WO2018123002A1

WO2018123002A1 - 外用組成物

Info

Publication number: WO2018123002A1
Application number: PCT/JP2016/089064
Authority: WO
Inventors: 牧中村; 梓西戸
Original assignee: 小林製薬株式会社
Priority date: 2016-12-28
Filing date: 2016-12-28
Publication date: 2018-07-05

Abstract

本発明の目的は、コーニファイドエンベロープの形成を効果的に促進できる外用組成物を提供することである。前記課題は、外用組成物において、セラミド０．０００１重量％以上、フィトステロール０．０００１～０．０１重量％、及び水素添加レシチン０．００００１～１重量％含有させることによって解決される。

Description

外用組成物

　本発明は外用組成物に関する。より具体的には、本発明は、コーニファイドエンベロープ（ＣｏｒｎｉｆｉｅｄＥｎｖｅｌｏｐｅ）の形成を促進できる外用組成物に関する。

　表皮は、基底層、有棘層、顆粒層、及び角質層の４層から構成されている。角層は、角層細胞とそれらの隙間を埋める細胞間脂質から構成され、体内の生きた細胞を保護する肌のバリアとして重要な役割を果たしている。角層細胞は、基底層から徐々に分化しながら皮膚表面側に移動し、最終的に角質細胞となって角質層を形成する。角層細胞に分化する過程において、有棘層ではＣＥの前駆体タンパク質（インボルクリン、ロリクリン等）の生成が始まり、当該前駆体タンパク質が顆粒層の上層部でＣＥになる。ＣＥは、トランスグルタミナーゼにより架橋され不溶化することにより、細胞膜の内張構造を形成し、徐々に成熟しながら角層に至ると、消失する細胞膜に置き換わり、角質細胞の外壁になる。更に、ＣＥは、角層内で十分に成熟することで角層細胞を包み込む丈夫なタンパク質の袋になる。

　ＣＥは、角層が正常に機能する役割を担っており、ＣＥの形成促進は、健康的な肌状態の維持又は回復、角層の機能の向上、皮膚老化の抑制等を図る上で重要になっている。そこで、従来、ＣＥの形成促進に着目した機能性成分について種々検討されている。例えば、特許文献１には、アスタキサンチン及びヘマトコッカス藻抽出物は、ＣＥ成熟促進作用があることが開示されている。また、特許文献２には、特定のピロリドン誘導体及び／又はその塩には、ＣＥの形成又は成熟を促進する作用があることが報告されている。また、特許文献３には、酸性キシロオリゴ糖には、ＣＥの構成タンパク質であるインボルクリン及びケラチン１０の発現を促進する作用があり、表皮角化正常化剤として使用できることが報告されている。

　しかしながら、従来、ＣＥ形成を促進することが報告されている成分では、効果が十分でなかったり、製剤処方上の制約があったりするため、ＣＥの形成を促進できる外用組成物の新たな処方の開発が切望されている。

特開２０１２－１５３６３７号公報特開２００８－３０３１８５号公報特開２００９－１４３８３２号公報

　本発明の目的は、ＣＥの形成を効果的に促進できる外用組成物を提供することである。

　本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、外用組成物において、セラミド、フィトステロール、及び水素添加レシチンを所定濃度で組み合わせて使用することによって、ＣＥの形成を飛躍的に向上させ得ることを見出した。具体的には、外用組成物において、セラミド０．０００１重量％以上、フィトステロール０．０００１～０．０１重量％、及び水素添加レシチン０．００００１～１重量％含有させることによって、ＣＥの形成を効果的に促進できることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。

　即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．　０．０００１重量％以上のセラミド、０．０００１～０．０１重量％のフィトステロール、及び０．００００１～１重量％の水素添加レシチンを含有する、外用組成物。
項２．　セラミド１００重量部当たり、フィトステロールを１００００重量部以下の比率で含む、項１に記載の外用組成物。
項３．　セラミド１００重量部当たり、水素添加レシチンを１００００００重量部以下の比率で含む、項１又は２に記載の外用組成物。
項４．　セラミドがセラミド２である、項１～３のいずれかに記載の外用組成物。
項５．　化粧料である、項１～４のいずれかに記載の外用組成物。
項６．　クリーム状である、項１～５のいずれかに記載の外用組成物。
項７．　コーニファイドエンベロープの形成促進用途に使用される、項１～６のいずれかに記載の外用組成物。
項８．　角層の形成促進及び／又は角層の機能向上の用途に使用される、項１～７のいずれかに記載の外用組成物。
項９．　０．０００１重量％以上のセラミド、０．０００１～０．０１重量％のフィトステロール、及び０．００００１～１重量％の水素添加レシチンを含有する組成物の、コーニファイドエンベロープの形成促進用外用組成物の製造のための使用。

　本発明の外用組成物は、ＣＥの形成を効果的に促進できるので、角層の機能を向上させることができる。また、本発明の外用組成物は、ＣＥの形成促進作用に基づいて、肌の状態の改善又は正常化、保湿、肌荒れ改善、敏感肌の解消、皮膚老化の防止等のスキンケアに好適に使用できる。

　本発明の外用組成物は、０．０００１重量％以上のセラミド、０．０００１～０．０１重量％のフィトステロール、及び０．００００１～１重量％の水素添加レシチンを含有することを特徴とする。以下、本発明の外用組成物について詳述する。

セラミド
　セラミドとは、スフィンゴシン又はフィトスフィンゴシンのアミノ基に脂肪酸がアミド結合により結合している化合物である。

　本発明で使用されるセラミドにおいて、スフィンゴシン又はフィトスフィンゴシンのアミノ基に結合している脂肪酸の種類については、特に制限されず、水酸基をもたない脂肪酸、α－ヒドロキシ脂肪酸、ω－ヒドロキシ脂肪酸等のいずれであってもよい。

　本発明で使用されるセラミドの種類としては、具体的には、セラミド１、セラミド２、セラミド３、セラミド４、セラミド５、セラミド６Ｉ、セラミド６ＩＩ、セラミド７、セラミド８、セラミド９、セラミド１０等が挙げられる。これらのセラミドは、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。これらのセラミドの中でも、ＣＥの形成をより一層効果的に促進させるという観点から、好ましくはセラミド２、セラミド１、セラミド３、更に好ましくはセラミド２が挙げられる。

　本発明で使用されるセラミドの由来については、特に制限されず、セラミドの種類等に応じて適宜設定すればよく、例えば、動植物から抽出したもの、微生物醗酵法によって得られたもの、化学的に合成したもの等のいずれであってもよい。

　本発明の外用組成物において、セラミドの含有量は０．０００１重量％以上に設定される。ＣＥの形成をより一層効果的に促進させるという観点から、本発明の外用組成物におけるセラミドの含有量として、好ましくは０．００１～１０重量％、更に好ましくは０．０１～１０重量％、特に好ましくは０．０１～０．０５重量％が挙げられる。

フィトステロール
　フィトステロールとは、植物由来ステロールの総称であり、トウモロコシ、豆又は他の植物油等の植物性油に少量見出される成分である。

　フィトステロールの種類については、特に制限されないが、例えば、β－シトステロール、スティグマステロール、カンペステロール、フコステロール、スピナステロール、ブラシカステロール、エルゴステロール等が挙げられる。これらのフィトステロールは、１種単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。本発明で使用されるフィトステロールとして、ＣＥの形成をより一層効果的に促進させるという観点から、好ましくは、β－シトステロール、スティグマステロール及びカンペステロールの中の少なくとも１種、更に好ましくはβ－シトステロール、スティグマステロール及びカンペステロールの混合物が挙げられる。

　本発明の外用組成物において、フィトステロールの含有量は０．０００１～０．０１重量％に設定される。ＣＥの形成をより一層効果的に促進させるという観点から、本発明の外用組成物におけるフィトステロールの含有量として、好ましくは０．００１～０．０１重量％が挙げられる。

　本発明の外用組成物において、セラミドとフィトステロールの比率については、前述する各含有量に応じて定めるが、具体的には、セラミド１００重量部当たり、フィトステロールが１００００重量部以下となる比率が挙げられる。ＣＥの形成をより一層効果的に促進させるという観点から、セラミド１００重量部当たり、フィトステロールが好ましくは０．００１～１００重量部、更に好ましくは０．２～１００重量部が挙げられる。

水素添加レシチン
　レシチンとは、脂肪酸鎖として不飽和脂肪酸鎖を含むリン脂質の一種である。また、水素添加レシチンとは、レシチンに対して水素添加処理することにより、不飽和二重結合の少なくとも一部が飽和結合に変換されたレシチンである。

　水素添加レシチンに含まれるリン脂質の種類については、特に制限されず、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、ホスファチジン酸等が挙げられる。本発明で使用される水素添加レシチンは、これらのリン脂質の内の１種単独で構成されていてもよく、また２種以上の組み合わせによって構成されていてもよい。

　本発明で使用される水素添加レシチンの由来については、特に制限されず、動物由来又は植物由来のいずれであってもよい。動物由来の水素添加レシチンとしては、具体的には、水素添加卵黄レシチン、水素添加魚介類由来のレシチン等が挙げられる。また、植物由来の水素添加レシチンとしては、具体的には、水素添加大豆レシチン、水素添加ゴマレシチン、水素添加とうもろこしレシチン、水素添加アマニレシチン、水素添加オリーブレシチン、水素添加米レシチン、水素添加なたねレシチン、水素添加ひまわりレシチン、水素添加サフラワーレシチン、水素添加綿実レシチン、水素添加キリレシチン、水素添加グレープレシチン、水素添加アボガドレシチン、水素添加ヤシレシチン、水素添加パームレシチン等が挙げられる。これらの水素添加レシチンは、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。本発明で使用される水素添加レシチンとして、ＣＥの形成をより一層効果的に促進させるという観点から、好ましくは植物由来の水素添加レシチン、更に好ましくは水素添加大豆レシチンが挙げられる。

　本発明で使用される水素添加レシチンのヨウ素価については、特に制限されないが、例えば、１０以下が挙げられる。

　本発明の外用組成物において、水素添加レシチンの含有量は０．００００１～１重量％に設定される。ＣＥの形成をより一層効果的に促進させるという観点から、本発明の外用組成物における水素添加レシチンの含有量として、好ましくは０．００００１～０．１重量％、好ましくは０．００００１～０．０５重量％が挙げられる。

　本発明の外用組成物において、セラミドと水素添加レシチンの比率については、前述する各含有量に応じて定めるが、具体的には、セラミド１００重量部当たり、水素添加レシチンが１００００００重量部以下となる比率が挙げられる。ＣＥの形成をより一層効果的に促進させるという観点から、セラミド１００重量部当たり、水素添加レシチンが好ましくは０．０００１～１００００重量部、更に好ましくは０．０２～１００００重量部が挙げられる。

その他の成分
　本発明の外用組成物は、セラミド、フィトステロール、及び水素添加レシチン以外に、必要に応じて、他の薬理成分を含有していてもよい。このような薬理成分としては、例えば、抗ヒスタミン剤（ジフェンヒドラミン、ジフェンヒドラミン塩酸塩、マレイン酸クロルフェニラミン等）、局所麻酔剤（リドカイン、ジブカイン、アミノ安息香酸メチル、プロカイン、テトラカイン、ブピパカイン、メピパカイン、クロロプロカイン、プロパラカイン、メプリルカイン又はこれらの塩、オルソカイン、オキセサゼイン、オキシポリエントキシデカン、ロートエキス、ペルカミンパーゼ、テシットデシチン等）、抗炎症剤（アラントイン、グリチルリチン酸、グリチルリチン酸メチル、グリチルリチン酸ステアリル、グリチルリチン酸ジカリウム、グリチルリチン酸モノアンモニウム、グリチルレチン酸、グリチルレチン酸ピリドキシン、グリチルレチン酸ステアリル、グリチルレチン酸グリセリル、グリチルレチン酸モノグルクロニド、サリチル酸、サリチル酸メチル、サリチル酸グリコール、インドメタシン、フェルビナク、ジクロフェナクナトリウム、ロキソプロフェンナトリウム、ウフェナマート、イブプロフェンピコノール、スプロフェン、ベンダザック、スプロフェン、ブフェキサマク等）、殺菌剤（ベンザルコニウム塩化物、デカリニウム塩化物、ベンゼトニウム塩化物、セチルピリジニウム塩化物、クロルヘキシジン塩化物、グルコン酸クロルヘキシジン、イソプロピルメチルフェノール、アンモニア水、スルファジアジン、乳酸、フェノール等）、皮膚保護剤（コロジオン、ヒマシ油等）、血行促進剤（ノニル酸ワニリルアミド、ニコチン酸ベンジルエステル、カプサイシン、トウガラシエキス等）、清涼化剤（メントール、カンフル等）、ビタミン類（ビタミンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ等）、ムコ多糖類（コンドロイチン硫酸ナトリウム、グルコサミン、ヒアルロン酸等）等が挙げられる。

　また、本発明の外用組成物は、所望の製剤形態にするために、必要に応じて、基剤や添加剤が含まれていてもよい。このような基剤や添加剤については、薬学的に許容されることを限度として特に制限されないが、例えば、水、低級アルコール（エタノール、イソプロパノール等）、多価アルコール（グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール等）等の水性基剤；油類（オリーブ油、サフラワー油、大豆油、つばき油、とうもろこし油、なたね油、ひまわり油、綿実油、落花生油、ラード、スクワラン、魚油等）、鉱物油（流動パラフィン、パラフィン、ゲル化炭化水素、ワセリン等）、ワックス類・ロウ類（ミツロウ、カルナウバロウ、キャンデリラロウ、セレシン、ライスワックス、マイクロクリスタリンワックス等）、エステル油（ミリスチン酸イソプロピル、アジピン酸イソプロピル、セバシン酸ジエチル、セバシン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、パルミチン酸セチル、オレイン酸エチル、トリ２－エチルヘキサン酸グリセリル等）、脂肪酸アルキルエステル、脂肪酸（ステアリン酸、オレイン酸、パルミチン酸、ベヘン酸、リノール酸、ラノリン等）、脂肪酸エステル（パルミチン酸セチル、パルミチン酸イソプロピル、リノール酸エチル等）、中鎖脂肪酸トリグリセリド、高級アルコール（ステアリルアルコール、セタノール、ベヘニルアルコール、ミリスチルアルコール、オレイルアルコール、ヘキサデシルアルコール、ラノリンアルコール、コレステロール、ジヒドロコレステロール、フィトステロール、ラウリルアルコール、セトステアリルアルコール、リノレイルアルコール、オクチルドデカノール、ヘキシルデカノール、イソステアリルアルコール等）、２－エチルヘキサン酸セチル、シリコーンオイル（ジメチルポリシロキサン、環状シリコーン等）等の油性基剤；ＰＯＥ（１０～５０モル）フィトステロールエーテル、ＰＯＥ（１０～５０モル）ジヒドロコレステロールエーテル、ＰＯＥ（１０～５０モル）２－オクチルドデシルエーテル、ＰＯＥ（１０～５０モル）デシルテトラデシルエーテル、ＰＯＥ（１０～５０モル）オレイルエーテル、ＰＯＥ（２～５０モル）セチルエーテル、ＰＯＥ（５～５０モル）ベヘニルエーテル、ＰＯＥ（５～３０モル）ポリオキシプロピレン（５～３０モル）２－デシルテトラデシルエーテル、ＰＯＥ（１０～５０モル）ポリオキシプロピレン（２～３０モル）セチルエーテルなどのポリオキシエチレンアルキルエーテル、これらのリン酸・リン酸塩（ＰＯＥセチルエーテルリン酸ナトリウムなど）、ＰＯＥ（２０～６０モル）ソルビタンモノオレート、ＰＯＥ（１０～６０モル）ソルビタンモノイソステアレート、ＰＯＥ（１０～８０モル）グリセリルモノイソステアレート、ＰＯＥ（１０～３０モル）グリセリルモノステアレート、ＰＯＥ（２０～１００モル）・ポリオキシプロピレン変性シリコーン、ＰＯＥ・アルキル変性シリコーン、モノラウリン酸ポリエチレングリコール、モノパルミチン酸ポリエチレングリコール、モノステアリン酸ポリエチレングリコール、ジラウリン酸ポリエチレングリコール、ジパルミチン酸ポリエチレングリコール、ジステアリン酸ポリエチレングリコール、ジオレイン酸ポリエチレングリコール、ジリシノレイン酸ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（５～１００）、ポリソルベート（２０～８５）、グリセリン脂肪酸エステル（モノステアリン酸グリセリン等）、水素添加大豆リン脂質、水素添加ラノリンアルコール等の界面活性剤；清涼化剤（メントール、カンフル、ボルネオール、ハッカ水、ハッカ油等）、防腐剤（メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸等）、着香剤（シトラール、１，８－シオネール、シトロネラール、ファルネソール等）、着色剤（タール色素（褐色２０１号、青色２０１号、黄色４号、黄色４０３号等）、カカオ色素、クロロフィル、酸化アルミニウム等）、粘稠剤（カルボキシビニルポリマー、ヒプロメロース、ポリビニルピロリドン、アルギン酸ナトリウム、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、キサンタンガム、カラギーナン等）、ｐＨ調整剤（リン酸、塩酸、クエン酸、クエン酸ナトリウム、コハク酸、酒石酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノールアミン、トリイソプロパノールアミン等）、湿潤剤（ｄｌ－ピロリドンカルボン酸ナトリウム液、Ｄ－ソルビトール液、マクロゴール等）、安定化剤（ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、エデト酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アスパラギン酸、ＤＬ－アラニン、グリシン、エリソルビン酸ナトリウム、没食子酸プロピル、亜硫酸ナトリウム、二酸化硫黄、クロロゲン酸、カテキン、ローズマリー抽出物等）、酸化防止剤、紫外線吸収剤、キレート剤、粘着剤、緩衝剤、溶解補助剤、可溶化剤、保存剤等の添加剤が挙げられる。

製剤形態
　本発明の外用組成物の剤型については、経皮適用可能であることを限度として特に制限されず、液状、固形状、半固形状（クリーム状、ゲル状、軟膏状、ペースト状）等のいずれであってもよい。また、外用組成物は、水中油型乳化製剤、油中水型乳化製剤等の乳化製剤であってもよく、また水性製剤、油性製剤等の非乳化製剤であってもよい。これらの剤型の中でも、好ましくは乳化製剤、更に好ましくは水中油型乳化製剤、特に好ましくはクリーム状の水中油型乳化製剤が挙げられる。

　また、本発明の外用組成物は、皮膚に適用されるものである限り、皮膚外用医薬品、化粧料、皮膚洗浄料等のいずれの製剤形態であってもよい。

　本発明の外用組成物の製剤形態として、具体的には、クリーム剤、ローション剤、ジェル剤、乳液剤、液剤、パップ剤、貼付剤、リニメント剤、エアゾール剤、軟膏剤、パック剤等の皮膚外用医薬品；軟膏、クリーム、乳液、化粧水、ローション、パック、ゲル等の化粧料；クレンジングミルク、ボディーシャンプー、ヘアシャンプー、リンス等の皮膚洗浄料等が挙げられる。これらの製剤形態の中でも、好ましくは化粧料、更に好ましくはクリームが挙げられる。

用途・使用方法
　本発明の外用組成物は、ＣＥの形成を効果的に促進できるので、角層の形成促進や角層の機能向上が可能になり、肌の状態の改善又は正常化、保湿、肌荒れ改善、敏感肌の解消、皮膚老化の防止等のスキンケア目的で使用することができる。

　本発明の外用組成物は、ＣＥの形成促進が求められている皮膚に適量塗布又は噴霧することによって使用される。本発明の外用組成物の皮膚への適用量については、特に制限されないが、例えば、皮膚１ｃｍ²当たり３０００～７０００μｇ程度となる量が挙げられる。

　以下に実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、以下に示す試験例において使用したフィトステロールはタマ生化学株式会社製であり、主に、β-シトステロール（C₂₉H₅₀O:414.71）、スティグマステロール（C₂₉H₄₈O:412.69）、及びカンぺステロール（C₂₈H₄₈O:400.68）を含んでおり、医薬部外品原料規格「フィトステロール」に適合するものである。また、以下に示す試験例において使用した水素添加レシチンは、一丸ファルコス株式会社製であり、ホスファチジルコリンを７５～８５重量％含み、ヨウ素価は１０以下である。

試験例１
　セラミド、フィトステロール、及び水素添加レシチンが、ヒト角化細胞のインボルクリン、ロリクリン、トランスグルタミナーゼ及びフィラグリンの発現に及ぼす影響について評価した。本試験例１では、セラミドとして、セラミド２（高砂香料工業株式会社製）を使用した。なお、インボルクリン及びロリクリンはＣＥの前駆体タンパク質であり、トランスグルタミナーゼは前駆体タンパク質に架橋を施すことによりＣＥを形成乃至成熟させる酵素であり、フィラグリンの一部はＣＥに組み込まれるタンパク質である。具体的な試験方法は、以下に示す通りである。

　先ず、１０容量％のFBS（ウシ胎児血清）を含むD-MEM/Ham's F12培地（和光純薬工業株式会社製）に、ヒト表皮角化細胞（HaCaT細胞）を４×１０⁵cells/mLとなるように懸濁した細胞液を調製した。当該細胞液１mLを１２ウェルプレートの各ウェルに播種し、５％ＣＯ₂の条件下で３７℃で２４時間培養を行った。次いで、各ウェル中の培地を表２及び３に示す各成分を所定濃度含む１０容量％のFBS（ウシ胎児血清）を含むD-MEM/Ham's F12培地に置き換えて、５％ＣＯ₂の条件下で３７℃で２４時間培養を行った。その後、各ウェル中の細胞を回収し、RNasy mini kit（製品番号74104、QIAGEN社製）及びRNase Free DNase set（製品番号79254、QIAGEN社製）を用いて、細胞中の全RNAを回収した。次いで、RT-PCRキット（ReverTra Plus、東洋紡績株式会社製；及びAppliedBiosystems PowerSYBR Green PCR Master Mix(2X)、Thermo Fisher Scientific社製）を用いて、qRT-PCRを行った。なお、各遺伝子の検出に使用したプライマーは表１に示す通りである。

　インボルクリン、ロリクリン、トランスグルタミナーゼ、及びフィラグリンの発現量について、βアクチン（ハウスキーピング遺伝子）の発現量に対する比率に補正し、これらの４つの遺伝子の発現量を合算して、ＣＥ形成因子の発現量とした。更に、条件１（無処置群）におけるＣＥ形成因子の発現量に対する各条件におけるＣＥ形成因子の発現量の比率を下記式に従って算出し、ＣＥ形成因子の発現増加割合とした。

　得られた結果を表２及び３に示す。セラミド、フィトステロール、及び水素添加レシチンは、それぞれ単独又はこれらの２成分の組み合わせでは、ＣＥ形成因子（インボルクリン、ロリクリン、トランスグルタミナーゼ、及びフィラグリン）の発現量を増大させることができなかった（条件１～１４、２２、２７、３３、及び４２）。これに対して、セラミド、フィトステロール、及び水素添加レシチンを組み合わせて使用し、且つ、セラミドが０．０００１重量％以上、フィトステロールが０．０００１～０．０１重量％、及び水素添加レシチン０．０００１～１重量％を満たす場合には、ＣＥ形成因子の発現量の増大が認められ（条件２３～２６、２８～３２、及び３４～４１）、これら３成分が特定の含有量を満たしている場合には、ＣＥの形成を促進できることが明らかになった。

試験例２
　セラミド、フィトステロール、及び水素添加レシチンが、ヒト角化細胞のＣＥ形成能に及ぼす影響について評価した。本試験例２では、セラミドとして、セラミド２（高砂香料工業株式会社製）を使用した。具体的な試験方法は、以下に示す通りである。

　先ず、１０容量％のFBS（ウシ胎児血清）を含むD-MEM/Ham's F12培地（和光純薬工業株式会社製）に、ヒト表皮角化細胞（HaCaT細胞）を１×１０⁵cells/mLとなるように懸濁した細胞液を調製した。当該細胞液１mLを１２ウェルプレートの各ウェルに播種し、５％ＣＯ₂の条件下で３７℃で３日間培養を行った。次いで、各ウェル中の培地を表４～６に示す各成分を所定濃度含む１０容量％のFBS（ウシ胎児血清）を含むD-MEM/Ham's F12培地に置き換えて、５％ＣＯ₂の条件下で３７℃で３日間培養を行った。その後、各ウェル中の細胞をトリプシン処理によって剥離させて回収し、D-MEM/Ham's F12培地（無血清、和光純薬工業株式会社製）に加えた。次いで、細胞濃度を８×１０⁵cells/mLに調整した後に、その細胞液２５０μLを２０００μL容のマイクロチューブに入れた。更に、０．０４μｇ/ｍLのカルシウムイオノファーを含むD-MEM/Ham's F12培地（無血清、和光純薬工業株式会社製）２５０μLをマイクロチューブに加え、ボルテックスミキサーにて撹拌した。その後、３７℃で５時間インキュベートした後に、遠心分離を行い、上清を除去した。次いで、マイクロチューブ内の沈殿物をリン酸緩衝液（PBS）にて洗浄した後に、遠心分離を行い、上清を除去した。マイクロチューブ内の沈殿物にDDT・SDS溶液（１Mのジチオトレイトール液20μL、１０重量％ドデシル硫酸ナトリウム液２００μL、及び精製水７８０μLの混合液）５０μLを加え、１０分間煮沸した。その後、血球計算盤を用いてＣＥ（Cornified envelope）の数の計測を行った。更に、条件１（無処置群）で認められたＣＥ数に対する各条件で認められたＣＥ数の比率を下記式に従って算出し、ＣＥ数の増加割合とした。

　得られた結果を表４～６に示す。セラミド、フィトステロール、及び水素添加レシチンは、それぞれ単独又はこれらの２成分の組み合わせでは、ＣＥの形成を促進できていなかった（条件１～１４、２２、２７、３３、４２、５１、及び６７）。これに対して、セラミド、フィトステロール、及び水素添加レシチンを組み合わせて使用し、且つ、セラミドが０．０００１重量％以上、フィトステロールが０．０００１～０．０１重量％、及び水素添加レシチン０．０００１～１重量％を満たす場合には、ＣＥの形成促進が認められ（条件２３～２６、３４～４１、５０、及び５３～５９）、本試験結果からも、これら３成分が特定の含有量を満たしている場合には、ＣＥの形成を促進できることが確認された。

試験例３
　セラミド１及びセラミド３を使用して、前記試験例２と同様の方法で、表７に示す濃度のセラミド、フィトステロール、及び水素添加レシチンが、ヒト角化細胞のＣＥ形成能に及ぼす影響について評価した。なお、本試験例３では、セラミド１及びセラミド３は、共に高砂香料工業株式会社製を使用した。

　得られた結果を表７に示す。この結果から、セラミド１及び３を使用した場合であっても、セラミドが０．０００１重量％以上、フィトステロールが０．０００１～０．０１重量％、及び水素添加レシチン０．０００１～１重量％を満たす場合には、ＣＥの形成を効果的に促進できることが確認された（条件７６～７９）。

製造例
　表８に示すクリーム剤、表９に示す化粧水、及び表１０に示すクレンジングミルクを製造した。これらのクリーム剤、化粧水、及びクレンジングミルクは、いずれも、コーニファイドエンベロープの形成を効果的に促進し得る。

Claims

　０．０００１重量％以上のセラミド、０．０００１～０．０１重量％のフィトステロール、及び０．００００１～１重量％の水素添加レシチンを含有する、外用組成物。
　セラミド１００重量部当たり、フィトステロールを１００００重量部以下の比率で含む、請求項１に記載の外用組成物。
　セラミド１００重量部当たり、水素添加レシチンを１００００００重量部以下の比率で含む、請求項１又は２に記載の外用組成物。
　セラミドがセラミド２である、請求項１～３のいずれかに記載の外用組成物。
　化粧料である、請求項１～４のいずれかに記載の外用組成物。
　クリーム状である、請求項１～５のいずれかに記載の外用組成物。
　コーニファイドエンベロープの形成促進用途に使用される、請求項１～６のいずれかに記載の外用組成物。
　角層の形成促進及び／又は角層の機能向上の用途に使用される、請求項１～７のいずれかに記載の外用組成物。