CN101914530A - 用于在植物繁殖组织中表达基因产物的调控序列 - Google Patents

Abstract

本文描述了使植物中转基因表达受到特异调节控制的表达盒，其中所述表达盒包括来自MARS基因家族的调控序列，用于在植物的繁殖组织中表达重组基因产物从而产生非生物性压力耐受植物。

Description

用于在植物繁殖组织中表达基因产物的调控序列

本申请是申请日为2005年4月19日、申请号为200580016385.X、发明名称为“用于在植物繁殖组织中表达基因产物的调控序列”的发明专利申请的分案申请。

发明领域

本发明包括含有来自靶基因的调控序列的表达盒，例如，来自MADS基因家族的调控序列，用于在植物中组织特异性的表达重组基因产物。

发明背景

在农业生物工程学上，植物可根据需要被加以修饰。完成这一任务的一条途径是利用现代遗传工程技术。例如，通过将目的基因引入植物中，植物就可被特异性的修饰以表现需要的表型特性。为此，非常普遍地采用含启动子区、编码区和终止区的异源基因转化植物。

当遗传改造某一异源基因以便于在植物中表达时，启动子的选择常常是一个关键的因素。尽管某些基因可能需要组成型表达，即在所有时间内都在整株植物中以及在大部分组织和器官中表达，但其它基因更需要只响应特定的刺激才表达或者局限于特殊的细胞或组织内。

启动子由启动子完全发挥作用所必需的几个区域组成。其中的一些区域是模块式的，换而言之它们可单独使用以使其具有启动子的活性，或者它们可与其它元件装配在一起构建成新的启动子。这些启动子区的第一个区位于编码序列的紧邻上游并形成含有一致序列的“核心启动子”，通常是位于编码序列紧邻上游的20-70个碱基对。核心启动子区包含TATA盒且常常是起始元件及起始位点。核心启动子区的准确长度不是固定的，但通常是可以很好的被识别的。这样的区域通常存在于大部分启动子中，也许有某些变化。位于各种已充分表征的元件之间的碱基序列较不重要。核心启动子区常常被称为最小的启动子区，因为它自身就能发挥作用而促进基础水平的转录。

核心启动子区的存在就确定了某一序列是启动子：如果没有该区域，启动子就无功能。核心区的作用在于将一般的转录系统吸引到启动子上以起始转录。不过，核心启动子区不足以提供完全的启动子活性。通常位于核心区上游的一系列调控序列组成了启动子的其余部分。调控序列决定了表达水平、表达的空间和时间模式，以及对于某些启动子而言，决定了在诱导条件下的表达(受诸如光、温度、化学物质和激素等外界因素的调节)。调控序列可以是6-100个碱基对长的短DNA序列区，确定了诸如转录因子等反式作用因子的结合位点。调控序列还可以是增强子，较长的DNA序列区，可从离核心启动子区较远的位置发挥作用，有时离核心区相隔数千个碱基。调控序列活性可受反式作用因素影响，包括一般的转录系统、转录因子和染色质装配因子。

研究中常常需要目的基因在植物中组织特异性的表达。组织特异性启动子专一地启动某一批组织中的表达，而不是在整株植物中表达；组织偏好的启动子在某亚类组织中启动高水平表达，而在植物的其它组织中则启动的表达处于显著较低水平。例如，研究者可能需要使某一增值产物只在玉米粒中表达而不在植物的其余部分表达。另一例子是通过组织特异性切除造成雄性不育。

组织特异性启动子可以在植物生长周期的特定时间或时间段表达于特定的组织中。不过，表达水平足够高的基因产物，尤其是那些被定向在特定组织中表达的基因产物，还是难以获得的(Iyer M.等(2001))。已知mRNA的5′非翻译前导序列、内含子和mRNA的3′非翻译区影响特定基因的表达。例如，Sieburth，L.E.和Meyerowitz，E.M.(1997)报道了基因内序列似乎是拟南芥MADS盒基因AGAMOUS(AG)基因表达所必需的，以花朵发育正常的早和稍晚的独特表达模式体现。Larkin J.C.等人(1993)报道了缺失拟南芥GLABROUSI(GL1)基因的3′非编码区负面影响了GL1的功能。不过，迄今为止，辨别和确定特定的调控区并将它们掺入固定特性投递平台中是仍未完成的工作。

本发明的重要方面是以发现来自MADS基因家族的DNA序列在开发于植物繁殖组织中表达重组基因的强表达盒中格外有用。

发明简述

本发明包括许多不同的方面，包括通过鉴别来自MADS基因家族的调控序列并将所述序列掺入用于在植物繁殖组织中表达重组基因产物的表达盒内而对植物中的转基因表达进行特定调节控制。

本发明涉及如下方法：通过鉴别靶基因，利用相应的cDNA序列分析gDNA序列以鉴别靶基因的调控序列，并将一种或多种调控序列掺入具有核酸分子的表达盒中，由此构建表达盒。用本发明表达盒转化的植物以模拟靶基因表达的方式表达核酸分子的产物。

本发明涉及植物中转基因表达的特异调节控制，包括使转基因定向表达于玉米、稻和其它单子叶植物内正在发育的繁殖组织中。本发明表达盒的用途包括表达葡萄糖或蔗糖转运蛋白以提高繁殖组织储备能力(sink strength)。

储备能力也可通过花朵特异性表达转化酶基因或者一种或更多种海藻糖代谢基因而得以提高。本发明进一步包括通过特异转运蛋白的表达增加来增强小分子摄取的能力。

定义

术语“开放阅读框架”和“ORF”指编码序列的翻译起始密码子和终止密码子之间序列所编码的氨基酸序列。术语“起始密码子”和“终止密码子”指在编码序列中分别指定蛋白质合成(mRNA翻译)起始和链终止的三个毗连核苷酸组成的单位(“密码子”)。

术语“非生物性压力”指对植物具有不利影响的无生命的环境因素，诸如霜冻、干旱、过热、大风等。

术语“核酸”指高分子量的多核苷酸，可以是单链或者双链，由含糖、磷酸和嘌呤或嘧啶碱基的单体(核苷酸)组成。“核酸片段”是给定核酸分子的一部分。在高等植物中，脱氧核糖核酸(DNA)是遗传物质，而核糖核酸(RNA)则涉及将DNA中所含信息转移到蛋白质中。“基因组”是生物体各个细胞中所含的遗传物质的总体。术语“核苷酸序列”指DNA或RNA多聚体，可以是单链或双链，任选的含有合成的、非天然的或改造过的能掺入DNA或RNA多聚体中的核苷酸碱基。

除非另外指出，不言自喻本发明的具体核酸序列还包括其保守性修饰的变体(如简并密码子取代)和互补序列以及明确指明的序列。具体地，通过产生其中一个或多个选定(或者全部)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列可完成简并密码子置换(Batzer等Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；和Rossolini等，Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。术语核酸可与基因、cDNA和基因编码的mRNA互换使用。

“可操作性的连接”指单个核酸片段中核酸序列的相互联系从而使某一序列的功能受到另一段序列的影响。例如，当启动子能影响编码序列或功能性RNA的表达时(即，编码序列或功能性RNA受启动子的转录调控)，则它是与编码序列或功能性RNA可操作性连接的。有义或反义方向的编码序列可与调控序列可操作性的连接。

“启动子”指某一段核苷酸序列，通常在其编码序列的上游(5′)，通过提供RNA聚合酶的识别以及正确转录所需的其它因子来调控编码序列的表达。“启动子调控序列”包括最接近的和稍远的上游元件。启动子调控序列影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译。调控序列包括增强子、启动子、非翻译前导序列、内含子和聚腺苷酸化信号序列。它们包括天然的和合成的序列以及可以是合成和天然序列的组合的序列。“增强子”是可刺激启动子活性的DNA序列，它可能是启动子的内在元件或者是被插入以增强启动子的水平或组织特异性的异源元件。它能以两种方向(正常的或者翻转的)发挥功能，并且在即使移动到启动子的上游或下游的情况下仍能发挥作用。术语“启动子”的意思包括“启动子调控序列”。

“初级转化子”和“T0代”指与起始转化的组织属于相同遗传代数的转基因植物(即转化后未经过减数分裂和受精)。“次级转化子”和“T1、T2、T3等世代”指通过一次或多次减数分裂和受精周期来自初级转化子的转基因植物。它们可能来自初级或次级转化子的自体受精或者初级或次级转化子与其它被转化或未转化植物的杂交。

“基因”指表达mRNA、功能性RNA或特异蛋白质的核酸，包括调控序列。术语“天然基因”指在自然界中发现的基因。术语“嵌合基因”指包含以下元件的任何基因：1)DNA序列，包括在自然界中未发现在一起的调控和编码序列，或者2)编码非天然毗连的蛋白质部分的序列，或3)非天然毗连的启动子部分。因此，嵌合基因可包含来自不同来源的调控序列和编码序列，或者包含来自同一来源、但以不同于天然状态的方式排列的调控序列和编码序列。“转基因”指通过转化引入基因组中并且稳定保持的基因。转基因可包括，例如，与待转化的特定植物的基因异源或同源的基因。此外，转基因可包含插入非天然生物体或嵌合基因内的天然基因。术语“内源基因”指在生物体基因组中它的自然位点处的天然基因。“外源的”基因指通常在宿主生物体中未发现而是通过基因转移引入生物体的基因。

“表达盒”用于此处意指能指导特定核苷酸序列在适当的宿主细胞中表达的DNA序列，包括与连接了终止信号的目的核苷酸序列可操作性联接的启动子。通常还包括核苷酸序列正确翻译所需要的序列。编码区通常编码目的蛋白质，但也可编码功能性的目的RNA，例如有义或反义方向的反义RNA或非翻译RNA。包含目的核苷酸序列的表达盒可能是嵌合的，意味着其中至少一种组分相对于至少另一种其它组分而言是异源的。

“内含子”指几乎只在真核基因中存在但在基因产物中不被翻译成氨基酸序列的DNA的间插部分。内含子通过所谓的剪接过程从预成熟的mRNA中被除去，留下未改变的外显子，形成mRNA。就本发明的目的而言，术语“内含子”的定义包括对源自靶基因的内含子的核苷酸序列进行修饰，只要被修饰的内含子不会显著降低与其相联的5’调控序列的活性即可。

“外显子”指携带某一蛋白质或其一部分的编码序列的DNA区段。外显子被间插的非编码序列(内含子)隔开。就本发明的目的而言，术语“外显子”的定义包括对来自靶基因的外显子核苷酸序列进行的修饰，只要被修饰的外显子不会显著降低与其相联的5’调控序列的活性即可。

附图简述

图1A和1B是OsMADS5 cDNA的图示以及携带OsMADS5 cDNA序列的OsMADS5 gDNA的注释。

图2A是OsMADS5装配载体的图示。

图2B是OsMADS5二元载体的图示。

图3包括显示T1代玉米中在授粉前5天OsMADS5驱动的GUS活性的组织化学定位的扫描图片：(A)穗(ear)的纵切片(B)穗的横切片(C)穗结节(穗已除去)，(D)穗结节下的结节(E)穗状雄花(tassel)(F)叶和(G)穗丝。

图4包括显示T1代玉米中在授粉后OsMADS5驱动的GUS活性的组织化学定位的扫描图片：授粉后1天收获的穗组织的(A)纵切片和(B)横切片，以及授粉后2天收获的穗组织的(C)纵切片和(D)横切片。

图5包括显示T1代玉米中核成熟期间OsMADS5驱动的GUS活性的组织化学定位的扫描图片：授粉后5天收获的穗组织的(A)横切片和(B)纵切片；授粉后10天收获的穗组织的(C)横切片和(D)纵切片；以及授粉后20天收获的穗组织的(E)横切片和(F)纵切片。

图6A和6B是OsMADS 6 cDNA的图示以及携带OsMADS6 cDNA序列的OsMADS6 gDNA的注释。

图7A是OsMADS6装配载体的图示。

图7B是OsMADS6二元载体的图示。

图8包括显示T1代玉米营养组织中OsMADS6驱动的GUS表达的组织化学定位的扫描图片：(A)在授粉前两天的穗丝中，以及在授粉前8天的(B)叶盘，(C)穗状雄花中以及在(D，E)穗结节的纵横切片中。

图9包括显示T1代玉米穗组织中OsMADS6驱动的GUS表达的组织化学定位的扫描图片：授粉前8天正在发育的穗的(A)纵切片和(B)横切片；以及授粉前2天正在发育的穗的(C)纵切片和(D)横切片。

图10包括显示T1代玉米穗组织中OsMADS6驱动的GUS表达的组织化学定位的扫描图片：授粉第一天的(A)横切片和(B)纵切片；以及授粉第三天的(C)横切片和(D)纵切片。

图11包括显示成熟期间T1代玉米穗组织中OsMADS6驱动的GUS表达的组织化学定位的照片：授粉后第5天的(A)纵切片和(B)横切片；以及授粉后第14天的(C)纵切片和(D)横切片；以及授粉后第25天的(E)纵切片和(F)横切片和(G)核。

图12是用OsMADS8 cDNA序列阐释OsMADS8 gDNA的图解。

图13A是OsMADS8装配载体的图示。

图13B是OsMADS8二元载体的图示。

图14包括显示T1代玉米中OsMADS8驱动的GUS表达的组织化学定位的扫描图片：(A)穗状雄花，(B)叶孔，(C)从小花穗脱离的穗丝，(D)穗节，(E)穗节下面的结节，(F)贯穿来自授粉前5天左右组织的正在发育的穗的横切片和(G)纵切片。

图15包括显示T1代玉米中OsMADS8驱动的GUS表达的组织化学定位的扫描图片：观察正在发育的穗的(A)横切片和(B)纵切片；以及(C)授粉前3天所取组织的彩色小花穗，以及授粉当日所取谷穗的(E)横切片和(F)纵切片，以及授粉后1天所取谷穗的(F)横切片和(G)纵切片，以及授粉后6天所取谷穗的(H)横切片和(I)纵切片。

图16包括显示T1代玉米中OsMADS8驱动的GUS表达的组织化学定位的扫描图片：授粉后11天所取的正在发育的谷穗的(A)横切片和(B)纵切片；以及授粉后14天所取的正在发育的谷穗的(C)横切片和(D)纵切片，以及授粉后20天所取的正在发育的谷穗的(E)横切片和(F)纵切片。

图17是用OsMADS13 cDNA序列阐释OsMADS 13 gDNA的图示。

图18是OsMADS13装配载体的图示。

图19是OsMADS13二元载体的图示。

图20包括显示授粉5天前所取的T1代玉米第一片充分展开的叶子中、(B)穗丝中；(C)穗状雄花的小花穗中、(D)正在发育的谷穗的纵切片；和(E)正在发育的谷穗的横切片中OsMADS13驱动的GUS活性的组织化学定位扫描图片。

图21包括显示授粉前5天左右T1代玉米中OsMADS13-驱动的GUS活性的组织化学定位的扫描图片，分别取自(A)第一片充分展开的叶子；(B)穗丝；(C)穗状雄花的小花穗，以及(D)贯穿已出现谷穗的结节的茎向切片。

图22包括显示T1代玉米株中OsMADS13-驱动的GUS活性的组织化学定位的扫描图片，所述玉米珠取自授粉前7天左右正在发育的谷穗纵向切片：(A)株编号#18和(B)株编号#5以及授粉前5天株号#4的(C)横切片和(D)纵切片。

图23包括显示授粉后4天收获的(A，B)和授粉后6-7天收获的(C)成熟玉米谷穗中OsMADS13-驱动的GUS活性的组织化学定位的扫描图片。

图24是显示授粉后21天收获的成熟玉米OsMADS 13谷穗中OsMADS13-驱动的GUS活性的组织化学定位的扫描图片。

图25包括来自用(A)OsMADS5、(B)OsMADS6、(C)OsMADS8和(D)OsMADS13转化的植物的T1代种子的扫描图片。通过组织化学定位评估GUS表达。种子在无菌培养基中发芽并培养10天。用组织化学试剂真空浸润幼苗并在37℃保温24小时，然后用乙醇清除。在(A)、(C)和(D)的气生组织中有很轻的着色。否则就检测不到GUS活性。在根部未观察到GUS活性。

图26显示了T6PP蛋白质的序列比对。

图27A显示的是OsMADS6-OsT6PP-装配载体。

图27B显示的是OsMADS6-OsT6PP-二元载体。

图28显示了在干旱压力研究中OsMADS6-T6PP-3转基因对产率的影响。

发明详述

本发明包括构建表达盒的方法，该方法基于的是鉴定靶基因并将选定靶基因的已修饰调控元件掺入表达盒中。例如，将来自在根、茎、叶或繁殖组织中表达的、并且提供昆虫抗性、除草剂耐受性或非生物压力耐受性的基因的调控元件插入表达盒中以便在植物中产生接近模拟原始靶基因表达图谱的转基因事件。因此，可以从基因表达数据中鉴定出靶基因。

本发明还涉及掺入目的靶基因的调控机制以便在植物中以模拟原始靶基因表达图谱的方式表达目的核酸分子产物的表达盒。

本发明进一步包括掺入5′-MADS基因调控序列以便在植物繁殖组织中表达核酸分子产物的表达盒，另外还包括掺入MADS 5′-和3′-调控序列的表达盒。

本发明还包括掺入5′-MADS基因调控序列并进一步掺入5′-MADS基因外显子的表达盒。

本发明还包括掺入5′-MADS基因调控序列并进一步掺入5′-MADS基因外显子和5′-MADS基因内含子的表达盒。

本发明进一步包括掺入5′-MADS基因调控序列、以及另外掺入5′-MADS基因外显子、5′-MADS基因内含子和第二个外显子的表达盒。

本发明还包括而且更多的包括掺入MADS 5′-和3′-调控序列的表达盒，其中所说的3′-调控序列包括3′-非翻译序列和3′-非转录序列。

就本发明的目的而言，术语“3’-非翻译序列”的定义包括对来自靶基因的3’-非翻译序列的核苷酸序列进行的修饰，只要被修饰的3’-非翻译序列不会显著降低其相关3’调控序列的活性即可。

就本发明的目的而言，术语“3’-非转录序列”的定义包括对来自靶基因的3’-非转录序列的核苷酸序列进行的修饰，只要被修饰的3’-非转录序列不会显著降低其相关3’调控序列的活性即可。3′-非转录序列延伸至转录终止位点下游约0.5至1.5kb处。

本发明还包括掺入MADS 5′-和3′-调控序列的表达盒，其中所说的3′-调控序列包括3′-非翻译序列以及3′-非转录序列，而且可能进一步包括所说的MADS基因的内含子。

一般而言，MADS基因对植物繁殖结构的发育有所贡献(De Bodt等，2003)。例如，DoMADS3基因特异表达于花梗组织中(Yu和Goh，2000)。选择适于开发表达盒的OsMADS基因家族的基因，因为它们编码表达于早期稻花朵中的MADS-转录因子(Kang和An，1997)。由OsMADS基因家族基因编码的蛋白质与兰花DoMADS3基因(GenBank收编号AF198176)编码的相似。本发明认为稳定或提高诸如玉米等单子叶植物中的产量的方法是为了提高繁殖组织中的贮存力(sink strength)。因此，用于产生繁殖组织中贮存力提高的植物的转基因方法将得益于造成在植物繁殖组织中特异表达的启动子的应用。本发明因此包括利用表达盒中的OsMADS基因5′-和3′-调控序列使转基因表达定向于正在发育的繁殖组织。基因调控序列已被鉴定且依照本发明加以利用的MADS基因编码下表的MADS蛋白(表1)。将MADS蛋白质与DoMADS3基因编码的蛋白质进行了同一性和相似性百分率的比较。

表1(见原文第10-11页)

因此，本发明包括适于主要在植物繁殖组织中表达核酸分子产物的表达盒，该表达盒含有MADS基因的启动子、第一个外显子、第一个内含子和第二个外显子，其中所说的启动子、第一个外显子、内含子和第二个外显子是所说表达盒的5′-调控序列；其中所说的5′-调控序列经改造而大约在所说5’-调控序列的3’-末端具有翻译起始密码子，而且不含妨碍用重组DNA方法进行操作的限制性内切核酸酶位点或所述翻译起始密码子上游的附加翻译起始密码子；不含妨碍重组DNA方法处理的限制性内切核酸酶位点的MADS基因的3′-调控序列；与所说的5′-调控序列和所说的3′-调控序列可操作性连接的核酸分子。

重组DNA方法需要在待联接的DNA分子末端存在特异的限制性内切核酸酶位点。最有效的实践要求某一分子中的所述位点与另一分子中的所述位点互补。例如，具有SacI和NotI限制性内切核酸酶位点的质粒需要克隆在其末端具有SacI和NotI限制性内切核酸酶位点的目的基因。理想的，这些位点是唯一的，即它们不应出现于任一分子中的任何其它位置处。如果这些位点出现在内部，它们就会妨碍用重组DNA方法进行处理并且应被除去。定位诱变是除去所述位点的一种方法。诸如部分消化然后凝胶纯化适当大小的片段等技术也可达到这一目的而不会消除内部的限制性内切核酸酶位点，但是效率太低因而不太合乎需要。

本发明认为多核苷酸分子的化学合成，即利用合成化学技术而非酶介导的技术，可取代或代替重组DNA方法用于构建含有特异核苷酸序列的多核苷酸分子。

本发明进一步包括用于构建表达盒的方法，包括如下步骤：基于其表达数据或其所编码的蛋白质与另一目的基因所编码的蛋白质的相似性选择靶基因；确定所说靶基因cDNA的开放阅读框架；用eDNA注释靶基因gDNA来确定所述靶基因gDNA的翻译起始密码子、翻译终止密码子、第一个内含子、第一个外显子、第二个外显子、3′-非翻译序列和3′-非转录序列的位置；将含有所述启动子、第一个外显子、第一个内含子和第二个外显子的5′-调控序列以及含有3’-非翻译序列和3’-非转录序列的3′-调控序列加入表达盒中；将核酸分子与所述表达盒的所述5′-调控序列和所述3′-调控序列可操作性的连接，其中所说的核酸分子以模拟所说目的靶基因表达图谱的方式被表达。

实施例1：构建含有来自MADS基因家族的调控序列的表达盒的方法。

1.确定靶MADS基因。

2.确定靶基因组DNA(gDNA)和cDNA二者的高保真序列。

3.确定cDNA上靶基因的开放阅读框架。通常这是最长的开放阅读框架。

4.用候选基因的cDNA序列注释gDNA序列并标示翻译起始密码子、翻译终止密码子、内含子、外显子、5′-非翻译前导序列和3′-非翻译序列的位置。正如本领域所已知的，标示翻译起始密码子和翻译终止密码子确定了基因的5′-调控序列和3′-调控序列。依照本发明，包括启动子调控序列在内的启动子是从翻译起始密码子上游延伸约1.5至2.5kb的序列，其中本发明的3′-调控序列包括位于翻译终止密码子紧邻下游的3′-非翻译序列以及所有或部分3′-非转录序列，它在转录终止位点下游延伸0.5至1.5kb。在本发明的某一实施方案中，5′-调控序列包括启动子、第一个外显子、第一个内含子和第二个外显子。

举例而言，图1A和1B描述了用OsMADS5 cDNA序列对OsMADS5 gDNA的注释。将gDNA毗连序列群(来自GenBank的AB026295和CL000624.108(SEQ ID NO.500)加CL019873.131(SEQ ID NO.521))与OsMADS5 cDNA序列(GenBank收编号U78890)进行序列比对。cDNA序列被分开成相应的外显子。依照cDNA碱基数对外显子进行标记。对两种序列进行准确的序列比对，而间插序列(内含子)侧翼为GT..AG边界。外显子之间的缺口代表了内含子。AB026295片断是整个细菌人工染色体(BAC)序列的一部分。AB026295(启动子)是来自BAC的、定义用于启动子开发的序列的附加片段。

5.设计加入了来自MADS基因的如下组分的表达盒：a.启动子，在翻译起始密码子处开始并向翻译起始密码子上游延伸大约1.5至2.5kb；b.第一个外显子；c.第一个内含子；d.第二个外显子的最5′-部分；e.终点，包括3′-非翻译序列和3′-非转录序列，在转录终止位点下游延伸0.5至1.5kb。终点可进一步包含内含子。简而言之，本发明的“5’-调控序列”包括组分a-d，而本发明的“3′-调控序列”指组分e。

6.通过高保真PCR由适当gDNA模板扩增5′-调控序列并克隆入合适的细菌载体中。

用高保真PCR扩增来自稻基因组DNA(gDNA)的5′-调控序列。50μL反应混合物中含100ng稻gDNA、200μM dNTPs(dATP，dCTP，dGTP，TTP)、为扩增5’-调控gDNA而设计的寡核苷酸引物(表2)每种各1μL 20μM、1μL 10X Expand高保真缓冲液和1μL Expand高保真聚合酶(Roche Diagnostics，Cat.No.1 759 078)。热循环程序是95℃2分钟，然后是40个循环(94℃15秒，68℃7.5分钟)，然后68℃10分钟。用TOPO XL PCR克隆试剂盒(Invitrogen，Cat.No.K4750-20)克隆5’-调控gDNA产物。pCR-XL-TOPO-5′-调控-gDNA通过用EcoRI(New England Biolabs)消化5μL pCR-XL-TOPO-5′-调控-gDNA小提DNA(用来自Qiagen的QIAprep Spin Miniprep流程制备，Cat.No.27106)进行鉴定，该20μL反应体系中含2μg BSA和2μL 10X EcoRI限制性内切核酸酶缓冲液(New England Biolabs)。反应在37℃保温2小时，然后将pCR-XL-TOPO-5′-调控-gDNA(EcoRI)产物用1％TAE琼脂糖分离。用ABI PRISM染料终止循环测序试剂盒(Perkin Elmer)对pCR-XL-TOPO-5′-调控-gDNA克隆进行测序。

7.用高保真PCR由适当gDNA模板扩增“3′-调控序列”并克隆入合适的细菌载体中。

用高保真PCR扩增来自稻gDNA的3′-调控序列。50μL反应混合物中含100ng稻gDNA、200μM dNTPs、为扩增3’-调控gDNA而设计的寡核苷酸引物(表2)每种各1μL 20μM、1μL 10X Expand高保真缓冲液和1μL Expand高保真聚合酶。热循环程序是95℃2分钟，然后是40个循环(94℃15秒，68℃7.5分钟)，然后在68℃10分钟。依照制造商的说明用TOPO XL PCR克隆试剂盒(Invitrogen，Cat.No.K4750-20)克隆3’-调控gDNA产物。pCR-XL-TOPO-3′-调控-gDNA是通过用EcoRI消化5μL pCR-XL-TOPO-3′-调控-gDNA小提DNA进行鉴定的，该20μL反应体系中含2μg BSA和2μL 10X EcoRI限制性内切核酸酶缓冲液。反应在37℃保温2小时，然后将pCR-XL-TOPO-3′-调控-gDNA(EcoRI)产物用1％ TAE琼脂糖分离。然后对pCR-XL-TOPO-3′-调控-gDNA克隆进行测序。

8.将5′-调控序列和3′-调控序列组装于任一细菌质粒中。将本发明的表达盒装配于载体pNOV6901中，又已知为“装配载体”。该载体含有GUS报道基因的编码序列(由内含子破坏以防止细菌的表达)，在其5′-和3′-末端侧翼有独一无二的限制性切点(多接头)以方便进行重组DNA操作。正如本领域技术人员所已知的，还可使用任何数目的其它载体。

9.如果有必要，可以在表达盒中插入限制性切点以方便进行重组DNA操作。在下面，“改造过的”翻译起始密码子是NcoI限制性切点(CCATGG)中的ATG。如果在“表达盒5’-调控序列”中有任何NcoI限制性切点，它们必须通过诱变消除。同样的，用于装配表达盒的限制性切点必须通过诱变消除。

将第一个内含子插入“表达盒5’-调控序列”中需要对序列进行修饰以避免在天然编码序列(该天然编码序列通常被翻译成由靶基因编码的蛋白质)和由表达盒驱动的“目的基因”(核酸分子)之间产生融合。这可通过任意多种诱变方法来完成，包括用Stratagene QuikChange多位点定向诱变试剂盒(Cat.No.200513)进行的方法。对表达盒5′-调控序列进行的修饰包括：a.修饰靶基因的天然翻译起始密码子以便靶基因的蛋白质编码序列沉默。b.修饰存在于“被沉默的”翻译起始密码子和“改造过的”翻译起始密码子之间序列中的任何其它翻译起始密码子以保证所述的密码子是不可操作的。c.修饰5′-调控序列中的任何NcoI位点。d.如果需要，修饰限制性内切核酸酶位点以方便表达盒装配。

在本发明的实施方案中，所述的方法不除去核苷酸。相反，它对它们进行了修饰以保持表达盒中5’-调控序列的长度，但仍沉默了候选基因的蛋白质编码序列。不过，可以考虑除去一个或多个所述核苷酸以使不合需要的蛋白质表达沉默，只要表达盒的5′-和3′-调控序列继续增强候选基因在植物繁殖组织中的表达即可。此外，本领域技术人员不会认为改变含有调控序列的多核苷酸分子中的核苷酸序列是不合理的，只要被修饰的调控序列保持与原始调控序列相关的大部分活性即可。

表2列举了为了完成这一任务针对来自MADS家族的各种5’-调控序列设计的引物。Stratagene QuikChange多位点定向诱变试剂盒利用了各个基因的pCR-XL-TOPO-5′-调控-gDNA克隆作为模板，依照本发明用的所列用于诱变该克隆的引物。所述引物必须含有5′-磷酸基团才能发挥功能。此外，改造可能需要一轮以上的诱变。用ABI PRISM染料终止子循环测序试剂盒(Perkin Elmer)对修饰过的pCR-XL-TOPO-5′-调控克隆进行测序。

10.在某些情况下，修饰3′-调控序列消除限制性内切核酸酶位点以方便进行重组DNA操作。“改造过的”翻译起始密码子是NcoI限制位点(CCATGG)中的ATG。如果在“表达盒3’-调控序列”中存在任何NcoI限制性切点，它们必须被诱变消除。同样地，这可以用任何多种诱变方法完成。因此本发明包括：a.修饰3′-调控序列中的任何NcoI位点。b.如果需要，修饰限制性内切核酸酶位点以方便表达盒的装配。

在本发明的该实施方案中，所述的方法并不除去核苷酸。相反，它对它们进行了修饰以保持表达盒中3’-调控序列的长度。不过，可以考虑除去一个或多个所述核苷酸以使不合需要的蛋白质表达沉默，只要表达盒的5′-和3′-调控序列继续增强候选基因在植物繁殖组织中的表达即可。此外，本领域技术人员不会认为改变含有调控序列的多核苷酸分子中的核苷酸序列是不合理的，只要被修饰的调控序列保持与原始调控序列相关的大部分活性即可。表2列举了为了完成这一任务而针对来自MADS基因家族的各种3’-调控序列设计的引物。利用各个基因的pCR-XL-TOPO-3′-调控-gDNA克隆作为模板，用所列举的引物诱变这些克隆。对修饰过的pCR-XL-TOPO-3′-调控克隆进行测序。

11.利用以修饰过的pCR-XL-TOPO-3′-调控克隆作为模板以及表2中所公布的适当引物对，通过PCR将3’-调控序列克隆入pNOV6901中。这些引物是将来自GUS 3’-末端多接头的单限制性酶切切点引入pNOV6901中的5’-寡核苷酸引物和引入稀有匹割的限制性切点(AscI、PacI、Sgfl或RsrII)以及随后对于3’-末端多接头而言唯一的限制性内切核酸酶位点的3’-寡核苷酸引物。在表2中，这些引物被列为“在pNOV6901中克隆3’-调控序列的引物”。

用高保真PCR由修饰过的pCR-XL-TOPO-3′-调控克隆扩增3’-调控序列。50μL反应混合物中含1μL小提DNA、200μM dNTPs，20μL寡核苷酸引物(表2)各1μM、5μL 10X Cloned PFU缓冲液和2.5个单位的Pfuturbo DNA聚合酶(Stratagene，Cat.No.600252)。热循环程序是95℃30秒，然后40个循环(95℃10秒，50℃60秒，72℃6分钟)，然后72℃10分钟。用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，Cat.No.28106)回收扩增的3’-调控序列DNA片段。将回收的3′-调控序列DNA片段用20μg糖原、0.3M CH₂COONa(pH 5.2)和2.5倍体积的乙醇在-20℃沉淀2小时以上。用微量离心回收3′-调控序列DNA片段，用70％乙醇洗涤，真空干燥并重悬于14μL ddH₂O中。在20μL反应体系中消化3′-调控序列DNA片段，该体系中含2μg BSA、2μL适当的10X限制性内切核酸酶缓冲液和2μL适当的限制性内切核酸酶。反应在37℃保温6小时以上。将消化后的3′-调控序列DNA产物在1.0％ TAE琼脂糖中分离并将合适的3′-调控序列(已消化的)带切出。用QIAquick凝胶抽提试剂盒(Qiagen，Cat.No.28704)提取和回收3’-调控序列(已消化的)DNA。用糖原载体乙醇沉淀回收的3′-调控序列(已消化的)DNA。微量离心回收3′-调控序列(已消化的)DNA片段，用70％乙醇洗涤，真空干燥并重悬于5μL ddH₂O。

在20μL反应混合物中消化2μg pNOV6901小提DNA，混合物中含2μg BSA、2μL适当的10X限制性内切核酸酶缓冲液(用于产生3′-基因调控序列)和2μL适当的限制性内切核酸酶(用于产生3′-基因调控序列)。反应混合物在37℃保温6小时以上，然后70℃20分钟。然后将1μL合适的10X限制性内切核酸酶缓冲液、1μL 1个单位/L的小牛肠碱性磷酸酶(CIP-New England Biolabs)和8μl ddH₂O加到反应混合物中并在37℃保温30分钟。将pNOV6901(已消化/CIP)DNA用1.0％ TAE琼脂糖分离并切下4.7kb的pNOV6901(已消化/CIP)条带。用QIAquick凝胶抽提试剂盒(Qiagen，Cat.No.28704)提取和回收pNOV6901(已消化/CIP)DNA。用糖原载体乙醇沉淀回收的pNOV6901(已消化的/CIP)DNA。微量离心回收pNOV6901(已消化/CIP)DNA，用70％乙醇洗涤，真空干燥并重悬于5μL ddH₂O。

在含1μL 10X T4 DNA连接酶缓冲液和1μL T4 DNA连接酶(400个单位/μL-New England Biolabs)的10μL连接混合液中将4.0μL 3’-调控序列(已消化)与4.0μL pNOV6901(已消化/CIP)连接。将连接混合物在16℃保温8小时以上。用5.0μL连接混合物转化50μL Top10感受态细胞(Invitrogen，Cat.No.C4040-03)。通过用1μL适当的限制性内切核酸酶在含1μg BSA和1μL适当的10X限制性内切核酸酶缓冲液的10μL反应体系中消化2μL pNOV6901-3′-调控序列小提DNA来检验pNOV6901-3′-调控序列重组子。消化在37℃保温2小时，然后用1％ TAE琼脂糖分离。对阳性pNOV6901-3′-调控序列重组子进行测序。

12.利用修饰过的pCR-XL-TOPO-5′-调控克隆作为模板并用表2所公布的适当引物对通过PCR将5’-调控序列克隆入pNOV6901-3′-调控序列中。这些引物是5′-寡核苷酸引物，它引入了与3’-调控序列所用的同样罕见的酶切限制性位点，前面是pNOV6901 5’-末端多接头中的唯一的限制性内切核酸酶位点；以及3′-寡核苷酸引物，它引入了一个NcoI位点，前面是在“改造过的”翻译起始密码子处的Kozak序列(CCACCATGG)。表2将这些引物列为“用于在pNOV6901中克隆5’-调控序列的引物”。

用高保真PCR扩增来自修饰过的pCR-XL-TOPO-5′-调控克隆的5’-调控序列。50μL反应混合物中含1μL小提DNA、200μM dNTPs，20μM寡核苷酸引物(表2)各1μL、5μL 10X Cloned PFU缓冲液和2.5个单位的Pfuturbo DNA聚合酶(Stratagene，Cat.No.600252)。热循环程序是95℃30秒，然后40个循环(95℃10秒，50℃60秒，72℃6分钟)，然后72℃10分钟。用QIAquick PCR纯化试剂盒回收已扩增的5’-调控序列DNA片段。将回收的5′-调控序列DNA片段用糖原载体乙醇沉淀。用微量离心回收5′-调控序列DNA片段，用70％乙醇洗涤，真空干燥并重悬于14μL ddH₂O中。在20μL反应体系中消化5′-调控序列DNA片段，该体系中含2μg BSA、2μL适当的10X限制性内切核酸酶缓冲液和2μL适当的限制性内切核酸酶，反应在37℃保温6小时以上。将消化后的5′-调控序列DNA产物在1.0％TAE琼脂糖中分离并将合适的5′-调控序列(已消化的)带切出。用QIAquick凝胶抽提试剂盒(Qiagen，Cat.No.28704)提取和回收5’-调控序列(已消化的)DNA。用糖原载体乙醇沉淀回收的5′-调控序列(已消化的)DNA。微量离心回收5′-调控序列(已消化的)DNA片段，用70％乙醇洗涤，真空干燥并重悬于5μL ddH₂O。

在20μL反应混合物中消化2μg pNOV6901-3’-调控序列小提DNA，该混合物中含2μg BSA、2μL适当的10X限制性内切核酸酶缓冲液和2μL适当的限制性内切核酸酶。反应混合物在37℃保温6小时以上，然后70℃20分钟。然后将1μL合适的10X限制性内切核酸酶缓冲液、1μL 1个单位/μL的CIP和8μL ddH₂O加到反应混合物中并在37℃保温30分钟。将pNOV6901-3’-调控序列(已消化/CIP)DNA用1.0％ TAE琼脂糖分离并切下pNOV6901-3’-调控序列(已消化/CIP)条带。提取和回收pNOV6901-3’-调控序列(已消化/CIP)DNA。用糖原载体乙醇沉淀回收的pNOV6901-3’-调控序列(已消化的/CIP)DNA。微量离心回收pNOV6901-3’-调控序列(已消化的/CIP)DNA，用70％乙醇洗涤，真空干燥并重悬于5μL ddH₂O。

在含1μL 10X T4 DNA连接酶缓冲液和1μL T4 DNA连接酶(400个单位/μL)的10μL连接混合液中将4.0μL 5’-调控序列(已消化)与4.0μL pNOV6901-3’-调控序列(已消化/CIP)连接。连接混合物在16℃保温8小时以上。用5.0μL连接混合物转化50μL Top10感受态细胞。通过用1μL适当的限制性内切核酸酶在含1μg BSA和1μL适当的10X限制性内切核酸酶缓冲液的10μL反应混合液中消化2μLpNOV6901-3′/5’-调控序列小提DNA来检验pNOV6901-3′/5’-调控序列重组子。消化在37℃保温2小时然后用1％ TAE琼脂糖分离pNOV6901-3′/5’-调控序列(已消化)DNA。对阳性pNOV6901-3′/5’-调控序列重组子进行测序。

本发明的表达盒包括装配载体中的GUS报道构建体。它的侧翼是改造过的、罕见的酶切限制性位点。在本发明的实施方案中，可用任一目的基因置换GUS报道基因，所用方法是本领域技术人员所已知的。

13.通过用稀有切割酶消化装配载体并纯化盒DNA，目前可将表达盒移入土壤杆菌二元载体pNOV6900中。

在20μL反应混合物中消化2μg pNOV6900，混合物中含2μg BSA、2μL适当的10X限制性内切核酸酶缓冲液和2μL适当的限制性内切核酸酶。反应混合物在37℃保温6小时以上，然后70℃20分钟。然后将1μL合适的10X限制性内切核酸酶缓冲液、1μL 1个单位/μL的CIP和8μL ddH₂O加到反应混合物中并进一步在37℃保温30分钟。将2μgpNOV6901-3′/5′-调控序列小提DNA于20μL反应体系中消化，该反应体系中含2μg BSA、2μL与pNOV6900所用同样的10X限制性内切核酸酶缓冲液和2μL与pNOV6900所用同样的限制性内切核酸酶。反应在37℃保温6小时以上。

将已消化的质粒DNA pNOV6900(已消化/CIP)和pNOV6900-3’/5’-调控序列(已消化)用1.0％ TAE琼脂糖分离并切下9.2kb的pNOV6900(已消化/CIP)和适当的pNOV6901-3′/5′-调控序列(已消化)条带。提取和回收pNOV6900(已消化/CIP)和适当的pNOV6901-3′/5′-调控序列(已消化)DNA。用糖原乙醇沉淀回收的pNOV6900(已消化/CIP)和适当的pNOV6901-3′/5′-调控序列(已消化)DNA。微量离心回收pNOV6900(已消化/CIP)和适当的pNOV6901-3′/5′-调控序列(已消化)DNA片段，用70％乙醇洗涤，真空干燥并重悬于5μL ddH₂O。

在含1μL 10X T4 DNA连接酶缓冲液和1μL T4 DNA连接酶(400个单位/μL)的10μL连接混合液中将4.0μL pNOV6900(已消化/CIP)与4.0μL pNOV6901-3′/5′-调控序列(已消化)连接。连接混合物在16℃保温8小时以上。用5.0μL连接混合物转化50μL Top10感受态细胞。通过用1μL NcoI在含1μg BSA和1μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液4(New England Biolabs)的10μL反应混合液中消化7.5μLpNOV6900-pNOV6901-3′/5′-调控序列小提DNA来检验pNOV6900-pNOV6901-3′/5′-调控序列重组子。消化在37℃保温2小时然后用1％ TAE琼脂糖分离。检验阳性pNOV6900-pNOV6901-3′/5′-调控序列重组子连接处的序列。

14.现在可依照本领域已知的方法将表达盒转化入土壤杆菌并随后转化进入植物。

表2.用于构建含有来自MADS基因家族的调控序列的表达盒的引物。(见原文第21-31页)

实施例2：含有β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)编码序列的装配载体pNOV6901的构建。

A.GUS编码序列的制备

β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)编码序列(Narasimhulu等1996，Plant Cell，8：873-886)包括改造过的内含子，用Pfuturbo聚合酶(Stratagene，Cat.No.600250)反应自pNOV5003中扩增。反应混合物由1μL pNOV5003小提DNA、200μM dNTPs、20μM GUS5寡核苷酸引物5′-atggtacgtcctgtagaaacc-3′(SEQ ID NO 498)、20μM GUS3寡核苷酸引物5′-gatcgagctctcattgtttgcctccctg-3′(SEQ ID NO 499)、5μL 10X cloned Pfu缓冲液和2.5个单位的Pfuturbo DNA聚合酶(Stratagene，Cat.No.600250)组成，终体积50μL。热循环程序是95℃30秒，然后10个循环(95℃5秒，55℃10秒，72℃2.5分钟)，然后20个循环(95℃5秒，57℃15秒，72℃2.5分钟)，然后72℃2.5分钟。用QIAEX II试剂盒(Qiagen，Cat.No.20021)分离并浓缩2.2kb的GUS PCR产物。将GUS PCR产物回收于15μL ddH₂O中并随后于含1μg BSA、2μL 10x限制性内切核酸酶缓冲液和1μL SacI的20μL反应液中消化。反应在37℃保温2小时。将GUS PCR产物(SacI)于1.5％ TBE琼脂糖上分离并切下2.2kb的GUS PCR产物(SacI)条带。用QIAEX II试剂盒(Qiagen，Cat.No.20021)从琼脂糖中回收GUS PCR产物(SacI)DNA溶于15μL ddH₂O中。

B.pSP73载体的制备

制备大肠杆菌载体pSP73(Promega，Cat.No.P2221)小提DNA。将1μL小提DNA于含1μg BSA、2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液、1μLSmaI和1μL SacI的20μL反应混合物中消化。反应在25℃保温1.5小时，然后在37℃保温1.5小时。在1.5％ TBE琼脂糖上分离pSP73(SmaI/SacI)DNA并切下2.4kb的pSP73(SmaI/SacI)条带。用QIAEX II试剂盒(Qiagen，Cat.No.20021)从琼脂糖中回收pSP73(SmaI/SacI)DNA，溶于15μL ddH₂O中。

C.pSP73-GUS的构建

通过与等体积的第二代Takara DNA连接混合物(目录号TAK 6022)混合并在16℃保温30分钟，将5μL pSP73(SmaI/SacI)与5μL GUS PCR产物(SacI)连接。用7.5μL连接混合物转化50μL XL-1超级感受态细胞(Stratagene，目录号200236)。通过在含2μg BSA、2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液、1μl XbaI和1μL SacI的20μL反应液中消化2μL pSP73-GUS小提DNA来检验pSP73-GUS重组子，并在1.5％ TBE的琼脂糖上分离pSP73-GUS(XbaI/SacI)产物。对阳性pSP73-GUS重组子进行测序。

D.向pSP73-GUS添加限制性内切核酸酶位点

pSP73-GUS构建体缺乏将3′-调控序列正好克隆于GUS编码序列之后的灵活性。通过将合成的衔接子连接到所述构建体中，将另外的限制性位点加入多克隆接头处以提高GUS编码序列在3’末端的灵活性。通过在100μL含有25mM Tris-HCl(pH 8.0)和10mM MgCl₂的混合物中联合40μL50μM的寡核苷酸PL-F 5′-Pccgcgggcggccgcactagtcccgggcccat-3′(SEQ ID NO.456)、40μL 50μM的寡核苷酸PL-R5′-Pcgatgggcccgggactagtgcggccgcccgcggagct-3′(SEQ ID NO.457)制备衔接子(合成衔接子I)--其中P是5′-磷酸基团。将混合物煮沸5分钟，取出并自然冷却至室温(大约60分钟)，产生20μM的合成衔接子I溶液。

通过用1μL SacI和1μL ClaI在含2μg BSA和2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液的20μL反应混合物中消化14μL小提pSP73-GUS DNA制备pSP73-GUS构建体。反应混合物在37℃保温6小时，然后70℃20分钟。然后将1μL适当的10X限制性内切核酸酶缓冲液、1μL 1个单位/μL CIP和8μL ddH₂O加入反应中，并进一步在37℃保温30分钟。将pSP73-GUS(SacI/ClaI/CIP)DNA在1％ TAE琼脂糖上分离、切下、回收并用糖原载体乙醇沉淀。微量离心回收pSP73-GUS(SacI/ClaI/CIP)DNA，用70％乙醇洗涤，真空干燥并重悬于5μL ddH₂O中。

将4.5μL合成的衔接子I溶液与2.5μLpSP73-GUS(SacI/ClaI/CIP)在含1μL 10X T4 DNA连接酶缓冲液和1μLT4 DNA连接酶的10μL连接混合物中连接，并在16℃保温8小时以上。用4μL连接混合物转化50L XL-1超感受态细胞(Stratagene，Cat.No.200236)。通过将5μL pSP73-GUS-mod小提DNA于含2μg BSA、2μl 10X限制性内切核酸酶缓冲液和1μL NotI的20μL反应液中消化，对pSP73-GUS-mod重组子进行检验。消化产物于1.0％ TAE琼脂糖上分离并验证阳性pSP73-GUS-mod重组子的序列。完成的克隆被命名为pNOV6901。

2.pNOV6900的构建

有必要构建土壤杆菌二元载体以方便构建于pNOV6901中的表达盒移动进入植物中。通过插入引入PacI、SgFI和RsrII限制性内切核酸酶识别位点的衔接子，对pNOV2115载体进行修饰。用1μL KpnI和1μL HindIII在含2μg BSA和2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液的20μL反应混合物中消化pNOV2115小提DNA(14μL)。消化在37℃进行6小时以上，然后70℃20分钟。然后将1μL适当的10X限制性内切核酸酶缓冲液、1μL 1个单位/μL CIP和8μL ddH₂O加入反应中，并进一步在37℃保温30分钟。将pNOV2115(KpnI/HindIII/CIP)在1％TAE琼脂糖上分离、切下9.2kb的pNOV2115(KpnI/HindIII/CIP)DNA条带、回收并用糖原载体乙醇沉淀。微量离心回收pNOV2115(KpnI/HindIII/CIP)DNA，用70％乙醇洗涤，真空干燥并重悬于5μLddH₂O中。

通过连接所述载体与合成的衔接子II，在pNOV2115(KpnI/HindIII/CIP)中加入另外的限制性切点。通过在含有25mMTris-HCl(pH 8.0)和10mM MgCl₂的100μL混合物中联合37μL 150μM的寡核苷酸PL1 5′-Pgtaccggaccgcgatcgct taatta-3′(SEQ ID NO458)、37μL 150μM的寡核苷酸PL2 5′-Pagcttaattaagcgatcgcggtccg-3′(SEQ ID NO 459)——其中P是5′磷酸基团，制备合成衔接子II。将混合物煮沸5分钟，取出并自然冷却至室温(大约60分钟)，产生55μM的合成衔接子II溶液。

通过与等体积的第二代Takara DNA连接混合物(目录号TAK 6022)混合并在16℃保温30分钟，将2.5μL pNOV2115(KpnI/HindllI/CIP)与2.5μL55μM的合成衔接子II溶液连接。用5.0μL连接混合物转化50μL DH5α感受态细胞(Invitrogen，Cat.No.18258-012)。通过在含1μg BSA、1μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液的10μL反应液中用KpnI、HindIII、PacI或RsrII消化2μL pNOV2115-mod小提DNA来检验pNOV2115-mod重组子。验证阳性pNOV2115-mod重组子的序列。

完成的克隆被命名为pNOV6900。

实施例3：OsMADS5表达盒的构建

A.克隆OsMADS5 5′-调控序列

用高保真PCR由稻基因组DNA(gDNA)扩增OsMADS5 5′-调控序列。50μL反应混合物中含100ng稻gDNA、200μM dNTPs、1μL 20μM寡核苷酸引物OsMADS5-P3 5′-tgagcagg tagccggcgaccaa tcgcgag-3′(SEQ ID NO 460)、1μL 20μM寡核苷酸引物OsMADS#5-P25′-catactgttacaaaaaagaaaatcagtggaccac-3′(SEQ ID NO 461)、1μL10X Expand高保真缓冲液和1μL Expand高保真聚合酶。热循环程序是95℃2分钟，然后是40个循环(94℃15秒，68℃7.5分钟)，然后68℃10分钟。用TOPO XL PCR试剂盒克隆编码OsMADS5 5′-调控序列的5.4kb DNA产物。含OsMADS5 5′-调控序列的pCR-XL-TOPO-OsMADS5-5′-gDNA重组子的鉴定是在含2μg BSA和2μL10X限制性内切核酸酶缓冲液的20μL反应体系中用EcoRI消化5μLpCR-XL-TOPO-OsMADS5-5′-gDNA小提DNA进行的。反应在37℃保温2小时，然后将pCR-XL-TOPO-OsMADS5-5′-gDNA(EcoRI)产物用1％TAE琼脂糖分离。对阳性pCR-XL-TOPO-OsMADSS-5′-gDNA克隆进行测序。

B.克隆OsMADS5 3′-调控序列

用高保真PCR由稻基因组DNA(gDNA)扩增OsMADS5 3′-调控序列。50μL反应混合物中含100ng稻gDNA、200μM dNTPs、1μL 20μM寡核苷酸引物OsMADS#5-T1 5′-atgaattgcttatcacattaatggacatc-3′(SEQ ID NO.462)、1μL 20μM寡核苷酸引物OsMADS#5-T25′-caaaactacatcaagagccttggaattggtcc-3′(SEQ ID NO.463)、1μL10X Expand高保真缓冲液和1μL Expand高保真聚合酶。热循环程序是95℃2分钟，然后是40个循环(94℃15秒，60℃30秒，68℃6分钟)，然后68℃15分钟。用Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒(Invitrogen，目录号K2875-20)克隆编码OsMADS5 3′-调控序列的1.2kb OsMADS5-3′-gDNA DNA产物。具有OsMADS5 3′-调控序列的pCR-Blunt II-TOPO-OsMADS5-3′-gDNA重组子的鉴定是在含2μg BSA和2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液的20μL反应体系中用EcoRI消化5μL pCR-Blunt II-TOPO-OsMADS5-3′-gDNA小提DNA进行的。反应在37℃保温2小时，然后将pCR-Blunt II-TOPO-OsMADS5-3′-gDNA(EcoRI)产物用1％ TAE琼脂糖分离。对阳性pCR-BluntII-TOPO-OsMADS5-3′-gDNA克隆进行测序。

C.OsMADS5 5′-调控序列的构建

用多个步骤制备用于表达盒的OsMADS5 5′-调控序列。

通过高保真PCR从上述PCR-XL-TOPO-OsMADS5-5′-gDNA克隆中产生3′-一半(O sMADS-5Pb，约3.03kb)。反应混合物含1μLpCR-XL-TOPO-OsMADS5-5′-gDNA小提DNA、200μM dNTPs、20μM寡核苷酸引物OsMADS5-C3 5′-cagtgtcgacggggcgagggaaagtagagc-3′(SEQID NO 464)、20μM寡核苷酸引物OsMADS5-C4 5′-cgatccatggtggatactgttacaaaaaagaaaatcagtg-3′(SEQ ID NO 465)、5μL 10X cloned Pfu缓冲液和2.5个单位的Pfuturbo DNA聚合酶(Stratagene，目录号600252)，终体积50μL。热循环程序是95℃30秒，然后是40个循环(94℃10秒，50℃60秒，72℃6分钟)，然后72℃10分钟。用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，Cat.No.28106)回收OsMADS-5Pb DNA产物。用糖原载体乙醇沉淀回收的OsMADS-5PbDNA。微量离心回收OsMADS-5Pb DNA，用70％乙醇洗涤，真空干燥并重悬于14μL ddH₂O中。在含2μg BSA、2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液、1μL Sall和1μL NcoI的20μL反应混合物中消化OsMADS-5Pb。反应混合物在37℃保温6小时以上。OsMADS-5Pb(NcoI/SalI)DNA用1.0％ TAE琼脂糖分离并将3.03kb的OsMADS-5Pb(NcoI/SalI)DNA条带切下、回收并用糖原载体乙醇沉淀。微量离心回收OsMADS-5Pb(NcoI/SalI)DNA，用70％乙醇洗涤，真空干燥并重悬于5μLddH₂O中。

在含2μg BSA、2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液、1μL SalI和1μL NcoI的20μL反应混合物中消化2μg pNOV6901小提DNA。反应混合物在37℃保温6小时以上，然后70℃20分钟。然后将1μL适当的10X限制性内切核酸酶缓冲液、1μL 1个单位/μL CIP和8μL ddH₂O加入反应中并进一步在37℃保温30分钟。pNOV6901(NcoI/SalI/CIP)DNA用1.0％ TAE琼脂糖分离并将4.7kb的pNOV6901(NcoI/SalI/CIP)条带切下、回收并用糖原载体乙醇沉淀。微量离心回收pNOV6901(NcoI/SalI/CIP)DNA，用70％乙醇洗涤，真空干燥并重悬于5μL ddH₂O中。

将4.0μL OsMADS-5Pb(NcoI/SalI)与4.0μL pNOV6901(NcoI/SalI/CIP)在含1μL 10X T4 DNA连接酶缓冲液和1μL T4 DNA连接酶(400单位/μL)的10μL连接混合物中连接，并在16℃保温8小时以上。用5.0μL连接混合物转化50μL Top 1 0超感受态细胞。通过用0.5μL SalI、0.5μL NcoI在含1μg BSA和1μl 10X限制性内切核酸酶缓冲液的10μL反应液中消化2μL LpNOV6901-OsMADS-5Pb小提DNA，对pNOV6901-OsMADS-5Pb重组子进行检验。消化产物在37℃保温2小时，并将pNOV6901-OsMADS-5Pb(NcoI/SalI)DNA用1％ TAE琼脂糖分离。对阳性pNOV6901-OsMADS-5Pb重组子进行测序。

通过高保真PCR从上述pCR-XL-TOPO-OsMADS5-5′-gDNA克隆中产生5′-一半(OsMADS-5Pa，约2.4kb)。反应混合物含1μLpCR-XL-TOPO-OsMADS5-5′-gDNA小提DNA、200μM dNTPs、20μM寡核苷酸引物OsMADS5-C1 5′-gactctcgaggcgcgcctgagcaggtagccggcgacc-3′(SEQ ID NO 466)、20μM寡核苷酸引物OsMADS5-C2b 5′-gtgtgtctcgagctctctctagctctctctcgg-3′(SEQ ID NO 467)、5μL 10Xcloned Pfu缓冲液和2.5个单位的PfuturboDNA聚合酶(Stratagene，目录号600252)，终体积50μL。热循环程序是95℃30秒，然后是40个循环(95℃10秒，50℃60秒，72℃6分钟)，然后72℃10分钟。用Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒(Invitrogen，Cat.No.K2875-20)回收2.4kb的OsMADS-5Pa DNA产物。用EcoRI在含2μg BSA和2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液的20μL反应混合物中消化5μl pCR-Blunt II-TOPO-OsMADS-5Pa小提DNA，对pCR-Blunt II-TOPO-OsMADS-5Pa重组子进行鉴定。消化产物在37℃保温2小时，并用1％ TAE琼脂糖分离。对阳性pCR-Blunt II-TOPO-OsMADS-5Pa重组子进行测序。

在含2μg BSA、2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液和2μL XhoI的20μL反应混合物中消化2μg pNOV6901-OsMADS-5Pb小提DNA。消化在37℃保温6小时以上，然后70℃20分钟。然后将1μL适当的10X限制性内切核酸酶缓冲液、1μL 1个单位/μL CIP和8μL ddH₂O加入反应中并进一步在37℃保温30分钟。在含2μg BSA、2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液和2μL SalI的20μL反应混合物中消化2μgpCR-Blunt II-TOPO-OsMADS-5Pa小提DNA。消化在37℃保温6小时以上。

将消化后的质粒DNA pNOV6901-OsMADS-5Pb(XhoI/CIP)和pCR-Blunt II-TOPO-OsMADS-5Pa(SalI)用1.0％ TAE琼脂糖分离并切下7.7kb的pNOV6901-OsMADS-5Pb(XhoI/CIP)和2.4kb的OsMADS-5Pa(SalI)条带、提取、回收并用糖原乙醇沉淀。微量离心回收pNOV6901-OsMADS-5Pb(XhoI/CIP)和OsMADS-5Pa(SalI)DNA片段，用70％乙醇洗涤，真空干燥并分别重悬于5μL ddH₂O中。

将4.0μL pNOV6901-OsMADS-5Pb(XhoI/CIP)与4.0μL OsMADS-5Pa(SalI)在含1μL 10X T4 DNA连接酶缓冲液和1μL T4 DNA连接酶(400U/μL)的10μL反应混合物中连接。反应混合物在16℃保温8小时以上。用5.0μL连接混合物转化50μL Top 1 0超感受态细胞。通过用0.5μL XhoI、0.5μL NcoI在含1μg BSA和1μl 10X限制性内切核酸酶缓冲液的10μL反应液中消化2μL pNOV6901-OsMADS5P小提DNA，对pNOV6901-OsMADS5P重组子进行检验。消化产物在37℃保温2小时，并用1％ TAE琼脂糖分离。对阳性pNOV6901-OsMADS5P重组子进行测序。

D.OsMADS5 3′-调控序列的构建

通过高保真PCR从上述pCR-BluntII-TOPO-OsMADS5-3′-gDNA克隆中产生用于表达盒的OsMADS-53′-调控序列。反应混合物含1μLpCR-BluntII-TOPO-OsMADS5-3′-gDNA小提DNA、200μM dNTPs、20μM寡核苷酸引物OsMADS5T-F 5′-cccgggccatggggggtctagaatgaattgcttatcacattaatgg-3′(SEQ ID NO468)、20μM寡核苷酸引物OsMADS5T-R5′-cccgggcgcgccggatgagaacagctacatcc-3′(SEQ ID NO 469)、5μL 10Xcloned Pfu缓冲液和2.5个单位的Pfuturbo DNA聚合酶(Stratagene，目录号600252)，终体积50μL。热循环程序是95℃30秒，然后是40个循环(95℃10秒，50℃60秒，72℃6分钟)，然后72℃10分钟。用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，Cat.No.28106)回收OsMADS5TDNA产物，并用糖原载体乙醇沉淀。微量离心回收OsMADS5T DNA，用70％乙醇洗涤，真空干燥并重悬于14μL ddH₂O中。在含2μg BSA、2μL10X限制性内切核酸酶缓冲液和2μL XmaI的20μL反应混合物中消化OsMADS5T DNA。反应混合物在37℃保温6小时以上。OsMADS5T(XmaI)DNA用1.0％ TAE琼脂糖分离，并将1.1kb的OsMADS5T(XmaI)条带切下、回收并用糖原载体乙醇沉淀。微量离心回收OsMADS5T(XmaI)DNA，用70％乙醇洗涤，真空干燥并重悬于5μL ddH₂O中。

在含2μg BSA、2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液和2μL XmaI的20μL反应混合物中消化2μg pNOV6901-OsMADS5P小提DNA。反应混合物在37℃保温6小时以上，然后70℃20分钟。然后将1μL适当的10X限制性内切核酸酶缓冲液、1μL 1个单位/μL CIP和8μL ddH₂O加入反应中并进一步在37℃保温30分钟。pNOV6901-OsMADS5P(XmaI/CIP)DNA用1.0％ TAE琼脂糖分离并将10.1kb的pNOV6901-OsMADS-5P(XmaI/CIP)条带切下、回收并用糖原载体乙醇沉淀。微量离心回收pNOV6901-OsMADS-5P(XmaI/CIP)DNA，用70％乙醇洗涤，真空干燥并分别重悬于5μL ddH₂O中。

将4.0μL pNOV6901-OsMADS5P(XmaI/CIP)与4.0μL OsMADS5T(XmaI)在含1μL 10X T4 DNA连接酶缓冲液和1μL T4 DNA连接酶(400单位/μL)的10μL连接混合物中连接，并在16℃保温8小时以上。用5.0μL连接混合物转化50μL Top 1 0超感受态细胞。通过用1.0μL AscI在含1μg BSA和1μl 10X限制性内切核酸酶缓冲液的10μL反应液中消化2μL小提DNA检验阳性pNOV6901-OsMADS5P/OsMADS5T重组子。

消化产物在37℃保温2小时并用1％ TAE琼脂糖分离。对阳性pNOV6901-OsMADS5P/OsMADS5T重组子进行测序。构建体被命名为pNOV6901-OsMADS5P/OsMADS5T。质粒的QC编号是11084。11084包含SEQ ID NO.536所述的完整OSMADS5表达盒。

E.将OsMADS5 GUS表达盒转pNOV6900中

在含2μg BSA、2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液和2μL AscI的20μL反应混合物中消化2μg pNOV6900。反应混合物在37℃保温6小时以上，然后70℃20分钟。然后将1μL适当的10X限制性内切核酸酶缓冲液、1μL 1个单位/μL CIP和8μL ddH₂O加入反应中并进一步在37℃保温30分钟。在含2μg BSA、2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液和2μL AscI的20μL反应混合物中消化2μgpNOV6901-OsMADS5P/OsMADS5T小提DNA。反应混合物在37℃保温6小时以上。

消化的质粒DNA pNOV6900(AscI/CIP)和pNOV6901-OsMADS5P/OsMADS5T(AscI)用1.0％ TAE琼脂糖分离，并切下9.2kb的pNOV6900(AscI/CIP)和8.7kb的pNOV6901-OsMADS5P/OsMADS5T(AscI)DNA条带、回收并用糖原载体乙醇沉淀。微量离心回收pNOV6900(AscI/CIP)和pNOV6901-OsMADS5P/OsMADS5T(AscI)DNA片段，用70％乙醇洗涤，真空干燥并分别重悬于5μL ddH₂O中。

将4.0μL pNOV6900(AscI/CIP)与4.0μL pNOV6901-OsMADS5P/OsMADS5T(AscI)在含1μL 10X T4 DNA连接酶缓冲液和1μLT4 DNA连接酶的10μL连接混合物中连接，16℃保温8小时以上。用5.0μL连接混合物转化50μL Top 1 0感受态细胞。通过用1.0μL NcoI在含1μg BSA和1μl 10X限制性内切核酸酶缓冲液的10μL反应液中消化7.5μL pNOV6900-pNOV6901-OsMADS5P/OsMADS5T小提DNA，检验pNOV6900-pNOV6901-OsMADS5P/OsMADS5T重组子。消化产物在37℃保温2小时并用1％ TAE琼脂糖分离。对阳性pNOV6900-pNOV6901-OsMADS5P/OsMADS5T重组子进行测序。完成的克隆被命名为pNOV6911。质粒的QC编号是11085。

OsMADS5P序列中基因工程所做的改变包括引入了一个XhoI位点，随后是OsMADS5P序列5′-端的AscI位点，消除了OsMADS5P序列的天然翻译起始密码子，消除了OsMADS5P序列的新前导序列(5′-UTR)中不需要的ORF，在OsMADS5P序列新翻译起始密码子上游插入了Kozak序列，以及在内含子1/外显子2连接处下游插入了新的翻译起始密码子(作为OsMADS5P序列中的NcoI位点形式)。OsMADS5T序列中基因工程所做的改变包括在OsMADS5T序列的5’-末端引入了一个XmaI位点，以及在OsMADS5T序列的3’-末端引入了一个AscI位点。以此结构，可以用侧翼为NcoI限制性切点的任一目的基因置换GUS编码序列。

然后可将完整的盒作为AscI片段切下并克隆入pNOV6900中。用标准的土壤杆菌介导的方法将所述的表达盒转化入A188 X HyII玉米和Kaybonnet稻中。

T0代玉米中GUS的表达

产生了15个T0代转基因玉米株系。在花粉临散播前取雄花穗小穗状花序和叶孔(leaf punches)样品并用组织化学方法鉴定GUS活性。切下来自含有多个转基因拷贝的植物的穗以检查发育着的小花中GUS的表达。Gus活性主要定位于各个小花底部的引导组织，而较低程度定位于发育着的谷穗的维管束。在发育的穗丝中也能看见GUS活性。这些资料表明所述的盒式驱动GUS主要在雌性繁殖组织中表达。

T0代稻中GUS的表达

对含pNOV6911(或11085)的40个T0代稻(cv.Kaybonnet)株系中的18个独立的转化子进行针对GUS表达的组织化学染色。只有四个事件在叶片组织中具有可检测到的GUS活性。在大部分事件中，小穗中的活性位于颖片尖端，在花粉囊中要少得多。

T1代玉米中的GUS表达

播种来自三个转化事件的T1子代以进行营养和繁殖组织中的表达分析。图3总结了约为授粉前5天取样的组织的数据。图3A和3B显示GUS活性局限于发育的穗中，尤其是沿着外部谷穗的脉管系统和小花穗底下的引导组织。图3B还显示了在环绕胚珠囊的组织中的GUS活性。在穗结节或它下面的结节、穗状花序、叶或穗丝中无可检测到的GUS活性(图3C-3G)。图4和5进一步提供了在发育的穗中GUS活性的证据。资料显示在授粉前5天建立的模式持续至授粉后2天。种子发育期间GUS活性变得局限于正在发育的核底部的引导组织和性组织。直至授粉后20天，GUS蛋白质在整个胚珠和核发育期间都可检测到。图25A显示在通气组织中有非常浅的染色，在根部没有GUS活性。

总之，本发明包括Oryza sativa OsMADS5基因为基础的表达盒。这些表达盒由基因的启动子组成，包括第一个内含子、5′-UTR、3′-UTR和3′-非转录序列。所述表达盒的设计方便了用任一目的基因置换GUS编码序列。所述表达盒驱动基因主要在受孕繁殖组织中表达。在发育的穗中，表达定位于沿着谷穗长轴的外部脉管系统、正发育的小花穗和核中的引导组织、正发育的核底部环绕胚珠和母性组织的组织。本发明的表达盒从胚珠发育的极早的时间点就开始驱动基因表达，有可能是在分化后不久。

实施例4. OsMADS6表达盒的构建

A.OsMADS6 5′-调控序列的克隆

用高保真PCR从稻基因组DNA(gDNA)扩增OsMADS6 5′-调控序列。50μL反应混合物中含100 ng稻gDNA、200μM dNTPs、1μL 20μM寡核苷酸引物OsMADS#6-P1 5′-ctaggacgatggtgtgatgtgggaacacg-3′(SEQ ID NO 470)、1μL 20μM寡核苷酸引物O sMADS#6-P2 5′-gtacctttctaaagtctttgttatgctgcac-3′(SEQ ID NO 471)、1μL 10XExpand高保真缓冲液和1μL Expand高保真聚合酶。热循环程序是95℃2分钟，然后是40个循环(94℃15秒，68℃7.5分钟)，然后68℃10分钟。用TOPO XL PCR克隆试剂盒克隆4.5kb的OsMADS6-5′-gDNADNA产物。通过用EcoRI在含2μg BSA和2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液的20μL反应体系中消化5μL pCR-XL-TOPO-OsMADS6-5′-gDNA小提DNA，对pCR-XL-TOPO-OsMADS6-5′-gDNA重组子进行鉴定。反应在37℃保温2小时，然后将产物用1％ TAE琼脂糖分离。对阳性pCR-XL-TOPO-OsMADS6-5′-gDNA克隆进行测序。

B.OsMADS6 3′-调控序列的克隆

用高保真PCR从稻基因组DNA(gDNA)扩增OsMADS6 3′-调控序列。50μL反应混合物中含100ng稻gDNA、200μM dNTPs、1μL 20μM寡核苷酸引物OsMADS#6-T1 5′-gctaagcagccatcgatcagctgtcag-3′(SEQID NO 470)、1μL 20μM寡核苷酸引物OsMADS#6-T25′-gatgccattgtgtaatgaatggaggagagc-3′(SEQ ID NO 471)、1μL 10XExpand高保真缓冲液和1μL Expand高保真聚合酶。热循环程序是95℃2分钟，然后是40个循环(94℃15秒，60℃30秒，68℃6分钟)，然后68℃15分钟。用Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒克隆1.2kb的DNA产物。pCR-II-Blunt-OsMADS6-3′-gDNA重组子的鉴定是用EcoRI在含2μg BSA和2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液的20μL反应混合物中消化5μL pCR-II-Blunt-OsMADS6-3′-gDNA小提DNA进行的。反应在37℃保温2小时，然后用1％ TAE琼脂糖分离。对阳性pCR-II-Blunt-OsMADS6-3′-gDNA克隆进行测序。

C.OsMADS6 5′-调控序列的构建

用多个步骤制备用于表达盒的OsMADS65′-调控序列。通过高保真PCR从上述OsMADS6 5′-基因调控序列克隆中产生3′-一半(OsMADS-6Pb，约2.96kb)。反应混合物含1μLpCR-XL-TOPO-OsMADS6-5′-gDNA小提DNA、200μM dNTPs、20μM寡核苷酸引物OsMADS6-P3b 5′-cgagtcgacgaggggaagagttgagctgag-3′(SEQ ID NO 474)、20μM寡核苷酸引物OsMADS6-P4c5′-gactccatggtggttatgctgcacaaaaatg-3′(SEQ ID NO 475)、5μL 10Xcloned Pfu缓冲液和2.5个单位的Pfuturbo DNA聚合酶(Stratagene，目录号600252)，终体积50μL。热循环程序是95℃30秒，然后是40个循环(95℃10秒，50℃60秒，72℃6分钟)，然后72℃10分钟。用Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒克隆DNA产物。pCR-Blunt-II-TOPO-OsMADS6-Pb重组子的鉴定是用EcoRI在含2μgBSA和2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液的20μL反应混合物中消化5μL的pCR-Blunt-II-TOPO-OsMADS6-Pb小提DNA进行的。反应在37℃保温2小时，然后用1％ TAE琼脂糖分离。对阳性pCR-Blunt-II-TOPO-OsMADS6-Pb重组子进行测序。

通过高保真PCR从上述pCR-XL-TOPO-OsMADS6-5′-gDNA克隆中产生5′-一半(O sMADS-6Pa，约1.5kb)。反应混合物含1μLpCR-XL-TOPO-OsMADS6-5′-gDNA小提DNA、200μM dNTPs、20μM寡核苷酸引物OsMADS6-Clb5′-cagtgcatgcggaccgctaggacgatggtgtgatgtg-3′(SEQ ID NO 476)、20μM寡核苷酸引物OsMADS6-Paa 5′-cctcgtcgactcgcccgatcgatcgaacg-3′(SEQ ID NO 477)、5μL 10Xcloned Pfu缓冲液和2.5个单位的Pfuturbo DNA聚合酶，终体积50μL。热循环程序是95℃30秒，然后是40个循环(95℃10秒，50℃60秒，72℃6分钟)，然后72℃10分钟。用Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒克隆1.5kb的OsMADS6-Pa DNA产物。

pCR-Blunt-II-TOPO-OsMADS6-Pa重组子的鉴定是用EcoRI在含2μgBSA和2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液的20μL反应混合物中消化5μL的pCR-Blunt-II-TOPO-OsMADS6-Pa小提DNA进行的。反应在37℃保温2小时，然后用1％ TAE琼脂糖分离。对阳性pCR-Blunt-II-TOPO-OsMADS6-Pa重组子进行测序。

在含2μg BSA、2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液、1μL SalI和1μL NcoI的20μL反应混合物中消化14μLpCR-Blunt-II-TOPO-OsMADS6-Pb小提DNA。消化在37℃进行6小时以上。消化的DNA用1.0％ TAE琼脂糖分离并将2.96kb的OsMADS6-Pb(SalI/NcoI)DNA条带切下、回收并用糖原进行乙醇沉淀。微量离心回收OsMADS6-Pb(SalI/NcoI)DNA，用70％乙醇洗涤，真空干燥并重悬于5μL ddH₂O中。

在含2μg BSA、2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液、1μL SalI和1μL NcoI的20μL反应混合物中消化2μg pNOV6901小提DNA。反应混合物在37℃保温6小时以上，然后70℃20分钟。然后将1μL适当的10X限制性内切核酸酶缓冲液、1μL 1个单位/μL CIP和8μL ddH₂O加入反应中并进一步在37℃保温30分钟。消化后的质粒DNA用1.0％TAE琼脂糖分离并将4.7kb的pNOV6901(SalI/NcoI/CIP)条带切下、回收并用糖原进行乙醇沉淀。微量离心回收pNOV6901(SalI/NcoI/CIP)DNA，用70％乙醇洗涤，真空干燥并重悬于5μL ddH₂O中。

在含1μL 10X T4 DNA连接酶缓冲液和1μL T4 DNA连接酶(400单位/μL)的10μL连接混合物中将4.0μL OsMADS6-Pb(SalI/NcoI)与4.0μL pNOV6901(SalI/NcoI/CIP)连接。连接混合物在16℃保温8小时以上。用5.0μL连接混合物转化50μL Top 1 0感受态细胞。通过用0.5μL SalI、0.5μL NcoI在含1μg BSA和1μl 10X限制性内切核酸酶缓冲液的10μL反应液中消化2μL pNOV6901-OsMADS6-Pb小提DNA对重组子进行检验。消化产物在37℃保温2小时并用1％ TAE琼脂糖分离。对阳性pNOV6901-OsMADS6-Pb重组子进行测序。

在含2μg BSA、2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液、1μL SalI和1μL SphI的20μL反应混合物中消化2μg pNOV6901-OsMADS6-Pb小提DNA。消化在37℃保温6小时以上，然后70℃20分钟。然后将1μL适当的10X限制性内切核酸酶缓冲液、1μL 1个单位/μL CIP和8μLddH₂O加入反应中并进一步在37℃保温30分钟。在含2μg BSA、2μL10X限制性内切核酸酶缓冲液、1μL SalI和1μL SphI的20μL反应混合物中消化2μg pCR-Blunt II-TOPO-OsMADS6-Pa小提DNA。消化在37℃保温6小时以上。

将消化后的质粒DNA pNOV6901-OsMADS6-Pb(SalI/SphI/CIP)和pCR-Blunt II-TOPO-OsMADS6-Pa(SalI/SphI)用1.0％ TAE琼脂糖分离并切下7.7kb的pNOV6901-OsMADS6-Pb(SalI/SphI/CIP)和1.5kb的OsMADS6-Pa(SalI/SphI)条带、回收并用糖原载体乙醇沉淀。微量离心回收pNOV6901-OsMADS6-Pb(SalI/SphI/CIP)和OsMADS6-Pa(SalI/SphI)DNA片段，用70％乙醇洗涤，真空干燥并分别重悬于5μL ddH₂O中。

在含1μL 10X T4 DNA连接酶缓冲液和1μL T4 DNA连接酶(400U/μL)的10μL反应混合物中将4.0μL pNOV6901-OsMADS6-Pb(SalI/SphI/CIP)与4.0μL OsMADS6-Pa(SalI/SphI)连接。反应混合物在16℃保温8小时以上。用5.0μL连接混合物转化50μL Top 1 0感受态细胞。通过用0.5μL SphI、0.5μL NcoI在含1μg BSA和1μl 10X限制性内切核酸酶缓冲液的10μL反应液中消化7.5μL pNOV6901-OsMADS6P小提DNA对pNOV6901-OsMADS6P重组子进行检验。消化产物在37℃保温2小时，然后用1％ TAE琼脂糖分离。对阳性pNOV6901-OsMADS6P重组子进行测序。

D.OsMADS6 3′-调控序列的构建

通过高保真PCR从上述pCR-II-Blunt-OsMADS5-3′-gDNA克隆中产生用于表达盒的OsMADS-6 3′-调控序列，约1.3kb。反应混合物含1μL pCR-II-Blunt-OsMADS6-3′-gDNA小提DNA、200μM dNTPs、20μM寡核苷酸引物OsMADS6-C4b 5′-acgtgagctcgctaagcagccatcgatcag-3′(SEQ ID NO 478)、20μM寡核苷酸引物OsMADS6-C2 5′-actgcggaccgatgccattgtgtaatgaatgg-3′(SEQ ID NO 479)、5μL 10X cloned Pfu缓冲液和2.5个单位的PfuturboDNA聚合酶，终体积50μL。热循环程序是95℃30秒，然后是40个循环(95℃10秒，50℃60秒，72℃6分钟)，然后72℃10分钟。回收1.3kb的OsMADS6T DNA产物并用糖原进行乙醇沉淀。微量离心回收OsMADS6T DNA，用70％乙醇洗涤，真空干燥并重悬于14μL ddH₂O中。在含2μg BSA、2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液和2μL SmaI的20μL反应混合物中消化OsMADS6T DNA。消化物在37℃保温6小时以上。OsMADS6T(SmaI)DNA用1.0％ TAE琼脂糖分离并将1.3kb的OsMADS6T(SmaI)条带切下、回收并用糖原载体进行乙醇沉淀。微量离心回收OsMADS6T(SmaI)DNA，用70％乙醇洗涤，真空干燥并重悬于5μL ddH₂O中。

在含2μg BSA、2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液和2μL SmaI的20μL反应混合物中消化2μg pNOV6901-OsMADS6P小提DNA。反应混合物在37℃保温6小时以上，然后70℃20分钟。然后将1μL适当的10X限制性内切核酸酶缓冲液、1μL 1个单位/μL CIP和8μL ddH₂O加入反应中并进一步在37℃保温30分钟。pNOV6901-OsMADS6P(SmaI/CIP)DNA用1.0％ TAE琼脂糖分离并将9.7kb的pNOV6901-OsMADS6P(SmaI/CIP)条带切下、回收并用糖原载体进行乙醇沉淀。微量离心回收pNOV6901-OsMADS6P(SmaI/CIP)DNA，用70％乙醇洗涤，真空干燥并分别重悬于5μL ddH₂O中。

在含1μL 10X T4 DNA连接酶缓冲液和1μL T4 DNA连接酶(400单位/μL)的10μL连接混合物中将4.0μL pNOV6901-OsMADS6P(SmaI/CIP)与4.0μL OsMADS6T(SmaI)连接。反应混合物在16℃保温8小时以上。用5.0μL连接混合物转化50μL Top 1 0感受态细胞。通过用1.0μLRsrII在含1μg BSA和1μl 10X限制性内切核酸酶缓冲液的10μL反应液中消化2μL pNOV6901-OsMADS6P/OsMADS6T小提DNA检验重组子。消化产物在37℃保温2小时并用1％ TAE琼脂糖分离。对阳性pNOV6901-OsMADS6P/OsMADS6T重组子进行测序。命名为载体pNOV6901-OsMADS6P/OsMADS6T。质粒的QC编号是11082。11082包含SEQ ID NO.537所述的OSMADS6表达盒。

E.将OsMADS6 GUS表达盒转入pNOV6900中

在含2μg BSA、2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液和2μL RsrII的20μL反应混合物中消化2μg pNOV6900。反应混合物在37℃保温6小时以上，然后70℃20分钟。然后将1μL适当的10X限制性内切核酸酶缓冲液、1μL 1个单位/μL CIP和8μL ddH₂O加入反应中并进一步在37℃保温30分钟。在含2μg BSA、2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液和2μL RsrII 的20μL反应混合物中消化2μgpNOV6901-OsMADS6P/OsMADS6T小提DNA。反应混合物在37℃保温6小时以上。pNOV6900(RsrII/CIP)和pNOV6901-OsMADS6P/OsMADS6T(RsrII)质粒DNA用1.0％ TAE琼脂糖回收并切下9.2kb的pNOV6900(RsrII/CIP)和8.0kb的pNOV6901-OsMADS6P/OsMADS6T(RsrII)DNA条带、回收并用糖原载体乙醇沉淀。微量离心回收pNOV6900(RsrII/CIP)和pNOV6901-OsMADS6P/OsMADS6T(RsrII)DNA片段，用70％乙醇洗涤，真空干燥并分别重悬于5μL ddH₂O中。

在含1μL 10X T4 DNA连接酶缓冲液和1μL T4 DNA连接酶(400U/μL)的10μL连接混合物中将4.0μL pNOV6900(RsrII/CIP)与4.0μL pNOV6901-OsMADS6P/OsMADS6T(RsrII)连接。反应混合物在16℃保温8小时以上。用5.0μL连接混合物转化50μL Top 1 0感受态细胞。通过用1.0μL NcoI在含1μg BSA和1μl 10X限制性内切核酸酶缓冲液的10μL反应液中消化2μL小提DNA检验pNOV6900-pNOV6901-OsMADS6P/OsMADS6T重组子。消化产物在37℃保温2小时，然后用1％ TAE琼脂糖分离。对阳性pNOV6900-pNOV6901-OsMADS6P/OsMADS6T重组子进行测序。完成的克隆被命名为pNOV6907。质粒的QC编号是11083。

对来自OsMADS6基因的5’-调控序列所进行的基因工程改造包括引入一个SphI位点，随后是OsMADS6P序列5′-端的RsrII位点，消除OsMADS6P序列的天然反应起始密码子，消除转录自OsMADS6P的新的5′-非翻译前导序列中不合需要的开放阅读框架，在OsMADS6P的新翻译起始密码子上游插入Kozak序列，以及在OsMADS6P中的内含子1/外显子2连接处下游以NcoI位点形式插入新的翻译起始密码子。对来自OsMADS6基因的3’-调控序列所进行的基因工程改造包括在OsMADS6T的5’-末端引入一个SacI位点，以及在OsMADS6T序列的3’-末端引入一个RsrII位点。以此结构可以用侧翼为NcoI/NotI或NcoI/SacI限制性切点的任一目的基因置换GUS编码序列。然后可将完整的盒作为RsrII片段转入二元载体pNOV6900中。用标准的土壤杆菌介导的方法将所述的表达盒转化入A188 X HyII玉米和Kaybonnet稻中。

T0代玉米中GUS的表达

产生了102个T0代转基因玉米株系。对穗状花序小穗进行针对GUS活性的组织化学筛选。有64个事件在穗状花序颖片中GUS活性为阳性，而某些还在小穗基底有阳性染色。56个事件还在叶孔处显现出GUS表达。切下来自多株植物的穗检查发育小花穗中GUS的表达。GUS活性主要定位于发育谷穗的维管束，看上去与各个小花穗中的引导组织相关。这些资料表明所述的盒式结构主要驱动雌性繁殖组织中GUS的表达。

T0代稻中GUS的表达

产生了41个含pNOV6907的T0代稻株系。对20个独立的转化子进行针对GUS表达的组织化学染色。在叶片组织中检测到由轻至重的GUS活性。在大部分事件中，小穗中的活动定位于颖片处。染色强度变化显著。收集来自各个株系的种子，但未进行进一步的分析。

T1代玉米中的GUS表达

播种来自两个独立转化子的T1子代以进行有关GUS表达的详细分析。图8A-8C显示在穗丝、叶片和穗状花序中无可检测到的GUS表达。这表明在T0代植物中观察到的穗状花序和叶片中的表达可能是与转化过程相关的组织培养造成的。来自T1代穗状花序小穗的解剖器官无明显的GUS活性(数据未显示)。图8D-8E显示了在谷穗结节和正发育的穗芽中的GUS活性。图8D显示了在中央木髓中残余的GUS活性，以及在发育穗芽中的大部分活性。穗的活性局限于结节处、外部轮生体和中央区。在穗结节下面的木髓中无可检测到的GUS活性。

图9显示了授粉前8天至前2天谷穗中的GUS活性。在T0代谷穗中，活性局限于脉管系统、小花穗和引导组织。授粉后GUS活性仍然局限于相同的组织中(图10)。在正发育的核中活性局限于雌性组织中。图11显示此模式持续贯穿整个核发育阶段。在胚乳或正发育的胚中未检测到活性，活性局限于正发育的核的胎座区、索状区和种脐区。在整个胚珠和核的发育中都可检测到GUS蛋白质，直至授粉后20天。这些资料表明OsMADS6盒是适于在正发育的小花穗和核中特征性表达的很好的候选者。在基于OsMADS6的表达盒的驱动下，诸如转化酶或蔗糖转运蛋白等方便韧皮部卸载的基因应被证实通过提高储备能力(sink strength)而有效支持早期穗的发育。图25B显示出在气生组织中染色非常浅或无染色，在根部无GUS活性。

本发明的某一实施方案是基于Oryza sativa OsMADS6基因的表达盒。这些表达盒由基因的启动子组成，包括第一个内含子、5′-UTR、3′-UTR和3′-非转录序列。将这些组分组装入GUS表达盒中并在转基因植物中进行了检测。所述表达盒的设计方便了用任一目的基因置换GUS编码序列。所述表达盒驱动基因表达主要在雌性繁殖组织中进行。在发育的穗中，表达定位于小花穗、发育核的雌性组分、胎座或引导组织和脉管系统。本发明的表达盒从胚珠发育的极早的时间点就开始驱动基因表达，有可能是在分化后不久开始。

实施例5：OsMADS8表达盒的构建

A.OsMADS8 5′-调控序列的克隆

用高保真PCR从稻基因组DNA(gDNA)扩增OsMADS8 5′-调控序列。50μL反应混合物中含100ng稻gDNA、200μM dNTPs、1μL 20μM寡核苷酸引物OsMADS8.P1 5′-ggtatctttccaaagttctggtcatgctgc-3′(SEQ ID NO 522)、1μL 20μM寡核苷酸引物OsMADS8.P25′-ccattttttgcgaaatgccaaatcctggc-3′(SEQ ID NO 523)、1μL 10XExpand高保真缓冲液和1μL Expand高保真聚合酶。热循环程序是95℃2分钟，然后是40个循环(94℃15秒，68℃7.5分钟)，然后68℃10分钟。用TOPO XL PCR克隆试剂盒克隆5.2kb的OsMADS8-5′-gDNADNA产物。pCR-XL-TOPO-OsMADS8-5′-gDNA重组子的鉴定是用EcoRI消化在含2μg BSA和2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液的20μL反应体系中5μL pCR-XL-TOPO-OsMADS8-5′-gDNA小提DNA进行的。反应在37℃保2小时，然后用1％ TAE琼脂糖分离。对阳性pCR-XL-TOPO-OsMADS8-5′-gDNA克隆进行测序。

B.OsMADS8 3′-调控序列的克隆

用高保真PCR从稻基因组DNA(gDNA)扩增OsMADS8 3′-调控序列。50μL反应混合物中含100ng稻gDNA、200μM dNTPs、1μL 20μM寡核苷酸引物OsMADS8.T1 5′-acgtgagctcactcctgaaggccgatgcgacaacc-3′(SEQ ID NO 480)、1μL20μM寡核苷酸引物OsMADS8.T25′-agtcatcgatcatgacaaaatatcatgtttatttcgagg-3′(SEQ  ID  NO481)、1μL 10X Expand高保真缓冲液和1μL Expand高保真聚合酶。热循环程序是95℃2分钟，然后是40个循环(94℃15秒，60℃30秒，68℃6分钟)，然后68℃15分钟。用Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒克隆2.04kb的OsMADS8-3′-gDNA DNA产物。

pCR-Blunt-II-OsMADS8-3′-gDNA重组子的鉴定是用EcoRI在含2μgBSA和2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液的20μL反应混合物中消化5μL小提DNA进行的。反应在37℃保温2小时，然后用1％ TAE琼脂糖分离。对阳性pCR-Blunt-II-OsMADS8-3′-gDNA克隆进行测序。

C.OsMADS8 5′-调控序列的构建

用多个步骤制备用于表达盒的OsMADS85′-调控序列。通过高保真PCR从上述pCR-XL-TOPO-OsMADS8-5′-gDNA中产生3′-一半(OsMADS-8Pb，约2.8kb)。反应混合物含1μLpCR-XL-TOPO-OsMADS8-5′-gDNA小提DNA、200μM dNTPs、20μM寡核苷酸引物OsMADS8-Pcc5′-atcgccatggtggtcaagctgcaagtttcaaaaacac-3′(SEQ ID NO 482)、20μM寡核苷酸引物OsMADS8-C3 5′-acgtgtcgacgagagggagggtgga-3′(SEQ ID NO 483)、5μL 10X cloned Pfu缓冲液和2.5个单位的PfuturboDNA聚合酶，终体积50μL。热循环程序是95℃30秒，然后是40个循环(95℃10秒，50℃60秒，72℃6分钟)，然后72℃10分钟。用Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒克隆2.8kb的OsMADS-8Pb DNA产物。

pCR-Blunt-II-TOPO-OsMADS-8Pb重组子的鉴定是用EcoRI在含2μgBSA和2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液的20μL反应混合物中消化5μL的pCR-Blunt-II-TOPO-OsMADS-8Pb小提DNA进行的。反应在37℃保2小时，然后用1％ TAE琼脂糖分离。对阳性pCR-Blunt-II-TOPO-OsMADS-8Pb克隆进行测序。

通过高保真PCR从上述pCR-XL-TOPO-OsMADS8-5′-gDNA中产生5′-一半(OsMADS-8Pa，约2.4kb)。反应混合物含1μLpCR-XL-TOPO-OsMADS8-5′-gDNA小提DNA、200μM dNTPs、20μM寡核苷酸引物OsMADS8-C5b 5′-tcctcctcctcctcctccacctcacct-3′(SEQ IDNO 484)、20μM寡核苷酸引物OsMADS8-Clb5′-aactaaatcgcctgcaggcggaccgttttttgcgaaatgcc-3′(SEQ ID NO485)、5μL 10X cloned Pfu缓冲液和2.5个单位的Pfuturbo DNA聚合酶，终体积50μL。热循环程序是95℃30秒，然后是40个循环(95℃10秒，50℃60秒，72℃6分钟)，然后72℃10分钟。用Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒克隆2.4kb的OsMADS-8Pa DNA产物。

pCR-Blunt-II-TOPO-OsMADS-8Pa重组子的鉴定是用EcoRI消化在含2μg BSA和2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液的20μL反应混合物中5μL的pCR-Blunt-II-TOPO-OsMADS-8Pa小提DNA进行的。反应在37℃保温2小时，然后用1％ TAE琼脂糖分离。对阳性pCR-Blunt-II-TOPO-OsMADS-8Pb克隆进行测序。

在含2μg BSA、2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液、1μL SalI和1μL NcoI的20μL反应混合物中消化14μLpCR-Blunt-II-TOPO-OsMADS-8Pb小提DNA。消化在37℃进行6小时以上。pCR-Blunt-II-TOPO-OsMADS-8Pb(SalI/NcoI)DNA用1.0％ TAE琼脂糖分离并将2.96kb的OsMADS-8Pb(SalI/NcoI)DNA条带切下、回收并用糖原载体乙醇沉淀。微量离心回收OsMADS-8Pb(SalI/NcoI)DNA，用70％乙醇洗涤，真空干燥并重悬于5μL ddH₂O中。

在含2μg BSA、2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液、1μL SalI和1μL NcoI的20μL反应混合物中消化2μg pNOV6901小提DNA。反应混合物在37℃保温6小时以上，然后70℃20分钟。然后将1μL适当的10X限制性内切核酸酶缓冲液、1μL 1个单位/μL CIP和8μL ddH₂O加入反应中并进一步在37℃保温30分钟。pNOV6901(SalI/NcoI/CIP)质粒DNA用1.0％ TAE琼脂糖分离并将4.7kb的pNOV6901(SalI/NcoI/CIP)DNA条带切下、回收并用糖原乙醇沉淀。微量离心回收pNOV6901(SalI/NcoI/CIP)DNA，用70％乙醇洗涤，真空干燥并重悬于5μL ddH₂O中。

将4.0μL OsMADS-8Pb(SalI/NcoI)与4.0μL pNOV6901(SalI/NcoI/CIP)在含1μL 10X T4 DNA连接酶缓冲液和1μL T4 DNA连接酶(400单位/μL)的10μL连接混合物中连接，在16℃保温8小时以上。用5.0μL连接混合物转化50μL Top 1 0感受态细胞。通过用0.5μLSalI、0.5μL NcoI在含1μg BSA和1μl 10X限制性内切核酸酶缓冲液的10μL反应液中消化2μL pNOV6901-OsMADS-8Pb小提DNA对pNOV6901-OsMADS-8Pb重组子进行检验。消化产物在37℃保温2小时并用1％ TAE琼脂糖分离。对阳性pNOV6901-OsMADS-8Pb重组子进行测序。

通过将合成的衔接子III与所述构建体连接，将SbfI限制性切点引入pNOV6901-OsMADS-8Pb中。通过在含25mM Tris-HCl(pH 8.0)和10mM MgCl₂的100μL混合物中混合40μL的50μM寡核苷酸8PA-15′-Pggagatcggg-3′(SEQ ID NO 486)和40μL的50μM寡核苷酸8PA-25′-Ptcgacccgatcacc-3′(SEQ ID NO 487)-其中的P是5′-磷酸基团-制备合成的衔接子III。将混合物煮沸5分钟，取下并自然冷却至室温(约60分钟)。这样产生了20μM的合成衔接子III混合物。

用2μL SalI在含2μg BSA和2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液的20μL反应混合物中消化14μL pNOV6901-OsMADS-8Pb小提DNA制备pNOV6901-OsMADS-8Pb。消化在37℃保温6小时，然后70℃20分钟。然后将1μL适当的10X限制性内切核酸酶缓冲液、1μL 1个单位/μL CIP和8μL ddH₂O加入反应中并进一步在37℃保温30分钟。将pNOV6901-OsMADS-8Pb(SalI/CIP)DNA用1.0％ TAE琼脂糖分离、回收并用糖原载体乙醇沉淀。微量离心回收pNOV6901-OsMADS-8Pb(SalI/CIP)DNA，用70％乙醇洗涤，真空干燥并分别重悬于5μL ddH₂O中。

将4.5μL合成的衔接子III混合物与2.5μLpNOV6901-OsMADS-8Pb(SalI/CIP)在含1μL 10X T4 DNA连接酶缓冲液和1μL T4 DNA连接酶(400U/μL)的10μL连接混合物中连接。反应混合物在16℃保温8小时以上。用4μL连接混合物转化50μL XL-1超感受态细胞(Stratagene，目录号200236)。通过在含1μg BSA、1μl 10X限制性内切核酸酶缓冲液和1μL SalI的10μL反应混合物中消化7.5μL pNOV6901-OsMADS-8Pb-SbfI小提DNA对pNOV6901-OsMADS-8Pb-SbfI重组子进行检验。消化产物在37℃保温2小时并用1％ TAE琼脂糖分离。用SbfI在含1μg BSA、1μl 10X限制性内切核酸酶缓冲液和1μL SbfI(New England Biolabs)的10μL反应混合物中消化丧失了SalI限制性切点的pNOV6901-OsMADS-8Pb-SbfI重组子。消化在37℃进行2小时，然后用1％ TAE琼脂糖分离。对阳性pNOV6901-OsMADS-8Pb-SbfI重组子进行测序。

在含2μg BSA、2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液和2μL SbfI的20μL反应混合物中消化2μg pNOV6901-OsMADS-8Pb-SbfI小提DNA。消化在37℃保温6小时以上，然后70℃20分钟。然后将1μL适当的10X限制性内切核酸酶缓冲液、1μL 1个单位/μL CIP和8μL ddH₂O加入反应中并进一步在37℃保温30分钟。在含2μg BSA、2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液和2μL SbfI的20μL反应混合物中消化2μgpCR-Blunt-II-TOPO-OsMADS-8P小提DNA。消化在37℃保温6小时以上。

将消化后的质粒DNA pNOV6901-OsMADS-8Pb-SbfI(SbfI/CIP)和pCR-Blunt-II-TOPO-OsMADS-8Pa(SbfI)用1.0％ TAE琼脂糖分离，并切下7.5kb的pNOV6901-OsMADS-8Pb(SbfI/CIP)和2.4kb的OsMADS-8Pa(SbfI)条带、回收并用糖原载体乙醇沉淀。微量离心回收DNA片段，用70％乙醇洗涤，真空干燥并分别重悬于5μL ddH₂O中。

将4.0μL pNOV6901-OsMADS-8Pb(SbfI/CIP)与4.0μL OsMADS-8Pa(SbfI)在含1μL 10X T4 DNA连接酶缓冲液和1μL T4 DNA连接酶(400U/μL)的10μL连接混合物中连接，在16℃保温8小时以上。用5.0μL连接混合物转化50μL Top 1 0感受态细胞。通过用0.5μL SbfI、0.5μLNcoI在含1μg BSA和1μl 10X限制性内切核酸酶缓冲液的10μL反应混合物中消化7.5μL pNOV6901-OsMADS-8P小提DNA对pNOV6901-OsMADS-8P重组子进行检验。消化产物在37℃保温2小时并用1％TAE琼脂糖分离。对阳性pNOV6901-OsMADS-8P重组子进行测序。

D.OsMADS8 3′-调控序列的构建

通过高保真PCR从上述pCR-Blunt-II-OsMADS8-3′-gDNA克隆中产生用于表达盒的OsMADS-8 3′-调控序列。反应混合物含1μLpCR-Blunt-II-OsMADS8-3′-gDNA小提DNA、200μM dNTPs、20μM寡核苷酸引物OsMADS8-C2 5′-acgtcccgggcggaccgagtcatcgatcatgac-3′(SEQ ID NO 488)、20μM寡核苷酸引物OsMADS8-C45′-tcgagcggccgcaggccgatgcgacaaccaataaaaac-3′(SEQ ID NO 489)、5μL 10X cloned Pfu缓冲液和2.5个单位的Pfuturbo DNA聚合酶(Stratagene，目录号600252)，终体积50μL。热循环程序是95℃30秒，然后是40个循环(95℃10秒，50℃60秒，72℃6分钟)，然后72℃10分钟。用QIAquick PCR纯化试剂盒回收OsMADS-8T DNA产物并用糖原乙醇沉淀。微量离心回收OsMADS-8T DNA，用70％乙醇洗涤，真空干燥并重悬于14μL ddH₂O中。在含2μg BSA、2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液、1μL NotI和1μL XmaI的20μL反应混合物中消化OsMADS-8T DNA。反应混合物在37℃保温6小时以上。OsMADS-8T(NotI/XmaI)DNA用1.0％ TAE琼脂糖分离、切下、回收并用糖原载体乙醇沉淀。微量离心回收OsMADS-8T(NotI/XmaI)DNA，用70％乙醇洗涤，真空干燥并重悬于5μL ddH₂O中。

在含2μg BSA、2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液、1μL NotI和1μL XmaI的20μL反应混合物中消化2μg pNOV6901-OsMADS-8P小提DNA。反应混合物在37℃保温6小时以上，然后70℃20分钟。然后将1μL适当的10X限制性内切核酸酶缓冲液、1μL 1个单位/μL CIP和8μL ddH₂O加入反应中并进一步在37℃保温30分钟。

pNOV6901-OsMADS-8P(NotI/XmaI/CIP)DNA用1.0％ TAE琼脂糖分离并将9.9kb的pNOV6901-OsMADS-8P条带切下、回收并用糖原载体乙醇沉淀。微量离心回收pNOV6901-OsMADS6P(NotI/SmaI/CIP)DNA，用70％乙醇洗涤，真空干燥并分别重悬于5μL ddH₂O中。

将4.0μL pNOV6901-OsMADS-8P(NotI/XmaI/CIP)与4.0μLOsMADS-8T(NotI/Xmal)在含1μL 10X T4 DNA连接酶缓冲液和1μL T4DNA连接酶(400单位/μL)的10μL连接混合物中连接，在16℃保温8小时以上。用5.0μL连接混合物转化50μL Top 1 0感受态细胞。通过用1.0μL RsrII在含1μg BSA和1μl 10X限制性内切核酸酶缓冲液的10μL反应液中消化2μL pNOV6901-OsMADS-8P/OsMADS-8T小提DNA检验pNOV6901-OsMADS-8P/OsMADS-8T重组子。消化在37℃进行2小时并用1％ TAE琼脂糖分离。对阳性pNOV6901-OsMADS-8P/OsMADS-8T重组子进行测序。完成的克隆被命名为pNOV6901-OsMADS-8P/OsMADS-8T。质粒的QC编号是11170。11170包含SEQ ID NO.538所述的完整OSMADS8表达盒。

E.将OsMADS8GUS表达盒转入pNOV6900中

在含2μg BSA、2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液和2μL RsrII的20μL反应混合物中消化2μg pNOV6900。反应混合物在37℃保温6小时以上，然后70℃20分钟。然后将1μL适当的10X限制性内切核酸酶缓冲液、1μL 1个单位/μL CIP和8μL ddH₂O加入反应中并进一步在37℃保温30分钟。在含2μg BSA、2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液和2μL RsrII的20μL反应混合物中消化2μgDNOV6901-OsMADS-8P/OsMADS-8T小提DNA。反应混合物在37℃保温6小时以上。

消化的质粒DNA pNOV6900(RsrII/CIP)和pNOV6901-OsMADS-8P/OsMADS-8T(RsrII)用1.0％ TAE琼脂糖分离并切下9.2kb的pNOV6900(RsrII/CIP)和9.5kb的pNOV6901-OsMADS-8P/OsMADS-8T(RsrII)DNA条带、回收并用糖原载体乙醇沉淀。微量离心回收pNOV6900(RsrII/CIP)和pNOV6901-OsMADS-8P/OsMADS-8T(RsrII)DNA片段，用70％乙醇洗涤，真空干燥并分别重悬于5μL ddH₂O中。

将4.0μL pNOV6900(RsrII/CIP)与4.0μL pNOV6901-OsMADS-8P/OsMADS-8T(RsrII)在含1μL 10X T4 DNA连接酶缓冲液和1μL T4 DNA连接酶(400U/μL)的10μL连接混合物中连接。反应混合物在16℃保温8小时以上。用5.0μL连接混合物转化50μL Top 1 0感受态细胞。通过用1.0μL NcoI在含1μg BSA和1μl 10X限制性内切核酸酶缓冲液的10μL反应液中消化7.5μLpNOV6900-pNOV6901-OsMADS-8P/OsMADS-8T小提DNA检验pNOV6900-pNOV6901-OsMADS-8P/OsMADS-8T重组子。消化产物在37℃保2小时并用1％ TAE琼脂糖分离。对阳性pNOV6900-pNOV6901-OsMADS-8P/OsMADS-8T重组子进行测序。完成的克隆被命名为pNOV6909。质粒的QC编号是11171。

对来自OsMADS8基因的5’-调控序列所进行的基因工程改造包括引入一个SbfI位点，随后是OsMADS8P序列5′-端的RsrII位点，消除OsMADS8P序列的天然翻译起始密码子，消除转录自OsMADS8P的新的5′-非翻译前导序列中不合需要的开放阅读框架，在OsMADS8P的新翻译起始密码子上游插入Kozak序列，以及在OsMADS8P中的内含子1/外显子2连接处下游以NcoI位点形式插入新的翻译起始密码子。对来自OsMADS8基因的3’-调控序列所进行的基因工程改造包括在OsMADS8T的5’-末端引入一个NotI位点，以及在OsMADS8T序列的3’-末端引入一个RsrII位点。以此结构，可以用侧翼为NcoI/NotI限制性切点的任一目的基因置换GUS编码序列。然后可将完整的盒作为RsrII片段转入二元载体pNOV6900中。用标准的土壤杆菌介导的方法将所述的表达盒转化入A188 X HyII玉米和Kaybonnet稻中。

T0代玉米中GUS的表达

产生了40个T0代转基因玉米株。对穗状花序小穗进行针对GUS活性的组织化学筛选。有29个事件的GUS活性为阳性。13株还在叶孔处显示出有GUS表达。大体上，此模式显示在穗状花序有可检测到的GUS活性而在叶孔(leaf punches)处没有或几乎没有。切下反映此模式的某株植物的穗以检查GUS表达。在整个穗中有明显的强GUS表达。这些资料表明所述的盒式结构驱动GUS表达主要在雌性繁殖组织中进行。

T0代稻中GUS的表达

对36个含pNOV6909的T0代稻株系中的32个独立转化子进行针对GUS表达的组织化学染色。在叶片组织中未检测到GUS活性。在大部分事件中，活性定位于圆锥花序处并且在花粉囊或心皮底部可观察到。染色强度变化显著。

T1代玉米中的GUS表达

播种来自4个独立转化子的T1子代以进行有关GUS表达的详细分析。图14A-14D显示在穗状花序、叶片组织、正发育的穗丝或芽中无可检测到的GUS表达。这表明在T0代植物中观察到的穗状花序和叶片中的表达可能是与转化过程相关的组织培养造成的。来自T1代穗状花序的切开器官无明显的GUS活性(数据未显示)。图14D显示了在与正发育的穗芽连接的结节中无可检测到的GUS活性。这下面的结节也无可检测到的GUS活性，但在滞留谷穗上的小花穗中有明显的活性(图14E)。表达盒在穗状花序发育的很早期就被激活。图14F、14G、15A和15B显示授粉前在中央木髓和正发育谷穗的穗状花序中有GUS活性。此模式从授粉前5天持续至授粉前一天。中央木髓处的表达持续至授粉前1天，之后在此区域不再检测到GUS活性(图15和16)。

图15D-15G表明从授粉之日至授粉后1天，在穗的脉管系统和小花穗的引导组织中有一些GUS活性。然后，GUS活性只在正发育的核的雌性成分中检测到。图15和16所显示的资料覆盖了从授粉前1天至授粉后20天的时间。在整个胚珠和核发育过程中都可检测到GUS蛋白质，直至授粉后20天。这些资料表明OsMADS8盒是适于在正发育的小花穗中特征性表达的很好的候选者。在基于OsMADS8的表达盒的驱动下，诸如转化酶或蔗糖转运蛋白等方便韧皮部卸载的基因应显示可通过提高沉积力而有效支持穗的早发育。图25C显示出在气生组织中染色非常浅，在根部无GUS活性。

总之，本发明包括基于Oryzasativa OsMADS8基因的表达盒。这些表达盒由基因的启动子组成，包括第一个内含子、5′-UTR、3′-UTR和3′-非转录序列。所述表达盒的设计方便了用任一目的基因置换GUS编码序列。所述表达盒将基因表达主要定向于正发育的小花穗和核，以及在各个小花穗底部的胎座组织。授粉后，在糊粉、种脐区和花梗内检测到表达。在发育上，所述表达盒从胚珠发育的极早的时间点就开始驱动基因表达，有可能是在分化后不久开始。

实施例6：OsMADS13表达盒的构建

A.OsMADS13 5′-调控序列的克隆

用高保真PCR扩增来自稻基因组DNA(gDNA)OsMADS13 5′-调控序列。50μL反应混合物中含100ng稻gDNA、200μM dNTPs、1μL 20μM寡核苷酸引物OsMADS13-Cl 5′-gactgcatgcggaccgttccaaaattaagcacacacatttg-3′(SEQ ID NO 490)、1μL 20μM寡核苷酸引物OsMADS13-C25′-gactccatggcttcttgctctcaactgatcaac-3′(SEQ ID NO 491)、1μL10X Expand高保真缓冲液和1μL Expand高保真聚合酶。热循环程序是95℃2分钟，然后是40个循环(94℃15秒，68℃7.5分钟)，然后68℃10分钟。回收并用糖原载体乙醇沉淀1.9kb的OsMADS13-5′-gDNA片段。微量离心回收OsMADS13-5′-gDNA片段，用70％乙醇洗涤，真空干燥并重悬于14μL ddH₂O中。在含2μg BSA、2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液和2μL NcoI的20μL反应混合物中消化OsMADS13-5′-gDNA片段。反应混合物在37℃保温6小时以上。消化产物用1.0％ TAE琼脂糖分离并切下1.9kb的OsMADS13-5′-gDNA(NcoI)DNA条带、回收并用糖原载体乙醇沉淀。微量离心回收OsMADS13-5′-gDNA(NcoI)DNA，用70％乙醇洗涤，真空干燥并重悬于5μL ddH₂O中。

在含2μg BSA、2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液和2μL SphI的20μL反应混合物中消化2μg pNOV6901小提DNA。消化在37℃保温6小时以上，然后70℃20分钟。然后将1μL适当的10X限制性内切核酸酶缓冲液、1μL 1个单位/μL CIP和8μL ddH₂O加入反应中并进一步在37℃保温30分钟。用1.0％的TAE琼脂糖分离pNOV6901(SphI/blunt)DNA并将4.7kb的pNOV6901(SphI/blunt)条带切下、回收并用糖原载体乙醇沉淀。微量离心回收pNOV6901(SphI/blunt)DNA，用70％乙醇洗涤，真空干燥并重悬于14μL ddH₂O中。

在含2μg BSA、2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液和2μL NcoI的20μL反应混合物中消化pNOV6901(SphI/blunt)小提DNA。消化在37℃保温6小时以上。将pNOV6901(SphI/blunt/NcoI)质粒DNA用1.0％ TAE琼脂糖分离，并切下4.7kb的pNOV6901(Sphllblunt/NcoI)条带、回收并用糖原载体乙醇沉淀。微量离心回收pNOV6901(SphI/blunt/NcoI)DNA，用70％乙醇洗涤，真空干燥并分别重悬于5μLddH₂O中。

将4.0μL OsMADS13-5′-gDNA(NcoI)与4.0μL pNOV6901(SphI/blunt/NcoI)在含1μL 10X T4 DNA连接酶缓冲液和1μL T4 DNA连接酶(400U/μL)的10μL连接混合物中连接。连接混合物在16℃保温8小时以上。用5.0μL连接混合物转化50μL Top 1 0感受态细胞。通过用0.5μL XhoI、0.5μL NcoI在含1μg BSA和1μl 10X限制性内切核酸酶缓冲液的10μL反应液中消化2μL pNOV690/-OSMADS 13P小提DNA检验pNOV6901-OsMADS13P重组子。消化产物在37℃保温2小时并用1％ TAE琼脂糖分离。对阳性pNOV6901-OsMADS13P重组子进行测序。

B.OsMADS13 3′-调控序列的克隆

用高保真PCR扩增来自稻基因组DNA(gDNA)的OsMADS13 3′-调控序列。50μL反应混合物中含100ng稻gDNA、200μM dNTPs、1μL 20μM寡核苷酸引物OsMADS13-C3 5′-tcgagcggccgctgacatggatatgatgatcag-3′(SEQ ID NO 492)、1μL 20μM寡核苷酸引物OsMADS13-C45′-acgtatcgatcggaccgcaacgcacgggcacccaac-3′(SEQ ID NO 493)、1μL 10X Expand高保真缓冲液和1μL Expand高保真聚合酶。热循环程序是95℃2分钟，然后是40个循环(94℃15秒，60℃30秒，68℃6分钟)，然后68℃15分钟。回收并用糖原乙醇沉淀1.2kb的OsMADS13-3′-gDNA DNA片段。微量离心回收OsMADS 13-3′-gDNA片段，用70％乙醇洗涤，真空干燥并重悬于14μL ddH₂O中。在含2μg BSA、2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液和2μL NotI的20μL反应混合物中消化OsMADS13-3′-gDNA片段。反应混合物在37℃保温6小时以上，然后用1.0％ TAE琼脂糖分离并切下1.2kb的OsMADS13-3′-gDNA(NotI)DNA条带、回收并用糖原载体乙醇沉淀。微量离心回收OsMADS 13-3′-gDNA(NotI)DNA，用70％乙醇洗涤，真空干燥并重悬于5μL ddH₂O中。

在含2μg BSA、2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液、1μL NotI和1μL SmaI的20μL反应混合物中消化2μg pNOV6901-OsMADS13P小提DNA。消化在37℃保温6小时以上，然后70℃20分钟。然后将1μL适当的10X限制性内切核酸酶缓冲液、1μL 1个单位/μL CIP和8μL ddH₂O加入反应中并进一步在37℃保温30分钟。用1.0％的TAE琼脂糖分离pNOV6901-OsMADS13P(NotI/SmaI/CIP)DNA并将6.6kb的条带切下、回收并用糖原载体乙醇沉淀。微量离心回收pNOV6901-OsMADS13P(NotI/SmaI/CIP)DNA片段，用70％乙醇洗涤，真空干燥并重悬于5μLddH₂O中。

将4.0μL pNOV6901-OsMADS13P(NotI/SmaI/CIP)与4.0μLOsMADS13-3′-gDNA(Notl)在含1μL 10X T4 DNA连接酶缓冲液和1μL T4DNA连接酶(400U/μL)的10μL连接混合物中连接。连接混合物在16℃保温8小时以上。用5.0μL连接混合物转化50μL Top 1 0感受态细胞。通过用1.0μL NotI在含1μg BSA和1μl 10X限制性内切核酸酶缓冲液的10μL反应液中消化7.5μLpNOV6901-OsMADS13P/OsMADS13T小提DNA检验pNOV6901-OsMADS13P/OsMADS13T重组子。消化产物在37℃保温2小时并用1％TAE琼脂糖分离。对阳性pNOV6901-OsMADS13P/OsMADS13T重组子进行测序。完成的克隆被命名为pNOV6904，这也是该质粒的QC编号。pNOV6904包含SEQ ID NO.539所描述的完整OSMAD13表达盒。

C.将OsMADS13 GUS表达盒转入pNOV6900中

在含2μg BSA、2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液和2μL RsrII的20μL反应混合物中消化2μg pNOV6900。反应混合物在37℃保温6小时以上，然后70℃20分钟。然后将1μL适当的10X限制性内切核酸酶缓冲液、1μL 1个单位/μL CIP和8μL ddH₂O加入反应中并进一步在37℃保温30分钟。在含2μg BSA、2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液和2μL RsrII的20μL反应混合物中消化2μgpNOV6901-OsMADS13P/OsMADS13T小提DNA。反应混合物在37℃保温6小时以上。

已消化的质粒DNA pNOV6900(RsrII/CIP)和pNOV6901-OsMADS13P/OsMADS13T(RsrII)用1.0％ TAE琼脂糖分离并切下9.2kb的pNOV6900(RsrII/CIP)和5.3kb的pNOV6901-OsMADS13P/OsMADS13T(RsrII)条带、回收并用糖原载体乙醇沉淀。微量离心回收pNOV6900(RsrII/CIP)和pNOV6901-OsMADS13P/OsMADS13T(RsrII)DNA片段，用70％乙醇洗涤，真空干燥并分别重悬于5μL ddH₂O中。

将4.0μL pNOV6900(RsrII/CIP)与4.0μLpNOV6901-OsMADS13P/OsMADS13T(RsrII)在含1μL 10X T4 DNA连接酶缓冲液和1μL T4 DNA连接酶(400U/μL)的10μL连接混合物中连接。反应混合物在16℃保温8小时以上。用5.0μL连接混合物转化50μL Top 1 0感受态细胞。通过用1.0μL NcoI在含1μg BSA和1μl 10X限制性内切核酸酶缓冲液的10μL反应液中消化7.5μLpNOV6900-pNOV6901-OsMADS13P/OsMADS13T小提DNA检验pNOV6900-pNOV6901-OsMADS13P/OsMADS13T重组子。消化产物在37℃保温2小时并用1％ TAE琼脂糖分离。对阳性pNOV6900-pNOV6901-OsMADS13P/OsMADS13T重组子进行测序。完成的克隆被命名为pNOV6905，这也是质粒的QC编号。

对来自OsMADS13基因的5’-调控序列所进行的基因工程改造包括在OsMADS13P序列5′-端引入一个RsrII位点，在天然OsMADS13P翻译起始密码子上游插入了Kozak序列，以及修饰天然的OsMADS13P翻译起始密码子以使其包含在NcoI位点内。对来自OsMADS13基因的3’-基因调控序列所进行的基因工程改造包括在OsMADS13T的5’-末端引入了一个NotI位点，以及在OsMADS13T序列的3’-末端引入了一个RsrII位点。以此结构，可以用侧翼为NcoI/NotI限制性切点的任一目的基因置换GUS编码序列。然后可将完整的盒作为RsrII片段转入二元载体pNOV6900中。用标准的土壤杆菌介导的方法将所述的表达盒转化入A188 X HyII玉米和Kaybonnet稻中。

T0代玉米中GUS的表达

产生了67个T0代转基因玉米株。对穗状花序小穗进行针对GUS活性的组织化学筛选。有56株的GUS活性为阳性。35株还在叶孔处显示出有GUS表达。10株在穗状花序或叶孔处无可检测到的GUS活性。

选择两个T0株系分析正发育的谷穗中的GUS表达。两株系均在穗状花序的小穗中有GUS信号而在叶孔处无GUS信号。在抽丝前约7天收获谷穗并进行针对GUS表达的组织化学染色。整体切片显示只在正发育的小花穗中有强的GUS信号，而在周围的穗组织中则缺乏GUS活性。这些资料表明OsMADS13表达盒的作用在于驱动T0代玉米转化株的雄性和雌性小花穗中的GUS表达

T0代稻中的GUS表达

产生了33个T0代稻株。对14个独立的转化株进行了针对GUS表达的组织化学染色。主要在小花穗中检测到GUS活性。一些植物还在叶孔处有GUS活性。

T1代玉米中的GUS表达

播种来自3个独立转化子的T1子代以进行有关GUS表达的详细分析。图20A-20C和图21A-21C显示在叶片组织、正发育的穗丝或穗状花序中无可检测到的GUS表达。这表明在T0代植物中观察到的穗状花序中的表达可能是与转化过程相关的组织培养造成的。来自T1代穗状花序的切开器官无明显的GUS表达(数据未显示)。图20D和20E显示了在授粉前约5天收获的正发育的穗中有GUS活性。纵向切片显示表达定位于正发育的胚珠和引导组织或胎座组织中。横向切片支持了这一观点，并且提供了在穗的脉管系统中表达的进一步证据。图21总结了在第二个转基因事件中观察到的GUS表达。它还定位于胚珠有可能发育的地带。图22证明了表达定位于供给正发育的穗的脉管系统。

这些资料表明OsMADS13盒是适于在正发育的胚珠中特征性表达的很好的候选者。在基于OsMADS13的表达盒的驱动下，诸如转化酶或蔗糖转运蛋白等方便韧皮部卸载的基因应显示通过提高沉积力而确实有效的支持穗的早发育。

图23和24证明了所述的盒在授粉后继续发挥作用。在授粉后4天和6天都观察到GUS表达(图23)。在核发育中稍晚(授粉后21天)，GUS表达仍然定位于花梗和种脐区(图24)。它还出现于糊粉中。在整个胚珠和核的发育过程中都可检测到GUS蛋白质，直至授粉后21天。图25D显示了气生组织中有非常轻的染色，在根部无GUS活性。

本发明包括基于Oryza sativa OsMADS13基因的表达盒。这些表达盒由基因的启动子组成，包括第一个内含子、5′-UTR、3′-UTR和3′-非转录序列。将这些组分组装成表达盒并用转基因植物进行测试。所述表达盒的设计方便了用任一目的基因置换GUS编码序列。所述表达盒将基因表达主要定向于发育着的小穗小花下面的胎座组织内的脉管系统。授粉后，在糊粉、种脐区和花梗内预计表达。在发育上，所述表达盒从胚珠发育的极早的时间点就开始驱动基因表达，比授粉前7天还要早。

实施例7：OsT6PP cDNA序列的鉴定

第一个维管植物海藻糖-6-磷酸磷酸酶基因是通过酵母tps2缺失突变株的互补作用自Arabidopsis thaliana克隆的(Vogel等1998)。

这些被命名为AtTPPA和AtTPPB(GenBank收编号为AF007778和AF007779)的基因在当时显示出具有海藻糖-6-磷酸磷酸酶活性。用AtTPPA和AtTTPB蛋白质序列在玉米和稻序列数据库中进行TBLASTN查询。序列比对将匹配的击中部分(hit)组织成单个基因。鉴定了三个玉米和三个稻T6PP同源序列。在图26中与拟南芥T6PP的全面序列比对中显示了相当于预计的各基因--ZmT6PP-1、-2和-3以及OsT6PP-1、-2和-3-的蛋白质序列的cDNA序列。

本发明的组合物和方法包括使用与核酸分子可操作性连接的OsMADS6启动子，当所述核酸分子在植物细胞中表达时，可提高T6PP的表达。由此，通过海藻糖途径的流量只在正发育的幼穗中有所增加，在那里它的作用是提高通过主要碳代谢的流量。

用高保真PCR扩增OsT6PP-3cDNA序列(SEQ ID NO.531)。50μL反应混合物中含1μL稻cDNA文库(制备自Stratagene的Lambda Unizap载体中的愈伤组织mRNA，初级库大小＞1 x10⁶ pfu，扩增库滴度＞1 x10¹² pfu/mL)、200μM dNTPs、1μL 20μM寡核苷酸引物T6PP-EC-5(5′-catggaccatggatttgagcaatagctcac-3′)SEQ ID NO.528、1μL 20μM寡核苷酸引物T6PP-EC-3(5′-atcgcagagctcacactgagtgcttcttcc-3′)SEQ ID NO.529、5μL 10XCloned PFU缓冲液和2.5μL Pfuturbo DNA聚合酶。热循环程序是95℃2分钟，然后是40个循环(94℃15秒，50℃1分钟，72℃1分钟)，然后72℃10分钟。用Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒克隆OsT6PP-3产物。在含2μg BSA和2μL 10X EcoRI限制性内切核酸酶缓冲液的20μL反应体系中用EcoRI消化5μL pCR-Blunt-II-TOPO-OsT6PP-3小提DNA，由此鉴定pCR-Blunt-II-TOPO-OsT6PP-3。反应混合物在37℃保温2小时，并用1.0％ TAE琼脂糖分离pCR-Blunt-II-TOPO-OsT6PP-3(EcoRI)产物。然后对pCR-Blunt-II-TOPO-OsT6PP-3克隆进行测序。OsT6PP-3cDNA两侧是NcoI/SacI限制性内切核酸酶位点。

为了便于克隆入11082，用Stratagene的QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit(快速改变多位点-定向诱变试剂盒)和寡核苷酸引物T6PP-QC(5′-CTTTATTATGCTGGAAGTCATGGTATGGACATAATGGCACC-3′)SEQ  IDNO.530沉默OsT6PP中的内部NcoI位点。

实施例8：OsMADS6-T6PP的构建

A.OsMADS6-OsT6PP-3表达盒的构建

在含2μg BSA、2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液、1μL NcoI和1μL SacI的20μL反应混合物中消化pCR-Blunt-II-TOPO-OsT6PP-3克隆(14μL)DNA。反应混合物在37℃保温6小时以上。然后用1.0％ TAE琼脂糖分离pCR-Blunt-II-TOPO-OsT6PP-3(NcoI/SacI)DNA并切下1.3kb的OsT6PP-3(NcoI/SacI)条带、回收并用糖原载体乙醇沉淀。微量离心回收OsT6PP-3(NcoI/SacI)DNA，用70％乙醇洗涤，真空干燥并重悬于5μL ddH₂O中。

在含2μg BSA、2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液、1μL NcoI和1μL SacI的20μL反应混合物中消化2μg 11082小提DNA。消化在37℃保温6小时以上，然后70℃20分钟。然后将1μL适当的10X限制性内切核酸酶缓冲液、1μL 1个单位/μL CIP和8μL ddH₂O加入反应中并进一步在37℃保温30分钟。用1.0％的TAE琼脂糖分离11082(NcoI/SacI/CIP)DNA并将8.1kb的11082(NcoI/SacI/CIP)条带切下、回收并用糖原载体乙醇沉淀。微量离心回收11082(NcoI/SacI/CIP)DNA片段，用70％乙醇洗涤，真空干燥并重悬于5μL ddH₂O中。

将4.0μL 11082(NcoI/SacI/CIP)与4.0μL OsT6PP-3(NcoI/SacI)在含1μL 10X T4 DNA连接酶缓冲液和1μL T4 DNA连接酶(400U/μL)的10μL连接混合物中连接。反应混合物在16℃保温8小时以上。用5.0μL连接混合物转化50μL Top 1 0感受态细胞。通过用1.0μL RsrII在含1μg BSA和1μl 10X限制性内切核酸酶缓冲液的10μL反应液中消化7.5μL 11082-OsT6PP-3小提DNA检验重组子。消化产物在37℃保温2小时并用1％TAE琼脂糖分离。对阳性11082-OsT6PP-3重组子进行测序。载体被命名为OsMADS6-OsT6PP-Assembly并如图27A所示。

将OsMADS6-OsT6PP-Assembly表达盒转入pNOV6900中

在含2μg BSA、2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液和2μL RsrII的20μL反应混合物中消化2μg pNOV6900。消化在37℃保温6小时以上，然后70℃20分钟。然后将1μL适当的10X限制性内切核酸酶缓冲液、1μL 1个单位/μL CIP和8μL ddH₂O加入反应中并进一步在37℃保温30分钟。在含2μg BSA、2μL 10X限制性内切核酸酶缓冲液和2μL RsrII的20μL反应混合物中消化2μg pNOV6906-OsT6PP-Assembly小提DNA。消化在37℃保温6小时以上。

用1.0％的TAE琼脂糖分离pNOV6900(RsrII/CIP)和pNOV6906-OsT6PP-Assembly(RsrII)质粒DNA，并将9.2kb的pNOV6900(RsrII/CIP)和6.8kb的pNOV6906-OsT6PP-Assembly(RsrII)条带切下、回收并用糖原载体乙醇沉淀。微量离心回收pNOV6900(RsrII/CIP)和pNOV6906-OsT6PP-Assembly(RsrII)DNA片段，用70％乙醇洗涤，真空干燥并重悬于5μL ddH₂O中。

将4.0μL pNOV6900(RsrII/CIP)与4.0μLpNOV6906-OsT6PP-Assembly(RsrII)在含1μL 10X T4 DNA连接酶缓冲液和1μL T4 DNA连接酶(400U/μL)的10μL连接混合物中连接。连接混合物在16℃保温8小时以上。用5.0μL连接混合物转化50μLTop 1 0感受态细胞。通过用1.0μL NcoI在含1μg BSA和1μl 10X限制性内切核酸酶缓冲液的10μL反应液中消化7.5μL小提DNA检验pNOV6900-pNOV6906-OsT6PP-Assembly重组子。消化产物在37℃保温2小时并用1％ TAE琼脂糖分离。对阳性pNOV6900-pNOV6906-OsT6PP-Assembly重组子进行测序。完成的克隆被命名为OsMADS6-OsT6PP-Binary并如图27B所示。质粒的QC编号是12194。

用标准的土壤杆菌介导的方法将OsMADS6-OsT6PP-3表达盒(SEQID NO.533)转化入A188玉米中。用Taqman^TM检验法筛选再生的T0代芽中转基因的拷贝数和插入片段的完整性。鉴定出含有单拷贝OsMADS6-OsT6PP-3表达盒且无来自二元载体的其它序列的事件。

通过RT-PCR证实在各个转基因事件中表达盒的功能。用RNeasy Plant mini试剂盒从100mg的T0代穗(tassel)组织中制备无DNA的总RNA模板。RT-PCR试验的进行使用了Qiagen一步RT-PCR试剂盒以及100ng总RNA模板、T6PP-RTPCRF(5′-gacagaactgacgaagacgctttcaa-3′)和6906-tr(5′-ctccaacttctgacagctg-3′)引物(分别为SEQ ID NOS.534，535)。此实验产生了转基因特异的210bp片段。

实施例9：温室生长条件

将玉米种子播种于2.5SVD罐(标准的600，～2加仑培养容器)内通用混合物(Sungrow Horticulture，Pine Bluff，AR)中。通用混合物是45％泥炭沼、45％树皮、5％珍珠岩、5％蛭石。温室玉米栽培的环境条件通常是16小时日照(平均光照强度600μmol m^-2 _S-2)，白天温度为80-86°F，夜间温度为70-76°F，且相对湿度大于50％。将植物放在2″的平台上以避免接触温室的地面。对植物进行手控浇水直至需要每日灌溉，然后将它们放在灌溉滴水器上。灌溉时程是每隔一天4分钟。通常用杀虫剂处理植物以控制害虫。

实施例10：温室中表达OsMADS6-OsT6PP-3的转基因玉米的评估

温室评估是量化受水压力和不受压力的植物中胚珠存活力的受控水压力实验。来自不受压力植物的数据代表了某基因型在理想条件下产籽的潜力。来自受水压力植物的数据量化了由于开花时候缺水造成的核败育。这些实验的结果可为大田作业的预报。我们以此方式选择适于田间评估的转基因事件。

将以单拷贝OsMADS6-T6PP-3转基因分离的转基因玉米如上所述进行播种。用Taqman分析将后代划分成纯合子或半合子(含OsMADS6-OsT6PP-3)和单性合子(丢失OsMADS6-OsT6PP-3)组。用JHAF031玉米花粉对这些个体进行授粉以产生杂合的种子(KP00188RAx JHAF031)用于温室实验。如上所述播种杂合的种子。将秧苗转移至上述的600个罐中并用标准的温室培养方法培养至它们达到V6生长期(Ritchie等，1997)。用系统性杀虫剂Marathon处理所有植株以降低对害虫的敏感性。

逐渐施加水压力，利用盐作为渗压剂(Nuccio等1998)。所述的盐由氯化钠/氯化钙以10：1的摩尔比组成，溶于0.5X Hoagland′s溶液中，以防止钠诱导的钾摄取中断。每三天一次将灌溉液中的盐浓度从50mM提高至100mM再至150mM，以便给予植物一定的时间适应所述的盐。在整个开花期间将植物培养于150mM的盐溶液中，通常是两周，此后用水将罐子彻底冲洗并对植物恢复正常的灌溉。与未接受盐的对照植物相比，此方法通常使核发育减少了40-60％。

通常将每个转基因事件的15-20粒种子播种以产生统一的秧苗群。将植物按完全随机分组的设计进行排列，每个处理有6-8个重复。在穗丝出现之前用授粉袋盖住正在发育的穗。记录花粉散发和穗丝出现的日期并在穗丝出现5天后用供体花粉对单个穗进行人工授粉。在完成所有授粉后将授粉袋除去。授粉后30天收获穗，干燥4天至15％的含水量。将穗脱壳并对核进行计数和称重。

实施例11：温室实验

研究两个OsMADS6-T6PP-3事件在水压力下产籽的能力。使来自各植株的24个杂合种子(A188 x JHAF031)发芽。利用Taqman分析确定各秧苗的接合性。用上述的温室水压力方案分析半合子和单性合子。在此实验中将单合子植物用作基准。在这些温室实验中，不能将半合子植物与单性合子植物区分开。平均起来，水压力使核发育减少了42％。这些温室实验的数据表明，在这些具体的温室实验中且应用以上水压力方案进行评估时，OsMADS6-T6PP-3表达盒不会影响玉米中的核发育。

实施例12：表达OsMADS-T6PP-3的转基因玉米在野外对干旱压力耐受性的评估

2004年后期在Kauai的Syngenta种子野外站针对各个转基因事件产生了杂合种子。将通过所选事件的T0代植物自交获得的T1代种子播种于四个单排的土地上，每排约20株植物，长12.7英尺，排间有三步左右的小经间隔。用Taqman分析将后代划分成纯合子或半合子(含OsMADS6-OsT6PP-3)和单性合子(丢失了OsMADS6-OsT6PP-3)类型。在单行试验田的两个内，破坏半合子和单性合子植物并且对纯合子植物自交以使种子胀大并与NP2043BT11和NP2044BT11进行测交。

在另两行单排植物中破坏纯合子和半合子植物并且对单性合子植物进行自交，且还与NP2043BT11和NP2044BT11进行了杂交。用此事件的单性合子和半合子测交种子进行田间试验。

进行田间评估以检查受控干旱实验中的转基因效果。该实验于2004年夏天在加州Visalia的Syngenta农作物保护研究室(Crop Protection Facility)进行。该种植地的夏天降雨量通常不足3英寸(3″)。此研究中使用了上文所得到的NP2043BT11测交种子。此种群中还包含BT转基因以控制昆虫压力。分块设计，以灌溉体系作为主要的划分方式排列于随机化的完整方块地中，重复三次各个实验作为亚小区，且在有单性合子和半合子杂交种子的情形下，使用了按亚亚小区划分的基因型。尝试了两个灌溉体系：水压力和良好的灌溉。每个区由两行组成，每行17.5英尺长种植了40粒种子。间隔小径大约为2.5英尺。用沟灌法对田地进行浇水。每个受处理的小块土地在田地的尾部有一专用的灌溉源。重复样本的安排方式是使样本1最接近而样本3离灌溉源最远。出芽后，进行有效计数并且根据需要使实验地变稀疏以使田地均匀。

在整个实验过程中良好浇水的方块地被认为进行了最佳的灌溉。对水压力的方块地进行最佳灌溉直至植物达到大约V期，此时停止浇水。在90％穗丝出现后对植物恢复最佳灌溉。

当植物过渡到繁殖发育阶段后，记录每块小实验田的50％花粉散发的日子，50％穗丝出现的日子以及叶子在开花的早、中和晚期卷曲情况。抽丝后三周记录试验田的空秆数。

联合收获实验田并记录谷物产量和谷物湿度。将来自半合子试验田的数据与单性合子试验田、在必要的情况下与野生型试验田进行比较，以衡量转基因对产量的影响。图28显示了7株OsMADS6-T6PP-3事件的结果。数据显示在7个事件中有4个事件的OsMADS6-T6PP-3转基因对产量具有积极的影响。在未施压和受干旱压力的试验田中产量的增加都是明显的。例如，在受干旱压力处理的试验田中，含转基因的5217个事件的平均产量是73Bu/英亩，而无转基因的5217个事件的平均产量是54Bu/英亩。结果表明，在受干旱压力的条件下，转基因使粒结实提高了25％。在受压力较少的试验田中，含转基因的5217个事件的平均产量是132Bu/英亩，而在无转基因的5217个事件的平均产量是95Bu/英亩。结果显示在受压力较少的植株中转基因将粒结实提高了将近28％。由在受干旱压力处理的试验田中每个小试验田的计算得到的平均产量是72Bu/英亩。在受压力较少处理的试验田中每个小试验田计算得到的平均产量是113Bu/英亩。由于OsMADS6-T6PP-3基因造成的产量提高在事件与事件之间有所变化。在7个所测试事件中，有4个观察到此现象，而且在受压力较少和受干旱压力的植物中都得到了证明。此田间试验的结果证实了OsMADS-T6PP-3转基因可有效稳定受干旱压力的玉米的粒结实。

实施例13：表达OsMADS-T6PP-3的转基因玉米的田间产量评估

2004年后期在Kauai的Syngenta Seeds野外站针对各个转基因事件产生杂交种子。将通过各事件的T0代植物自交获得的T1代种子播种于四个单排的土地上，每排约20株植物，长12.7英尺，排间有三步左右的小径间隔。用Taqman分析将后代划分成纯合子或半合子(含OsMADS6-OsT6PP-3)和单性合子(丢失了OsMADS6-OsT6PP-3)类型。在单行试验田的两个中，破坏合子和单性合子植物并且对纯合子植物自交以使种子胀大并与NP2043BT11和NP2044BT11进行测交。

在另两行单排试验田中破坏纯合子和半合子植物并且对单性合子植物进行自交且还与NP2043BT11和NP2044BT11进行了杂交。用这些事件的单性合子和半合子测交种子进行田间试验。在几个中西部地区进行了一系列田间试验，以检测培育者通常所用的条件下转基因的成效。将上文产生的XP00188RA xNP2043BT11株用于晚成熟的地区，而上文产生的XP00188RA x JHAF431B株则用于早成熟区。此种群中还包含BT转基因以控制昆虫压力。实验设计由具有三份重复的随机划分的完整区段组成。每个试验单元由两行试验田组成，每行17.5英尺长种植了34粒种子。间隔小径大约为3步的距离。

针对有单性合子和半合子杂交种子的事件，将随机化限制为在邻近的试验田中保持该事件的单性合子和半合子杂交株。在8到9个地区进行了大部分事件的评估。在三个地区进行了事件5124的评估。出芽后，进行有效计数并根据需要将试验田间疏，以达到田地的一致性。在生长季期间评估试验田的完整性、greensnap、根倒伏、50％花粉散发时的热单位(heat units)以及50％抽丝时的热单位。

联合收获实验田并记录谷物产量和谷物湿度。将来自半合子试验田的数据与单性合子试验田或在有必要的情况下与野生型试验田进行比较，衡量转基因对产量的影响。数据显示OsMADS6-T6PP-3转基因在此实验中对产量无显著影响。有两个因素需要考虑。首先是此实验中谷物产量的标准偏差是平均值的15-20％。这并非不寻常。其次，2004年中西部的生长条件对于玉米而言是相当好的。取决于地区差异，此实验中的产量平均为90至130Bu/英亩。此田间实验的结果表明OsMADS-T6PP-3转基因不影响产量。

实施例14：转化

一旦本发明的核酸序列已被克隆入表达体系，它就可转化入植物细胞中。本发明的受体和定向表达盒可用许多领域内公认的方法引入植物细胞中。

使植物再生的方法是本领域众所周知的。例如，已利用Ti质粒递送外源NA，以及通过电穿孔、显微注射和显微轰击粒子进行直接DNA摄入。此外，来自土壤杆菌属(Agrobacterium)的细菌可被用于转化植物细胞。以下是转化双子叶植物和单子叶植物的代表性技术的描述，以及代表性的质体转化技术的描述。

A.双子叶植物的转化

双子叶植物的转化技术是本领域众所周知的，包括以土壤杆菌为基础的技术和不需要土壤杆菌的技术。非土壤杆菌技术包括由原生质体或细胞直接摄取外源遗传物质。这可以通过PEG或电穿孔介导的摄取、粒子轰击介导的递送或显微注射来完成。有关这些技术的例子可参阅Paszkowski等，EMBO J 3：2717-2722(1984)；Potrykus等，Mol.Gen.Genet.199：169-177(1985)；Reich等，Biotechnology4：1001-1004(1986)和Klein等，Nature 327：70-73(1987)。在每种情形下都可用本领域已知的标准技术使被转化的细胞再生成完整的植物。

土壤杆菌介导的转化是优选的转化双子叶植物的技术，因为它具有高转化效率和对于许多不同物种的广泛效用。土壤杆菌转化通常涉及将携带目的外源基因的二元载体(例如pCIB200或pCIB2001)转移至适当的土壤杆菌株系，这可能依赖于宿主土壤杆菌菌株所携带的vir基因的互补作用，该基因或者位于共存的Ti质粒中，或者位于染色体上(例如，对于pCIB200和pCIB2001有菌株CIB542(Uknes等PlantCell 5：159-169(1993))。重组二元载体向土壤杆菌的转移是通过三亲株杂交法完成的，其中使用了携带重组二元载体的大肠杆菌、携带诸如pRK2013等质粒的辅助大肠杆菌菌株和能使重组二元载体向目标土壤杆菌菌株移动的辅助大肠杆菌菌株。或者，重组二元载体可通过DNA转化方式向土壤杆菌转移(Hofgen & Willmitzer，Nucl.AcidsRes.16：9877(1988))。

用重组土壤杆菌转化目标植物种属通常包括所述土壤杆菌与来自所述植物的外植体共培养并遵循本领域众所周知的流程。转化的组织在携带存在于二元质粒T-DNA边界之间的抗生素或杀虫剂抗性标记的选择性培养基上再生。另一用基因转化植物细胞的方法涉及向植物组织和细胞推进惰性或生物学活性的颗粒。此技术公布于全部属于Sanford等人的美国专利申请4,945,050、5,036,006和5,100,792中。大体上，此方法包括在有效穿透细胞外表面并且掺入其内部的条件下向细胞推进惰性的或生物学活性的颗粒。当利用惰性颗粒时，可通过用含目的基因的载体包裹所述颗粒而将所述载体引入细胞。或者，靶细胞可被所述载体环绕以便所述载体通过颗粒流进行细胞。也可将生物学活性的颗粒(例如，干酵母细胞、干细菌或噬菌体，各自含有希望被引入的DNA)推进植物细胞组织中。

B.单子叶植物的转化

如今大部分单子叶植物物种的转化已变得常规化了。优选的技术包括用PEG或电穿孔技术进行直接基因转移进入原生质体中以及颗粒轰击进入愈伤组织中。转化可用单一DNA或多种DNA(即，共转化)进行，这两种技术均适用于本发明。共转化的优势在于避免了完整载体的构建以及产生对于目的基因和可选择标记而言具有分开的位置的转基因植物，使得在需要时可在随后的世代中可去除此选择性标记。不过，使用共转化的缺陷在于分开的DNA都被整合入基因组的概率小于100％(Schocher等，Biotechnology 4：1093-1096(1986))。

专利申请EP 0 292 435、EP 0 392 225和WO 93/07278描述了从玉米原种近交系制备愈伤组织和原生质体、用PEG或电穿孔转化原生质体以及从被转化的原生质体再生出玉米株的技术。Gordon-Kamm等(Plant Cell 2：603-618(1990))和Fromm等(Biotechnology 8：833-839(1990))已发表了用微粒轰击转化A188-衍生玉米株系的技术。此外，文献WO 93/07278和Koziel等(Biotechnology 11：194-200(1993))描述了用微粒轰击转化玉米原种近交系的技术。此技术利用了从授粉后14-15天的玉米穗中切下、1.5-2.5mm长的未成熟玉米胚芽以及用于轰击的PDS-1000He Biolistics装置。

稻的转化也可通过利用原生质体或微粒轰击指引基因转移的技术进行。原生质体介导的转化被描述为Japonica-型和Indica-型(Zhang等Plant Cell Rep 7：379-384(1988)；Shimamoto等Nature 338：274-277(1989)；Datta等Biotechnology 8：736-740(1990))。这两种类型通常也可用微粒轰击转化(Christou等Biotechnology 9：957-962(1991))。此外，WO 93/21335描述了通过电穿孔转化稻的技术。

专利申请EP 0 332 581描述了Pooideae原生质体产生、转化和再生的技术。这些技术可用于转化Dactylis和小麦。此外，小麦转化已在文献中有所描述，例如Vasil等人(Biotechnology 10：667-674(1992))已描述了利用微粒轰击进入C型长期可再生愈伤组织，Vasil等人(Biotechnology 11：1553-1558(1993))和Weeks等人(Plant Physiol.102：1077-1084(1993))还描述了利用微粒轰击不成熟的胚和不成熟胚来源的愈伤组织。不过，用于小麦转化的优选技术涉及通过微粒轰击不成熟的胚来转化小麦，而且在基因投递之前包括一个高蔗糖或高麦芽糖的步骤。在进行轰击之前，将任一数目的胚(0.75-1mm长)铺在含3％蔗糖(Murashiga & Skoog，Physiologia Plantarum 15：473-497(1962))和3mg/12，4-D的MS培养基中以诱导体细胞胚，这可以在黑暗中进行。在选定轰击的日子，将胚从诱导培养基上取下并放在渗压剂上(即，诱导培养基中添加了理想浓度的蔗糖或麦芽糖，通常是15％)。使所述胚质壁分离2-3小时，然后进行轰击。每个目标平板有二十个胚芽是具代表性的，尽管这不是关键的。用标准方法使携带适当基因的质粒(诸如pCIB3064或pSG35)沉淀在微米大小的金颗粒上用标准的80网格筛以大约1000psi的脉冲压力通过DuPont

装置射击各个平板的胚。轰击后，将胚芽放回黑暗中恢复大约24小时(仍然在渗压剂上)。24小时后，将胚芽从渗压剂上移走并放回诱导培养基上，再生之前它们将在此停留大约一个月。大约一个月后，将具有正发育的胚形成愈伤的胚外植体转移至再生培养基(MS+1mg/升NAA，5mg/升GA)中，其中进一步包含适当的选择剂(在pCIB3064的情形下使用10mg/l basta，而在pSOG35的情形下使用2mg/l的氨甲喋呤)。大约一个月后，将发育好的芽转移到较大的被称为″GA7s″的无菌容器中，其中含浓度减半的MS、2％的蔗糖以及同样浓度的选择剂。

用土壤杆菌转化单子叶植物也已有描述。可参阅文献WO 94/00977和美国专利申请5,591,616，这两篇文献均收编于此作为参照。也可参阅，Negrotto等Plant Cell Reports 19：798-803(2000)，收编于此作为参照。

实施例15：利用本发明的表达盒使植物具有非生物性压力的耐受性

一旦开始，玉米雌性小穗就被定义为新陈代谢沉积库。它们从来源组织到燃料开发都需要由碳水化合物、氨基酸、辅助因子、矿物质和其它物质组成的营养流。来源组织包括叶、根、茎和其它有关营养性植物部分。大部分到达各个小穗的营养物质都被迅速消耗掉了，被转变成细胞壁物质、蛋白质、脂类、核酸等。极少被保存在储备物中。

在非生物性压力期间所述的营养流平息。此压力通过许多刺激施加，包括干旱、云覆盖、温度极限和土壤养分耗竭。不管生长条件如何，小穗都继续发育，这依赖于能量和原料的储备。大部分情况下，储备可将发育维持至多几天。如果非生物性压力期延长，储备被耗竭，则小穗发育停止。此后果是粒败育和产量降低。

本发明的OsMADS表达盒可通过与起提高储存能力(sink strength)的基因融合而用于提高雌性小穗中的储存能力。这些基因包括蔗糖转运蛋白、转化酶和海藻糖代谢基因。许多这些基因在早期小穗发育中都不是高表达的。任何这些基因在植物繁殖器官，例如小穗中的早期和特异性表达都会改善小穗的营养状况而不损害其它植物器官。

营养状况改进使得小穗在理想的生长条件下、更重要的是在非生物性压力延长期内能完成发育周期并能胜任授粉过程。

碳以蔗糖的形式抵达正发育的小穗中。小穗利用蔗糖的能力有限，因为促进其进入新陈代谢的酶不是高表达的。这些酶包括蔗糖转运蛋白，帮助从韧皮部卸载的蔗糖的吸收。OsMADS表达盒可提高引导组织和其它母系组织中蔗糖转运蛋白的水平。输入的蔗糖为发育供能，而过量的蔗糖则被掺入淀粉和空泡储备中。增加的淀粉和蔗糖储备使小穗在非生物性压力延长期内能更好的完成发育。

碳营养物也可通过增加转化酶的表达而得以增强。此酶家族将蔗糖切割成葡萄糖和果糖。这两种单糖都可被积累至高水平并迅速进入碳代谢。本发明的OSMADS表达盒可用于通过质外体或细胞壁转化酶的表达来提高小穗和其它母系组织的质外体区内的葡萄糖和果糖水平。所述单糖比蔗糖更容易进入细胞和碳代谢。有促进性的蔗糖利用应增加从韧皮部卸载的蔗糖并提高发育着的小穗的碳利用率。

同样的，正发育的小穗的胞液中碳营养状况可通过胞液或中性转化酶的表达而得以增强。此酶切割胞液内的蔗糖，促进其进入碳代谢。本发明的OSMADS表达盒可提高正发育的小穗中中性转化酶的表达。胞液、引导组织和相关小穗组织中蔗糖利用的增加提高了对蔗糖的需求，因此提高了从质外体输入蔗糖。

发育着的小穗中碳利用率和非生物性压力抗性也可通过液泡或可溶酸性转化酶的表达而得以增强。此酶将液泡内的蔗糖切割成果糖和葡萄糖，使得碳可为能量代谢所利用。

蔗糖转变成葡萄糖和果糖还增加了细胞的溶质势能，使其在干旱期间能保持水分并因此膨胀。这使得尽管可用的水分减少，但小穗仍能继续发育。此外，本发明的OSMADS表达盒可提高正发育的小穗中液泡的或可溶性酸性转化酶的表达，从而增强非生物性压力的耐受性。

海藻糖途径的作用在于调控初级代谢和淀粉合成之间的碳分配。此途径的上调使碳趋向于淀粉合成。本发明的OsMADS表达盒可用于驱动发育着的小穗中海藻糖-6-磷酸合酶、海藻糖-6-磷酸磷酸酶和海藻糖酶的表达，从而增强那些组织中的储备能力和淀粉合成。维持大淀粉库使发育着的小穗更能经得起延长期的非生物学压力并完成它们的发育周期。

尽管前述发明已通过图解和实施例的方式进行了详述以便于理解清晰，但显然在本发明的范围内是可以进行一定的改动和修饰的。

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本发明的优选实施方案如下：

1.用于在植物繁殖组织中表达核酸分子产物的表达盒，其中包含：a)MADS基因的启动子、第一个外显子、第一个内含子和第二个外显子，其中所说的启动子、第一个外显子、内含子和第二个外显子是所说表达盒的5′-调控序列；其中所说的5′-调控序列已被改造成大约在所说5′-调控序列的3’-末端有翻译起始密码子，且不包含妨碍用重组DNA方法进行操作的限制性内切核酸酶位点或在所说翻译起始密码子上游的另外的翻译起始密码子；b)MADS基因的3′-调控序列；和c)与所说的5′-调控序列和所说的3′-调控序列可操作性连接的核酸分子。

2.实施方案1的表达盒，其中所说的核酸分子产物在植物中表达时使得所说的植物耐受非生物性压力。

3.实施方案1的表达盒，其中当表达于植物中时，所说核酸分子的产物提高了所说植物中所说繁殖组织内的储备能力。

4.实施方案2的表达盒，其中所说的核酸分子是蔗糖转运蛋白基因。

5.实施方案2的表达盒，其中所说的核酸分子是转化酶基因。

6.实施方案2的表达盒，其中所说的核酸分子是针对转化酶基因的RNA干扰分子。

7.实施方案1的表达盒，其中所说的核酸分子是T6PP基因。

8.实施方案7的表达盒，其中所说的核酸分子具有SEQ ID NO.531所示序列。

9.实施方案1的表达盒，其中所说的表达盒具有NO.532所示序列。

10.实施方案1的表达盒，其中所说的表达盒如SEQ ID NO.536、537、538或539所示。

11.实施方案2的表达盒，其中所说的核酸分子是海藻糖代谢基因。

12.实施方案2的表达盒，其中所说的核酸分子是定向针对海藻糖代谢基因的RNA干扰分子。

13.包含实施方案1的表达盒的重组载体。

14.包含实施方案1的表达盒的转基因植物细胞。

15.包含实施方案10的转基因植物细胞的转基因植物。

16.依照实施方案11的转基因植物，其中所说的植物是单子叶植物。

17.依照实施方案11的转基因植物，其中所说的植物是玉米植株。

18.依照实施方案11的转基因植物，其中所说的植物是稻。

19.来自实施方案11的转基因植物的种子。

20.来自实施方案12的转基因植物的种子。

21.来自实施方案13的转基因植物的种子。

22.来自实施方案14的转基因植物的种子。

23.包含依照实施方案1的表达盒的植物。

24.包含选自SEQ ID NOS.6、12、20、28、506、34、39、43、47、51、55、59、63、67、71、75、79、83、87、91、95、99、103、107、111、115、119、123、127、131和526中的5′-调控序列以及选自SEQ ID NOS.10、16、24、30、507、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、124、128、132和527中的3′-调控序列的表达盒。

25.构建表达盒的方法，包括步骤：a)选择靶基因；b)确定所说靶基因cDNA上的开放阅读框架；c)通过用cDNA注释所说靶基因gDNA确定所说靶基因gDNA的翻译起始密码子、翻译终止密码子、第一个内含子、第一个外显子、第二个外显子、3′非翻译序列和3′非转录序列的位置；d)构建含所说启动子、第一个外显子、第一个内含子和第二个外显子的5′-调控序列以及含3′-非翻译序列和3′-非转录序列的3′-调控序列；并e)将核酸分子与所说表达盒的所说5′-调控序列和所说3′调控序列可操作性的连接，其中所说的核酸分子以模拟所说靶基因表达的方式进行表达。

26.构建依照实施方案21的表达盒的方法，其中所说的靶基因是MADS基因。

27.构建依照实施方案21的表达盒的方法，其中所说的核酸分子是蔗糖转运蛋白基因。

28.构建依照实施方案21的表达盒的方法，其中所说的核酸分子是转化酶基因。

29.构建依照实施方案21的表达盒的方法，其中所说的核酸分子是海藻糖代谢基因。

30.构建依照实施方案25的表达盒的方法，其中所说的海藻糖代谢基因是海藻糖-6-磷酸合酶基因、海藻糖-6-磷酸磷酸酶基因或海藻糖基因。

31.构建依照实施方案24的表达盒的方法，其中所说的转化酶基因是可溶性的酸性转化酶基因、可溶性的中性转化酶基因或不溶性的酸性转化酶基因。

32.构建依照实施方案21的表达盒的方法，进一步包括在大约所说5′调控序列的3’末端加工翻译起始密码子的步骤。

33.构建依照实施方案21的表达盒的方法，进一步包括改造所说表达盒使其不含有妨碍用重组DNA方法进行操作的限制性内切核酸酶位点或所说翻译起始密码子上游的另外的翻译起始密码子。

34.赋予植物以非生物性压力耐受性的方法，包括构建含MADS基因家族的5′-调控和3′-调控序列的表达盒。

35.构建依照实施方案21的表达盒的方法，其中所说的5′调控序列选自SEQ ID NOS.6、12、20、28、506、34、39、43、47、51、55、59、63、67、71、75、79、83、87、91、95、99、103、107、111、115、119、123、127、131和526之中。

36.构建依照实施方案21的表达盒的方法，其中所说的3′-调控序列选自SEQ ID NOS.10、16、24、30、507、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、124、128、132和527之中。

37.构建依照实施方案21的表达盒的方法，其中所说的靶基因是基于其表达情况而选定的。

Claims (15)

1.构建表达盒的方法，包括步骤：a)选择靶基因；b)确定所述靶基因的启动子、翻译起始密码子、翻译终止密码子、第一个内含子、第一个外显子和第二个外显子；c)构建以5′至3′方向包含所述启动子、第一个外显子、第一个内含子和第二个外显子的5′-调控序列；并d)将核酸分子与所述5′-调控序列可操作性地连接，从而构建出所述表达盒，其中所述核酸分子进行表达。

2.依照权利要求1的构建表达盒的方法，其中所述靶基因是MADS基因。

3.依照权利要求1的构建表达盒的方法，其中所述核酸分子是蔗糖转运蛋白基因。

4.依照权利要求1的构建表达盒的方法，其中所述核酸分子是转化酶基因。

5.依照权利要求4的构建表达盒的方法，其中所述转化酶基因是可溶性的酸性转化酶基因、可溶性的中性转化酶基因或不溶性的酸性转化酶基因。

6.依照权利要求1的构建表达盒的方法，其中所述核酸分子是海藻糖代谢基因。

7.依照权利要求6的构建表达盒的方法，其中所述海藻糖代谢基因是海藻糖-6-磷酸合酶基因、海藻糖-6-磷酸磷酸酶基因或海藻糖酶基因。

8.依照权利要求1的构建表达盒的方法，进一步包括在所述5′-调控序列的3′末端改造翻译起始密码子的步骤。

9.依照权利要求1的构建表达盒的方法，进一步包括改造所述表达盒使其不含有妨碍用重组DNA方法进行操作的限制性内切核酸酶位点或所述翻译起始密码子上游的另外的翻译起始密码子。

10.依照权利要求1的构建表达盒的方法，其中所述5′-调控序列选自SEQ ID NOS.6、12、20、28、506、34、39、43、47、51、55、59、63、67、71、75、79、83、87、91、95、99、103、107、111、115、119、123、127、131和526。

11.依照权利要求1的构建表达盒的方法，其中所述3′-调控序列选自SEQ ID NOS.10、16、24、30、507、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、124、128、132和527。

12.依照权利要求1的构建表达盒的方法，其中所述靶基因是基于其表达数据而选定的。

13.依照权利要求1的构建表达盒的方法，其中所述核酸分子以模拟所述靶基因表达的方式进行表达。

14.依照权利要求1的构建表达盒的方法，其中所述表达盒进一步包含含有所述靶基因的3′-非翻译序列和3′-非转录序列的3′-调控序列，所述3′-调控序列与所述核酸分子可操作性地连接。

15.赋予植物以非生物性压力耐受性的方法，包括构建含MADS基因家族的5′-调控和3′-调控序列的表达盒的步骤。

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