CN104805102A - 用于克隆高粱可溶性酸性转化酶基因sai-1的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于克隆高粱可溶性酸性转化酶基因SAI-1的方法，属于分子生物学和遗传学领域。所述方法将SAI-1基因分为不均等的两段，前段分子大小635bp，后段分子大小3232～3412bp，采用两对引物SAIA-F/SAIA-R和SAIP-F/SAIP-R，以待测高粱品种的基因组DNA为模板分别进行PCR，对两份扩增产物进行测序后拼接，获得全长SAI-1基因。本发明提供的方法能够准确、快速、简便地获得待测高粱品种的SAI-1基因全长，促进高粱SAI-1基因优异单体型发掘，推动高粱蔗糖代谢的研究，为分子育种、种质创新提供技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于克隆高粱可溶性酸性转化酶基因SAI-1的方法，属于分子生物学和遗传学领域。
背景技术
高粱是一种抗逆性强、产量潜力大的高光效C4作物，具有粮食、饲料、能源等多种用途，在干旱半干旱中低产地区发挥重要作用。蔗糖代谢是植物最重要的代谢之一，在糖感知和生长发育中发挥重要作用，转化酶基因是蔗糖代谢的关键调节基因，而可溶性酸性转化酶(SAI)是蔗糖代谢途径中的关键酶，对植物生长发育起着至关重要的调节作用，开发简捷快速克隆可溶性酸性转化酶基因的方法，对于育种材料和品种资源的基因分型具有重要意义。
目前，已有包括甜高粱在内的大量关于转化酶基因的研究，并进行了基因克隆。基因克隆方法主要有功能克隆，PCR扩增，定位克隆，差别杂交和减法杂交等多种方法。越来越多基因的克隆和植物基因组的测序，使得同源PCR克隆，成为一种快速、简便克隆植物基因的方法，其在功能标记开发中发挥了重要作用。刘洋(2009)在高粱基因组测序公布之前利用同源PCR克隆技术克隆了甜高粱SAI-1基因大部分片段。后与高粱基因组序列比对发现，已克隆的SAI-1基因片段之前恰好是一段序列空白。之后在空白片段两端设计引物，改变PCR参数，克隆出这段空白片段，同时采用RT-PCR方法克隆了该基因的cDNA全长。但由于该基因全长是分成五段后克隆、测序后拼接而成，要克隆更多高粱材料的SAI-1基因，这种方法显然不合适，因此目前需要一种更为简便的方法，为研究高粱SAI-1基因优异单体型发掘和分子育种、种质创新提供技术支持。
发明内容
为了满足上述领域的需求，本发明提供一种用于克隆高粱可溶性酸性转化酶基因SAI-1的方法，所述方法将SAI-1基因分为不均等的两段，采用两对引物分别进行PCR，然后再拼接获得SAI-1基因全长。
本发明请求保护的技术方案如下：
用于克隆高粱可溶性酸性转化酶基因SAI-1的引物，其核苷酸序列为：
SAIA-F/SAIA-R：CCTCCCATCCTTGATTCTCTT/TTGGGATCGTTCATCCAGTTC；
SAIP-F/SAIP-R：GTGGAGCAATGCGATGCTGC/CAGCATCAGATGTCCGTGACC。
用于克隆高粱可溶性酸性转化酶基因SAI-1前半段序列的引物，其核苷酸序列为：
SAIA-F/SAIA-R：CCTCCCATCCTTGATTCTCTT/TTGGGATCGTTCATCCAGTTC。
用于克隆高粱可溶性酸性转化酶基因SAI-1后半段序列的引物，其核苷酸序列为：
SAIP-F/SAIP-R：GTGGAGCAATGCGATGCTGC/CAGCATCAGATGTCCGTGACC。
用于克隆高粱可溶性酸性转化酶基因SAI-1的方法，包括如下步骤：
(1)以待测高粱品种为材料，提取样品基因组DNA；
(2)采用权利要求2所述的引物SAIA-F/SAIA-R，以样品基因组DNA为模板进行PCR反应A，获得扩增产物；若扩增产物中出现大小为635bp片段，则回收、克隆、测序该635bp片段，即SAI-1基因的前段；
(3)采用权利要求3所述的引物SAIP-F/SAIP-R，以样品基因组DNA为模板进行PCR反应B，获得扩增产物；若扩增产物中出现大小为3232～3412bp之间的单一片段，则回收、克隆、测序所述单一片段，为SAI-1基因的后段；
(4)将获得的所述SAI-1基因的前段和所述SAI-1基因的后段进行序列拼接，获得待测高粱品种的可溶性酸性转化酶基因全长。
所述PCR反应A的体系为：反应的总体积50μl，其中2×PCR Buffer for KOD FX 25μl，2mmol/L dNTPs 10μl，ddH2O 10μl，10μmol/L引物SAIA-F/SAIA-R各1.5μl，KOD FX 1μl，样品基因组DNA 1μl。
所述PCR反应A的程序为：94℃预变性2min；98℃10s，61℃30s，68℃30s，30个循环；68℃延伸10min。
所述PCR反应B的体系为：反应的总体积50μl，其中2×PCR Buffer for KOD FX 25μl，2mmol/L dNTPs 10μl，ddH2O 10μl，10μmol/L引物SAIP-F/SAIP-R各1.5μl，KOD FX 1μl，样品基因组DNA 1μl。
所述PCR反应B的程序为：94℃预变性2min；98℃10s，60℃30s，68℃3m30s，30个循环；68℃延伸10min。
基因序列扩增克隆是研究基因功能、标记开发等一系列研究的第一步。虽然各种类型PCR技术的基本反应原理都大致相同，但在实践中会遇到难以扩增的DNA目标序列，尤其相对于非高GC含量DNA序列而言，高GC含量DNA序列的PCR扩增更是困难。我们对近50份高粱属材料重测序的序列进行人工拼接发现，几乎所有的重测序数据都不能拼成完整SAI-1基因序列，在第一外显子和第三外显子区域高GC区未能完整测序。为进一步了解克隆的SAI-1基因GC分布，我们对每100bp DNA序列的GC含量进行统计。结果如图9所示，SAI-1基因GC的分布不均衡，外显子序列GC含量普遍较高，最高处可达80％以上，而内含子区，GC含量普遍较低，最低30％以下。一些区域GC含量波动剧烈，可能是导致SAI-1基因克隆困难的原因之一。
本研究通过对已知的高粱可溶性酸性转化酶基因序列及高粱基因组中该基因序列片段，设计引物，比较了基因全长克隆、巢式PCR、分段克隆等方法克隆高粱SAI-1基因的效果。结果表明，直接扩增全长，扩增产物极其不稳定且扩增产物纯化、连接，转化后得不到阳性克隆；采用均等分段克隆，前半段扩增产物纯化、连接转化后得不到阳性克隆，但后半段克隆成功。
为解决SAI-1基因难以克隆的问题，本发明提供一种用于克隆高粱可溶性酸性转化酶基因SAI-1的方法，采用不均等分段PCR策略，针对高粱基因组信息中SAI-1基因上游的未知序列部分设计引物SAIA-F/SAIA-R，以待测高粱品种的基因组DNA为模板，扩增SAI-1基因的前段；根据余下的已知序列设计引物SAIP-F/SAIP-R，以待测高粱品种的基因组DNA为模板，扩增SAI-1基因的后段；然后将获得的两个片段进行拼接，得到SAI-1基因的全长。
以甜高粱品种“MN-3466”为例，采用本发明提供的方法进行SAI-1基因克隆。经测序，引物SAIA-F/SAIA-R扩增的前段序列长635bp，其碱基组成为：腺嘌呤A 13.86％，鸟嘌呤G32.28％，胸腺嘧啶T 16.54％，胞嘧啶C 37.32％，A+T 30.39％，C+G 69.61％，属于富含GC片段。引物SAIP-F/SAIP-R扩增的后段序列长3408bp，其碱基组成为：A 22.68％，G23.36％，T24.79％，C29.17％，GC合计52.52％。两个片段之间有78bp的重叠，拼接后得到的SAI-1基因全长3965bp，其碱基组成为：A 21.19％，G 24.69％，T 23.63％，C30.49％，C+G 55.18％。将获得的SAI-1基因全长序列与已经公布的高粱基因组序列(GenBank AccessionNC_012873.1)比对发现，基因组中所缺失的实际片段长450bp，其C+G比例43.11％偏低。与已经克隆的SAI-1基因序列(GenBank Accession JX535516.1)相似性99.3％，证明该序列正确。之后，我们利用该方法对136份高粱材料的SAI-1基因进行了克隆，均能成功获得SAI-1基因全长，证明本发明提供的方法可行。
通过对各种PCR方法的尝试，我们认为高GC含量虽是造成SAI-1基因克隆的重要原因，但GC分布的巨大波动性可能是影响PCR的更重要的因素。随着研究的不断深入，高GC序列的克隆已经不再是特别困难的事，市场上已有不少针对GC含量PCR的专用试剂盒。然而，高粱SAI-1基因GC分布极不均匀，有的区段GC含量高达80％以上，而有的区段GC含量却不到30％。因此，即便使用这种专用试剂盒，采用常规的全长PCR、巢式PCR及均等分段PCR等方法也不能克隆出SAI-1基因全长。现有技术中虽然已有成功克隆高粱SAI-1基因的例子，但是该方法将SAI-1基因分成五段后克隆、测序后拼接而成，步骤繁琐，而高粱有上千个品种，如果都采用这种多段PCR的方法，耗费时间长，势必阻碍后续研究的进行。发明人经过多年的研究发现，将SAI-1基因按照本发明所述的位置分为不均等的两段，采用两对引物SAIA-F/SAIA-R和SAIP-F/SAIP-R分别进行扩增，然后再进行拼接，能够快速成功地获得SAI-1基因全长，并且，所述两对引物均在保守区域内设计，适用于所有的高粱品种。实验证明，采用本发明提供的引物和方法，能够成功获得136份高粱材料的SAI-1基因全长。
在优选实施例中，两段PCR条件不同，用引物SAIA-F/SAIA-R扩增前段时，其退火温度为61℃；用引物SAIP-F/SAIP-R扩增后段时，其退火温度为60℃。由于前段GC含量高，因此前段PCR退火温度较后段高1度，提高其特异性。
综上，本发明用于克隆高粱可溶性酸性转化酶基因SAI-1的方法，能够快速、简便、成功地克隆出高粱的SAI-1基因，解决了SAI-1基因难以克隆的问题，大大缩短了该基因的克隆周期，促进了该基因的功能研究，推动了高粱蔗糖代谢的研究，加速了高粱的分子育种和种质创新。
附图说明
图1.高粱SAI-1基因全长PCR产物检测
其中，M为DL8000标记，从上至下条带大小为8000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；1-2为SAI-1基因扩增条带。
图2.巢式PCR扩增高粱SAI-1基因的第一轮PCR产物检测
其中，M为DL8000标记，从上至下条带大小为8000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；1为第一轮PCR产物。
图3.巢式PCR扩增高粱SAI-1基因的第二轮PCR产物检测
其中，M为DL8000标记，从上至下条带大小为8000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；1-2为第二轮PCR产物。
图4.均等分段PCR扩增高粱SAI-1基因的PCR产物检测
其中，M为DL8000标记，从上至下条带大小为8000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；1为SAI-1基因前半段扩增产物；2为SAI-1基因后半段扩增产物。
图5.均等分段PCR扩增高粱SAI-1基因的前半段克隆PCR鉴定
其中，M为DL8000标记，从上至下条带大小为8000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；1-10为SAI-1基因前半段克隆PCR鉴定条带。
图6.均等分段PCR扩增高粱SAI-1基因的后半段克隆PCR鉴定
其中，M为DL8000标记，从上至下条带大小为8000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；1-10为SAI-1基因后半段克隆PCR鉴定条带。
图7.不均等分段PCR扩增高粱SAI-1基因的前段PCR产物检测
其中，M为DL5000标记，从上至下条带大小为5000bp，3000bp，2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；1-3为SAI-1基因前段扩增产物。
图8.不均等分段PCR扩增高粱SAI-1基因的后段PCR产物检测
其中，M为DL5000标记，从上至下条带大小为5000bp，3000bp，2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；1-3为SAI-1基因后段扩增产物。
图9.不均等分段PCR扩增高粱SAI-1基因的前段克隆PCR鉴定
其中，M为DL5000标记，从上至下条带大小为5000bp，3000bp，2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；1-9为SAI-1基因前段克隆PCR鉴定产物。
图10.不均等分段PCR扩增高粱SAI-1基因的后段克隆PCR鉴定
其中，M为DL5000标记，从上至下条带大小为5000bp，3000bp，2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；1-10为SAI-1基因后段克隆PCR鉴定产物。
图11.SAI-1基因序列GC含量分布图
图12.不均等分段扩增其它高粱品种SAI-1基因的前段PCR产物检测
其中，M为DL5000标记，从上至下条带大小为5000bp，3000bp，2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；1-6分别为高粱品种原2B、原937B、原8002、新高粱9号、吉甜3号和甜选3号的SAI-1基因前段扩增产物。
图13.不均等分段扩增其它高粱品种SAI-1基因的后段PCR产物检测
其中，M为DL5000标记，从上至下条带大小为5000bp，3000bp，2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；1-6为高粱品种原2B、原937B、原8002、新高粱9号、吉甜3号和甜选3号的SAI-1基因后段扩增产物。
图14.不均等分段PCR扩增高粱品种原2B的SAI-1基因的前段克隆PCR鉴定
其中，M为DL5000标记，从上至下条带大小为5000bp，3000bp，2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；1-10为高粱品种原2B的SAI-1基因前段克隆PCR鉴定产物。
图15.不均等分段PCR扩增高粱品种原937B的SAI-1基因的前段克隆PCR鉴定
其中，M为DL5000标记，从上至下条带大小为5000bp，3000bp，2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；1-10为高粱品种原937B的SAI-1基因前段克隆PCR鉴定产物。
图16.不均等分段PCR扩增高粱品种原8002的SAI-1基因的前段克隆PCR鉴定
其中，M为DL5000标记，从上至下条带大小为5000bp，3000bp，2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；1-10为高粱品种原8002的SAI-1基因前段克隆PCR鉴定产物。
图17.不均等分段PCR扩增高粱品种新高粱9号的SAI-1基因的前段克隆PCR鉴定
其中，M为DL5000标记，从上至下条带大小为5000bp，3000bp，2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；1-10为高粱品种新高粱9号的SAI-1基因前段克隆PCR鉴定产物。
图18.不均等分段PCR扩增高粱吉甜3号的SAI-1基因的前段克隆PCR鉴定
其中，M为DL5000标记，从上至下条带大小为5000bp，3000bp，2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；1-10为高粱吉甜3号的SAI-1基因前段克隆PCR鉴定产物。
图19.不均等分段PCR扩增高粱品种甜选3号的SAI-1基因的前段克隆PCR鉴定
其中，M为DL5000标记，从上至下条带大小为5000bp，3000bp，2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；1-10为高粱品种甜选3号的SAI-1基因前段克隆PCR鉴定产物。
图20.不均等分段PCR扩增高粱品种原2B的SAI-1基因的后段克隆PCR鉴定
其中，M为DL5000标记，从上至下条带大小为5000bp，3000bp，2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；1-10为高粱品种原2B的SAI-1基因后段克隆PCR鉴定产物。
图21.不均等分段PCR扩增高粱品种原937B的SAI-1基因的后段克隆PCR鉴定
其中，M为DL5000标记，从上至下条带大小为5000bp，3000bp，2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；1-10为高粱品种原937B的SAI-1基因后段克隆PCR鉴定产物。
图22.不均等分段PCR扩增高粱品种原8002的SAI-1基因的后段克隆PCR鉴定
其中，M为DL5000标记，从上至下条带大小为5000bp，3000bp，2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；1-10为高粱品种原8002的SAI-1基因后段克隆PCR鉴定产物。
图23.不均等分段PCR扩增高粱品种新高粱9号的SAI-1基因的后段克隆PCR鉴定
其中，M为DL5000标记，从上至下条带大小为5000bp，3000bp，2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；1-10为高粱品种新高粱9号的SAI-1基因后段克隆PCR鉴定产物。图24.不均等分段PCR扩增高粱品种吉甜3号的SAI-1基因的后段克隆PCR鉴定
其中，M为DL5000标记，从上至下条带大小为8000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；1-10为高粱品种吉甜3号的SAI-1基因后段克隆PCR鉴定产物。
图25.不均等分段PCR扩增高粱品种甜选3号的SAI-1基因的后段克隆PCR鉴定
其中，M为DL5000标记，从上至下条带大小为8000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；1-10为高粱品种甜选3号的SAI-1基因后段克隆PCR鉴定产物。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明进行详细说明，需要理解的是，下述实施例仅作为解释和说明，而不构成对本发明范围的任何限制。
实验材料：
甜高粱品种“MN-3466”，美国品种，为本实验室保存。2013年5月于中国农业科学院作物科学研究所昌平试验基地播种。
本实验室已克隆出136个其它高粱品种的SAI-1基因，其中6个品种的名称及其来源如表1所示，所列品种均可商购获得。
表1 部分已克隆出SAI-1基因的高粱品种
上述生物材料本实验室亦有保存，可自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。
实验试剂：
KOD-FX DNA聚合酶，购于TOYOBO公司；
AxyPrep PCR清洁试剂盒，购于AXYGEN；
胶回收试剂盒Gel Extraction Kit，购于QIAGEN公司；
零背景快速连接试剂盒，购于天根生化科技(北京)有限公司；
DH5α大肠杆菌感受态细胞，购于天根生化科技(北京)有限公司；
质粒提取试剂盒Axy PrepTM Plasmid Miniprep Kit，购自AXYGEN公司；
引物合成与测序由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。
本发明未特别说明的实验试剂均为本领域常规试剂，或采用本领域常规方法配制而得，可商购获得，规格为分析纯。
实施例1、采用不同PCR方法克隆甜高粱SAI-1基因的效果对比
(一)提取基因组DNA
剪取出苗三周后的甜高粱“MN-3466”的植株幼叶，置于冰盒内带回，于-80℃超低温冰箱内保存，用于基因组DNA的提取。采用CTAB法提取叶片基因组DNA，用1％的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测提取的基因组DNA的质量和浓度。
结果显示，提取的甜高粱基因组DNA在1％的琼脂糖凝胶电泳检测中带型清晰完整，经紫外分光光度计检测，其质量浓度大于300ng/μl，OD260/OD280在1.8左右。
(二)引物设计
根据GenBank登记的已克隆的甜高粱SAI-1基因(Genbank accession no.JX535517)及其在高粱基因组中的位置获得SAI-1基因序列及其两端序列，利用引物设计软件Primer Premier 6.0，根据该序列设计引物如下：
(1)全长PCR引物SAI1-F/SAI1-R：用于扩增高粱SAI-1基因全长。
(2)巢式PCR引物SAI2-F/SAI2-R：用于扩增高粱SAI-1基因全长，其中，引物SAI1-F、SAI1-R所扩增的片段位于引物SAI2-F、SAI2-R所扩增的片段内。
(3)均等分段PCR引物SAIF-F/SAIF-R和SAIL-F/SAIL-R：将高粱SAI-1基因分为长度约相同的两个片段，引物SAIF-F/SAIF-R用于扩增前半段，引物SAIL-F/SAIL-R用于扩增后半段，两个片段间具有168bp的重叠，拼接可得到全长。
(4)不均等分段PCR引物SAIA-F/SAIA-R和SAIP-F/SAIP-R：高粱基因组测序已完成，但公布的基因组序列中，SAI-1基因上游有一段未知序列，推测该段较难克隆。根据该未知序列两端序列设计引物SAIA-F/SAIA-R扩增该片段，根据SAI-1基因序列设计引物
SAIP-F/SAIP-R扩增其后面的已知片段，保证两段序列间有78bp的重叠，拼接得到全长。
(三)SAI-1基因克隆
1、SAI-1基因全长克隆
采用引物SAI1-F/SAI1-R，以甜高粱“MN-3466”基因组DNA为模板，按照下列反应体系和程序进行PCR，扩增SAI-1基因全长。
反应体系：总体积50μl，其中2×PCR Buffer for KOD FX 25μl，dNTPs(2mmol/L)10μl，ddH2O 10μl，上下游引物(10μmol/L)各1.5μl，KOD FX 1μl，DNA模板1μl。
反应程序：94℃预变性2min；98℃ 10s，50℃ 30s，68℃ 4min，30个循环；68℃延伸10min。
1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，利用QIAGEN的Gel Extraction Kit试剂盒对PCR产物进行回收。采用天根零背景快速连接试剂盒将回收的PCR产物与克隆载体pZeroBack/blunt连接，并将连接产物转入大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中。转化后的大肠杆菌在含Amp(60μg/ml)的LB琼脂平板培养基上过夜培养，菌落PCR鉴定，得到3个阳性克隆，将阳性克隆的单菌落接种于液体LB(Amp：60μg/ml)培养基中过夜培养，用Axy PrepTMPlasmid Miniprep Kit试剂盒提取质粒，送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。
结果表明，使用全长PCR引物SAI1-F/SAI1-R对基因组中SAI-1基因进行扩增，目标条带相对较暗(图1)，对PCR产物进行回收、连接、转化后，单菌落鉴定无阳性克隆。并且PCR稳定性较差，调整扩增程序后扩增效果仍难于改善，之后又设计了几对引物进行克隆仍未获得阳性克隆。
2、巢式PCR克隆SAI-1基因全长
采用引物SAI2-F/SAI2-R，以甜高粱“MN-3466”基因组DNA为模板，按照SAI-1基因全长克隆中的反应体系和程序进行第一轮PCR，得到第一轮PCR产物。用1％琼脂糖凝胶电泳检测第一轮PCR产物，利用AxyPrep PCR清洁试剂盒将PCR产物进行纯化。然后采用巢式PCR引物SAI1-F/SAI1-R，以纯化后的第一轮PCR产物为模板，按照SAI-1基因全长克隆中的反应体系和程序进行第二轮PCR，扩增SAI-1基因全长。
结果显示，引物SAI2-F/SAI2-R可以扩增出条带(图2)；以纯化后的第一轮PCR产物为模板，SAI1-F/SAI1-R为引物进行扩增，不能扩增出目标条带(图3)，巢式PCR未能成功克隆高粱SAI-1基因。
3、均等分段法克隆SAI-1基因
以甜高粱“MN-3466”基因组DNA为模板，分别采用引物SAIF-F/SAIF-R和SAIL-F/SAIL-R，按照下列反应体系和程序进行PCR，分别扩增SAI-1基因的前半段和后半段。
PCR体系：总体积50μl，其中2×PCR Buffer for KOD FX 25μl，dNTPs(2mmol/L)10μl，ddH2O 10μl，上下游引物(10μmol/L)各1.5μl，KOD FX 1μl，DNA模板1μl。
PCR程序：94℃预变性2min；98℃10s，64℃30s，68℃2min，30个循环；68℃延伸10min。
1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，利用QIAGEN的Gel Extraction Kit试剂盒对PCR产物进行回收。采用天根零背景快速连接试剂盒将回收的PCR产物与克隆载体pZeroBack/blunt连接，并将连接产物转入大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中。转化后的大肠杆菌在含Amp(60μg/ml)的LB琼脂平板培养基上过夜培养，菌落PCR鉴定，将鉴定的阳性克隆的单菌落接种于液体LB(Amp：60μg/ml)培养基中过夜培养，用Axy PrepTM PlasmidMiniprep Kit试剂盒提取质粒，送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。
结果表明，两对引物的扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中均表现为较单一清晰的条带(图4)，对SAIF-F/SAIF-R的扩增产物进行PCR产物回收并与克隆载体连接克隆后未得到阳性克隆(图5)。虽多次设计前半段引物，均未能成功克隆出SAI-1基因的前半段。对SAIL-F/SAIL-R的扩增产物进行胶回收并将产物和克隆载体连接克隆后可以得到阳性克隆(图6)，挑取阳性菌落过夜培养，提取质粒，送测序，经验证，该扩增产物为目标序列，即SAI-1基因的后半段。
4、不均等分段克隆SAI-1基因
(1)以甜高粱“MN-3466”基因组DNA为模板，采用引物SAIA-F/SAIA-R，按照下列反应体系和程序进行PCR，扩增高粱基因组序列中SAI基因的未知序列，即SAI-1基因的前段。
PCR体系：总体积50μl，其中2×PCR Buffer for KOD FX 25μl，dNTPs(2mmol/L)10μl，ddH2O 10μl，上下游引物(10μmol/L)各1.5μl，KOD FX 1μl，DNA模板1μl。
PCR程序：94℃预变性2min；98℃10s，61℃30s，68℃30s，30个循环；68℃延伸10min。
扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，利用AXYGEN的AxyPrep PCR清洁试剂盒回收PCR产物。
(2)然后以甜高粱“MN-3466”基因组DNA为模板，采用引物SAIP-F/SAIP-R，按照下列反应体系和程序进行PCR，扩增高粱基因组序列中SAI-1基因的已知序列，即SAI-1基因的后段。
PCR体系：总体积50μl，其中2×PCR Buffer for KOD FX 25μl，dNTPs(2mmol/L)10μl，ddH2O 10μl，上下游引物(10μmol/L)各1.5μl，KOD FX 1μl，DNA模板1μl。
PCR程序：94℃预变性2min；98℃10s，60℃30s，68℃3m30s，30个循环；68℃延伸10min。
扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，利用QIAGEN的Gel Extraction Kit回收PCR产物。
(3)采用天根零背景快速连接试剂盒将步骤(1)和步骤(2)回收的PCR产物分别与克隆载体pZeroBack/blunt连接，并将连接产物转入大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中。转化后的大肠杆菌在含Amp(60μg/ml)的LB琼脂平板培养基上过夜培养，菌落PCR鉴定，将鉴定的阳性克隆的单菌落接种于液体LB(Amp：60μg/ml)培养基中过夜培养，用Axy PrepTM PlasmidMiniprep Kit试剂盒提取质粒，送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。
结果表明，引物SAIA-F/SAIA-R的扩增产物在凝胶电泳中呈较为单一的条带(图7)，对扩增产物进行PCR产物纯化回收，并与克隆载体连接、转化、鉴定，挑取阳性克隆菌落过夜培养，提取质粒进行测序后比对，获得SAI-1基因的前段序列，长635bp，其碱基组成为：腺嘌呤A 13.86％，鸟嘌呤G 32.28％，胸腺嘧啶T 16.54％，胞嘧啶C 37.32％，A+T 30.39％，C+G69.61％，属于富含GC片段。
引物SAIP-F/SAIP-R的扩增产物大小正确(图8)，扩增产物进行胶回收并与克隆载体连接、转化、鉴定，挑取阳性克隆菌落过夜培养，提取质粒进行测序后比对，获得SAI-1基因的后段序列，长3408bp，其碱基组成为：A22.68％，G23.36％，T24.79％，C29.17％，GC合计52.52％。
引物SAIA-F、SAIA-R扩增SAI-1基因所得到的片段长度约为635bp，与预测大小一致，而与克隆载体连接、转化后，鉴定发现均为300bp左右，挑3个菌落进行培养、提质粒测序，结果均正确。推测有可能是形成了高级结构或者错配(图9)。
将两段序列拼接，得到SAI-1基因的全长，共3965bp，其碱基组成为：A 21.19％，G 24.69％，T 23.63％，C30.49％，C+G 55.18％。与已经克隆的SAI-1基因序列(Genbank AccessionJX535516.1)相似性为99.3％，证明该序列正确。
实施例2、其它高粱品种中SAI-1基因的克隆
为证明本发明提供的用于克隆高粱SAI-1基因的引物和方法可行，我们对136份高粱材料的SAI-1基因进行了克隆，均成功获得各品种的全长SAI-1基因，下面以表1所列高粱品种为例进行详细说明。
1、提取基因组DNA
剪取出苗三周后的高粱品种原2B、原937B、原8002、新高粱9号、吉甜3号、甜选3号的植株幼叶，置于冰盒内带回，于-80℃超低温冰箱内保存，用于基因组DNA的提取。采用CTAB法提取叶片基因组DNA，用1％的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测提取的基因组DNA的质量和浓度。
2、SAI-1基因克隆
(1)分别以高粱品种原2B、原937B、原8002、新高粱9号、吉甜3号、甜选3号基因组DNA为模板，采用引物SAIA-F/SAIA-R，按照下列反应体系和程序进行PCR，扩增高粱基因组序列中SAI-1基因的未知序列，即SAI-1基因的前段。
PCR体系：总体积50μl，其中2×PCR Buffer for KOD FX 25μl，dNTPs(2mmol/L)10μl，ddH2O 10μl，上下游引物(10μmol/L)各1.5μl，KOD FX 1μl，DNA模板1μl。
PCR程序：94℃预变性2min；98℃10s，61℃30s，68℃30s，30个循环；68℃延伸10min。
扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测(图12)，利用AXYGEN的AxyPrep PCR清洁试剂盒回收PCR产物。
(2)然后分别以高粱品种原2B、原937B、原8002、新高粱9号、吉甜3号、甜选3号基因组DNA为模板，采用引物SAIP-F/SAIP-R，按照下列反应体系和程序进行PCR，扩增高粱基因组序列中SAI-1基因的已知序列，即SAI-1基因的后段。
PCR体系：总体积50μl，其中2×PCR Buffer for KOD FX 25μl，dNTPs(2mmol/L)10μl，ddH2O 10μl，上下游引物(10μmol/L)各1.5μl，KOD FX 1μl，DNA模板1μl。
PCR程序：94℃预变性2min；98℃10s，60℃30s，68℃3m30s，30个循环；68℃延伸10min。
扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测(图13)，利用QIAGEN的Gel ExtractionKit回收PCR产物。
(3)采用天根零背景快速连接试剂盒将步骤(1)和步骤(2)回收的PCR产物分别与克隆载体pZeroBack/blunt连接，并将连接产物转入大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中。转化后的大肠杆菌在含Amp(60μg/ml)的LB琼脂平板培养基上过夜培养，菌落PCR鉴定(图14-25)，将鉴定的阳性克隆的单菌落接种于液体LB(Amp：60μg/ml)培养基中过夜培养，用AxyPrepTM Plasmid Miniprep Kit试剂盒提取质粒，送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。
结果表明，采用本发明提供的引物及不均等分段PCR方法，均能成功克隆出这六个高粱品种的SAI-1基因全长。所有高粱品种的前段PCR产物大小相同，均为635bp，后段PCR产物大小各异。其中，高粱品种原2B的后段PCR产物大小为3409bp，其SAI-1基因全长3966bp；原937B的后段PCR产物大小为3406bp，其SAI-1基因全长3964bp；原8002的后段PCR产物大小为3232bp，其SAI-1基因全长3791bp；新高粱9号的后段PCR产物大小为3410bp，其SAI-1基因全长3966bp；吉甜3号的后段PCR产物大小为3402bp，其SAI-1基因全长3960bp；甜选3号的后段PCR产物大小为3412bp，其SAI-1基因全长3971bp。
Claims (8)
1.用于克隆高粱可溶性酸性转化酶基因SAI-1的引物，其核苷酸序列为：
SAIA-F/SAIA-R：CCTCCCATCCTTGATTCTCTT/TTGGGATCGTTCATCCAGTTC；
SAIP-F/SAIP-R：GTGGAGCAATGCGATGCTGC/CAGCATCAGATGTCCGTGACC。
2.用于克隆高粱可溶性酸性转化酶基因SAI-1前半段序列的引物，其核苷酸序列为：
SAIA-F/SAIA-R：CCTCCCATCCTTGATTCTCTT/TTGGGATCGTTCATCCAGTTC。
3.用于克隆高粱可溶性酸性转化酶基因SAI-1后半段序列的引物，其核苷酸序列为：
SAIP-F/SAIP-R：GTGGAGCAATGCGATGCTGC/CAGCATCAGATGTCCGTGACC。
4.用于克隆高粱可溶性酸性转化酶基因SAI-1的方法，包括如下步骤：
(1)以待测高粱品种为材料，提取样品基因组DNA；
(2)采用权利要求2所述的引物SAIA-F/SAIA-R，以样品基因组DNA为模板进行PCR反应A，获得扩增产物；若扩增产物中出现大小为635bp片段，则回收、克隆、测序该635bp片段，即SAI-1基因的前段；
(3)采用权利要求3所述的引物SAIP-F/SAIP-R，以样品基因组DNA为模板进行PCR反应B，获得扩增产物；若扩增产物中出现大小为3232～3412bp之间的单一片段，则回收、克隆、测序所述单一片段，为SAI-1基因的后段；
(4)将获得的所述SAI-1基因的前段和所述SAI-1基因的后段进行序列拼接，获得待测高粱品种的可溶性酸性转化酶基因全长。
5.根据权利要求4所述的方法，所述PCR反应A的体系为：反应的总体积50μl，其中2×PCRBuffer for KOD FX 25μl，2mmol/L dNTPs 10μl，ddH2O 10μl，10μmol/L引物SAIA-F/SAIA-R各1.5μl，KOD FX 1μl，样品基因组DNA 1μl。
6.根据权利要求4或5所述的方法，所述PCR反应A的程序为：94℃预变性2min；98℃10s，61℃30s，68℃30s，30个循环；68℃延伸10min。
7.根据权利要求4所述的方法，所述PCR反应B的体系为：反应的总体积50μl，其中2×PCRBuffer for KOD FX 25μl，2mmol/L dNTPs 10μl，ddH2O 10μl，10μmol/L引物SAIP-F/SAIP-R各1.5μl，KOD FX 1μl，样品基因组DNA 1μl。
8.根据权利要求6或7所述的方法，所述PCR反应B的程序为：94℃预变性2min；98℃10s，60℃30s，68℃3m30s，30个循环；68℃延伸10min。
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005102034A2 (en) * | 2004-04-20 | 2005-11-03 | Syngenta Participations Ag | Regulatory sequences for expressing gene products in plant reproductive tissue |
| CN101580878A (zh) * | 2009-06-29 | 2009-11-18 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 鉴别可溶性酸性转化酶基因等位变异的甜高粱材料的分子标记 |
| CN102505021A (zh) * | 2011-11-17 | 2012-06-20 | 广西大学 | 甘蔗GH32家族可溶性酸性转化酶（SoINV）基因及其蛋白序列 |
-
2015
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005102034A2 (en) * | 2004-04-20 | 2005-11-03 | Syngenta Participations Ag | Regulatory sequences for expressing gene products in plant reproductive tissue |
| CN101580878A (zh) * | 2009-06-29 | 2009-11-18 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 鉴别可溶性酸性转化酶基因等位变异的甜高粱材料的分子标记 |
| CN102505021A (zh) * | 2011-11-17 | 2012-06-20 | 广西大学 | 甘蔗GH32家族可溶性酸性转化酶（SoINV）基因及其蛋白序列 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| E. GNANSOUNOU等: "Refining sweet sorghum to ethanol and sugar: economic trade-offs in the context of North China", 《BIORESOURCE TECHNOLOGY》 * |
| GEORGIA ANTONOPOULOU等: "Biofuels generation from sweet sorghum: Fermentative hydrogen production and anaerobic digestion of the remaining biomass", 《BIORESOURCE TECHNOLOGY》 * |
| YANG LIU等: "Allelic variation of a soluble acid invertase gene (SAI-1) and development of a functional marker in sweet sorghum [Sorghum bicolor (L.) Moench]", 《MOL BREEDING》 * |
| 聂元冬: "甜高粱SAI-1基因全长克隆及表达分析", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑》 * |
| 聂元冬等: "甜高粱可溶性酸性转化酶基因(SAI-1)cDNA全长克隆及表达分析", 《分子植物育种》 * |
| 阮燕哔等: "甜高梁茎秆贮存过程中蔗糖代谢及其相关酶活性的变化研究", 《中国农业学报》 * |
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