CN101802600B - 基质浓度的测定方法及测定装置以及基质浓度测定用试剂 - Google Patents

基质浓度的测定方法及测定装置以及基质浓度测定用试剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及以基质生成的过氧化氢的量为基础的测定基质浓度的方法、试剂和装置。本发明添加了用于抑制过氧化氢与阻碍物质反应的抑制剂。抑制剂可使用叠氮化钠之类的叠氮化合物及亚硝酸钠之类的亚硝酸化合物。本发明还可进一步添加氯化钠、氯化钾之类的支持电解质。

Description

基质浓度的测定方法及测定装置以及基质浓度测定用试剂
技术领域
本发明涉及测定葡萄糖等基质的方法、装置及试剂。
背景技术
被称为酶电极法的方法为测定葡萄糖浓度的一种方法。这种方法是将与试样中葡萄糖浓度相关的信息输出至与试样相接触的电极，并基于该输出计算出葡萄糖浓度的方法。它的一个例子是从用酶氧化葡萄糖而生成的过氧化氢获取电极的电子，基于此时电极中所测定的电流值计算葡萄糖浓度的方法(例如参见专利文献1)。
在测定葡萄糖浓度时，可用血液作为试样，但出现血细胞溶血时，无论使用全血情况和使用血清或血浆的情况的任一种，试样中均会含有血红蛋白。
然而，血红蛋白容易与过氧化氢反应，一旦试样中含有血红蛋白，将阻碍过氧化氢与电极的反应。因此，在存在血红蛋白的情况下，血红蛋白将与过氧化氢发生反应，导致电极输出的值有降低的趋势，将难以获得高的测定精确度。
此外，不可能通过防止血细胞溶血来避免试样中含有血红蛋白，这时，在血液的输送·保存及前处理阶段就必须细心注意，不仅增强操作的烦杂性，而且由于检测材料的不同在溶血的容易性方面也存在离差，非常不现实。
专利文献1：日本特公平7-37991号公报
发明内容
发明解决的问题
本发明要解决的技术问题是无需复杂操作即可抑制测定血液等试样中葡萄糖等基质浓度时存在的阻碍物质的影响，提高测定精确度。
解决问题的技术手段
在本发明的第一个方面中，提供了一种基质浓度的测定方法，其是基于由基质生成的过氧化氢的量来测定基质浓度的方法，其中，使为了抑制过氧化氢与阻碍物质的反应的抑制剂共存。
在本发明的第二个方面中，提供了一种浓度测定装置，其是配备有用来测定由基质生成的过氧化氢浓度的过氧化氢电极的浓度测定装置，其以供给用于抑制过氧化氢与阻碍物质反应的抑制剂的方式构成。
在本发明的第三个方面中，提供了一种基质浓度测定用试剂，其是基于由基质所生成的过氧化氢的量来测定基质浓度的试剂，其中，含有用于抑制过氧化氢与阻碍物质发生反应的抑制剂。
抑制剂可使用例如作为阻碍物质的将血红蛋白高铁化的物质。将血红蛋白高铁化的物质例如可使用选自例如叠氮化合物、亚硝酸盐、铁氰化盐、过氧化盐及高锰酸盐中的一种。
叠氮化合物例如可使用叠氮化钠、4-十二烷基苯磺酰叠氮、4-乙酰氨基苯磺酰叠氮、二苯基磷酸叠氮化物、叠氮化铁、叠氮化氢、叠氮化铅、叠氮化汞、叠氮化铜或者叠氮化银。叠氮化合物在测定系统中的浓度优选为0.001～1.000wt％，更优选0.010～0.100wt％。
亚硝酸盐例如可使用亚硝酸钠及亚硝酸钾。铁氰化盐例如可使用铁氰化钾，过氧化盐例如可使用过氧化钡，高锰酸盐例如可使用高锰酸钾。在使用作为抑制剂而例举的盐时，抑制剂在测定系统中的浓度优选为例如0.001～1.000wt％，更优选0.010～0.100wt％。
在本发明中，优选还加入(共存)支持电解质。支持电解质例如可使用氯化钠或氯化钾。优选地，支持电解质用氯化钠。支持电解质的浓度优选是0.010～2.000wt％，更优选0.050～0.500wt％。
基质可举出例如葡萄糖或乳酸酯。此外，基质可以是例如血液、尿或者唾液等生化学试样中含有的物质。
在本发明的方法及装置中，用例如酶电极法测定过氧化氢的量。
附图说明
[图1]本发明的浓度测定装置的概略结构的示意截面图。
[图2]图1所示浓度测定装置中酶电极的概略结构的示意截面图。
[图3]是为了说明本发明的浓度测定装置的其他例子的配管图。
[图4]是示出实施例1中没有添加叠氮化钠的全血的应答电流的测定结果的图。
[图5]是示出实施例1中添加了叠氮化钠的全血的应答电流的测定结果的图。
[图6]图6A是示出实施例2中没有添加抑制剂的应答电流的测定结果的图；图6B是示出实施例2中添加了叠氮化钠作为抑制剂的全血的应答电流的测定结果的图；图6C是示出实施例2中添加了亚硝酸钠作为抑制剂的全血的应答电流的测定结果的图。
[图7]是示出实施例3中没有添加氯化钠的生理盐水的应答电流的测定结果的图。
[图8]是示出实施例3中添加了氯化钠的生理盐水的应答电流的测定结果的图。
符号说明
1浓度测定装置
36过氧化氢电极
具体实施方式
以下将参照附图说明本发明。
图1示出的浓度测定装置1是以在测定机构3中测定在试料制备机构2中被制备了的试样的方式构成的装置。
试样制备机构2是为了制备从检测材料得到的试样的机构，配备有喷嘴20、试剂瓶21及稀释混合槽22。
喷嘴20是用于对稀释混合槽22提供检测材料的装置。检测材料可使用例如血液、尿或唾液等的生化学试样及其稀释液。当用血液作为试样时，也可使用全血和血浆或血清中的任一种。
试剂瓶21用于盛放为了稀释检测材料或洗净稀释混合槽22的试剂。该试剂瓶21通过配管23连接至稀释混合槽22。在配管23的中途设计了泵24，通过泵24的动力将试剂瓶21的试剂提供给稀释混合槽22。
试剂使用含有稀释液和抑制剂的试剂。
稀释液可用例如缓冲液。缓冲液只要是能将基质反应的pH调整至目的范围即可，例如可使用磷酸盐类。缓冲剂在试剂中的浓度例如是0.0001～0.1000M。
抑制剂是能抑制作为基质的过氧化氢与阻碍物质发生反应的物质。当阻碍物质是血红蛋白时，抑制剂可使用将血红蛋白高铁化的化合物，例如选自叠氮化合物、亚硝酸盐、铁氰化盐、过氧化盐及高锰酸盐中的至少一种。
叠氮化合物可使用例如叠氮化钠(NaN3)、叠氮化钠、4-十二烷基苯磺酰叠氮、4-乙酰氨基苯磺酰叠氮、二苯基磷酸叠氮化物、叠氮化铁、叠氮化氢、叠氮化铅、叠氮化汞、叠氮化铜、或者叠氮化银。叠氮化合物在试剂中的浓度是例如0.001～1.000wt％，优选0.010～0.100wt％。
亚硝酸盐可使用例如亚硝酸钠及亚硝酸钾。铁氰化盐可使用例如铁氰化钾，过氧化盐可使用例如过氧化钡，高锰酸盐可使用例如高锰酸钾。当使用作为抑制剂而例举的盐时，抑制剂在测定系统中的浓度优选是例如0.001～1.000wt％，更优选0.010～0.100wt％。
试剂优选还含有支持电解质。支持电解质可使用例如氯化钠或者氯化钾。支持电解质在试剂中的浓度是例如0.010～2.00wt％，优选0.050～0.500wt％。
稀释混合槽22用于提供稀释检测材料后调整试样的场所。稀释反应槽22中以由喷嘴20供给检测材料、由试剂瓶21供给试剂的方式形成。该稀释混合槽22容纳了搅拌子25，通过利用棒26使搅拌子25旋转，从而混合检测材料和试剂。此外，稀释混合槽22还经配管27连接至测定机构3的酶电极30。配管27中途设计有泵28，通过泵28的动力将稀释混合槽22中调制的试样供给测定机构3的酶电极30。
测定机构3具有酶电极30、电源31及电流值测定部32。
酶电极30根据试样中与基质的电子授受量输出电的物理量。如图2所示，酶电极30具有例如基质选择透过膜33、酶固定化膜34、过氧化氢选择透过膜35及过氧化氢电极36。
基质选择透过膜33用于对酶固定化膜34选择性供给试样中的基质。基质选择透过膜33可根据基质的种类选定，可使用公知的各种材料。
酶固定化膜34用于氧化基质生成过氧化氢，其由包含氧化酶的物质构成。本发明使用的氧化酶可根据基质种类选择定。其中，浓度测定装置1中作为测定对象的基质可举出葡萄糖或者乳酸酯，氧化酶可举出葡萄糖氧化酶或者乳酸氧化酶。
过氧化氢选择透过膜35使用于对过氧化氢电极36选择性供给过氧化氢的膜。过氧化氢选择透过膜35可使用例如乙酰基纤维素系或者聚烯丙胺系的膜。
过氧化氢电极36输出与供给的过氧化氢量即基质浓度相对应的电信号。这种过氧化氢电极36可使用例如采用了白金作为阳极37、采用了银作为阴极38的电极。
图1示出的电源31使用于对酶电极30(过氧化氢电极36)施加电压的电源。电源31可使用例如直流电源，对酶电极30(过氧化氢电极36)的施加电压例如可设定为0.1～1.0V。
电流值测定部32测定过氧化氢电极36与过氧化氢之间电子的授受量作为电流值。电流值测定部32中电流值的测定是断续进行的，其测定间隔为例如50～200msec。
接着，以测定全血中葡萄糖为例说明浓度测定装置1的操作。
当测定全血中葡萄糖浓度时，向稀释混合槽22中供给全血及试剂。用喷嘴20向稀释混合槽22供给全血，其供给量设定为例如4～20μL。另一方面，用泵24向稀释混合槽22供给试剂，其供给量例如是全血量的100倍。
在浓度测定装置1中，供给全血及试剂时，通过搅拌子25搅拌稀释混合槽22。这时，由于试剂的供给量是全血供给量的100倍，因此，稀释混合槽22中缓冲液的pH、抑制剂及支持电解质的浓度基本上维持试剂的pH及浓度。随后，用泵28将调制好的试样供给给酶电极30。
酶电极30中将透过基质选择透过膜33的葡萄糖提供至酶固定化膜34。在酶固定化膜34上，如下述反应式(1)所示，氧化酶(葡萄糖脱氢酶)的葡萄糖发生氧化生成葡糖酸和过氧化氢。过氧化氢通过过氧化氢透过膜35，提供给过氧化氢电极36。在过氧化氢电极36中，通过电源31的外加电压，进行下述反应式(2)，过氧化氢向阳极37供给电子，分解成氧和氢离子。这时，随着向阳极37供给电子，阳极37和阴极38之间电流流动，电流值测定部32测定此时的电流。另一方面，在阴极38上，通过来自阳极37的电子，进行下述反应式(3)所示的反应，生成水。
Figure GPA00001013932500061
阳极：H2O2→2H++O2+2e-   (2)
阴极：4H++O2+4e+→H2O    (3)
其中，在阳极38上发生过氧化氢(H2O2)的还原反应，一旦稀释混合槽22内存在氧化血红蛋白(Fe(II))，将如下述反应式(4)所示，出现与阳极反应相竞合的由去氧血红蛋白(氧化Hb(Fe(II)))变为高铁化血红蛋白(高铁化Hb(Fe(III)))的氧化反应。
Figure GPA00001013932500062
当发生这种竞合反应时，由于本来应该在阳极37处消耗的过氧化氢被去氧血红蛋白消耗掉，电流值测定部32测定的电流值将较本来应该得到的值小。尤其在含有血细胞的试样中，葡糖酸的生成将降低血细胞膜附近的pH。因此，认为不仅pH降低，氧化血红蛋白将释放出氧变为去氧血红蛋白，随着葡萄糖的氧化反应的进行，去氧血红蛋白的生成量增大。结果是随着葡萄糖氧化反应的进行(葡糖酸的生成)，生成阻碍阳极37上的过氧化氢氧化反应的去氧血红蛋白，测得的氧化电流值将比真值减小。
另一方面，如果试样中同时存在叠氮化合物或亚硝酸盐之类的氧化物作为抑制剂，将如下述反应式(5)所示，由于抑制剂的氧化作用而发生自去氧血红蛋白(Fe(II))生成高铁化血红蛋白(Fe(III))的氧化反应。
Figure GPA00001013932500063
因此，当试样中同时存在抑制剂时，将抑制过氧化氢与去氧血红蛋白的反应。结果是，在浓度测定装置1中可抑制电流值测定部测得的电流值的低值化以及抑制测得的应答电流值的离散性。由此可避免浓度测定结果的低值化并提高再现性，提高测定精确度和测定可信度。
这种效果不局限于阻碍物质是去氧血红蛋白的情况或者基质是葡萄糖的情况，在基质引起生成过氧化氢、以及过氧化氢与阳极发生反应以测定基质浓度的其他系统中也可实现这些效果。
此外，如果试剂中含有氯化钠等支持电解质，可提高反应槽20中的离子强度。因此，可使电流值测定部32得到的氧化电流更为稳定化。结果是由于含有支持电解质还可提高测定的再现性。
本发明不限于上述实施方式，还可进行多种变更。例如，酶电极可固定在稀释混合槽中，进行分批式基质浓度的测定。
此外，如图3示出的浓度测定装置1，还可省去稀释混合槽，在向酶电极30连续供给试剂瓶21的试剂的同时，从注入阀门4中注入检测材料或试样。
实施例1
在本实施例中，研究用过氧化氢电极测定试样中的葡萄糖浓度时，叠氮化钠对应答值的影响。
(试样)
试样使用葡萄糖浓度调整为100mg/dL的全血。
(试剂)
在[61H](爱科来株式会社制)中添加NaCl至0.234wt％获得试样1，以及在试样1中添加NaN3至0.02wt％获得试样2，将上述试剂分别稀释100倍，供给反应槽。
(应答值的测定)
用Adams葡萄糖GA-117(爱科来株式会社制)，在向反应槽中供给试样和试剂时测定用GOD固定化过氧化氢电极得到的氧化电流作为应答值。过氧化氢电极对应的外加电压为650mV，应答电流的测定间隔为50msec。将在向反应槽供给试样及试剂并保持一定时间后替换试样及试剂再保持一定时间的试样及试剂记为1组，连续进行总共3组的应答电流的测定。在各组之间用一定时间洗净反应槽及配管。应答电流值的测定结果由电压值换算获得，试样1的结果由图4示出，试样2的结果由图5示出。
比较图4及图5可知，在未添加NaN3的试样1中，应答值的最大值变小，且无明确峰值，出现最大值离散的结果。这被认为是由于葡萄糖氧化生成的过氧化氢与血红蛋白发生反应，在过氧化氢电极测定的过氧化氢的量变少导致出现低值化。
另一方面，在添加了NaN3的试样2中，与试样1相比，最大值更大，应答值的时间过程也较稳定。即，我们认为，试样2由于添加了NaN3，血红蛋白与NaN3反应，抑制了在过氧化氢电极测得的过氧化氢的量的减少。
因此，由于通过向反应系统中添加NaN3，可提高应答值且最大值稳定，从而起到改善测定精确度和再现性的作用。
实施例2
在本实施例中，研究当用过氧化氢电极测定试样中葡萄糖浓度时，叠氮化钠与亚硝酸钠对应答值的影响。
(试样)
试样使用葡萄糖浓度调整为100mg/dL的全血。
(试剂)
在[61H](爱科来株式会社制)中添加NaCl至0.234wt％获得试样3，以及在试样3中添加NaN3至0.02wt％获得试样4，以及在试样3中添加亚硝酸钠至0.02wt％获得试样5，将上述试剂分别稀释100倍，供给反应槽。
(应答值的测定)
用Adams葡萄糖GA-117(爱科来株式会社制)，在向反应槽中供给试样和试剂时，测定用GOD固定化过氧化氢电极得到的氧化电流作为应答值。过氧化氢电极对应的外加电压为650mV，应答电流的测定间隔为50msec。在保持向反应槽供给试样及试剂并搅拌一定时间后停止搅拌，进行一连串的动作以进行应答电流的连续测定。应答电流值的测定结果由电压值换算获得，图6A示出的是试样3的结果，图6B示出的是试样4的结果，图6C示出的是试样5的结果。
从图6A可知，未添加NaN3及亚硝酸钠的试样3在搅拌停止后不久灵敏度降低。我们认为这是由于进行了从去氧血红蛋白(氧代Hb(Fe(II)))至高铁化血红蛋白(高铁化Hb(Fe(III)))的氧化反应，从而阻碍了过氧化氢的阳极反应。
另一方面，从图6B可知，添加了NaN3的试样4在此次测定范围内搅拌停止后灵敏度提高；从图6A可知，添加了亚硝酸钠的试样5在此次测定范围内搅拌停止后灵敏度有逐渐接近一个定值的倾向。即，添加了NaN3和亚硝酸钠时灵敏度不会降低，我们认为是由于NaN3和亚硝酸钠的存在，抑制了自去氧血红蛋白(氧代Hb(Fe(II)))至高铁化血红蛋白(高铁化Hb(Fe(III)))的氧化反应。
实施例3
本实施例研究试剂中NaCl对应答值的影响。
以[61H](爱科来株式会社制)作为试样6，在试样6中添加NaCl至0.234wt％获得试样7。
用含0.9wt％NaCl的生理盐水将试剂6或试剂7稀释100倍，用作试样。
与实施例1相同进行应答值的测定。应答值的测定结果，作为换算成电压值的值，对于试样6的结果示出在图7，对于试样4的结果示出在图8示。
从图7和图8可知，在未添加NaCl的试样6中，应答值相对不稳定，在添加了NaCl的试样7中应答值稳定。即可以认为NaCl具有稳定应答电流值的基数的作用。
因此，认为在试剂中添加NaCl可稳定应答值，改善测定精确度和再现性。

Claims (16)

1.一种基质浓度的测定方法，从用酶氧化葡萄糖而生成的过氧化氢获取与试样接触的电极的电子，基于此时电极中所测定的电流值计算葡萄糖浓度，
其中，使用于抑制过氧化氢和血红蛋白反应的抑制剂共存，所述抑制剂是叠氮化合物，或者选自亚硝酸盐、铁氰化盐、过氧化钡及高锰酸盐的至少一种。
2.根据权利要求1所述的基质浓度的测定方法，所述叠氮化合物是叠氮化钠。
3.根据权利要求2所述的基质浓度的测定方法，所述叠氮化合物的浓度是0.001～1.000wt%。
4.根据权利要求1所述的基质浓度的测定方法，所述抑制剂选自亚硝酸钠、铁氰化钾、过氧化钡及高锰酸钾的至少一种。
5.根据权利要求1所述的基质浓度的测定方法，其中，还使支持电解质共存。
6.根据权利要求5所述的基质浓度的测定方法，其中，所述支持电解质是氯化钠或氯化钾。
7.根据权利要求5所述的基质浓度的测定方法，所述支持电解质的浓度是0.01～2.00wt%。
8.一种基质浓度的测定装置，其是配备过氧化氢电极的浓度测定装置，
其以从用酶氧化葡萄糖而生成的过氧化氢获取与试样接触的所述过氧化氢电极的电子，基于此时电极中所测定的电流值计算葡萄糖浓度，且供给用于抑制过氧化氢与血红蛋白反应的抑制剂的方式形成，
所述抑制剂是叠氮化合物，或者选自亚硝酸盐、铁氰化盐、过氧化钡及高锰酸盐的至少一种。
9.根据权利要求8所述的基质浓度的测定装置，其中，所述叠氮化合物是叠氮化钠。
10.根据权利要求8所述的基质浓度的测定装置，其中，所述抑制剂选自亚硝酸钠、铁氰化钾、过氧化钡及高锰酸钾中的至少一种。
11.根据权利要求8所述的基质浓度的测定装置，其以还供给支持电解质的方式形成。
12.一种基质浓度测定用试剂，其是通过从用酶氧化葡萄糖而生成的过氧化氢获取与试样接触的电极的电子，基于此时电极中所测定的电流值计算葡萄糖浓度来测定葡萄糖浓度的试剂，其中，
含有用于抑制过氧化氢与血红蛋白反应的抑制剂，
所述抑制剂是叠氮化合物，或者选自亚硝酸盐、铁氰化盐、过氧化钡及高锰酸盐的至少一种。
13.根据权利要求12所述的基质浓度测定用试剂，所述叠氮化合物是叠氮化钠。
14.根据权利要求12所述的基质浓度测定用试剂，所述抑制剂选自亚硝酸钠、铁氰化钾、过氧化钡及高锰酸钾中的至少一种。
15.根据权利要求12所述的基质浓度测定用试剂，其中，还含有支持电解质。
16.根据权利要求15所述的基质浓度测定用试剂，其中，所述支持电解质为氯化钠或氯化钾。
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