方面相同的脂质体混悬液没有实现合适的稳定性。照这样，申请人相信在本发明的脂质体混悬液中使用偶合剂在稳定性方面不构成公认的、结果有效的变量。合适的偶合剂包括丁二醇、丙二醇、己二醇、聚乙二醇、硅酮二醇，如PEG-12二甲基硅油，及其类似物、衍生物和混合物。用于本发明的偶合剂总量可占脂质体混悬液重量约1％-约10％，更优选占脂质体混悬液重量约3％-约8％。通常，偶合剂的浓度应等于或超过磷脂在脂质体溶液中的总浓度。使用10-15％的偶合剂浓度可允许活性成分的溶解稍大，特别是当使用较高磷脂浓度(如1.5×)时。但是，据信高于10％的偶合剂浓度可导致相转化，其中油相存在外连续区，从而妨碍脂质体微囊化。在这些条件下，水被类脂溶液以符合油包水乳液的形式排斥。这可在显微镜下看到，或者可通过由于水合氢离子屏蔽而不能精确测量pH而推断。或者，可使用浓度超过磷脂浓度的偶合剂，此时不仅需要溶解油相组分，还需要溶解水溶性组合物中的活性物质。

磷脂

本发明脂质体混悬液中的油溶性组合物包含至少一种磷脂或磷脂混合物。例示性磷脂包括含有饱和和/或不饱和脂肪酰基部份的甘油磷脂，包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酸、N-酰基磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂和心磷脂；鞘磷脂；浆磷脂；其氢化、部份氢化或未氢化衍生物；其类似物；及其混合物。

当通过磷脂酶A从磷脂(如溶血卵磷脂)上裂解酰基时获得溶血磷脂。心磷脂如1，3-双磷脂酰甘油是由2个磷脂酸通过甘油连接组成的磷脂。鞘磷脂是一类神经鞘脂，通常由磷酰胆碱和神经酰胺组成。浆磷脂是醚类脂，其中甘油的第一个碳位具有醚连接烯烃，第二个碳具有典型的酯连接脂肪酸，第三个碳通常具有磷脂头基如胆碱或乙醇胺。

例示性磷脂混合物包括卵磷脂，包括粗卵磷脂，其已被脱油、分馏、喷干、乙酰化、水解、羟基化、氢化，和/或富集磷酯酰胆碱、磷脂酰肌醇或其组合。卵磷脂和卵磷脂混合物市售获得。在一些实施方案中，可使用天然来源(大豆/蛋)的卵磷脂，如来自大豆的磷脂酰胆碱富集制剂。

市售获得的大豆/蛋卵磷脂制剂和磷脂浓缩物，包括以下列商品名销售的制剂和浓缩物：Phospholipon90G，Phospholipon90H，Phospholipon85G，Phospholipon80H，Phospholipon80，Phosal50PG，Phosal50SA，Phosal53MCT，和Phosal75SA，购自AmericanLecithinCompany，OxfordConn.；LipoidS75，LipoidS100，LipoidSPC，和LipoidSL80，购自LipoidGmbH，LudwigshafenGermany；Epikuron125F，Epikuron135F，Epikuron130P，Epikuron130G，Epikuron100H，Epikuron145V，Epikuron170，Epikuron200SH，Epikuron200，Emulmetik950，Emulmetik900和Emulmetik300，EmulfluidF30(Emulfluid，LipotinNebr.)，Lipotin100，LipotinSB，Lipotin100J，LipotinH，LipotinNA，LipotinAH，和Lipopur，购自DegussaTexturantSystemsUKLtd.；TerradrillV408和TerradrillV1075，购自Cognis；Yellowthin100，Yellowthin200，LecistarSun100，和YellowthinSun200，购自Sternchemie；LecinolS-10(氢化卵磷脂)，购自BarnettIndustries；LipoH(由20％磷脂酰胆碱组成的氢化大豆卵磷脂)，购自LucasMeyerCosmetics，SouthPlainfield，NJ；和LanchemPE-130K，购自LambentTechnologies，Gurnee，III。

在冻干或加入外相组合物之前，用于本发明的磷脂总量可占脂质体水溶液重量约1％-约10％，更优选占脂质体水溶液重量约3％-约8％。此外，脂质体水溶液将优选包含约3∶1-9∶1的水∶类脂比。

在一个实施方案中，油溶性组合物包括包含至少60％混合物重量、至少70％重量、至少80％重量、至少85％重量或至少90％混合物重量的磷脂酰胆碱的磷脂制剂或混合物。在另一个实施方案中，油溶性组合物包括含有磷脂酰胆碱浓度为约80％-约95％磷脂混合物重量的磷脂混合物。另外，上述磷脂混合物可包含约1％-约10％脂质体混悬液重量，优选约3％-约8％脂质体混悬液重量。据信使用高于15％浓度的磷脂将导致相转化，产生油包水乳液而不是包囊脂质体。

刚度增强剂

本发明脂质体混悬液中的油溶性组合物将包含至少一种刚度增强剂。刚度增强剂包括至少一种神经鞘脂、神经酰胺、甾醇，或其组合，当包埋在脂双层中时其发挥作用以减少脂肪酸链的移动或流动性和促进脂双层的包装。增加的刚度可减少小泡的破裂和渗漏，可改变膜的zeta电位或电荷以抑制颗粒之间吸引。据信刚度增强剂帮助稳定脂质体颗粒中的电荷或zeta电位。

神经鞘脂代表参与维持皮肤屏障功能的关键表皮脂类。神经鞘脂，如鞘氨醇、二氢鞘氨醇、鞘磷脂和植物鞘氨醇，通常包含长鞘氨基醇碱作为中央基团或“主链”，包括酰胺连接的长链脂肪酸和头基。有几百种已知类别的具有不同头基(如磷酸胆碱、葡萄糖、半乳糖、多糖)和具有不同脂肪酸和鞘氨基醇碱的神经鞘脂。植物鞘氨醇是神经酰胺前体，集中在健康角质层内，由皮肤中的酶转化为神经鞘脂。

神经酰胺构成神经鞘脂家族，非常难溶解和难配制。外源性给予的神经酰胺必须能够渗透角质层以到达渗透性屏障的类脂片层。据信干性皮肤的原因之一是细胞间类脂片层内的神经酰胺量减少。因此用本发明的脂质体混悬液通过局部给予成功地代替这些衰竭的类脂是理想的。本发明的脂质体混悬液提供递送神经酰胺的有用方法。

神经酰胺可以是天然存在的神经酰胺、合成神经酰胺、糖基神经酰胺，或其衍生物。天然存在的神经酰胺可来自动物、植物或微生物。皮肤中的神经酰胺主要由6种层析分离的流分或家族组成，分为I、II、III、IV、V、Via和VIb(或1、2、3、4、5、6a和6b)型。合成(或杂合)神经酰胺是神经酰胺样神经鞘脂，其中N-酰基与天然存在的神经酰胺中发现的不同。神经酰胺可通过例如饱和度和链长相互区分。神经酰胺衍生物包括例如用一种或多种饱和或不饱和脂肪酸衍生的那些衍生物，或者通过磷酸化或硫酸化改性的那些衍生物。

3型神经酰胺构成不同分子的混合物，所述分子具有以通用名N-乙酰植物鞘氨醇为特征的植物鞘氨醇主链，其中酰基是饱和的，具有14-30个碳的链长。在一个实施方案中，神经酰胺可以是用单不饱和脂肪酸衍生的神经酰胺或植物鞘氨醇，如N-油酰基植物鞘氨醇(神经酰胺3B)。其它神经酰胺公开于授予Lambers等的美国专利号5,693,677和6,001,375，其公开通过引用结合到本文中。

用于本发明的神经酰胺总量可占脂质体混悬液重量约0.01％-约1.00％，更优选占脂质体混悬液重量约0.025％-约0.20％。

用于本发明的甾醇代表其它类别的刚度增强剂，包括胆甾醇、植物甾醇和有机酸衍生物，和/或其盐形式。植物甾醇是携带甾醇骨架的植物衍生的类脂。植物甾醇可同步化皮肤表皮细胞的代谢循环，可提高具有双层膜结构的隔膜在脂质体或其它膜结构中的强度。

本发明可利用任何一种植物甾醇类别的成员，包括4-去甲基甾醇、4-单甲基甾醇和4，4-二甲基甾醇。例示性植物甾醇包括谷甾醇、β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、chalinosterol、穿贝海绵甾醇、菜籽甾醇、α-菠菜甾醇、Δ5-燕麦甾醇、羽扇豆醇、胡萝卜苷、链甾醇和多孔甾醇。

甾醇的非限制性实例另外包括胆甾醇，有机酸衍生的胆甾醇如半琥珀酸胆甾醇，植物甾醇，没药醇，甾体类激素如氢化可的松，以及甾醇脂族酸酯如硫酸胆甾醇、丁酸胆甾醇、异丁酸胆甾醇、棕榈酸胆甾醇、硬脂酸胆甾醇、乙酸羊毛甾醇、棕榈酸麦角甾醇和正丁酸植物甾醇；和糖酯的甾醇酯，如葡糖苷酸胆甾醇、葡糖苷酸羊毛甾醇、7-脱氢葡糖苷酸胆甾醇、葡糖苷酸麦角甾醇和葡糖酸胆甾醇。

用于本发明的甾醇总量可占脂质体混悬液重量约0.01％-约1.00％，更优选占脂质体混悬液重量约0.025％-约0.20％。

在一个实施方案中，脂质体混悬液包含至少2种刚度增强剂，包括至少一种植物甾醇和神经酰胺或鞘氨醇。在优选实施方案中，脂质体混悬液包含神经酰胺IIIB和β-谷甾醇。

用于本发明的刚度增强剂总量可占脂质体混悬液重量约0.02％-约1.00％，更优选占脂质体混悬液重量约0.05％-约0.40％。

申请人已经意外地发现使用刚度增强剂与脂质体稳定性之间的关系。更具体来讲，申请人已发现脂质体的稳定性取决于掺入相当窄浓度范围的刚度增强剂。具体来讲，发现掺入超过1.0％水平或与磷脂的重量比超过1∶4的刚度增强剂可使微结构的形态变为层片，与球形脂质体小泡相反。例如，放大100-400×的显微镜检查已证实使用大于25％磷脂水平的刚度增强剂时产生层片，老化后可进一步转化为可用肉眼观察的大针状结构。

抗氧化剂

根据本发明，将至少一种抗氧化剂包埋在脂质体中。可将抗氧化剂例如包埋在脂质体的磷脂双层中，在脂质体的含水中心内，或两者均可。抗氧化剂可发挥保护脂质体免受因脂质体含水中心或脂质体外活性氧中间体(ROS)引起的氧化损伤或降解的功能。事实上，在细胞中抗氧化剂的一种主要作用是防止因ROS作用引起的损伤。活性氧中间体包括过氧化氢(H₂O₂)、超氧化物负离子(O₂ ^-)，和游离基如羟基(OH^-)。这些分子不稳定和高度反应性，可通过化学链式反应如脂质过氧化损伤细胞。

可用多种不同方式将抗氧化剂掺入本发明的脂质体内。在一个实施例中，可将脂溶性抗氧化剂直接埋入脂质体的脂双层内。在另一个实施例中，可将水溶性抗氧化剂包在脂质体的含水中心内。在又一个实施例中，可将脂溶性抗氧化剂埋在脂双层中和将水溶性抗氧化剂包在脂双层的含水中心内。

在另一个实施例中，抗氧化剂可以是单态氧清除剂。在另一个实施例中，抗氧化剂可以既是水溶性也是单态氧清除剂，或者既是脂溶性也是单态氧清除剂。在又一个实施例中，可将不止一种抗氧化剂埋在本发明的脂质体中。

生育酚(即维生素E)和抗坏血酸(即维生素C)是可包埋在本发明脂质体中的抗氧化剂实例。合适的生育酚抗氧化剂包括生育酚；母育酚的单甲基、二甲基或三乙基衍生物，包括但不限于α生育酚、β生育酚、γ生育酚、δ生育酚、ε生育酚、ζ生育酚和η生育酚；生育酚酯，及其衍生物，包括乙酸生育酚酯、琥珀酸生育酚酯、苯甲酸生育酚酯、丙酸生育酚酯、山梨酸生育酚酯、油酸生育酚酯、乳清酸生育酚酯、亚油酸生育酚酯、烟酸生育酚酯和2-乙基-己酸酯。

除了其抗氧化剂功能之外，另外已知抗坏血酸(维生素C)及其衍生物可促进胶原合成。用于本发明的抗坏血酸衍生物包括所有对映体，无论是单种或组合。优选提供左旋形式的抗坏血酸。此外，抗坏血酸及其衍生物可采用水溶性或油溶性形式。

维生素C(抗坏血酸)衍生物的非除外性实例包括例如L-抗坏血酸的烷基酯，其中烷基段具有8-20个碳原子。关于酯，它们可选自抗坏血酸的脂肪酸单-、二-、三-或四-酯。例如，此类酯包括但不限于棕榈酸抗坏血酸酯、月桂酸抗坏血酸酯、肉豆蔻酸抗坏血酸酯、硬脂酸抗坏血酸酯、二棕榈酸抗坏血酸酯、二月桂酸抗坏血酸酯、二肉豆蔻酸抗坏血酸酯、二硬脂酸抗坏血酸酯、三棕榈酸抗坏血酸酯、三月桂酸抗坏血酸酯、三肉豆蔻酸抗坏血酸酯、三硬脂酸抗坏血酸酯、抗坏血酸四己基癸基酯、四月桂酸抗坏血酸酯、四肉豆蔻酸抗坏血酸酯、四硬脂酸抗坏血酸酯、L-抗坏血酸棕榈酸酯、L-抗坏血酸异棕榈酸酯、L-抗坏血酸二棕榈酸酯、L-抗坏血酸异硬脂酸酯、L-抗坏血酸二硬脂酸酯、L-抗坏血酸二异硬脂酸酯、L-抗坏血酸肉豆蔻酸酯、L-抗坏血酸异肉豆蔻酸酯、L-抗坏血酸2-乙基己酸酯、L-抗坏血酸二-2-乙基己酸酯、L-抗坏血酸油酸酯和L-抗坏血酸二油酸酯、抗坏血酸四己基癸基酯；L-抗坏血酸的磷酸酯如L-抗坏血酸-2-磷酸酯和L-抗坏血酸-3-磷酸酯；L-抗坏血酸的硫酸酯如L-抗坏血酸-2-硫酸酯和L-抗坏血酸-3-硫酸酯；其与碱土金属如钙和镁的盐。

关于盐，它们可选自磷酸盐和硫酸盐，优选磷酸盐。抗坏血酸磷酸盐通常选自L-抗坏血酸3-磷酸盐、L-抗坏血酸2-磷酸盐、L-抗坏血酸3-焦磷酸盐和双(L-抗坏血酸3，3-)磷酸盐。优选抗坏血酸磷酸盐是镁或钠抗坏血酸磷酸盐；更优选抗坏血酸磷酸镁。同样，抗坏血酸硫酸盐通常选自L-抗坏血酸3-硫酸盐、L-抗坏血酸2-硫酸盐、L-抗坏血酸3-焦硫酸盐和双(L-抗坏血酸3，3-)硫酸盐。

其它抗氧化剂包括抗坏血酸四己基癸基酯、丁羟甲苯(BHT)、丁羟茴醚、龙胆酸甲酯、L-肌肽、叔丁基氢醌(TBHQ)、谷胱甘肽，包括其衍生物、组合和混合物。在一个实施例中，鉴于水溶性L-肌肽能够保护脂质体免受经过其含水中心的氧化损伤，可将其掺入脂质体的含水中心作为抗氧化剂使用。

用于本发明的抗氧化剂总量可占脂质体混悬液重量约0.01％-约1.00％，更优选占脂质体混悬液重量约0.025％-约0.50％。

水溶性组合物

水溶性组合物将主要由水组成，包含或不包含负载的活性(水溶性)剂，这在下文进一步描述。通常，水溶性组合物将占脂质体混悬液重量约10％-约65％或占脂质体制剂重量约67％-约95％。

外相组合物

脂质体混悬液中的脂质体颗粒被包含水溶液的外组合物包围，包括一种或多种粘度促进剂，共同有效地促使外相组合物在21℃和10sec^-1剪切速率下具备约0.95g/cc-约1.25g/cc的密度和/或通常为约2.5cP-约40,000cP的粘度。一种或多种粘度促进剂可包括一种或多种增稠剂、胶凝剂，或两者均有。在优选实施方案中外相组合物在21℃和10sec^-1剪切速率下具有粘度为约800cP-20,000cP。或者，当使用更高胶凝剂浓度时，在21℃和10sec^-1剪切速率下外相粘度可上升至约60,000-80,000cP，但澄清度下降。

外相组合物通常包含接近与分散其中的脂质体颗粒匹配的密度，以充分促进脂质体颗粒稳定性和减少脂质体颗粒移行、絮凝或凝聚的量掺入本发明的脂质体混悬液内。

外相组合物包含一种或多种粘度促进剂，包括增稠剂、致密剂、胶凝剂、树胶，及本领域技术人员已知的其它粘度促进剂。可根据经验选择用于本发明的粘度促进剂以增加本文脂质体制剂的粘度和提高稳定性。优选选择这些试剂以保护脂质体混悬液的半透明或透明性。而且，可通过用选择的试剂调节组合物以根据需要对粘度或密度提供比较大的影响。例示性粘度促进剂包括甘油；纤维素，包括羟乙基-、羟丙基-、羟甲基-、羟丙基甲基纤维素，及其衍生物，包括商品名为Natrosol、Methocel和Bermocoll的各种纤维素；光非离子型乳液；和聚山梨酯。例示性胶凝剂和/或增稠剂包括胶基体剂，包括黄原胶，和丙烯酸酯聚合物，包括与聚烯基聚醚或二乙烯二醇交联的丙烯酸高分子量同-和共聚物，商品名为Carbopol，包括Carbopol934、940、941、980、981、1342、1382、2020、2050，和商品名为Simulgel的各种丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸酯共聚物。

外相组合物可具有牛顿或非牛顿流动特征。在一个实施方案中，一种或多种粘度促进剂包括具有牛顿流动特征的水溶液，如甘油。包括甘油在内的牛顿流体的粘度独立于施加于流体的指定转速下的剪切速率。包含牛顿流动特征的外相组合物可具有约500cP-约10,000cP或者约800cP-约2,000cP的粘度。

在另一个实施方案中，一种或多种粘度促进剂可包括浓度为约0.10％-约1.0％的一种或多种试剂，如聚合胶凝剂，提供非牛顿流动特征。非牛顿流体包括例如聚合胶凝剂或增稠剂，表现作为剪切速率函数的比浓粘度。但是，与牛顿流体如甘油相比，聚合胶凝剂可在低浓度提供非牛顿流动特征，可提供受温度影响较小的表观粘度。

可根据剪切和时间依赖性将非牛顿流体的粘度分级。因此，非牛顿流体可以剪切稀化和剪切稠化。而且，表观粘度的下降可以呈时间独立性(假塑性)或时间依赖性(触变性)。在优选非牛顿实施方案中，流体具有Carbopol聚合物的假塑性剪切稀化性特征。

在10sec^-1的相对低剪切速率下，在21℃含有赋予非牛顿流动特征的胶凝剂或增稠剂的外相组合物的粘度可为约500cP-约80,000cP，约800cP-40,000cP，或者约2,000cP-20,000cP。在一个实施方案中，当使用胶凝剂如Carbopol聚合物时，外相组合物在21℃的粘度在0.1sec^-1为约284,000cP，在1sec^-1为约60,000cP，在10sec^-1为约11,200cP，在20sec^-1为约6,852cP。在另一个实施方案中，当使用增稠剂如黄原胶时，外相组合物在21℃的粘度在0.1sec^-1为约110,000cP，在1sec^-1为约18,670cP，在10sec^-1为约2,341cP，在20sec^-1为约1,272cP。

可用合适的粘度计测量粘度，包括BrookfieldSyncho-LectricModelRVTViscometer、HaakeRotoviscoModelRV-12Viscometer或本领域技术人员已知用于根据ASTMD1084-88、ASTMD1824-87、D2196-86及其它与粘度测量有关的ASTM方案在指定转速和低剪切速率下测量牛顿流体的粘度或非牛顿物质的表观粘度的其它合适粘度计(或电流计如TAInstrumentsAR-1000N)。

在形成脂质体混悬液时，可将外相组合物加入含脂质体颗粒的脂质体溶液中，或者可将其加入用脂质体溶液制备的脂质体颗粒冻干(冷冻干燥)制剂中。根据理论上的截留体积数据，脂质体颗粒相对于脂质体混悬液的重量百分数可为约0.96％-约54％重量。

当加入脂质体溶液时，外相组合物的量可占脂质体混悬液重量约30％-约75％，占脂质体混悬液重量约55％-约70％，占脂质体混悬液重量约65％-约70％，或者占脂质体混悬液重量约65％。另外，脂质体溶液与外相组合物的重量比可为约0.002-约0.54。在优选实施方案中，当加入到脂质体溶液时，脂质体混悬液包含约35％-约75％甘油，更优选约50％-约65％甘油。当胶凝剂，包括中和的Carbopol用于外相中时，胶凝剂的水平不应超过约1.0％脂质体混悬液，否则在脂质体混悬液中视觉澄清度/透明度/半透明度可能下降。通常，应在制备24小时内用外相组合物稀释脂质体制剂以减小不稳定性。

脂质体混悬液的屈光指数可为约1.3-约1.45。例如，在外相组合物中含有牛顿流体如甘油的脂质体混悬液的屈光指数可通常为约1.40-约1.45，当使用非牛顿流体用树胶或胶凝剂时可通常为约1.35-约1.40，包括黄原胶混合物的屈光指数为约1.39-约1.40，包含聚合Carbopols的外相组合物为约1.37。

外相组合物可进一步包含一种或多种防腐剂、pH调节剂、和/或水。防腐剂的非限制性实例包括苯氧乙醇、氯苯甘醚、甲基异噻唑啉酮、丙二醇、苄醇、乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丁酯和对羟基苯甲酸异丁酯。商业上合适的防腐剂制剂包括以商品名MicrocareMTC(丙二醇、氯苯甘醚和甲基异噻唑啉酮)和PhenonipXB(苯氧乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸乙酯)销售的那些制剂。例示性pH调节剂包括L-精氨酸和三乙醇胺。

申请人已经意外地发现常规防腐剂，包括螯合剂如EDTA二钠，可对上述脂质体混悬液的稳定性产生负面影响，以及苯甲酸钠和各种酸，包括柠檬酸、山梨酸、苯甲酸和异丙基甲酚，在浓度大于0.01％时可使脂质体小泡破裂。通过在将柠檬酸加入上述脂质体溶液的同时发生视觉不透明性证实双层/小泡破裂的现象(接着胶体系统失去稳定性)。而且，申请人已发现对羟基苯甲酸酯防腐剂因为分配入油相内容易移行至双脂膜，对稳定性产生负面影响。此外，已发现在老化后对羟基苯甲酸酯导致脂质体粒度总体增加。申请人已进一步发现当除去水相组合物中的L-精氨酸时可削弱本发明脂质体混悬液的长期稳定性。

优选用于本发明脂质体混悬液的防腐剂不含EDTA、苯甲酸钠、柠檬酸、山梨酸、苯甲酸和异丙基甲酚。在优选实施方案中，脂质体混悬液还不含对羟基苯甲酸酯类。用于本发明脂质体混悬液的优选防腐剂包括单独的苯氧乙醇、单独的甲基异噻唑啉酮、单独的氯苯甘醚、氯苯甘醚与甲基异噻唑啉酮组合，或者氯苯甘醚与甲基异噻唑啉酮和苯氧乙醇组合。

防腐剂的量可占脂质体混悬液重量约0.01％-约5.00％，约0.01％-约2.00％，或者占脂质体混悬液重量约0.01％-约0.30％。L-精氨酸或乙醇胺的量可为约0.001％-约0.10％，优选约0.001％-约0.010％。

活性剂

本发明的脂质体混悬液可进一步包含一种或多种活性剂(或“活性物质”)包埋入本发明的脂质体颗粒内。活性剂可包括本领域已知用于美容、治疗或诊断用途的任何活性剂。活性物质的性质可以疏水(即油溶性)或亲水(即水溶性)。水溶性活性物质可通过“被动负载”在脂质体制剂加工的过程中包埋。这可通过使亲水活性物质预先溶解在用于干脂水合的缓冲液中完成。然后可通过透析空白缓冲液或者通过使分散体穿过Sephadex^TM凝胶柱除去任何未包埋分子。对于大多数美容和个人护理产品，除去未包埋分子并非关键，因为进行这样的加工需要高成本，并且在它们的常用水平下美容分子无毒性。

与截留在脂质体核心内的亲水性活性物质相反，疏水化合物通常截留在脂双层的疏水区。这种截留类型涉及一种分配形式，其中疏水化合物与类脂一起溶于合适的增溶剂中。例如，如果化合物可溶于丁二醇、乙氧基二醇、乙醇、甲醇、氯仿、甲苯、醚、丙二醇、聚乙二醇包括聚乙二醇200和聚乙二醇300，或者中链甘油三酯中，它可与类脂一起溶于溶剂中。虽然其它溶剂如乙醇和甲醇可用于溶解类脂和油溶性活性物质，应在加入外相组合物之前将其通过提取除去。申请人已发现，例如浓度高于3％的溶剂如乙醇、甲醇、氯仿、甲苯或醚可导致凝胶塌陷，密度平衡破坏，或外相的粘度下降，从而降低脂质体混悬液的稳定性。

例如，可将多种皮肤保湿剂、屏障增强剂、必需脂肪酸和维生素包埋入本发明的脂质体内或与其联合。这些成分通过防止和逆转对其的损伤帮助保湿和进一步支持皮肤的屏障功能。例示性皮肤保湿剂包括甘油、透明质酸钠、泛醇和氨基酸。

屏障增强剂包括各种皮肤类脂，帮助支持和维持健康的皮肤屏障功能。皮肤屏障功能的特征在于皮肤中不可渗透水的屏障，或者更具体来讲是角质层保留水的功能。在角质层细胞间隙中的脂片层结构被视为负责角质层保留水的特性。

有助于维持屏障功能的例示性皮肤类脂包括包含在上述脂质体油相组合物中的上述类脂，包括磷脂、神经鞘脂、胆甾醇和植物甾醇，可用于补充与维持和提高皮肤屏障功能有关的关键性角质层类脂。

其他屏障增强剂包括水解大豆蛋白和大豆蛋白提取物。已知大豆蛋白提取物可抑制酶(即弹性酶)的活性，该酶分解真皮中的弹性蛋白纤维，通常因对UV线、干燥和环境应激的反应而释放入皮肤中。用水解大豆蛋白提取物处理帮助保持皮肤有弹性、紧实、光滑、柔软和湿润。已知水解大豆蛋白可促进胶原和弹性蛋白产生，使皮肤紧实和有弹性。

其它屏障增强剂成分包括必需脂肪酸和维生素。可用于本组合物的此类必需脂肪酸的非限制性实例包括亚油酸、亚麻酸、油酸、铌酸、花生酸、花生四烯酸、椈酸、神经酸、二十碳五烯酸、棕榈酸硬脂酸，及其混合物。本领域技术人员已知的其它必需脂肪酸，如以上来源描述的那些脂肪酸，也可考虑用于本组合物。

必需脂肪酸可来自多种来源。例如，可用疏水植物提取物衍生的一种或多种油将必需脂肪酸提供在脂质体混悬液中。可用于这方面的例示性油包括各种蔬菜或植物油，包括但不限于亚麻籽油、线麻油、棉籽油、南瓜籽油、玉米油、芸苔油、亚麻籽油、迷迭香油、大豆油、麦胚芽油、橄榄油、葡萄籽油、沙棘籽油、琉璃苣油、全缘叶澳洲圣果籽油、月见草油、绣线菊籽油、紫苏籽油、黑葡萄籽油、板栗油、棕榈油、木瓜籽油、甘草、玉米油、柚籽油、奇异果籽油、ligonberryseedoil、西番莲籽油、西瓜籽油、玫瑰籽油、红花油、向日葵油、葵花籽油、棉籽油、花生油、荷荷巴油、芝麻油、罂粟籽油、植物油，其混合物，及其氢化衍生物。

或者或除此以外，本发明的脂质体可负载一种或多种植物提取物、植物成分、DNA修复酶和/或甲基黄嘌呤。例示性提取物可来自各种植物来源，包括迷迭香、积雪草、紫锥菊、姜、熊果、黄褥花果发酵物(AcerolaCherryFermentate)，或来自与上述油相对应的植物。植物提取物、植物成分和植物衍生的油的其它实例描述于美国专利申请公开号2006/0257509和2007/0003536，其公开通过引用明确地结合到本文中。

用于本发明的油或提取物的总量可占脂质体混悬液重量约0.0001％-1％，更优选约0.0003wt％-约0.003wt％。

例示性DNA修复酶包括噬菌体T4嘧啶二聚体-特异性核酸内切酶、滕黄微球菌N-糖基化酶/AP裂解酶、酿酒酵母N-糖基化酶脱嘌呤/脱嘧啶核酸裂解酶、粟酒裂殖酵母UV损伤核酸内切酶(UVDE)、绿藻病毒分离PBCV-1嘧啶二聚体-特异性糖基化酶和组囊藻光裂合酶。其它DNA修复酶描述于美国专利申请公开号2006/0257509，其公开通过引用明确地结合到本文中。DNA修复酶的总量可占脂质体混悬液重量约0.01％-约10％，更优选约0.1％-约3％重量。

例示性维生素包括上文描述的抗氧化剂，以及亲脂维生素，如维生素A，包括游离酸或其衍生物及其前体，包括类视黄醇，如视黄醇、视黄醛和视黄酯，如乙酸视黄酯、丁酸视黄酯、丙酸视黄酯、辛酸视黄酯、月桂酸视黄酯、棕榈酸视黄酯、油酸视黄酯和亚油酸视黄酯；和类胡萝卜素；B-复合维生素，包括B1：硫胺素，B2：核黄素，B6：吡哆醇、泛醇和泛酸；维生素B12及其组合；维生素D，生物素，维生素K，其水溶性衍生物等。

局部给予甲基黄嘌呤如咖啡因，据信可减轻皮肤因暴露于紫外光或日光照射引起的DNA损伤的有害作用。具体来讲，在用紫外光照射后将咖啡因局部给予小鼠皮肤，显示可降低非恶性和恶性皮肤肿瘤的数目(Luetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA99(19)：12455-60，2002)，减少光损伤和促进DNA-损伤角化细胞的消除(Kooetal.，Br.J.Dermatol.，156(5)：957-64，2007)。此外，甲基黄嘌呤如咖啡因据信可发挥“阳光照射不到的”鞣剂的作用，单独或与晒黑刺激物如紫外光或日光照射联合，调节参与黑素生成的生化途径的活性，大概是通过它们抑制环-AMP磷酸二酯酶和增强黑素细胞中黑色素产生的能力。

用于本发明的例示性甲基黄嘌呤包括咖啡因(1，3，7-三甲基黄嘌呤)、茶碱(1，3-二甲基黄嘌呤)、氨茶碱、可可碱(3，7-二甲基黄嘌呤)、副黄嘌呤、异丁基甲基黄嘌呤、丁基甲基黄嘌呤，及其类似物、衍生物和组合。在具体实施方案中，甲基黄嘌呤如咖啡因的重量浓度为约0.01％-约0.30％。

本领域技术人员将清楚可包含在本发明脂质体混悬液中的其它添加剂，包括在本发明的范围内。

在皮肤护理或美容产品中，可将本发明的脂质体混悬液掺入适合美容的基体中以形成用于局部给药的采用霜剂、洗剂、凝胶、浆液、补剂、乳液、糊剂或喷雾剂形式的美容制剂。

制备脂质体的方法

另一方面，本发明提供制备如上所述的稳定、透明至半透明的单层脂质体混悬液的方法。在一个实施方案中，制备稳定、透明至半透明的单层脂质体混悬液的方法包括：(a)制备含有偶合剂、至少一种磷脂、刚度增强剂和抗氧化剂的油溶性组合物；(b)制备水溶性组合物；(c)将水溶性组合物与油溶性组合物合并以形成多层、多泡脂质体制剂；(d)将多层、多泡脂质体制剂转化为单层脂质体制剂；和(e)将单层脂质体制剂加入密度为约0.95g/cc-约1.25g/cc的外相组合物内。该方法将通常得到含有均匀的大量平均粒度为约50-约290nm的单层脂质体颗粒的脂质体混悬液，其中脂质体混悬液的屈光指数为1.30-1.45，在约4℃-约50℃在棕色玻璃瓶、无色玻璃瓶或不透明的塑料容器内以纯净形式保持其稳定性至少30天，或者在21℃保持至少180天，或更久。

在一个实施方案中，可通过按顺序加入至少一种偶合剂、至少一种磷脂、至少一种刚度增强剂和/或至少一种抗氧化剂以形成批料组合物制备油溶性组合物。可将批料组合物搅拌和加热至充分溶解组分的温度(如190-210℉)。冷却后，可加入一种或多种温度敏感性油溶性组分，包括油溶性活性物质。然后可使批料组合物冷却，维持(和搅拌)在约75-85℉温度与水溶性组合物进行相组合。可将水溶性组合物和油溶性组合物(包括或不包括水溶性和/或油溶性活性物质)在搅拌器中混合(例如50rpm10-15分钟)。可形成多层、多泡脂质体颗粒组合物，然后用合适的转化过程如高压微流化、挤出、高速剪切、研磨、声处理、选择性微通道过滤或匀浆化转化为单层脂质体颗粒组合物。可通过将外相组合物的一种或多种内容物按顺序混合一起，搅拌使其溶解，将内容物加入上文描述的脂质体制剂中，制备外相组合物。

因为在经受约200℉的油溶性批料组合物温度后，某些活性成分的生物活性可能削弱，例如，某些活性成分，包括植物性物质(如积雪草提取物)，在更低的温度条件下可溶解在水溶性组合物中或者在进一步冷却后它们可加(和溶解)在油溶性批料组合物中。

有多种方法可用于将多层、多泡脂质体制剂转化为单层脂质体制剂。这些包括高压微流化、挤出、高速剪切、研磨、声处理、选择性微通道过滤或匀浆化。

微流化提供制备单层脂质体制剂的优选方法，特别是根据其制备大批量脂质体制剂的能力。微流化涉及将浆料样浓缩的类脂/水分散体引入微流化器内，其通过直径1-5μm的微通道以非常高的压力(10,000-20,000psi)泵送分散体。微通道裂开和相互碰撞以增强小滴尺寸减小和能量输入。通过加压进入2条限定的微通道内使极高速移动的流体分成2股流化。在流体通过微流室很小的洞口进入后，出现大规模空化，但也出现快速压差。通过常规匀浆化获得类似的压差。然后使2股流以极高速直角碰撞一起。由高压差和高速产生的巨大能量导致类脂自我组装成脂质体。可使终端收集的流体再穿过微流化器1-4次，直至获得看起来均匀的分散体和单峰、均匀的粒度分布。适合用于制备本发明脂质体制剂的微流化装置包括MicofluidicsModelsM110Y和M210EH(MicrofluidicsCorp.，Newton，MA)。

或者，还可通过在水中声处理磷脂产生本发明的单层脂质体。低剪切速率产生多层脂质体，像洋葱一样具有许多层。连续高剪切声处理容易形成较小的单层脂质体。

又一方面，本发明包括制备美容制剂的方法，其中将本发明的脂质体混悬液与适合美容的基体合并以形成采用霜剂、洗剂、凝胶、浆液、补剂、乳液、糊剂或喷雾剂形式的美容制剂。

透射电子显微镜(TEM)提供表征脂质体的大小、完整性和稳定性的方法。常用的样品制备方法包括将1滴1∶5稀释的脂质体混悬液涂在塑料涂层网格内，用磷钨酸或钼酸铵使材料负染色，从而制备负染包埋的脂质体单层。

更具体来讲可制备样品用于TEM分析，如下：将1％含水琼脂糖(w/v)倒入塑料培养皿内，在室温下风干10分钟。通过辉光放电使Formvar或火棉胶涂层网格具备亲水性，将网格置于1号Whatman滤纸上。每个网格上各放1滴样品混悬液。当滤纸在网格周围吸收大部分液体时，将网格转移至琼脂糖平板30分钟-1小时以促使盐和液体扩散入琼脂糖内。

用具备ESI的Zeiss-902观察未染色的网格并照相。通常，脂质体将表现为分离的圆形结构，没有明显凝块的迹象。

可以例如通过评估脂质体在水溶液或在霜剂中的大小和结构，评估脂质体的粒度和稳定性，两者都在棕色玻璃瓶、无色玻璃瓶或不透明的塑料容器中贮存之前或贮存1-12个月后，或者更后的时间进行。脂质体的粒度和稳定性可用合适的激光散射(如Nanotrac或Microtrac)、多重光散射、动态稳定性分析仪(TurbiscanTLabExpert)，和/或本领域技术人员已知的透射电子显微镜装置和方法评估。

一方面，激光散射可用于粒度定量。例如，Nanotrac利用“控制参考”动态光散射法，利用780nm波长激光二级闪烁光通过蓝宝石过滤窗进入稀释的样品分散介质中。激光(频移的散射方式)通过蓝宝石窗反射回分光器内，由光电探测器接收。散射光的频移代表“控制参考”的组合，是由蓝宝石滤器(已知非漂移频率)反射的光，结合出现Brownian运动的悬浮样品颗粒的速度的影响。根据“Doppler效应”激光是频移的，与感兴趣的颗粒分布的移动速度成比例。然后将检测器输出信号放大、过滤、数字化和在数学上分析以量化粒度分布。

当经受降低或提高的温度时，稳定的脂质体系统在老化后表现颗粒均匀、单峰分布。当颗粒聚结或絮凝导致其截留的内容物破裂和整个微结构/胶体系统全面形成乳状液或沉降时，出现双峰或三峰分布。本发明的脂质体混悬液可在约4℃-约50℃在棕色玻璃瓶、无色玻璃瓶或不透明的塑料容器内以纯净形式保持其稳定性至少30天，至少约2个月，至少约3个月，至少约6个月，至少约19个月，或更久。如以下图5显示，发现本发明的脂质体制剂在环境室温条件下保持其稳定性和单峰颗粒分布至少19个月，如在单峰粒度分布所反应，特征在于平均粒度为约157nm和大小范围为约54nm-约521nm。

TurbiscanAcceleratedKineticStabilityAnalyzer可提供早期预测胶体系统稳定性的可追踪的定量方法。TurbiscanAnalyzer应用多重光散射检测透射和反散射光的水平，作为样品深度的函数用于透明至不透明外观的胶体系统。Turbiscan仪器由近红外激光二极管组成，照亮充满样品的小(1cm×8cm)圆筒状玻璃比色槽深度全部的光的光子。光的光子以散射方式从样品发出(I)，同时由透射(用于透明度)和反散射(用于不透明度)检测器检测。根据使用者限定的时间间隔将反散射与透射光的比率收集作为“指纹”扫描。叠加数据扫描的动态结果显示感兴趣的混悬液、乳液或泡沫状物的均匀程度。

在本发明中相对于术语“稳定性”，“反散射动态结果”可限定为反散射光的相对改变，是由使用者限定的时间间隔的函数。产物反散射光的每次扫描随激光扫描的每次时间间隔变化。反散射光的这种改变与系统内颗粒的移行有关。在稳定的脂质体混悬液中，反散射光的激光扫描与反散射光的初始扫描相比将很少改变。关于本发明，反散射动态结果小于2.0％表示在选择的温度条件和使用者限定的时间间隔下稳定的脂质体溶液或混悬液。关于本发明的脂质体系统，当暴露于25℃-50℃的温度超过16小时，反散射动态结果大约0.2-1.0％。对于胶体系统可在短至4-8小时的时间段检测不稳定性的早期指征。

给药方式

通常将本发明的脂质体混悬液设计用于局部给药。通常，以至少每天为基础给予本发明的组合物。本发明组合物的给药可持续任何合适的时间段。应理解美容增效的程度和维持、改善、保持或修复的程度将直接随所用组合物的总量和频率而不同。

可通过本领域技术人员将很好理解的方法和技术制备有用的剂型，可包括用其它成分制备合适的剂型。在一个实施例中，通常至少每天1次给予本发明的脂质体混悬液。在另一个实施例中，每天2次给予脂质体混悬液。在又一个实施例中，可以每天3-5次给予制剂。通常，对可以每天给药的制剂的量没有限制。

本发明还包括通过局部涂用本发明的脂质体混悬液治疗皮肤的方法。在使用时，将小量组合物例如1-100ml从合适的容器或涂抹器涂在暴露的皮肤区，然后如果需要则用手或手指或合适的装置将其摊开和/或擦入皮肤内。

在一个实施方案中，本发明提供预防、阻止、逆转、缓解、消除、减小或改善老化迹象的方法，其中将足以预防、阻止、逆转、缓解、消除、减小或改善皮肤老化迹象的美容有效量的本发明组合物局部涂在皮肤上。例示性老化迹象包括但不限于面部皱纹、细纹、皱纹、鱼尾纹、黑眼圈、瑕疵、老年斑、妊娠纹、减弱的皮肤屏障修复性，或其组合。

在另一个实施方案中，本发明提供改善皮肤美学外观的方法，其中将足以改善皮肤美学外观的美容有效量的本发明组合物局部涂在皮肤上。改善可涉及皮肤厚度、弹性、回弹性、保湿性、色调、纹理、辐射亮度、光泽、亮度、澄清度、轮廓、均匀度、紧实度、紧张度、柔软度、柔和度、敏感性、毛孔大小、水分丢失减少，或其组合。

改善可进一步涉及改善受以下情况影响、导致以下情况或由以下情况造成的不良皮肤状况：银屑病、湿疹、脂溢性皮炎、皮炎、晒伤、雌激素失衡、色素沉着过度、色素沉着不足、脱色、黄化、雀斑、皮肤萎缩、皮肤破裂、皮肤脆弱、干燥、皲裂、下垂、变薄、增生、纤维化、毛孔增大、蜂窝组织形成、擦伤、座疮形成、凋亡、细胞分化、细胞去分化、预防肿瘤诱导或肿瘤进展、病毒感染、真菌感染、细菌感染、蜘蛛静脉(毛细血管扩张)、多毛症、酒糟鼻、搔痒症、胼胝、疣、鸡眼，或其组合。

老化迹象或不良皮肤状况可来自自由基损伤、环境因素、污染物、饮食、时间性老化、过早老化、激素老化、光老化或其组合。因此，选择用于改善抗老化特征或不良皮肤状况的本组合物和方法可局部应用抑制加速或促进老化、损伤、自由基形成或皮肤成分分解的酶或介质(包括但不限于金属蛋白酶、胶原酶、弹性酶、透明质酸酶和蛋白酶)的活性成分。活性成分可具有抗氧化活性、自由基清除或抗炎活性，和/或它们可抑制胶原、弹力蛋白、纤维连接蛋白、透明质酸、糖胺聚糖(GAG)或者其它细胞外基质元件或NF-kB信号转导途径的调节酶或介质的分解。活性剂还可抑制与老化有关的其它信号转导途径，包括与这些途径有关的介质和调节剂，或其组合。

除了改善皮肤的美学或美容外观之外，本发明的局部组合物可局部涂用以增强皮肤的整体健康、活力和外观。例如，可将本组合物涂在皮肤上以改善微循环、皮肤细胞间的沟通、补充必需营养素或皮肤组分，或者改善皮肤细胞的代谢、增殖、增大、周转和/或剥脱。

可在使用或不用α-或β羟基酸或其它剥脱剂或其组合涂在皮肤上的情况下实施剥脱。当在本发明的组合物中使用剥脱剂时，包含足够的抗刺激剂或抗炎剂以中和在缺乏此类中和剂的情况下可能伴随的刺激。

预期以上详细说明视为例示性而非限制性。本发明通过以下实验性研究和实施例进一步举例，不应将其视为限制性。而且，在表3-6中的脂质体混悬液是例示性制剂，其组成成分和量可根据以上指导进行调节。

实施例1

脂质体混悬液的制备.

在制备本发明脂质体混悬液的例示性方法中，通过按顺序将Phospholipon85、神经酰胺IIIB和β-谷甾醇和丁二醇加入scrapewall涡轮槽内制备油溶性组合物。开始以40rpm搅拌scrapewall，将批料组合物加热至充分溶解组分的温度(190-210℉)。冷却组合物，当批料温度下降至170℉时加入生育酚。然后使批料组合物冷却并维持在75-85℉温度与水溶性组合物相组合。在以50rpm搅拌scrapewall的同时，用气动齿轮泵以8-10Ib/min速率将水缓慢地加入油溶性组合物内。用涡轮式搅拌器以50rpm将水溶性和油溶性组分混合10-15分钟。然后用80-100psi进料压在微流化器(MicrofluidicsMHOY和M210EH)中以12,000-15,000psi使所得多层、多泡脂质体颗粒组合物通过1-4次，以形成单层脂质体颗粒组合物。通过将甘油、对羟基苯甲酸甲酯、精氨酸和水在scrapewall涡轮槽中按顺序混合一起，边搅拌(scrapewall为30rpm；涡轮为300-350rpm)边使内容物在145-155℉溶解约20分钟，制备外相组合物。冷却至140℉后，将附加防腐剂加入外相组合物内。接着，在进一步冷却后，将微流化单层颗粒组合物加入外相组合物内，在75-90℉混合15分钟。

所得含60％甘油的脂质体混悬液具有的屈光指数为1.4，在4℃-60℃的温度下稳定至少6个月。用TransmissionElectronMicroscope(TEM)分析(图1A-1C)进一步评估制剂，确认产生结构上完整的单层脂质体(图1B，1C)。

表1显示用NanotracN150SubmicronParticleSizeAnalyzer(MicrotracInc.，Montgomeryville，PA)通过动态激光散射，在不同温度贮存条件下(40℉，环境，和120℉)，在制备后以各种时间间隔(开始，1个月，2个月，3个月，和6个月)通过微流化器2或3次后图1A-1C脂质体制剂的粒度分析。列举的25种条件各自包括每种测试条件下基于3次扫描(直方图)的75次不同测试的粒度计算。如表1显示，含有脂质体混悬液的美容制剂的特征在于在环境温度条件下贮存6个月后粒度范围是56nm-333nm和中位粒度约140nm。

图2显示在环境温度条件下19个月贮存期后所得实施例1脂质体混悬液的单峰、粒度分布。图2显示平均粒度为约157nm和大小范围约54-约521nm。

实施例2

表2描述通过描述于实施例1的过程制备的脂质体混悬液。

实施例3

表3描述通过描述于实施例1的过程形成的脂质体混悬液。

实施例4

表4描述通过描述于实施例1的通用过程联合几种如下所示的成分改变形成的脂质体混悬液。图3和4显示在环境温度条件下与不同防腐剂组合经过2.5个月贮存期后表4的2种脂质体混悬液的所得单峰、粒度分布。图3的脂质体溶液穿过微流化器4次；图4的脂质体溶液穿过微流化器2次。图3显示使用苯氧乙醇、丙二醇、氯苯甘醚和甲基异噻唑啉酮且不含对羟基苯甲酸酯的混悬液的平均粒度为约87nm和大小范围约38-约187nm。图4显示使用苯氧乙醇联合各种对羟基苯甲酸酯，包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸乙酯的混悬液的平均粒度为约247nm和大小范围约141nm-约518nm。图5显示在环境温度条件下表4的脂质体混悬液维持单峰粒度分布至少19个月。具体来讲，图5显示以平均粒度为约157nm和大小范围约54nm-约521nm为特征的单峰粒度分布。

实施例5

表5描述通过描述于实施例1的通用过程联合几种如下所示的成分改变形成的脂质体混悬液。图6显示在环境温度条件下2.5个月贮存期后表5混悬液的所得单峰、粒度分布，其中使脂质体溶液穿过微流化器2次。

实施例6

表6描述用描述于实施例1的通用过程联合几种如下所示的成分改变的脂质体混悬液。图7显示在环境温度条件下2.5个月贮存期后表6混悬液的所得单峰粒度分布。

实施例7

脂质体霜剂

图8是放大11,430×的脂质体霜剂制剂TEM显微照片。图9是用Zeiss-902电子显微镜放大30,000×采集的脂质体霜剂制剂TEM显微照片。用箭头标识脂质体。用箭头标识脂质体。在图8和9中，将脂质体混悬液以1∶5稀释在去离子水中，混合直至均匀。

Claims

1.一种稳定的透明至半透明的单层脂质体混悬液，包含：

悬浮于外相组合物中的脂质体制剂，所述脂质体制剂包含大量具有单峰尺寸分布且平均粒度为50nm-290nm的单层脂质体颗粒，所述脂质体制剂用由油溶性组合物和水溶性组合物组成的脂质体水溶液形成，所述油溶性组合物浓度为5％-33％脂质体溶液重量，所述水溶性组合物浓度为67％-95％脂质体溶液重量，

其中所述油溶性组合物包含偶合剂、至少一种磷脂、至少一种刚度增强剂和抗氧化剂；

其中所述外相组合物浓度为30％-75％脂质体混悬液重量，所述外相组合物包含选自增稠剂、致密剂、胶凝剂、树胶及其混合物的粘度促进剂，其中所述外相组合物的密度为0.95g/cc-1.25g/cc且在21℃和10sec^-1剪切速率下的粘度为2.5cP-40,000cP；和

其中所述脂质体混悬液的折光率为1.30-1.45，在4℃-50℃温度下以纯净形式保持其稳定性至少30天或在21℃保持至少180天。

2.权利要求1的脂质体混悬液，其中所述偶合剂选自丁二醇、丙二醇、己二醇和聚乙二醇，及其混合物。

3.权利要求1的脂质体混悬液，其中所述偶合剂是丁二醇。

4.权利要求2的脂质体混悬液，其中所述至少一种刚度增强剂选自神经鞘脂、植物甾醇、胆甾醇，及其混合物。

5.权利要求4的脂质体混悬液，包含至少2种刚度增强剂，包括至少一种植物甾醇和至少一种选自神经酰胺、鞘氨醇和植物鞘氨醇的成分。

6.权利要求4的脂质体混悬液，其中所述至少一种磷脂包括具有不同脂肪酰基部分的甘油磷脂或鞘磷脂。

7.权利要求1-6中任一项的脂质体混悬液，其中所述至少一种磷脂包括含有浓度为80％-95％磷脂制剂重量的磷脂酰胆碱的磷脂制剂。

8.权利要求1-6中任一项的脂质体混悬液，其中所述油溶性组合物包含丁二醇、神经酰胺IIIB、β-谷甾醇和生育酚。

9.权利要求1-6中任一项的脂质体混悬液，其中所述抗氧化剂选自生育酚、乙酸生育酚酯、琥珀酸生育酚酯、苯甲酸生育酚酯、丙酸生育酚酯、山梨酸生育酚酯、油酸生育酚酯、乳清酸生育酚酯、亚油酸生育酚酯、烟酸生育酚酯、生育酚2-乙基-己酸酯、抗坏血酸、棕榈酸抗坏血酸酯、月桂酸抗坏血酸酯、肉豆蔻酸抗坏血酸酯、硬脂酸抗坏血酸酯、二棕榈酸抗坏血酸酯、二月桂酸抗坏血酸酯、二肉豆蔻酸抗坏血酸酯、二硬脂酸抗坏血酸酯、三棕榈酸抗坏血酸酯、三月桂酸抗坏血酸酯、三肉豆蔻酸抗坏血酸酯、三硬脂酸抗坏血酸酯、四月桂酸抗坏血酸酯、四肉豆蔻酸抗坏血酸酯、四硬脂酸抗坏血酸酯、L-抗坏血酸异棕榈酸酯、L-抗坏血酸异硬脂酸酯、L-抗坏血酸二异硬脂酸酯、L-抗坏血酸异肉豆蔻酸酯、L-抗坏血酸2-乙基己酸酯、L-抗坏血酸二-2-乙基己酸酯、L-抗坏血酸油酸酯、L-抗坏血酸二油酸酯、L-抗坏血酸-2-磷酸酯、L-抗坏血酸-3-磷酸酯、L-抗坏血酸-2-硫酸酯和L-抗坏血酸-3-硫酸酯、L-抗坏血酸3-磷酸盐、L-抗坏血酸2-磷酸盐、L-抗坏血酸3-焦磷酸盐和双(L-抗坏血酸3，3-)磷酸盐、抗坏血酸磷酸钠、抗坏血酸磷酸镁、L-抗坏血酸3-硫酸盐、L-抗坏血酸2-硫酸盐、L-抗坏血酸3-焦硫酸盐和双(L-抗坏血酸3，3-)硫酸盐、龙胆酸甲酯、叔丁基氢醌、谷胱甘肽、L-肌肽、抗坏血酸四己基癸基酯、丁羟甲苯、丁羟茴醚，及其混合物。

10.权利要求9的脂质体混悬液，其中所述抗氧化剂选自α生育酚、β生育酚、γ生育酚、δ生育酚、ε生育酚、ζ生育酚、η生育酚、L-抗坏血酸棕榈酸酯、L-抗坏血酸二棕榈酸酯、L-抗坏血酸二硬脂酸酯、L-抗坏血酸肉豆蔻酸酯，及其混合物。

11.权利要求1-6中任一项的脂质体混悬液，其中所述脂质体混悬液包含浓度为35％-75％脂质体混悬液的甘油。

12.权利要求11的脂质体混悬液，其中所述油溶性组合物包含卵磷脂制剂、丁二醇、神经酰胺IIIB和β-谷甾醇；和

其中所述脂质体混悬液的折光率为1.30-1.45。

13.一种制备权利要求1的稳定的透明至半透明的单层脂质体混悬液的方法，包括：

a.制备含有偶合剂、至少一种磷脂、刚度增强剂和抗氧化剂的油溶性组合物；

b.制备水溶性组合物；

c.将水溶性组合物与油溶性组合物合并以形成多层、多泡脂质体制剂；

d.将多层、多泡脂质体制剂转化为单层脂质体制剂；和

e.将单层脂质体制剂加入外相组合物内，所述外相组合物包含选自增稠剂、致密剂、胶凝剂、树胶及其混合物的粘度促进剂以提供密度为1.05g/cc-1.25g/cc且在21℃和10sec^-1剪切速率下的粘度为2.5cP-40,000cP的外相组合物，以形成含有大量平均粒度为50-290nm的单层脂质体颗粒的脂质体混悬液；

其中所述脂质体混悬液的折光率为1.30-1.45，在4℃-50℃温度下以纯净形式保持其稳定性至少30天，或在21℃保持至少180天。

14.权利要求13的方法，其中偶合剂选自丁二醇、丙二醇、己二醇和聚乙二醇，及其混合物。

15.权利要求13的方法，其中偶合剂是丁二醇。

16.权利要求14的方法，其中刚度增强剂选自神经鞘脂、植物甾醇、胆甾醇，及其混合物。

17.权利要求16的方法，包含至少2种刚度增强剂，包括至少一种植物甾醇和至少一种选自神经酰胺、鞘氨醇和植物鞘氨醇的成分。

18.权利要求13-17中任一项的方法，其中所述至少一种磷脂包括具有不同脂肪酰基部分的甘油磷脂或神经鞘脂。

19.权利要求13-17中任一项的方法，其中所述至少一种磷脂包括含有浓度为80％-95％磷脂制剂重量的磷脂酰胆碱的磷脂制剂。

20.权利要求13-17中任一项的方法，其中所述油溶性组合物包含丁二醇、神经酰胺IIIB、β-谷甾醇和生育酚。

21.权利要求13-17中任一项的方法，其中所述抗氧化剂选自生育酚、乙酸生育酚酯、琥珀酸生育酚酯、苯甲酸生育酚酯、丙酸生育酚酯、山梨酸生育酚酯、油酸生育酚酯、乳清酸生育酚酯、亚油酸生育酚酯、烟酸生育酚酯、生育酚2-乙基-己酸酯、抗坏血酸、棕榈酸抗坏血酸酯、月桂酸抗坏血酸酯、肉豆蔻酸抗坏血酸酯、硬脂酸抗坏血酸酯、二棕榈酸抗坏血酸酯、二月桂酸抗坏血酸酯、二肉豆蔻酸抗坏血酸酯、二硬脂酸抗坏血酸酯、三棕榈酸抗坏血酸酯、三月桂酸抗坏血酸酯、三肉豆蔻酸抗坏血酸酯、三硬脂酸抗坏血酸酯、四月桂酸抗坏血酸酯、四肉豆蔻酸抗坏血酸酯、四硬脂酸抗坏血酸酯、L-抗坏血酸异棕榈酸酯、L-抗坏血酸异硬脂酸酯、L-抗坏血酸二异硬脂酸酯、L-抗坏血酸异肉豆蔻酸酯、L-抗坏血酸2-乙基己酸酯、L-抗坏血酸二-2-乙基己酸酯、L-抗坏血酸油酸酯、L-抗坏血酸二油酸酯、L-抗坏血酸-2-磷酸酯、L-抗坏血酸-3-磷酸酯、L-抗坏血酸-2-硫酸酯和L-抗坏血酸-3-硫酸酯、L-抗坏血酸3-磷酸盐、L-抗坏血酸2-磷酸盐、L-抗坏血酸3-焦磷酸盐和双(L-抗坏血酸3，3-)磷酸盐、抗坏血酸磷酸钠、抗坏血酸磷酸镁、L-抗坏血酸3-硫酸盐、L-抗坏血酸2-硫酸盐、L-抗坏血酸3-焦硫酸盐和双(L-抗坏血酸3，3-)硫酸盐、龙胆酸甲酯、叔丁基氢醌、谷胱甘肽、L-肌肽、抗坏血酸四己基癸基酯、丁羟甲苯、丁羟茴醚，及其混合物。

22.权利要求21的方法，其中所述抗氧化剂选自α生育酚、β生育酚、γ生育酚、δ生育酚、ε生育酚、ζ生育酚、η生育酚、L-抗坏血酸棕榈酸酯、L-抗坏血酸二棕榈酸酯、L-抗坏血酸二硬脂酸酯、L-抗坏血酸肉豆蔻酸酯，及其混合物。

23.权利要求13-17中任一项的方法，其中所述脂质体溶液与外相组合物的重量比为0.002-0.54。

24.权利要求13-17中任一项的方法，其中所述脂质体混悬液包含浓度为35％-75％脂质体混悬液的甘油。

25.权利要求13-17中任一项的方法，其中所述转化包括高压微流化、挤出、高速剪切、研磨、声处理、选择性微通道过滤或匀浆化。

26.权利要求13-17中任一项的方法，其中在悬浮于外相组合物之前将单层脂质体制剂冻干。

27.一种制备包含权利要求1的透明至半透明的单层脂质体混悬液的美容制剂的方法，包括：

b.制备水溶性组合物；

d.将多层、多泡脂质体制剂转化为单层脂质体制剂；和

其中所述脂质体混悬液的折光率为1.30-1.45，在4℃-50℃温度下以纯净形式保持其稳定性至少30天，或在21℃保持至少180天；

f.将脂质体混悬液与适合美容的基体合并以形成采用霜剂、洗剂、凝胶、浆液、补剂、乳液、糊剂或喷雾剂形式的美容制剂。