CN112957277B - 一种多重透明质酸纳米组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及化妆品领域，提供了一种多重透明质酸纳米组合物，包括寡聚透明质酸、低分子透明质酸、中分子透明质酸、高分子透明质酸、油脂、乳化剂、多元醇、促渗剂、阻滞剂和水。本发明将四种不同分子量大小的HA合理搭配，采用特定乳化剂、油脂、多元醇、阻滞剂和促渗剂，构建多重透明质酸纳米组合物，能够显著提高多重结构纳米乳的负载量，提高载体结构稳定性，促进活性成分透过皮肤角质层，渗透入活性表皮和真皮层，并在该组织中长时间滞留。本发明提供的纳米组合物具有显著的保湿补水、抗衰、修复、抗炎等功效。

Description

一种多重透明质酸纳米组合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及化妆品技术领域，具体涉及一种多重透明质酸纳米组合物及其制备方法和应用。
背景技术
透明质酸(HA)是构成细胞间质和细胞外基质的主要成分，具有保水、细胞保护、参与细胞增殖与分化、抗自由基以及加速创面愈合等多种作用。
HA原本就存在于皮肤内，能够帮助皮肤从体内及皮肤表层吸得水分，还能增强皮肤长时间的保水能力。当透明质酸吸收水分后，使得弹力纤维及胶原蛋白处在充满湿润的环境中，皮肤因此具有了弹性。但是，皮肤的透明质酸从25岁以后就开始流失，30岁时只剩下幼年期65％、60岁时只剩下25％，皮肤的水分也会跟着透明质酸而散失，失去弹性与光泽，长久下来便出现皱纹的老化现象。
尽管现有技术中有将HA作为功能性成分制备化妆品的情况，但是大多基于HA暂时水化和保湿作用，加上皮肤的屏障功能，HA很难透过角质层进入真皮层。即使部分寡聚HA能进入真皮层，但HA在皮肤上的整体渗透性、稳定性较差，作用时间较短，生物利用度低，难以充分发挥HA的护肤功能。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种多重透明质酸纳米组合物及其制备方法和应用。本发明提供的多重透明质酸纳米组合物提高了稳定性，延长了活性成分在皮肤中的作用时间，活性成分能够透过角质层进入真皮层，直接作用于细胞靶部位，提高了生物利用度。不同分子量大小的HA合理搭配，具有显著的保湿补水、抗衰、修复、抗炎等功效。
为了解决上述问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种多重透明质酸纳米组合物，包括寡聚透明质酸、低分子透明质酸、中分子透明质酸、高分子透明质酸、油脂、乳化剂、多元醇、促渗剂、阻滞剂和水。
优选的，所述寡聚透明质酸的质量为纳米组合物总质量的0.1～10％；
所述低分子透明质酸的质量为纳米组合物总质量的0.1～10％；
所述中分子透明质酸的质量为纳米组合物总质量的0.01～1％；
所述高分子透明质酸的质量为纳米组合物总质量的0.01～1％。
优选的，所述寡聚透明质酸的分子量<1WDa；
所述低分子透明质酸的分子量为1WDa～50WDa；
所述中分子透明质酸的分子量为50WDa～200WDa；
所述高分子透明质酸>200WDa。
优选的，所述油脂包括植物油脂和合成油脂中的一种或多种；
所述乳化剂包括聚甘油乳化剂和聚醚类乳化剂中的一种或多种；
所述多元醇包括甘油、丁二醇、己基癸醇、聚乙二醇、丙二醇、二丙二醇、1,3-丙二醇和甲基丙二醇中的一种或多种；
所述促渗剂包括苯乙烯/VP共聚物、肉桂酸、肉桂醇和薄荷醇中的一种或多种；
所述阻滞剂包括1,4-环己二醇、1,2-己二醇和聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯中的一种或多种。
优选的，以组合物总质量计，所述油脂为1～10％、乳化剂为1～20％、多元醇为10～30％、促渗剂为0.1～5％、阻滞剂为0.1～5％和余量的水。
本发明还提供了上述多重透明质酸纳米组合物的制备方法，包括以下步骤：
将寡聚透明质酸、低分子透明质酸、中分子透明质酸、高分子透明质酸和水混合，得到水相；
将油脂、乳化剂和促渗剂混合，得到油相；
将所述油相与所述水相混合，得到第一混合物；
将多元醇和阻滞剂与所述第一混合物混合，得到第二混合物；
将所述第二混合物乳化后微米化处理，得到微米级分散体；
将所述微米级分散体进行纳米化处理，得到多重透明质酸纳米组合物。
优选的，所述混合的方式包括：在搅拌条件下将所述油相滴加至所述水相中。
优选的，所述微米化处理为剪切乳化，所述纳米化处理为高压均质处理或高速微射流处理。
本发明还提供了上述多重透明质酸纳米组合物在制备化妆品中的应用。
本发明提供了一种多重透明质酸纳米组合物，包括寡聚透明质酸、低分子透明质酸、中分子透明质酸、高分子透明质酸、油脂、乳化剂、多元醇、促渗剂、阻滞剂和水。
本发明提供的纳米组合物将四种不同分子量大小的HA(寡聚透明质酸、低分子透明质酸、中分子透明质酸、高分子透明质酸)合理搭配、共同包载，综合效果突出，其中寡聚透明质酸能透过皮肤表层进入皮肤活性真皮层并能高含量滞留；小分子透明质酸能有效渗透进入活性表皮、真皮组织并在该组织内长时间滞留，缓释控释；中分子透明质酸能进入皮肤表皮层锁水、补水；高分子透明质酸均匀覆盖在皮肤角质层，加强皮肤屏障功能，减少皮肤内部水分蒸发，实现了不同分子量透明质酸活性成分的皮肤靶向输送，提高了生物利用度，具有显著的保湿补水、抗衰、修复、抗炎等功效。在清除活性氧自由基ROS、降低炎症因子TNF-a含量、抗干燥损伤、提高皮肤水含量方面多重透明质酸纳米组合物功效均优于游离透明质酸。将本发明提供的纳米组合物在常温放置90d后，所述纳米组合物的包封率并未发生显著性变化，也未出现团聚、变色、分层现象，多重透明质酸纳米组合物稳定性良好。本发明体外药物释放实验表明，所述多重透明质酸纳米组合物，呈现出缓慢释放的特点，其体外释放速率明显低于游离透明质酸，可延长活性成分在皮肤中的作用时间。
本发明提供的纳米组合物能够用于制备化妆品，可直接添加到不同类型的保湿补水、抗衰、修复、抗炎等功效性化妆品中，使化妆品具有稳定性好、使用方便、提高化妆品的护肤功效等优点。
附图说明
图1为实施例11纳米组合物在室温放置12个月前后样品状态对比图；
图2为实施例10纳米组合物在常温放置90天前后样品状态对比图；
图3为实施例6纳米组合物和对比例1复合透明质酸水溶液的体外药物释放性能对比分析图；
图4为应用例1、2制备的纳米复合透明质酸膏霜和对比例3制备的普通复合透明质酸膏霜在12h后体外皮肤累积透过情况；
图5为应用例1、2制备的纳米复合透明质酸膏霜和对比例3制备的普通复合透明质酸膏霜的体外皮肤滞留情况；
图6为实施例6、8、10纳米组合物清除活性氧自由基ROS功效情况，与模型组比较，*P<0.05；与4号样品比较，#P<0.05；
图7为实施例6、8、10纳米组合物对炎症因子TNF-α的影响情况；与模型组比较，*P<0.05；与4号样品比较，#P<0.05；
图8为实施例6、8、10纳米组合物对细胞干燥死亡率的影响情况；与模型组比较，*P<0.05；与4号样品比较，#P<0.05；
图9为应用例1、2纳米复合透明质酸膏霜对皮肤含水量校准改善率情况；与对比例3比较，*P<0.05；
图10为应用例1、2纳米复合透明质酸膏霜对皮肤含水量变化。
具体实施方式
本发明提供了一种多重透明质酸纳米组合物，包括寡聚透明质酸、低分子透明质酸、中分子透明质酸、高分子透明质酸、油脂、乳化剂、多元醇、促渗剂、阻滞剂和水。
如无特殊说明，本发明对组分的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。
以质量百分含量计，本发明提供的多重透明质酸纳米组合物优选包括0.1～10％寡聚透明质酸，进一步优选为1～6％，更优选为3～4％。在本发明中，所述寡聚透明质酸的分子量优选<1WDa，进一步优选<0.9WDa，更优选<0.8WDa，最优选<0.6WDa。在本发明中，寡聚透明质酸能透过皮肤表层进入皮肤活性真皮层并能高含量滞留，深层保湿。
以质量百分含量计，本发明提供的多重透明质酸纳米组合物优选包括0.1～10％低分子透明质酸，进一步优选为1～6％，更优选为3～4％。在本发明中，所述低分子透明质酸的分子量优选1WDa～50WDa，进一步优选为2WDa～40WDa，更优选3WDa～30WDa，最优选5WDa～20WDa。在本发明中，低分子透明质酸能有效渗透进入活性表皮、真皮组织并在该组织内长时间滞留，缓释控释。
以质量百分含量计，本发明提供的多重透明质酸纳米组合物优选包括0.01～1％中分子透明质酸，进一步优选为0.05～0.6％，更优选为0.1～0.4％。在本发明中，所述中分子透明质酸的分子量优选50WDa～200WDa，进一步优选60WDa～180WDa，更优选70WDa～160WDa，最优选80WDa～140WDa。在本发明中，中分子透明质酸能进入皮肤表皮层锁水、补水。
以质量百分含量计，本发明提供的多重透明质酸纳米组合物优选包括0.01～1％高分子透明质酸，进一步优选为0.05～0.6％，更优选为0.1～0.4％。在本发明中，所述高分子透明质酸的分子量优选>200WDa，进一步优选为>250WDa，更优选>300WDa，最优选为>400WDa。在本发明中，高分子透明质酸均匀覆盖在皮肤角质层，加强皮肤屏障功能，减少皮肤内部水分蒸发。
在本发明中，所述寡聚透明质酸、低分子透明质酸、中分子透明质酸和高分子透明质酸合理搭配，开发的多重透明质酸纳米组合物稳定性好，实现了不同分子量透明质酸活性成分的皮肤靶向输送，具有显著的保湿补水、抗衰、修复、抗炎等功效。
以质量百分含量计，本发明提供的多重透明质酸纳米组合物优选包括1～10％油脂，进一步优选为3～8％，更优选为4～6％。在本发明中，所述油脂包括但不限于植物油脂和合成油脂中的一种或多种。所述植物油脂优选为橄榄油、大豆油和蓖麻油中的一种或多种，进一步优选为橄榄油和/或大豆油；所述合成油脂优选为癸二酸二乙酯、鲸蜡醇乙基己酸酯、辛基十二醇肉豆蔻酸酯、甘油三(乙基己酸)酯、丙二醇辛酸酯、三一辛酸甘油酯、亚油酸甘油酯中的一种或多种，进一步优选为癸二酸二乙酯、鲸蜡醇乙基己酸酯、甘油三(乙基己酸)酯、丙二醇辛酸酯、亚油酸甘油酯中的一种或多种；更优选为癸二酸二乙酯、甘油三(乙基己酸)酯、亚油酸甘油酯中的一种或多种，本发明所述油脂由上述物质中的的1～2种组成；更优选的，所述油脂为亚油酸甘油酯和大豆油的混合物，二者质量比优选为0.5～2:1，进一步优选为1：1。在本发明中，选择的油脂安全性高、无刺激作用。油脂和水在乳化剂的作用下形成油水界面膜来包裹活性成分，油脂对纳米乳的结构及药物的增溶非常重要。单一的油脂有时不能满足纳米乳制剂对油相的要求，需要进行不同油脂的混合。
以质量百分含量计，本发明提供的多重透明质酸纳米组合物优选包括1～20％乳化剂，进一步优选为3～18％，更优选为5～15％，最优选为8～10％。在本发明中，所述乳化剂包括但不限于聚甘油类乳化剂和聚醚类乳化剂中的一种或多种。所述聚甘油类乳化剂优选为聚甘油-6月桂酸酯、聚甘油-6硬脂酸酯、聚甘油-10异硬脂酸酯和聚甘油-4癸酸酯中的一种或多种，进一步优选为聚甘油-6月桂酸酯和/或聚甘油-10异硬脂酸酯；所述聚醚类乳化剂优选为月桂醇聚醚-9、鲸蜡醇聚醚-20、油醇聚醚-50和辛基十二醇聚醚-25中的一种或多种，进一步优选为月桂醇聚醚-9和/或油醇聚醚-50；更优选的，本发明所述乳化剂由上述物质中的的1～2种组成；更优选的，所述乳化剂为聚甘油-6月桂酸酯、聚甘油-10异硬脂酸酯的混合物，二者质量比优选为0.5～2:1，进一步优选为1：1。本发明采用特定非离子乳化剂起到乳化作用，皮肤相容性好，温和无刺激，通过形成牢固的乳化膜降低油水界面张力，并且对活性成分还能起到增溶效果。所述乳化剂的用量比例要适当，用量过少时乳化能力较低，性质不稳定，用量过多时则容易形成胶束，直接影响到药物的释放。当不同乳化剂搭配使用时，由于乳化剂分子之间的相互作用，导致形成更加紧密、更高强度的复合膜，使得纳米组合物更加稳定。
以质量百分含量计，本发明提供的多重透明质酸纳米组合物优选包括10～30％多元醇，进一步优选为12～28％，更优选为15～25％，最优选为20～23％。所述多元醇优选为甘油、丁二醇、甲基丙二醇、二丙二醇和1,3-丙二醇中的一种或多种，进一步优选为甘油、丁二醇和1,3-丙二醇中的一种或多种；本发明所述多元醇由上述物质中的的1～2种组成；更优选的，所述多元醇为1,3-丙二醇、丁二醇的混合物，二者质量比优选为0.5～2:1，进一步优选为1：1。在本发明中，多元醇不仅能起到助乳化的作用，改变纳米乳骨架的刚性，提高液体油脂的乳化稳定性，降低界面张力从而使纳米乳自发形成，扩大纳米乳的形成区域，而且多元醇具有透皮促进作用，可促进活性物透过皮肤角质层。
以质量百分含量计，本发明提供的多重透明质酸纳米组合物优选包括0.1～5％促渗剂，进一步优选为0.5～3％，更优选为1～2％。所述促渗剂优选为肉桂酸和/或肉桂醇。在本发明中，促渗剂能促进透明质酸活性成分渗透进入皮肤，其中，苯乙烯/VP共聚物可使脂质紊乱、萃取脂质以及在角质层透明质酸头部基因的氨基之间与氢原子竞争性结合，达到渗透增强效果；肉桂酸/肉桂醇能不同程度搅乱角质层脂质，降低角质层细胞的致密程度，并构成脂质通道，促进透明质酸透过角质层；薄荷醇则通过两种方式增大角质层的流动性：(1)与皮肤脂质分子头基形成连续的氢键，破坏原来脂质分子间紧密的氢键网络，从而扰乱脂质分子紧密、有序的排布，降低其屏障功能；(2)与脂质分子中胆固醇分子的最突出的亲和力，有效地增大胆固醇分子对膜流动性的贡献。
以质量百分含量计，本发明提供的多重透明质酸纳米组合物优选包括0.1～5％阻滞剂，进一步优选为0.5～3％，更优选为1～2％。所述阻滞剂优选为1,4-环己二醇和/或1,2-己二醇，当优选为两种时，其含量比例优选为0.5～2:1，进一步优选为1：1。在本发明中，阻滞剂可以将多重透明质酸纳米组合物中的有效成分更多的滞留在作用靶部位即活性表皮、真皮层中，提高皮肤滞留量，而更少的进入血液循环，以避免不必要的副作用。1,4-环己二醇可通过其醇羟基基团与皮肤角质层中的透明质酸6的羟基以及氨基发生了氢键的相互作用，从而保护了药物在皮肤中的滞留；1,2-己二醇与1,4-环己二醇搭配具有协同阻滞作用，1,2-己二醇的疏水性长链打开角质层的疏水孔道后，剩余的羟基可以与邻近的透明质酸6形成氢键，从而堵塞物质进入皮肤的孔道，发挥阻滞的作用；聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯是水溶性的维生素E衍生物，由亲水的极性聚乙二醇链段和亲酯的非极性维生素E琥珀酸酯链段组成，可以抑制皮肤细胞内的P-糖蛋白将HA外排到血液中，从而增加HA在皮肤组织的滞留时间。
本发明提供的多重透明质酸纳米组合物采用特定乳化剂、油脂、多元醇、阻滞剂和促渗剂，按特定比例和特定制备方法构建成的多重结构纳米乳，能够显著提高多重结构纳米乳的负载量，提高载体结构稳定性，促进活性成分透过皮肤角质层，渗透入活性表皮和真皮层，并在该组织中长时间滞留。
本发明采用水作为溶剂，溶解寡聚透明质酸、低分子透明质酸、中分子透明质酸、高分子透明质酸。所述水优选为纯化水。
本发明还提供了上述技术方案所述多重透明质酸纳米组合物的制备方法，包括以下步骤：
将寡聚透明质酸、低分子透明质酸、中分子透明质酸、高分子透明质酸和水混合，得到水相；
将油脂、乳化剂和促渗剂混合，得到油相；
将所述油相与所述水相混合，得到第一混合物；
将多元醇和阻滞剂与所述第一混合物混合，得到第二混合物；
将所述第二混合物乳化后微米化处理，得到微米级分散体；
将所述微米级分散体进行纳米化处理，得到多重透明质酸纳米组合物。
本发明提供的制备方法，分别制备油相和水相，将油相与水相混合得到第一预混物；将多元醇和阻滞剂与所述第一混合物混合得到第二预混物，依次进行微米化、纳米化处理，让HA透入活性表皮、真皮组织并在该组织内长时间滞留，实现了不同分子量透明质酸活性成分的皮肤靶向输送，促进皮肤组织内HA的合成和补充，具有显著的保湿补水、抗衰、修复、抗炎等功效，并且具有良好的稳定性。
在本发明中，所述混合的温度优选为45～70℃，进一步优选为50～65℃，更优选为55～60℃。本发明优选在水浴条件下进行混合，使得各组分均匀分散。
在本发明中，得到所述第一混合物的方式优选包括：将所述油相滴加至所述水相中，所述滴加的速度优选为1～10滴/秒，进一步优选为3～8滴/秒；更优选的，所述滴加在搅拌条件下滴加，所述搅拌的速率优选为400r/min～1000r/min，进一步优选为500r/min～800r/min。
在本发明中，得到所述第二混合物的方式优选包括：将多元醇和阻滞剂加入所述第一混合物中，进一步优选的，所述混合时，搅拌速率为400r/min～1000r/min，进一步优选为500r/min～800r/min。
在本发明中，所述微米化处理的方式优选为高速剪切乳化，所述剪切乳化的剪切转速优选为5000～15000rpm，进一步优选为6000～12000rpm，更优选为8000～10000rpm；剪切时间优选为1～10min，进一步优选为3～8min，更优选为4～6min；在本发明中，所述微米化处理得到的微米化分散体粒径优选为1～100μm，进一步优选为1～50μm。
得到微米级分散体后，本发明将所述微米级分散体进行纳米化处理，得到多重透明质酸纳米组合物。
在本发明中，所述纳米化处理的方式优选为高压均质处理或高压微射流处理。当选择高压均质处理微米级分散体至纳米级时，所述高压均质处理的压力优选为600～1200bar，进一步优选为800～1000bar。所述高压均质的循环次数优选为2～10次，进一步优选为3～6次，更优选为4～5次；所述高压均质的温度优选为45～70℃，进一步优选为50～65℃，更优选为55～60℃。
当采用高速微射流技术处理微米级分散体至纳米级时，所述高速微射流处理的压力优选为6000～16000psi，进一步优选为8000～14000psi，更优选为10000～12000psi；所述高速微射流处理的循环次数优选为2～10次，进一步优选为3～6次，更优选为4～5次；所述高速微射流处理温度优选为45～70℃，进一步优选为50～65℃，更优选为55～60℃。
在本发明中，所述纳米化处理得到的多重透明质酸纳米组合物粒径为10～200nm；优选为20～100nm。
本发明还提供了上述技术方案所述多重透明质酸纳米组合物在制备化妆品中的应用。具体的，本发明所述纳米组合物用于制备具有保湿补水、抗衰、修复、抗炎等功效的化妆品。所述化妆品的形式包括但不限于化妆水、精华、膏霜、乳液、面膜、凝胶。利用本发明所述多重透明质酸纳米组合物制备化妆品时，可直接将所述纳米组合物添加于各类保湿补水、抗衰、修复和抗炎产品基质中，使用方便。所述纳米组合物优选占化妆品质量百分含量的0.1～30％，进一步优选为1～20％。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种多重透明质酸纳米组合物及其制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
以下实施例，如无特殊说明，所提及的百分含量均为相应组分在多重透明质酸纳米组合物中所占质量的比例。
实施例1
将10％寡聚透明质酸(平均分子量为0.9WDa)、0.1％低分子透明质酸(平均分子量为1WDa)、0.01％中分子透明质酸(平均分子量为138WDa)和0.05％高分子透明质酸(平均分子量为220WDa)加入到46.34％纯化水中，45℃水浴加热溶解，得到水相；
将3％癸二酸二乙酯、2％橄榄油、7％聚甘油-6月桂酸酯、6％聚甘油-6硬脂酸酯和3％苯乙烯/VP共聚物混合，45℃水浴加热溶解，得到油相；
将油相以6滴/秒的速度加入水相中，45℃水浴加热搅拌，搅拌速率为700r/min，得到第一混合物；
将10％甘油、12％己基癸醇和0.5％1,4-环己二醇加入第一混合物中，45℃水浴加热继续搅拌，搅拌速率为700r/min，得到第二混合物；
将第二混合物在6000rpm转速下高速剪切乳化3min，得到微米级分散体；
将微米级分散体在800bar条件下进行高压均质处理，循环5次，冷却至室温，得到多重透明质酸纳米组合物；
对上述纳米组合物的粒径和多分散系数(PDI)进行检测，可得该纳米组合物粒径为87.7nm，PDI为0.158。
实施例2
将0.1％寡聚透明质酸(平均分子量为0.6WDa)、10％低分子透明质酸(平均分子量为11WDa)、0.05％中分子透明质酸(平均分子量为58WDa)和0.01％高分子透明质酸(平均分子量为250WDa)加入到49.34％纯化水中，50℃水浴加热溶解，得到水相；
将2％鲸蜡醇乙基己酸酯、2％癸二酸二乙酯、5％聚甘油-10异硬脂酸酯、5％月桂醇聚醚-9和0.5％肉桂酸混合，50℃水浴加热溶解，得到油相；
将油相以5滴/秒的速度加入水相中，50℃水浴加热搅拌，搅拌速率为600r/min，得到第一混合物；
将13％聚乙二醇、10％丙二醇和3％1,2-己二醇加入第一混合物中，50℃水浴加热继续搅拌，搅拌速率为600r/min，得到第二混合物；
将第二混合物在6000rpm转速下高速剪切乳化2min，得到微米级分散体；
将微米级分散体在700bar条件下进行高压均质处理，循环6次，冷却至室温，得到多重透明质酸纳米组合物；
对上述纳米组合物的粒径和PDI进行检测，可得该纳米组合物粒径为98.6nm，PDI为0.162。
实施例3
将1％寡聚透明质酸(平均分子量为0.5WDa)、3％低分子透明质酸(平均分子量为2WDa)、0.6％中分子透明质酸(平均分子量为69WDa)和0.5％高分子透明质酸(平均分子量为300WDa)加入到62.3％纯化水中，55℃水浴加热溶解，得到水相；
将2％辛基十二醇肉豆蔻酸酯、3％鲸蜡醇聚醚-20和0.1％肉桂醇混合，55℃水浴加热溶解，得到油相；
将油相以1滴/秒的速度加入水相中，55℃水浴加热搅拌，搅拌速率为400r/min，得到第一混合物；
将13％二丙二醇、14％1,3-丙二醇和0.5％聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯加入第一混合物中，55℃水浴加热继续搅拌，搅拌速率为400r/min，得到第二混合物；
将第二混合物在5000rpm转速下高速剪切乳化4min，得到微米级分散体；
将微米级分散体在500bar条件下进行高压均质处理，循环10次，冷却至室温，得到多重透明质酸纳米组合物；
对上述纳米组合物的粒径和PDI进行检测，可得该纳米组合物粒径为11.8nm，PDI为0.075。
实施例4
将3％寡聚透明质酸(平均分子量为0.8WDa)、1％低分子透明质酸(平均分子量为15WDa)、1％中分子透明质酸(平均分子量为82WDa)和1％高分子透明质酸(平均分子量为350WDa)加入到61.4％纯化水中，60℃水浴加热溶解，得到水相；
将1％甘油三(乙基己酸)酯、1％油醇聚醚-50和0.5％薄荷醇混合，60℃水浴加热溶解，得到油相；
将油相以2滴/秒的速度加入水相中，60℃水浴加热搅拌，搅拌速率为500r/min，得到第一混合物；
将15％丁二醇、15％甲基丙二醇和0.1％1,4-环己二醇加入第一混合物中，60℃水浴加热继续搅拌，搅拌速率为500r/min，得到第二混合物；
将第二混合物在7000rpm转速下高速剪切乳化1min，得到微米级分散体；
将微米级分散体在600bar条件下进行高压均质处理，循环7次，冷却至室温，得到多重透明质酸纳米组合物；
对上述纳米组合物的粒径和PDI进行检测，可得该纳米组合物粒径为22.2nm，PDI为0.097。
实施例5
将5％寡聚透明质酸(平均分子量为0.7WDa)、2％低分子透明质酸(平均分子量为3.9WDa)、0.8％中分子透明质酸(平均分子量为105WDa)和0.2％高分子透明质酸(平均分子量为410WDa)加入到53％纯化水中，65℃水浴加热溶解，得到水相；
将2％丙二醇辛酸酯、1％大豆油、8％聚甘油-4癸酸酯和1％肉桂酸混合，65℃水浴加热溶解，得到油相；
将油相以3滴/秒的速度加入水相中，65℃水浴加热搅拌，搅拌速率为600r/min，得到第一混合物；
将15％甘油、10％丁二醇和2％1,2-己二醇加入第一混合物中，65℃水浴加热继续搅拌，搅拌速率为600r/min，得到第二混合物；
将第二混合物在8000rpm转速下高速剪切乳化5min，得到微米级分散体；
将微米级分散体在1100bar条件下进行高压均质处理，循环4次，冷却至室温，得到多重透明质酸纳米组合物；
对上述纳米组合物的粒径和PDI进行检测，可得该纳米组合物粒径为46.1nm，PDI为0.106。
实施例6
将2％寡聚透明质酸(平均分子量为0.4WDa)、5％低分子透明质酸(平均分子量为20WDa)、0.1％中分子透明质酸(平均分子量为127WDa)和0.4％高分子透明质酸(平均分子量为490WDa)加入到54.5％纯化水中，55℃水浴加热溶解，得到水相；
将2％三一辛酸甘油酯、1％亚油酸甘油酯、5％辛基十二醇聚醚-25和1％肉桂醇混合，55℃水浴加热溶解，得到油相；
将油相以4滴/秒的速度加入水相中，55℃水浴加热搅拌，搅拌速率为800r/min，得到第一混合物；
将14％1,3-丙二醇、14％丁二醇和1％聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯加入第一混合物中，55℃水浴加热继续搅拌，搅拌速率为800r/min，得到第二混合物；
将第二混合物在9000rpm转速下高速剪切乳化6min，得到微米级分散体；
将微米级分散体在1200bar条件下进行高压均质处理，循环3次，冷却至室温，得到多重透明质酸纳米组合物；
对上述纳米组合物的粒径和PDI进行检测，可得该纳米组合物粒径为62.3nm，PDI为0.114。
实施例7
将4％寡聚透明质酸(平均分子量为0.3WDa)、9％低分子透明质酸(平均分子量为6WDa)、0.3％中分子透明质酸(平均分子量为98WDa)和0.8％高分子透明质酸(平均分子量为570WDa)加入到34.9％纯化水中，70℃水浴加热溶解，得到水相；
将4％蓖麻油、4％丙二醇辛酸酯、8％聚甘油-6月桂酸酯、8％聚甘油-10异硬脂酸酯和4％苯乙烯/VP共聚物混合，70℃水浴加热溶解，得到油相；
将油相以8滴/秒的速度加入水相中，70℃水浴加热搅拌，搅拌速率为900r/min，得到第一混合物；
将10％1,3-丙二醇、10％二丙二醇和3％1,4-环己二醇加入第一混合物中，70℃水浴加热继续搅拌，搅拌速率为900r/min，得到第二混合物；
将第二混合物在12000rpm转速下高速剪切乳化9min，得到微米级分散体；
将微米级分散体在8000psi条件下进行高速微射流处理，循环4次，冷却至室温，得到多重透明质酸纳米组合物；
对上述纳米组合物的粒径和PDI进行检测，可得该纳米组合物粒径为158.1nm，PDI为0.131。
实施例8
将6％寡聚透明质酸(平均分子量为0.2WDa)、6％低分子透明质酸(平均分子量为48WDa)、0.5％中分子透明质酸(平均分子量为158WDa)和0.6％高分子透明质酸(平均分子量为750WDa)加入到43.9％纯化水中，50℃水浴加热溶解，得到水相；
将4％癸二酸二乙酯、2％大豆油、10％月桂醇聚醚-9、5％油醇聚醚-50和2％肉桂酸混合，50℃水浴加热溶解，得到油相；
将油相以7滴/秒的速度加入水相中，50℃水浴加热搅拌，搅拌速率为1000r/min，得到第一混合物；
将10％甘油、8％丁二醇和2％1,2-己二醇加入第一混合物中，50℃水浴加热继续搅拌，搅拌速率为1000r/min，得到第二混合物；
将第二混合物在11000rpm转速下高速剪切乳化8min，得到微米级分散体；
将微米级分散体在1400bar条件下进行高压均质处理，循环4次，冷却至室温，得到多重透明质酸纳米组合物；
对上述纳米组合物的粒径和PDI进行检测，可得该纳米组合物粒径为136.4nm，PDI为0.162。
实施例9
将7％寡聚透明质酸(平均分子量为0.1WDa)、4％低分子透明质酸(平均分子量为28WDa)、0.7％中分子透明质酸(平均分子量为172WDa)和0.3％高分子透明质酸(平均分子量为820WDa)加入到54％纯化水中，55℃水浴加热溶解，得到水相；
将3％甘油三(乙基己酸)酯、4％癸二酸二乙酯、10％聚甘油-10异硬脂酸酯、4％月桂醇聚醚-9和2％肉桂醇混合，55℃水浴加热溶解，得到油相；
将油相以9滴/秒的速度加入水相中，55℃水浴加热搅拌，搅拌速率为600r/min，得到第一混合物；
将5％丁二醇、5％丙二醇和1％1,4-环己二醇加入第一混合物中，55℃水浴加热继续搅拌，搅拌速率为600r/min，得到第二混合物；
将第二混合物在10000rpm转速下高速剪切乳化7min，得到微米级分散体；
将微米级分散体在1300bar条件下进行高压均质处理，循环2次，冷却至室温，得到多重透明质酸纳米组合物；
对上述纳米组合物的粒径和PDI进行检测，可得该纳米组合物粒径为112.4nm，PDI为0.147。
实施例10
将8％寡聚透明质酸(平均分子量为0.4WDa)、7％低分子透明质酸(平均分子量为17WDa)、0.4％中分子透明质酸(平均分子量为193WDa)和0.1％高分子透明质酸(平均分子量为950WDa)加入到37.5％纯化水中，60℃水浴加热溶解，得到水相；
将5％橄榄油、4％大豆油、9％聚甘油-4癸酸酯、9％辛基十二醇聚醚-25和3％苯乙烯/VP共聚物混合，60℃水浴加热溶解，得到油相；
将油相以10滴/秒的速度加入水相中，60℃水浴加热搅拌，搅拌速率为800r/min，得到第一混合物；
将6％1,3-丙二醇、6％甲基丙二醇和5％聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯加入第一混合物中，60℃水浴加热继续搅拌，搅拌速率为800r/min，得到第二混合物；
将第二混合物在13000rpm转速下高速剪切乳化10min，得到微米级分散体；
将微米级分散体在9000psi条件下进行高速微射流处理，循环4次，冷却至室温，得到多重透明质酸纳米组合物；
对上述纳米组合物的粒径和PDI进行检测，可得该纳米组合物粒径为172.5nm，PDI为0.216。
实施例11
将9％寡聚透明质酸(平均分子量为0.5WDa)、8％低分子透明质酸(平均分子量为36WDa)、0.2％中分子透明质酸(平均分子量为115WDa)和0.7％高分子透明质酸(平均分子量为460WDa)加入到28.1％纯化水中，65℃水浴加热溶解，得到水相；
将5％亚油酸甘油酯、5％大豆油、10％聚甘油-6月桂酸酯、10％油醇聚醚-50和5％肉桂醇混合，65℃水浴加热溶解，得到油相；
将油相以8滴/秒的速度加入水相中，65℃水浴加热搅拌，搅拌速率为500r/min，得到第一混合物；
将10％1,3-丙二醇、5％甘油和2％1,4-环己二醇、2％1,2-己二醇加入第一混合物中，65℃水浴加热继续搅拌，搅拌速率为500r/min，得到第二混合物；
将第二混合物在15000rpm转速下高速剪切乳化5min，得到微米级分散体；
将微米级分散体在10000psi条件下进行高速微射流处理，循环5次，冷却至室温，得到多重透明质酸纳米组合物；
对上述纳米组合物的粒径和PDI进行检测，可得该纳米组合物粒径为199.2nm，PDI为0.273。
测试例1
稳定性试验1
将实施例1～11制备得到的纳米组合物在密闭容器、室温条件下放置3、6、9、12个月后，对样品的粒径和多分散系数PDI进行检测，并观察样品性状，综合评价纳米组合物的稳定性。具体检测结果如表1、图1所示。
表1一种多重透明质酸纳米组合物稳定性试验结果
Figure BDA0002939630760000151
由表1可以看出：本发明高压均质处理和高速微射流处理制备的多重透明质酸纳米组合物粒径在10～200nm之间，PDI小于0.3，满足实际应用要求。由图1可以看出，实施例11样品在放置12个月后也未出现团聚、变色、分层现象，样品粒径、PDI未发生显著性变化，仍然满足实际应用需求，尤其在活性成分浓度高的情况下仍然较稳定，未发现结晶析出现象，因此，本发明高压均质处理和高速微射流处理制备的多重透明质酸纳米组合物具有良好的稳定性。
测试例2
稳定性试验2
纳米载体中活性成分的包封率变化是纳米载体稳定性评价的重要指标之一，本发明采用超滤离心法测定多重透明质酸纳米组合物的初始包封率和在常温放置90d后的包封率，并观察样品性状变化。取实施例4、6、8、10制备所得纳米组合物400μL，加入超滤离心管样品池中，置于常温，18000r/min离心30min后收集滤液。用HPLC法检测滤液、离心前纳米组合物中寡聚透明质酸和高分子透明质酸的含量，按下列公式计算，将试验结果列于表2、图2中。
Figure BDA0002939630760000161
式中，Wt为投药量，Wf为游离透明质酸含量。
表2多重透明质酸纳米组合物包封率稳定性考察结果
Figure BDA0002939630760000162
由表2可以看出实施例4、6、8、10制备所得纳米组合物中寡聚透明质酸的初始包封率分别为82.4％、85.9％、85.1％和89.3％；高分子透明质酸的初始包封率分别为85.4％、80.4％、86.7％和88.5％，均符合药典包封率>80％的规定(参照药典2005版2部附录XIXE181～192对分散在液体介质中的微球微囊脂质体的包封率的要求)。
且实施例4、6、8、10的多重透明质酸纳米组合物在常温放置90d后寡聚透明质酸的包封率分别下降4.3％、3.8％、2.8％和2.5％；高分子透明质酸的包封率分别下降5.9％、4.1％、4.3％和4.8％，包封率并未发生显著性变化；由图2可以看出，实施例10样品在放在常温放置90d后，也未出现团聚、变色、分层现象，仍然满足实际应用需求，因此，本发明高压均质处理和高速微射流处理制备的多重透明质酸纳米组合物有较高的稳定性。
对比例1
制备2％寡聚透明质酸、5％低分子透明质酸、0.1％中分子透明质酸、0.4％高分子透明质酸的复合透明质酸水溶液。复合透明质酸水溶液中各透明质酸浓度与实施例6中各透明质酸浓度相同。
对比例2
制备空白膏霜：将5％丙二醇、2％硬脂酸、4％羊毛脂在75℃加热溶解得到油相，0.3％卡波940和余量水在75℃加热溶解得到水相，得到油相和水相后，于75℃条件下将油相以8滴/秒的速度滴加至水相中，滴加过程中控制搅拌速率为1000rpm，混合完成后于10000rpm转速下剪切乳化3min，加入0.3％三乙醇胺，继续剪切2min，冷却后加入0.5％苯氧乙醇，搅拌均匀即得空白霜剂。
应用例1
制备纳米复合透明质酸膏霜：实施例6制备的纳米组合物与对比例2中的空白霜剂按照质量百分含量1:9进行复配，搅拌均匀，即得到纳米复合透明质酸膏霜。
纳米复合透明质酸膏霜中功效成分及含量分别为：0.2％寡聚透明质酸、0.5％低分子透明质酸、0.01％中分子透明质酸、0.04％高分子透明质酸。
应用例2
制备纳米复合透明质酸膏霜：实施例7制备的纳米组合物与对比例2中的空白霜剂按照质量百分含量1:9进行复配，搅拌均匀，即得到纳米复合透明质酸膏霜。
对比例3
制备与应用例1中功效成分及含量相同的普通复合透明质酸膏霜：将5％丙二醇、2％硬脂酸、4％羊毛脂在75℃加热溶解得到油相，0.2％寡聚透明质酸、0.5％低分子透明质酸、0.01％中分子透明质酸、0.04％高分子透明质酸、0.3％卡波940和余量水在75℃加热溶解得到水相，得到油相和水相后，于75℃条件下将油相以8滴/秒的速度滴加至水相中，滴加过程中控制搅拌速率为1000rpm，混合完成后于10000rpm转速下剪切乳化3min，加入0.3％三乙醇胺，继续剪切2min，冷却后加入0.5％苯氧乙醇，搅拌均匀即得到与应用例1中功效成分及含量相同的普通复合透明质酸膏霜。
测试例3
刺激性试验
将实施例6～11所制得的纳米组合物样品，分别与对比例2中的空白霜剂按照质量百分含量3:7进行复配，进行皮肤刺激性试验。
取健康家兔42只，体重2.0±0.2kg，随机分为7组，每组动物6只，于实验前24h将家兔背部皮肤两侧去毛，去毛后24h检查去毛皮肤是否受伤，受伤皮肤不宜做皮肤刺激性试验。每天涂抹使用实施例6～11制得的纳米组合物制备的纳米复合霜剂3次，连续涂抹7天，同时涂抹空白霜剂进行对照，观察试验结果，将试验结果列于表8中。
表3实施例6～11样品制备的复合霜剂及空白组皮肤刺激性观察结果
Figure BDA0002939630760000171
Figure BDA0002939630760000181
“+”家兔皮肤充血、红肿；“++”表示充血、红肿现象仍在，但有增加趋势；“—”表示无充血、红肿现象。
根据表3中的试验结果可以看出，使用实施例6～11纳米组合物制备的复合霜剂及空白霜剂涂抹于家兔皮肤后均无充血、红肿现象，说明本发明提供的纳米组合物对皮肤没有刺激性，安全性高。
测试例4
药物释放实验
准确移取3g实施例6制备的多重透明质酸纳米组合物和对比例1制备的复合透明质酸水溶液，分别于透析袋中，透析袋两头用夹子夹住悬放于烧杯中，加入100mL接收液(由质量分数为10％丙二醇和90％纯化水组成)，避光37℃水浴搅拌。分别在1h、2h、3h、5h、7h、9h、12h、14h、16h取1mL袋外液同时补充相同体积的接收液。利用HPLC进行测试，以寡聚透明质酸含量计，计算寡聚透明质酸的累计释放量，结果见图3和表4。
表4实施例6和对比例1体外药物释放性能试验结果
Figure BDA0002939630760000182
从图3和表4中可看出，本申请的多重透明质酸纳米组合物中寡聚透明质酸释放速率明显低于对比例1中的游离寡聚透明质酸，对比例1中游离寡聚透明质酸在3h内释放完全，而本申请多重透明质酸纳米组合物中的寡聚透明质酸在12h才基本释放完全，释放速率明显低于未包载的游离寡聚透明质酸，呈缓慢释放。由此看出，本申请多重透明质酸纳米组合物具有缓慢释放的特点，能够对皮肤进行持续有效地护肤作用。
测试例5
体外透皮试验
采用垂直式Franz扩散池法进行离体鼠皮的透皮实验，将完整无破损的大鼠腹部皮肤固定于接收池和供给池间，取应用例1、2制备的纳米复合透明质酸膏霜和对比例3制备的普通复合透明质酸膏霜各1g于供给室中，接收液由质量分数为10％丙二醇和90％生理盐水组成，37℃下300r/min搅拌。于1，2，4，6，8，10，12h吸取接收液0.5mL，并补充等体积空白接受收液0.5mL，HPLC检测，计算各时间点寡聚透明质酸和高分子透明质酸的累积透过量，计算公式为：
Figure BDA0002939630760000191
式中，Qn为药物累计透过量，Cn为第n次测得的药物浓度，Ci为第i个点所测得的药物浓度，V0为扩散池的体积，Vi为每次取样的量。单位面累积透过量Q＝Qn/S，S为扩散池的面积，3.14cm2。
透皮实验结束后，取下皮肤，用超纯水洗去样品残液后剪碎，转入组织匀浆器中充分研磨成匀浆液，加适量接受收液转移至离心管中，7000r/min离心20min，取上清液用0.45μm滤膜过滤后HPLC分析，计算皮肤中寡聚透明质酸和高分子透明质酸的滞留量。试验结果见图4、图5和表5。
表5应用例1、2和对比例3在12h后体外皮肤累积透过量和皮肤累积滞留量结果
Figure BDA0002939630760000192
图4为应用例1、2制备的纳米复合透明质酸膏霜和对比例3制备的普通复合透明质酸膏霜在12h后体外皮肤累积透过量；图5为应用例1、2制备的纳米复合透明质酸膏霜和对比例3制备的普通复合透明质酸膏霜的体外皮肤滞留量。
由图4和表9分析可知，应用例1在12h寡聚透明质酸和高分子透明质酸的单位面积皮肤累积透过量分别为213.94μg/cm2、46.53μg/cm2；应用例2在12h寡聚透明质酸和高分子透明质酸的单位面积皮肤累积透过量分别为356.25μg/cm2、76.24μg/cm2，表明本申请高压均质处理和高速微射流处理制备的纳米组合物中寡聚透明质酸较大分子透明质酸有更好的透皮效果，寡聚透明质酸能透过皮肤表层进入皮肤活性真皮层，而大分子透明质酸则主要在皮肤角质层发挥功效；对比例3和应用例1中功效成分及含量相同，对比例3在12h寡聚透明质酸和高分子透明质酸的单位面积皮肤累积透过量仅为110.97μg/cm2、10.21μg/cm2，表明游离寡聚透明质酸经过纳米包载后，皮肤透过量显著提高，寡聚透明质酸经过纳米包载后透皮效果显著提升。游离寡聚透明质酸由于皮肤屏障作用较难透过皮肤角质层到达皮肤深层结构发挥作用，经纳米包载后能促进寡聚透明质酸穿透皮肤表层进入活性真皮层，且组合物中的促渗剂能增大角质层的流动性，降低角质层细胞的致密程度，并构成脂质通道，促进透明质酸透过角质层。
由图5和表9分析可知，应用例1在12h寡聚透明质酸和高分子透明质酸的单位面积皮肤滞留量分别为45.62μg/cm2、8.37μg/cm2，应用例2在12h寡聚透明质酸和高分子透明质酸的单位面积皮肤累积滞留量分别为85.16μg/cm2、14.83μg/cm2，表明本申请高压均质处理和高速微射流处理制备的纳米组合物中寡聚透明质酸能在表层和活性真皮层高浓度滞留；对比例3和应用例1中功效成分及含量相同，对比例3在12h寡聚透明质酸和高分子透明质酸的单位面积皮肤滞留量仅为12.84μg/cm2、2.31μg/cm2，表明游离的寡聚透明质酸虽能部分透过皮肤，但滞留量低，大分子透明质酸则主要分布在皮肤角质层，在皮肤深层组织滞留很少；寡聚透明质酸经过纳米包载后在皮肤中的滞留量显著提高，能在皮肤深层组织高浓度富集和长时间滞留。本申请制备的纳米组合物因为粒径小，比表面积大，与细胞生物膜之间具有更强的粘附性，且组合物中的阻滞剂能协助减缓透明质酸在细胞中清除速度，从而延长透明质酸在活性表皮和真皮层的滞留时间，缓释控释，显著提高其生物利用度，增强保湿、修复等作用效果。
测试例6
清除活性氧自由基ROS功效测试
测试样品：将实施例6、8、10用培养液稀释1000倍得到的纳米组合物培养样品，对应编号1、2、3号，并用相同培养液配制与1号样品中透明质酸种类及含量相同的游离活性原料培养样品，编号4号作为对照。
将HSF细胞以每孔3×104个细胞的密度接种到96孔板中，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养24h。培养结束后吸出细胞板中的培养基，空白对照组加入500μL的无血清培养基，用800μM H2O2处理24h的HSF细胞作为模型组，用测试样品在800μM H2O2条件下孵育24h的HSF细胞作为给药组。孵育结束后，用培养基洗涤3次，加入含有20μM DCFH-DA的培养基继续孵育20min。细胞用PBS洗涤1次后用1％Triton X-100裂解细胞，离心，并使用酶标仪检测活性氧自由基ROS荧光强度，实验结果见图6、表6。
表6 1～4号样品活性氧自由基ROS荧光强度结果
样品名称 空白对照 模型组 1号样品 2号样品 3号样品 4号样品
ROS荧光强度 24330 63600 41000 37500 32700 50600
由图6和表6可知，经H2O2诱导损伤后，ROS荧光强度显著上升，说明H2O2诱导的氧化应激刺激了HSF细胞内ROS的产生，且与模型组ROS的荧光强度(63600)比较，实施例6、8、10制得的纳米组合物均能显著降低ROS的活性，ROS的荧光强度分别为41000、37500、32700，说明本申请高压均质处理和高速微射流处理制备的多重透明质酸纳米组合物能有效清除体内自由基；与游离透明质酸(4号样品)ROS荧光强度(50600)比较，实施例6、8、10制得的纳米组合物对ROS荧光强度的降低具有显著性差异，表明透明质酸经纳米组合物包载后能更有效地清除HSF细胞中氧化应激的ROS，具有更显著的抗氧化性能。
测试例7
细胞抗炎试验
测试样品：同测试例6。
将HSF细胞以每孔8×103个细胞的密度接种到96孔板中，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养24h。培养结束后吸出细胞板中的培养基，实验分为空白对照组、模型组和给药组，除空白对照组外，每孔加入1mg/mL的LPS建立细胞炎症模型，给药组中分别加入测试样品，空白对照组加入等体积的无血清培养基，继续培育48h。48h后收集细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明书要求进行炎症因子TNF-a检测，计算细胞上清液TNF-a的含量，实验结果见图7、表7。
表7 1～4号样品炎症因子TNF-a含量结果
样品名称 空白对照 模型组 1号样品 2号样品 3号样品 4号样品
TNF-a含量(ng/mL) 4.13 12.32 6.94 6.31 5.82 8.52
根据图7和表7可以看出，经LPS诱导后，模型组TNF-a的含量显著上升，说明本试验细胞炎症模型建立成功。与模型组TNF-a的含量(12.32ng/mL)比较，实施例6、8、10制得的纳米组合物均能显著降低TNF-a的含量，TNF-a的含量分别为6.94ng/mL、6.31ng/mL、5.82ng/mL，说明本申请高压均质处理和高速微射流处理制备的多重透明质酸纳米组合物能显著抑制细胞炎症；与游离透明质酸(4号样品)TNF-a的含量(8.52ng/mL)比较，实施例6、8、10制得的纳米组合物对TNF-a的含量的降低具有显著性差异，表明透明质酸经纳米组合物包载后能更有效地抑制细胞中的炎症，具有更显著的抗炎、加速创面愈合功能。
测试例8
体外表皮细胞抗干燥损伤(保湿、修复)实验
测试样品：同测试例6。
建立细胞干燥损伤模型，采用MTT法检测细胞抵抗干燥、防止脱水死亡、细胞修复的能力，从而反映多重透明质酸纳米组合物抗干燥损伤、修复、保湿的功效。
收集生长至融合率达80％以上的表皮细胞，加入不含血清的MEM培养基作同步化处理12h，胰酶消化收集，计数后调整细胞浓度，接种至96孔培养板。实验分为空白对照组、模型组和给药组，待细胞贴壁后，给药组加入待测样品进行孵育。24h后，空白对照组不作任何处理，模型组和给药组置于超净台内一定风速下进行干燥处理后，各组加入新鲜培养基，继续培养24h，进行MTT测定。
按以下公式计算细胞干燥死亡率(％)和防护率(％)，试验结果如图8、表8、表9。
细胞干燥死亡率(％)＝(1-检测组OD值/空白对照组OD值)×100％
细胞防护率(％)＝(模型组细胞干燥死亡率－给药组细胞干燥死亡率)/模型组细胞干燥死亡率×100％
表8 1～4号样品细胞干燥死亡率结果
样品名称 空白对照 模型组 1号样品 2号样品 3号样品 4号样品
细胞干燥死亡率/％ 0 58.7 30.6 28.5 25.1 38.2
表9 1～4号样品细胞防护率实验结果
组别 防护率/％
1号样品 47.87
2号样品 51.45
3号样品 57.24
4号样品 34.92
根据图8和表8可以看出，经干燥处理后，模型组细胞干燥死亡率显著上升，说明本试验细胞干燥损伤模型建立成功。与模型组干燥死亡率(58.7％)比较，实施例6、8、10制得的纳米组合物均能显著降低细胞的死亡率，细胞干燥死亡率分别为30.6％、28.5％、25.1％，说明本申请高压均质处理和高速微射流处理制备的多重透明质酸纳米组合物具有优异的抵抗干燥、防止细胞脱水死亡、细胞修复的能力；与游离透明质酸(4号样品)干燥死亡率(38.2％)比较，实施例6、8、10制得的纳米组合物对细胞干燥死亡率的降低具有显著性差异，表明透明质酸经纳米组合物包载后能提高透明质酸的水合能力，具有更优异的保湿和修复受损细胞的功效。
根据表9结果可以看出，1～3号样品细胞防护率明显高于4号样品，表明透明质酸经纳米组合物包载后可显著抵御干燥对表皮细胞的损伤，减少干燥对细胞活力的影响，提高表皮细胞的防护率。
测试例9
保湿功效测定
分别取应用例2、应用例1、对比例3制得的纳米复合透明质酸膏霜、普通复合透明质酸膏霜进行皮肤保湿功效评价测试，测试仪器为德国CK公司生产的皮肤水分含量测试仪CM825。
选取25名皮肤健康、无化妆品过敏史、年龄在20～35岁之间的志愿者作为受试者，选择受试者左、右手臂内侧距手掌基部5cm处为试验部位，试验面积为5×5cm2，分别按(2.0±0.1)mg/cm2的用量进行涂抹应用例2、应用例1、对比例3制得的纳米复合透明质酸膏霜、普通复合透明质酸膏霜，试验前，受试者统一清洁双手前臂内侧，在恒温恒湿环境(温度20℃±2℃，相对湿度50％±10％)中静坐30min，然后测试受试者试验区域的空白值和使用霜剂0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、12h后皮肤的含水量，每次测量平行测定5次，取平均值。在手臂内侧设置空白对照区域，空白对照区域不做任何处理，在同样时间点测试空白对照区域的含水量，按以下公式计算皮肤含水量校准改善率和皮肤含水量变化率，将得到的结果绘制成图9、图10、表10、表11。
校准改善率(％)＝[(X样品t-X样品0)-(X空白t-X空白0)]/[X样品0+(X空白t-X空白0)]×100％；
皮肤含水量变化率(％)＝(X样品t-X样品0)/X样品0×100％；
其中X为皮肤含水量。
表10应用例2、应用例1与对比例3校准改善率实验结果
Figure BDA0002939630760000241
表11应用例2、应用例1与对比例3皮肤含水量变化率实验结果
Figure BDA0002939630760000242
由图9、图10及表10、表11可知，应用例1、应用例2制备的纳米复合透明质酸膏霜和对比例3制备的普通复合透明质酸膏霜保湿趋势基本一致，但纳米复合透明质酸膏霜的即时保湿效果和长时保湿效果均优于活性物浓度相同的普通复合透明质酸膏霜，且具有显著性差异，涂抹应用例1纳米复合透明质酸膏霜0.5h后，与涂抹前相比，皮肤含水量增加36.54％，12h后皮肤含水量增加仍达10.78％，而涂抹活性物浓度相同的普通复合透明质酸膏霜0.5h后，皮肤水含量仅增长26.25％，12h后皮肤水含量增加仅有7.30％。表明透明质酸经纳米包载后小分子透明质酸能快速穿透皮肤表层到达皮肤深层组织，并且能在皮肤内长时间滞留，使活性物长时间维持在有效浓度，使纳米组合物即时保湿效果显著；经纳米包载后大分子透明质酸能进入皮肤表层，形成一层透气薄膜，可以加强皮肤屏障功能，减少皮肤内部水分蒸发，使纳米组合物长时保湿效果显著，实现了不同分子量透明质酸活性成分的皮肤靶向输送，本申请高压均质处理和高速微射流处理制备的多重透明质酸纳米组合物具有优异的皮肤保湿、补水功效。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一种多重透明质酸纳米组合物，由寡聚透明质酸、低分子透明质酸、中分子透明质酸、高分子透明质酸、油脂、乳化剂、多元醇、促渗剂、阻滞剂和水组成；
所述的纳米组合物的制备方法，包括以下步骤：
将寡聚透明质酸、低分子透明质酸、中分子透明质酸、高分子透明质酸和水混合，得到水相；
将油脂、乳化剂和促渗剂混合，得到油相；
将所述油相与所述水相混合，得到第一混合物；
将多元醇和阻滞剂与所述第一混合物混合，得到第二混合物；
将所述第二混合物乳化后微米化处理，得到微米级分散体；
将所述微米级分散体进行纳米化处理，得到多重透明质酸纳米组合物。
2.根据权利要求1所述的纳米组合物，其特征在于，所述寡聚透明质酸的质量为纳米组合物总质量的0.1～10％；
所述低分子透明质酸的质量为纳米组合物总质量的0.1～10％；
所述中分子透明质酸的质量为纳米组合物总质量的0.01～1％；
所述高分子透明质酸的质量为纳米组合物总质量的0.01～1％。
3.根据权利要求1或2所述的纳米组合物，其特征在于，所述寡聚透明质酸的分子量<1WDa；
所述低分子透明质酸的分子量为1WDa～50WDa；
所述中分子透明质酸的分子量为50WDa～200WDa；
所述高分子透明质酸>200WDa。
4.根据权利要求1所述的纳米组合物，其特征在于，所述油脂包括植物油脂和合成油脂中的一种或多种；
所述乳化剂包括聚甘油乳化剂和聚醚类乳化剂中的一种或多种；
所述多元醇包括甘油、丁二醇、己基癸醇、聚乙二醇、丙二醇、二丙二醇、1，3-丙二醇和甲基丙二醇中的一种或多种；
所述促渗剂包括苯乙烯/VP共聚物、肉桂酸、肉桂醇和薄荷醇中的一种或多种；
所述阻滞剂包括1，4-环己二醇、1，2-己二醇和聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯中的一种或多种。
5.根据权利要求1或4所述的纳米组合物，其特征在于，以组合物总质量计，所述油脂为1～10％、乳化剂为1～20％、多元醇为10～30％、促渗剂为0.1～5％、阻滞剂为0.1～5％和余量的水。
6.权利要求1～5任意一项所述的纳米组合物的制备方法，包括以下步骤：
将寡聚透明质酸、低分子透明质酸、中分子透明质酸、高分子透明质酸和水混合，得到水相；
将油脂、乳化剂和促渗剂混合，得到油相；
将所述油相与所述水相混合，得到第一混合物；
将多元醇和阻滞剂与所述第一混合物混合，得到第二混合物；
将所述第二混合物乳化后微米化处理，得到微米级分散体；
将所述微米级分散体进行纳米化处理，得到多重透明质酸纳米组合物。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述混合的方式包括：在搅拌条件下将所述油相滴加至所述水相中。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述微米化处理为剪切乳化，所述纳米化处理为高压均质处理或高速微射流处理。
9.权利要求1～5任意一项所述多重透明质酸纳米组合物或权利要求6～8任意一项所述的制备方法制备得到的多重透明质酸纳米组合物在制备化妆品中的应用。
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