CN112851782B - 一种水稻穗长调控基因及其分子标记和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻穗长调控基因及其分子标记和应用，所述的调控基因为LOC_Os06g06490，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，CDS序列如SEQ ID NO.2所示，所述调控蛋白其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，分子标记为RM19402和Chr06MM0327。本发明基因LOC_Os06g06490是控制水稻穗长的基因，伴随有穗粒数增多，结实率提高，穗粒密度增大，株高略有增高，但有效穗略有减少，粒重略有减小，最终产量略有增加。该基因的进一步研究对于水稻产量与品质的分子机制研究有一定的作用。

Description

一种水稻穗长调控基因及其分子标记和应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种水稻穗长调控基因及其分子标记和应用。

背景技术

水稻是重要的粮食作物，水稻穗长是与穗粒数、穗粒密度及因其充实相关的稻米品质和产量密切相关的重要农艺性状。我国水稻超高产育种研究始于80年代中期，对超高产水稻育种理想株型的研究，众学者们也提出了一系列的模型，有库西的“少分蘖、大穗模式”，黄耀祥的“半矮秆丛生快长模式”，杨守仁的“巨型稻型”，周开达的“重穗型”，袁隆平的“绵里藏针型”等等，这些模型基本上都是从株型、穗型的相关结构上进行设计的。半个多世纪以来，粳稻的短直立穗型育种，为我国北方的粮食增产起到了重要的作用。然而，水稻的穗型是具有生态选择性的，适合于北方干燥气温低的短而密穗型的水稻在南方会由于高温高湿会大大增加稻曲病的发生。在长江中下游稻区，籼稻特别是“北粳南移”的粳稻，适当长而弯穗型的水稻更有利于稻米品质的提高、病虫害的减少和产量的提升。因而穗型育种对提高稻米品质和产量具有重要的意义。

Gramene网站上报道过穗长QTL共有260次，除去报道重复的还共有207次。申请人在前期的研究工作中，通过筛选染色体单片段代换系(SSSLs)(Liu et al,.2015)，从51份SSSLs中筛选了几份带穗长QTL的材料，通过3季对穗长QTL的检测和F₂群体的连锁分析，在第6号染色体的RM190附近(Wax的连锁标记)约1.65Mb的范围，重复鉴定和定位到了一个穗长QTL-qPL6，效应非常大，主效QTL很稳定。通过进一步研究将目标基因定在Os06g0155000-Os06g0160500的232.3kb范围，包括28个候选基因，其中的7个基因在穗部表达量比在其他组织表达量高很多(数据rap.dp网站)，对候选基因进行了5cm穗长的基因表达、测序分析与基因编辑功能验证，确定本申请的基因LOC_Os06g06490为控制穗长目的基因。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水稻穗长调控基因LOC_Os06g06490、蛋白、分子标记及其在辅助选择育种中的应用。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种水稻穗长调控基因LOC_Os06g06490，所述的调控基因LOC_Os06g06490的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了所述调控基因LOC_Os06g06490的编码区的核苷酸序列(CDS区)如SEQ ID NO.2所示。

同时提供了所述调控基因LOC_Os06g06490的表达引物S50-490R和S50-490F：

S50-490R：GCGGATTACGAGCAGGTGAT；

S50-490F：GTTTTTGGCTTTTGAGTTCC(130bp跨外显子)。

在本发明的另一方面，提供了一种水稻穗长调控蛋白，所述调控蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

所述的调控蛋白的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的另一方面，将本发明的调控基因LOC_Os06g06490进行敲除，其敲除基因植株表现为穗长长度回复，说明本发明的调控基因LOC_Os06g06490是水稻穗长杂优调控功能基因。

因此，所述的调控基因LOC_Os06g06490或其编码的调控蛋白在增加水稻穗长和提高水稻产量中的应用也在本发明的保护范围内。

在本发明的另一方面，还提供所述调控基因LOC_Os06g06490的分子标记，所述的分子标记为RM25753和Chr06MM0327。

其中，分子标记RM25753的引物为：

RM25753-F：ACCATTTGTCAGTGAACTACCC；

RM25753-R：ATCAGAGCACCTAACACATAGC。

分子标记Chr06MM0327的引物为：

Chr06MM0327-F：CCATGAGACCGTGACTACGA；

Chr06MM0327-R：TCAAGAAACCAAATCCGACC。

同时，所述的分子标记在辅助选择长穗型水稻育种中的应用也在本发明保护范围之内。

本发明的有益效果为：

水稻育种过程中，产量是一个极其复杂的性状，主要由穗数、穗粒数和粒重相关，穗长涉及的并不多。近年来，优质化+高产化育种的目标越来越被重视，以往认为高产与优质化很难兼顾，随着一些有利基因的发掘与应用，生产中出现了不少即高产又优质的水稻品种，其中穗长起到了一个重要的作用，适当长的穗长为增加穗粒数、减少高温下密的穗粒密度影响灌浆品质起到举足轻重的作用。本发明的水稻穗长基因LOC_Os06g06490，伴随有穗粒数增多，结实率提高，穗粒密度增大，株高略有增高，但有效穗略有减少，粒重略有减小，最终产量略有增加，该基因的进一步研究对于水稻产量与品质的分子机制研究有一定的作用。

附图说明

图1是本发明实施例基因连锁图；

图2是本发明实施例S50穗长的基因表达；

图3是本发明实施例功能验证基因编辑位点；

图4是基因表型；a为株型，b为穗型，c、d为粒型。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

表型鉴定试验方法：每份材料按照随机区组种植，设置3个重复，保证水肥一致、通风一致、病虫害防治一致和阳光一致。待灌浆期每份材料每个重复数10株，计算平均有效穗，待成熟期，每份材料每个重复取平均有效穗的5株单独收种，烘干后考种产量相关指标，包括：单株产量、穗数、实粒数、千粒重和穗长，粒长和粒宽用万深扫描仪进行扫描(每份材料挑选充实均匀的约50粒测算)，株高和抽穗期在田间收割前记载。

实施例1基因LOC_Os06g06490的筛选

S50与S0杂交，得到F₂分离群体，构建基因的定位群体，每个群体240株，每株检测基因型，成熟后扫描粒形表型，利用Mapmaker/Exp3.0和IciMapping version 4.0进行连锁分析，方法详情参见Identification and application of major quantitative traitloci for panicle length in rice(Oryza sativa)through single-segmentsubstitution lines.Xiaoling Wang,Guifu Liu,Zhiquan Wang,Songliang Chen,YulongXiao,Chuanyuan Yu.Plant Breeding.2019；138:299–308。

最终将目标基因定位在紧密连锁的标记为：RM190-F:CTTTgTCTATCTCAAgACAC，RM190-R:TTgCAgATgTTCTTCCTgATg。RM508-F：ggATAgATCATgTgTggggg，RM508-R：ACCCgTgAACCACAAAgAAC(图1)。通过筛选标记加密，结合重叠群作图，将目标定于RM25753与Chr06MM0327之间，电子克隆显示，Os06g0155000-Os06g0160500的232.3kb范围，包括28个候选基因，其中的7个基因在穗部表达量比在其他组织表达量高很多(数据rap.dp网站)，也即是LOC_Os06g06250、LOC_Os06g06330、LOC_Os06g06460、LOC_Os06g06480、LOC_Os06g06490、LOC_Os06g06510和LOC_Os06g06530作为候选基因。

实施例2候选基因的鉴定与敲除

将7个候选基因LOC_Os06g06250、LOC_Os06g06330、LOC_Os06g06460、LOC_Os06g06480、LOC_Os06g06490、LOC_Os06g06510和LOC_Os06g06530分别设计尽可能跨外显子的表达引物，进行5cm穗长的基因表达分析，发现S50只有Os06g06490与对照的表达差异极显著(图2)，其表达引物为：S50-490R：GCGGATTACGAGCAGGTGAT；S50-490F：GTTTTTGGCTTTTGAGTTCC(130bp跨外显子)。基因全长4606bp，有7个外显子，转录343个AA。

通过构建pC1300-Cas9载体，对LOC_Os06g06490基因送武汉伯远生物科技有限公司进行转化敲除验证，编辑位点的几个突变事件(图3)，其穗长与对照不显著，为鉴定的目标基因。

实施例3基因的聚合育种应用

带LOC_Os06g06490的S50与对照的农艺性状如表1和图4；将S50与带另外穗长QTL(Chr.7)的S17进行聚合，聚合系表现出与对照穗长增长，产量增加(如表2)。

表1.S50的农艺性状

表2.聚合系农艺表型

实施例4

从染色体片段代换系S50的代换片段中，开发和筛选一系列的定位加密标记，其中RM25753与Chr06MM0327之间距离约1cM，之间发生的交换率非常低，用这两个卡口标记辅助杂交后代的选择。S50×S17杂交后得到的种子种植F₁(F₁全部基因为杂合型，可以考察杂种优势效应)，继续收种种植得到F₂群体，从F₂群体中检测S50的两个卡口标记为纯合或杂合阳性标记，即可分别考察LOC_Os06g06490基因的本身遗传效应和杂种优势效应。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 江西省农业科学院水稻研究所

<120> 一种水稻穗长调控基因及其分子标记和应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4606

<212> DNA

<213> 水稻穗长调控基因(LOC_Os06g06490)

<400> 1

tcgacgagct tcgggaaagc tctatcgggc ccttcatgta caatgtaccg tccgaatctc 60

aaagctccga acgttcgacg agcttcggga aagaacgaat cgttcgcacc ggttataaat 120

agtgtgctgc gaacgttcac tctcacaacc agtcaaccac aaccatccgt tcgattgatc 180

gatccttcca aaccctagct tagtcgttga ctcctgcgcc gtccggtgag ccagccatgt 240

ctcccgtacg cttcaacccg tggcgtgcgg cggaggcgga ggtgcaaggt gtgaagagga 300

aaggtgactc ctgctacaac aaggggagct acgggaaggc catcaagcac tacacccgcg 360

gcgccgaact cgaccccagc gacatctcct tcttgatcaa gcgagccaaa gccctatcgg 420

gcctgggaca ggtcagactc ctttttcttt ccggcctgat tgaacaagac aagggaaagg 480

gtaggggagt tgtttagacg gtgggattag tcgacggact tactagtaac atcttttagt 540

tcccatccct tgtttggttt aagatggaga ttaccccggg atttggggga gatttggcac 600

aaaatgggca tctctggaac gtgaatcgag tggcacattc tgaaacgagt gtgaattgag 660

tagcatataa tgaaatttct tccaaattga tgttcctcgc ggatttaatt ttttttttcg 720

agggaaccct cgcggacttg attaacgccc tgttcgtttc agtaccagga gtgcgtgagg 780

gactgcaacg acgcgctgag gaggggcgag gagctcggct ccggcagctc cggcaacaag 840

ctgatctcgg aggcgctgtt gtggaaggcg tcggcgctgg agcatctcgc cgactgcgcc 900

gcggattacg agcaggtgat cctgctgctg cggcggtcgc tggaaacgtg ccacagcgag 960

gaggcgcaga ttaggctgaa gggggcgttg ttcatgaggg agcagtacga ggaactcaaa 1020

agtatggact ttcatttcct ctgctttatc agtatacgaa gccagttgat tactgtgcac 1080

attgatcgat tttccttgta ttttcaagat atattcctcc ctgacatatg gtcattgaat 1140

gatctactac ctccgaccca taaaaaaaag accagtactg aatgtaatat atcatagtac 1200

tacgaaaatc tctgtctaga tttagattta ttatgctaga atatgtcata tctaattata 1260

tatttgtttt ttttgagacg gagggagtag ataccacttt acccaagttt tactttaaac 1320

catctttagc acatacagta gtattatttc acatcctttg agaactccgc aacaaatgtt 1380

gtggttgtta tagtggaagt gcagaacgca aagtaaattg tatagctcat ggggcttgca 1440

atgccagtgt agttgtacca atatgccctt tctttaagca tgagtatata tgggtgtgtt 1500

tagttcacgt taaaattgga agtttggttg aaatttgaac gatgtgacga gaaagttgga 1560

agtttgtgtg tgtagaaaag ttttaatgtg atggaaaagt tggaagttta aataaatagt 1620

ttagaactaa acaaggccat agtagcaagt tcctgagccc tacctagtac tactaaagtt 1680

ctaaattgga attgcattaa attgtaattt atagtcattc ttcctgtaac atctctaata 1740

attagaagtt gtagcttctt taaagcagag ttcggaatga atttcgttat taaaaaaaag 1800

tcccattaag atgtacaaat gttacaggcc aaaaacttga atgtggtgct tatccaactt 1860

acacgcagca tctttacccc gcaaggtacc tttccagtca tctgttatcc ttataaattt 1920

tgctattatt attggaacta acattttgtc cggtttagac ttgaagagcg cattaacatg 1980

gataaaacca ggctcaacac cttgttgaag gtattctacc catttacttt ctttctttta 2040

acagggatgt attgcttgtg tggttatctc taatgttgta aaaatcagcc aaagtggcca 2100

caaattcggg taataccaat atagctcctc acaacttgga agatacaatc tgtaccttct 2160

tatggaggag gtaccgaaac taattctaca agaggaaata ggattgaaga tttttgactc 2220

tcattggtat ttaagggtta gttaacagat aatggaaaaa acatatatac ctcccgagtc 2280

ccgatatctc tcccaaccaa aaaaaaaaca aaccttatat tgccgactat acaccttccc 2340

aaggttggaa gcagtgggcc aaaacggcct taggctatta cgcattcttt tctctttcat 2400

tttaactcat ttcgcatagc acatatattt ttcctttttg agcacttcta atatggtgga 2460

atattattta tttttatcag caagctaatg gatgcctatt tttagcatgc aacaaaagaa 2520

ctacaaaaaa atgaggacaa attatccgag gagcgctcaa gacggaagga atacgaagac 2580

atggtaaaaa ccattaccga tttgctaaat gtcactgcat tgaacattta tttttgcaaa 2640

agtttagctt gaccagaagc gtaacatcat gtcatcaatc atcctcaatt gtttcttatt 2700

gtgaaaaagt ttgattctat agtgtataac agcattcact gctgctattc caagatatgg 2760

acgagcttgg agcagatcat tcccatatca gaatactttt cgattacatt tttttttcca 2820

aaaattgaaa actgtaggat gcagcgcgcc attgagtaca cctatcaata atcccgatgt 2880

atgtctgaat gatatgaatg tgtttggttt gtgcaggtca tggcaattca agcctcgatt 2940

gaacaactta caatgaatca cgatgcagaa cttaagtcag tccgggagga taaagcgaat 3000

ctagaatgtc aactcttaca atgcacagag aaacttgaac ggctacaatc catcttaaac 3060

cgcgaaccgc cattcacctg tcctatattt ctggtgagca gaaaatgatc attatttttt 3120

ccttttccag ttcatcttat tttttatata caattttctg aaactattga ctattgtaca 3180

aattgttttt ttttccttca ggggattttc acccattctt gtcatccaaa caatcataaa 3240

aaatgatgag ttaatatgag gagatggcac cttcacaaat gtgctggttt aaattcaacc 3300

tatatcactt gaagccaaaa cactatttat agtcatattt attatttttt tcaactggcc 3360

ttgaatttaa gcttaaatgt ttgtgaatca atgttacata atattctttc ttgccaaaat 3420

ttttaataac ttttagatgt catgcaaaac aaaatctttc ctgactacac ttattacctt 3480

gcttggtcaa aatttcagca tgtcatggag gatccttaca ttacagcgga tggacacacc 3540

tacgacggtg aggcgatcag ggcatggctc gacgctgggc atgacacatc tccagttacc 3600

aacttgcctc ttgaacacat ggaactcatt cccaatcgcg cactccgttc tgctattgtg 3660

tggtggcacg aacagcagaa cgcggcacgc gaacaccgcg acatggcgtg aactacaact 3720

cggcgtttca tattgtaaaa ttcttaattg ttgtctgtac ttttgaacaa ttttttgctg 3780

tctgtagtta cttgttagcc atgtttataa cacacaggtt gaaattgtag gctgttagta 3840

tgccttgtac acacaggtcg atataattca tgccagaatg caacataaac acagcattca 3900

gtaaaacagc tcttaatcat atgactgtga aacagtacca aatatttcac aaaagcaggt 3960

gaaacaaata gcaagatttg aacatcagaa agatttccca tttataatca gagcaacaat 4020

tgacagcaac agcaacaagc cattacatca ctactactaa gcaattctgg tactagagct 4080

atcacagatg aagcgactaa taaattaatc aggcgcgctc accgcggatg cggcgggcga 4140

gctggatgtc cttgggcatg atggtgacgc gcttggcgtg gatggcgcac aggttagtgt 4200

cctcgaagag cccgacgagg tacgcctccg cggcctcctg cagcgcggcg acggcggagc 4260

tctggaagcg gaggtcggtc ttgaagtcct gggcgatctc gcggacgagg cgctggaagg 4320

ggagcttgcg gatgagcagc tccgtgctct tctggtactt gcggatctca cggagcgcga 4380

cggtgcccgg cctgaagcgg tgcggcttct tcacgccgcc ggtggccggc gccgacttgc 4440

gcgccgcctt ggtcgccagc tgcttcctcg gcgccttccc gccggtggac ttgcgcgccg 4500

tctgcttcgt gcgggccatc gaggaggaga ggagaggaga gcttgacgcg gcggagcttt 4560

ggatttgaga aatttcgcgg cgaagtcggc ggcggcggag tgggtt 4606

<210> 2

<211> 1032

<212> DNA

<213> 水稻穗长调控基因编码区(LOC_Os06g06490.1--CDS)

<400> 2

atgtctcccg tacgcttcaa cccgtggcgt gcggcggagg cggaggtgca aggtgtgaag 60

aggaaaggtg actcctgcta caacaagggg agctacggga aggccatcaa gcactacacc 120

cgcggcgccg aactcgaccc cagcgacatc tccttcttga tcaagcgagc caaagcccta 180

tcgggcctgg gacagtacca ggagtgcgtg agggactgca acgacgcgct gaggaggggc 240

gaggagctcg gctccggcag ctccggcaac aagctgatct cggaggcgct gttgtggaag 300

gcgtcggcgc tggagcatct cgccgactgc gccgcggatt acgagcaggt gatcctgctg 360

ctgcggcggt cgctggaaac gtgccacagc gaggaggcgc agattaggct gaagggggcg 420

ttgttcatga gggagcagta cgaggaactc aaaagccaaa aacttgaatg tggtgcttat 480

ccaacttaca cgcagcatct ttaccccgca agacttgaag agcgcattaa catggataaa 540

accaggctca acaccttgtt gaagcatgca acaaaagaac tacaaaaaaa tgaggacaaa 600

ttatccgagg agcgctcaag acggaaggaa tacgaagaca tggtcatggc aattcaagcc 660

tcgattgaac aacttacaat gaatcacgat gcagaactta agtcagtccg ggaggataaa 720

gcgaatctag aatgtcaact cttacaatgc acagagaaac ttgaacggct acaatccatc 780

ttaaaccgcg aaccgccatt cacctgtcct atatttctgc atgtcatgga ggatccttac 840

attacagcgg atggacacac ctacgacggt gaggcgatca gggcatggct cgacgctggg 900

catgacacat ctccagttac caacttgcct cttgaacaca tggaactcat tcccaatcgc 960

gcactccgtt ctgctattgt gtggtggcac gaacagcaga acgcggcacg cgaacaccgc 1020

gacatggcgt ga 1032

<210> 3

<211> 343

<212> PRT

<213> 水稻穗长调控蛋白(LOC_Os06g06490.1--AA)

<400> 3

Met Ser Pro Val Arg Phe Asn Pro Trp Arg Ala Ala Glu Ala Glu Val

1 5 10 15

Gln Gly Val Lys Arg Lys Gly Asp Ser Cys Tyr Asn Lys Gly Ser Tyr

20 25 30

Gly Lys Ala Ile Lys His Tyr Thr Arg Gly Ala Glu Leu Asp Pro Ser

35 40 45

Asp Ile Ser Phe Leu Ile Lys Arg Ala Lys Ala Leu Ser Gly Leu Gly

50 55 60

Gln Tyr Gln Glu Cys Val Arg Asp Cys Asn Asp Ala Leu Arg Arg Gly

65 70 75 80

Glu Glu Leu Gly Ser Gly Ser Ser Gly Asn Lys Leu Ile Ser Glu Ala

85 90 95

Leu Leu Trp Lys Ala Ser Ala Leu Glu His Leu Ala Asp Cys Ala Ala

100 105 110

Asp Tyr Glu Gln Val Ile Leu Leu Leu Arg Arg Ser Leu Glu Thr Cys

115 120 125

His Ser Glu Glu Ala Gln Ile Arg Leu Lys Gly Ala Leu Phe Met Arg

130 135 140

Glu Gln Tyr Glu Glu Leu Lys Ser Gln Lys Leu Glu Cys Gly Ala Tyr

145 150 155 160

Pro Thr Tyr Thr Gln His Leu Tyr Pro Ala Arg Leu Glu Glu Arg Ile

165 170 175

Asn Met Asp Lys Thr Arg Leu Asn Thr Leu Leu Lys His Ala Thr Lys

180 185 190

Glu Leu Gln Lys Asn Glu Asp Lys Leu Ser Glu Glu Arg Ser Arg Arg

195 200 205

Lys Glu Tyr Glu Asp Met Val Met Ala Ile Gln Ala Ser Ile Glu Gln

210 215 220

Leu Thr Met Asn His Asp Ala Glu Leu Lys Ser Val Arg Glu Asp Lys

225 230 235 240

Ala Asn Leu Glu Cys Gln Leu Leu Gln Cys Thr Glu Lys Leu Glu Arg

245 250 255

Leu Gln Ser Ile Leu Asn Arg Glu Pro Pro Phe Thr Cys Pro Ile Phe

260 265 270

Leu His Val Met Glu Asp Pro Tyr Ile Thr Ala Asp Gly His Thr Tyr

275 280 285

Asp Gly Glu Ala Ile Arg Ala Trp Leu Asp Ala Gly His Asp Thr Ser

290 295 300

Pro Val Thr Asn Leu Pro Leu Glu His Met Glu Leu Ile Pro Asn Arg

305 310 315 320

Ala Leu Arg Ser Ala Ile Val Trp Trp His Glu Gln Gln Asn Ala Ala

325 330 335

Arg Glu His Arg Asp Met Ala

340

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcggattacg agcaggtgat 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtttttggct tttgagttcc 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

accatttgtc agtgaactac cc 22

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atcagagcac ctaacacata gc 22

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccatgagacc gtgactacga 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tcaagaaacc aaatccgacc 20

Claims (1)

1.通过提高调控基因LOC_Os06g06490或其编码的调控蛋白的表达在增加水稻穗长和提高水稻产量中的应用，其特征在于，所述调控基因LOC_Os06g06490的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

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