JPS6041600B2 - 酵素活性測定方法及びその装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の技術分野〕 本発明は電気化学的測定手法を用いた酵素活性測定方法
及びその装置に関する。

〔発明の技術的背景とその問題点〕

従来、酵素活性の測定は、ある酵素を含む試料液とその
酵素の基質を含む溶液と更に他の酵素、補酵素、発色試
薬等を添加して成る反応系において、酵素作用により酵
素基質に化学反応を行なわせ、そのときの反応系の吸光
度を測定するという方法で行なわれている。

例えば、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（
ＧＰＴ）の酵素活性の場合、ＧＰＴをその基質と接触さ
せて該ＧＰＴの酵素作用によりピルビン酸を生成し、そ
のピルビン酸をラクテートデヒドロナーゼ（ＬＤＨ）の
酵素作用で還元する。

このとき、この反応系に所定濃度のニコチン酸アミドア
デニンヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を共存させておくと時
間の経過とともに該ＮＡＤＨが減少してその濃度が低下
する。その濃度変化は波長３４０ｒ１ｍ１こおけるＮＡ
ＤＨの吸光度測定から知ることができる。したがつて、
間接的にＧＰＴの酵素活性が測定できることになる。し
かしながら、この吸光度測定法にあつては、Ｎ．ＡＤＨ
，．ＬＤＨ又は各種の発色試薬などの高価な試薬を用い
かつそれらは測定後廃棄せざるを得ないため測定は極め
てコスト高となる。

また、懸濁物を含む反応系に対しては吸光度測定が不可
能となるため、それら試料にあつては測定に先立つて懸
濁物の除去など前処理を必要とする。このような吸光度
測定の欠点を解決するために、電気化学的測定法を適用
した装置が提案されている（特開昭５６−９７８６４号
参照）。

これは、試料中の酵素が関与して生成若しくは消滅する
物質（検知物質）に作用するある酵素を固定した膜を添
着して成る酵素電極を２本相互に離して配設したフロー
システムであつて、試料中に当初から含まれていた検知
物質の与える電気信号をベース値とし、更に試料中の酵
素の作用により該酵素の活性に対応して生成若しくは消
滅した物質（検知物質）の与える電気信号を測定し、両
者の差から試料中の酵素の活性を測定するものである。
しかしながらこの装置にあつては、２本の酵素電極を用
いるため両者の出力調整をすることが容．易ではなくそ
の操作が極めて煩雑かつ多大な労力を要するものとなる
。

すなわち、感度、応答速度、ゲイン等の電極特性が全く
同じでかつその特性の経時変化も同一である酵素電極を
製造することは極めて困難であ・る。

そのため、測定時にあつては各電極の出力の調整が必要
となるが、その場合でも得られた検量線の直線性、直線
領域にそれぞれの電極ては相違があり、そのため測定に
誤差が生じる結果を招く。また、フローシステムの液流
路にあつて２本の電極を相互に離して配設した場合、液
流路内で試料の拡散に基つく希釈現象が発生し下流の電
極位置では検知物質の濃度が低下して、２本の電極間の
出力差調整、差動増幅時にあつてはその調整が極めて困
難となる。

とくに、低活性の酵素を含む微量の試料の測定にあつて
は著るしく困難である。ノ また、液流路内に酵素基質
含有緩衝液を一定の流速で流し、ここに試料液を注入し
、両者が流路内を流れる間に酵素と基質とを接触させて
、酵素作用により減少若しくは増加した検知物質の与え
る電気信号を下流に配設した電極で検出して酵素・活性
を測定するという方法も提案されている（特公昭５６−
９２４４＼９２４４６号参照）。

しかしながら、この方法にあつては、試料注入口と電極
間の液流路は酵素と基質の反応の場であるため、長い反
応時間の低活性酵素の稿合は液流・路が長くなる。また
、流路が長くなればなるほどそれは注入した試料の流路
内での希釈が進み、その結果、試料注入量を増すか、よ
り流路を長くして反応時間を長くしなければならないと
いう不都合が生ずる。一方、１本の電極を用いても酵素
活性を測定することがてきる（特開昭５６−９２４４５
号参照）。

すなわち、一定流速で溶液流路内をフローセルに向つて
流れる基質溶液に、所定量の酵素試料溶液を注入し、該
流路内で両者の反応を進行せしめそのとき酵素の作用に
より生成若しくは消滅する検知物質の濃度変化を１本の
電極て電気信号として知る方法である。しかしながら、
この場合、試料溶液中に測定対象とする酵素以外の電極
感応物質か予め含有されていると、電極は該物質にも感
応してその濃度を電気信号とするので、結局は該物質の
濃度に相当する誤差が生じ対象とする酵素の活性測定が
不正確になる。

〔発明の目的〕

本発明は、電気化学的手法を用いた従来の酵素活性測定
方法、装置における上記のような問題点を解消した新規
な酵素活性測定方法及びそのための装置の提供を目的と
する。

〔発明の概要〕

本発明方法は、１本の電極で検知物質の濃度変化を測定
すること；酵素含有試料液と基質含有液とを混合し、常
時その一部を循環させておき、測定時には該循環混合液
の一部を緩衝液とともに所定の時間間隔でフローセルに
送液すること；このときフローセルの電極から得られる
電気信号の差から酵素活性を測定するものである。

すなわち、本発明方法は、酵素と基質を接触させ、電極
が感応する検知物質を生成若しくは消滅させ、そのとき
の該検知物質の濃度を該電極からの電気信号として測定
する酵素活性測定方法において、酵素含有試料液と基質
含有液を混合し；得られた混合液の一部を循環経路内に
常時循環させ；測定時には、循環する混合液の一部を所
定の時間間隔をおいて緩衝液と混合して１本の電極を備
えるフローセルに送液し、該電極の発信する電気信号を
測定し各電気信号の差から酵素活性を測定することを特
徴とし、したがつて本発明装置は、酵素含有試料液と基
質含有液を混合する混合系と；該混合系の混合液の一部
を該混合系から導出させ再び帰還せしめる経路から成る
混合液循環系と；緩衝液供給系と；１本の電極を備えた
フローセル及び該電極からの電気信号の測定・表示機構
を有する測定系とから構成される酵素活性測定装置であ
つて、該混合液循環系と該緩衝液供給系とを、流路切換
機構を介在させて接続したことを特徴とするものである
。本発明を第１図及び第４図に示した装置例のブロック
図により詳細に説明する。

第１図、第４図は、流路切換機構がそれぞれ二方向スラ
イドバルブ、三方向スライドバルブの場合を示すもので
ある。

まず、第１図に則して説明する。

１は混合容器で、ここに試料液槽２、基質液槽３からそ
れぞれ測定対象の酵素を含有する試料液と該酵素に対応
する基質を含有する基質含有液が、定量ポンプ４，４″
によつて配管５，５″から所定量送液される。

容器１内では、例えばマグネチツクスターラーによつて
２つの液が混合されて混合系を構成する。混合容器１か
らは、図中矢印Ｐで示した経路６によつて混合液の循環
系が構成される。

容器１内の混合液は定量ポンプ４″によつて経路６内を
矢印Ｐ方向に常時循環する。７は所定の緩衝液を貯留す
る緩衝液槽で、配管５″，５″″″を介してフローセル
８に接続して定量ポンプ４″″″の作動により緩衝液槽
７からフローセル８へ緩衝液を送液する緩衝液供給系を
構成する。

フローセル８には１本の電極９が装着され、該電極９に
はその電気信号を測定して表示する機構１０が接続され
て全体として電気信号の測定系を構成する。

ここで、電極としては、測定対象の酵素の作用によつて
生成若しくは消滅する検知物質の濃度を電気信号に変換
し得る電極であれば何であつてもよく、例えば、ＰＨ電
極、アンモニウムイオン電極、アンモニアガス電極、炭
酸ガス電極、酸素電極、過酸化水素電極、グルコース、
ピルビン酸等の有機物に感応するいわゆる酵素電極など
をあげることができる。さて、本発明装置にあつては、
混合液循環系と緩衝液供給系とが、流路切換機構（第１
図では二方向スライドバルブ１１）を介して接続される
。

流路切換機構に二方向スライドバルブ１１を用いた場合
には、該切換機構１１から混合容器１に至る経路の任意
の個所に、第１図の如く三方バルブ１２を配設し、該バ
ルブ１２の残る１つの方向は廃液路１３に接続しておく
ことが好ましい。第１図に示した装置例の操作を、二方
向スライドバルブ１１の操作を説明するための第２図、
第３図を参考にして説明する。まずバルブ１１を第２図
に示すようにセットし、また、三方バルブ１２を廃液路
１３への道が）閉じるようにセットして各系におけるそ
れぞれの定量ポンプ４，４″，４″，４″″″を作動す
る。

まず酸素含有試料液、基質含有液はそれぞれの槽２，３
から配管５，５″を通つて混合容器１に流入し、ここで
混合される。混合液中では継続し７て酵素と基質の反応
が進行し検知物質の濃度が経時的に変化していく。この
過程で、容器１内の混合液の一部は、経路６を通り、第
２図に示したバルブ１１の内部経路品″Ａ″″″Ａ″（
図では点線で表示）を通過して矢印Ｐ方向に流れ三方バ
ルブ１２フを経由して再び混合容器１に帰還し経路６内
を循環する。一方、緩衝液槽７の緩衝液は、配管５″を
通りバルブ１１の内部経路Ｂ″Ｂ″″″Ｂ″Ｂ（図では
点線で表示）を通過して配管５″″″を矢印Ｑ方向に流
れてフローセル８に送液されていく。

この過程で電極９は該緩衝液により洗浄されることにな
る。ついで、酵素活性測定時は、バルブ１１を第２図の
矢印Ｒ方向に１１２回転して第３図に示す状態にし、同
時にバルブ１２を切換えて循環系を閉じ、バルブ１１を
通つた液が廃液路１３に流れるようにする。バルブ１１
の内部経路Ｂ″Ｂ″″″Ｂ″Ｂに含有されていた緩衝液
がバルブ１１の切換えによつて油″″″Ｂ″Ａ″になり
流路６内を通り、三方バルブ１２で廃液路１３から排出
された後は、再び三方バルブ１２をもとにもどし、廃液
路１３を閉じて混合容器１内の混合液が循環するように
する。このときバルブ１１の内部経路品″Ａ″″″Ａ″
内に存在し、その容積に相当する量の混合液はバルブ１
１の切換でそのまま配管５″″″から緩衝液に運ばれて
フローセル８に送られ、電極９により検知物質の濃度が
測定される。本発明方法にあつては、このようなバルブ
１１、三方バルブ１２の切換え操作を所定の時間間隔で
行なつてその時々の電気信号を得、該電気信号の差から
酵素活性を求めるものである。

このようにすれば、試料液中に存在していた電極感応物
質に基づく電気信号は消去され、電気信号の差はそのま
ま試料液中の酵素の作用により生成若しくは消滅した検
知信号の濃度変化を表示することとなるので電極感応物
質の影響は除去される。

第４図は三方向スライドバルブを流路切換機構として用
いた場合である。

この場合、他の要素は第１図と同様だが、第１図で示し
た三方バルブ１２、廃液路１３は不要となる。図で、５
″″は緩衝液槽７の緩衝液の中に挿入された配管であつ
て、その一端はバルブ１１の１つの内部経路（第５図の
ＥＥ″Ｅ″″″Ｅ″）と接続し、更に配管５″″″を経
て空気ポンプ１４に連らなつている。さて、まずバルブ
１１を第５図の状態にセットする。このとき、混合液は
経路６からバルブの内部経路ＣＣ″Ｃ″″″Ｃ″を通り
再び混合容器１へと循環する。緩衝液は、配管５″から
のバルブの内部経路Ｄ″Ｄ″″″Ｄ″Ｄを通り配管５″
″を経由してフローセル８へ送液される。このとき、空
気ポンプ１４を作動して空気を配管５″からバルブの内
部経路Ｅ″Ｅ″″″Ｅ″Ｅを通し配管５７を経由させ緩
衝液に送入して曝気し緩衝液を攪拌し、よく混合してお
くとともに緩衝液中の溶存空気を一定に保持することが
好ましい。測定時には、バルブ１１を矢印Ｒ方向に１２
０度回転させて第６図の状態にする。

このとき、第５図のバルブ１１の内部経路ＣＣ″Ｃ″″
″Ｃ″内に存在し、その容積に相当する量の混合液は、
そのまま、配管５″からの緩衝液に運ばれ、配管５″″
″を経由してフローセル８に送液され、その検知物質の
濃度が電極９によつて測定されることとなる。

一方、第５図のバルブ１１の内部経路Ｄ″Ｄ″″゛Ｄ″
Ｄは第６図の内部経路ＥＤ″Ｄ″″″Ｅ″となり、第５
図の内部経路Ｄ″Ｄ″″゛Ｄ″Ｄの中に存在していた緩
衝液は空気ポンプ１４からの空気によつて再び緩衝液槽
７にもどされてその内部経路からは除去される。

また、第５図の内部経路ＥＥ″″Ｅ″″″Ｅ″は、第６
図の内部経路ＣＥ″″″Ｅ″Ｃ″となり、そこを混合液
が流れて全体としての混合液循環系が再構成される。

このとき、第５図の内部経路ＥＥ″″Ｅ″″″Ｅ″の中
には緩衝液は存在せず、空気が存在するのみなので、第
６図の如き内部経路ＣＥ゛″Ｅ″Ｃ″となつても、混合
液を希釈することがない。また、内部経路ＥＥ″Ｅ″″
″Ｅ″内に存在していた空気はそのまま経路６を通つて
混合容器１で分離される。第４図の装置例にあつては、
所定の時間間隔をおいてこの矢印Ｒ方向に１２０度ずつ
バルブを回転させれば、一定量の混合液をフローセル８
に送液することができる。

〔発明の実施例〕実施例１ 第１図の装置を用いてグルタミン酸ピルビン酸トランス
アミナーゼ（ＧＰＴ）の酵素活性を測定した。

基質溶液：０．０５Ｍリン酸塩緩衝液（ＰＨ７．５）の
中に、０．０１ｍＭフラビンアデニンヌクレオチド（Ｆ
．ＡＤ）、０．０４５Ｔｎ．Ｍ塩化マンガン、０．１Ｔ
ｒ１．Ｍチアミンピロリン酸、２．１７ＴＬＭα−ケト
グルタル酸及び３０Ｔｒ１．ＭＬ−アラニンを含有せし
めたもの。

これ・を基質液槽３に貯留した。緩衝液：０．０５Ｍリ
ン酸塩緩衝液（ＰＨ７．５）の中に、０．０１ｊ！．Ｍ
ＦＡＤ．．Ｏ．Ｏ４５７Ｔｌ．Ｍ塩化マンガン、０．１
ｍＭチアミンピロリン酸を含有せしめたもの。

これを緩衝液槽７に貯留した。電極：過酸化水素透過性
膜で白金陰極を被覆したポーラログラフ式過酸化水素電
極の感応面を、ピルビン酸オキシダーゼ固定化コラーゲ
ン膜（厚み３５μｍ１酵素活性約４５旧１ｃ１ｔ）で被
覆し、更にその上をセルロースジアセテートの限外ろ過
膜（厚み４８μＴｒｌ．）の粗密層で被覆して構成した
ピルビン酸酵素電極。

これをフローセル８に装着した。試料液：測定対象のＧ
ＰＴを含有する血清試料。

これを試料液槽２に貯留した。まず、バルブ１１を第２
図の状態にセットし、定量ポンプ４″″″を作動してフ
ローセル８に緩衝液を０．５ｍＬＩｍｉｎの流量で流し
ておく。

つぎに、定量ポンプ４，４″を作動して、試料液１００
Ｐｅ１基質溶液９００ｐ′を混合容器１に注入し、マグ
ネチツクスターラーで両者を攪拌・混合する。直ちに、
定量ポンプ４″を作動して混合液を経路内に循環させた
。ついで、バルブ１１及び三方バルブ１２を同時に切換
えて、２分間隔で混合液２１μ′をフローセルに導びき
、各時点における電気信号を測定した。

その結果、１０〜１０００１ＵＩ′の範囲て良好な検量
線を作成することができた。

実施例２ 第３図の装置によりα−アミラーゼの酵素活性を測定し
た。

基質溶液：０．０５Ｍリン酸塩緩衝液（ＰＨ７．Ｏ）の
中に濃度２０ｙ１′の可溶性スターチを含有させたもの
。

緩衝液：０．０５Ｍリン酸塩緩衝液（ＰＨ６．Ｏ）。

電極：白金陰極面を四フッ化エチレン膜（酸素透過性膜
）で被覆した酸素電極の感応面に、グルコースオキシダ
ーゼとα−グルコシダーゼをそれぞれ約３０１Ｕ１ｃＩ
Ｌ１１０１ＵＩｃｄ固定化した厚み２７μｍの酵素固定
化膜を添着し、更にその上をセルロースジアセテートの
非対称構造限外ろ過膜の粗密層側で被覆して構成したグ
ルコース検知電極。試料液：測定対称の酵素としてα−
アミラーゼを含有するもの。まず、バルブ１１を第５図
のようにセットし、定量ポンプ４″″″を作動して緩衝
液を０．６ｍＵｍｉｎの一定流量でフローセル８に流し
ておく。

つぎに、定量ポンプ４，４″を作動して試料液１００Ｐ
ｅ１基質溶液４００μｌを混合容器１に注入し攪拌・混
合した。直ちに、定量ポンプ４″を作動して混合液を経
路６に循環させた。混合直後から１分ごとに５分間、バ
ルブ１１を矢印Ｒ方向に順次切換えて、各回２５μｅの
混合液をフローセル８に送流した。電極９の電気信号か
ら、α−アミラーゼの酵素活性を２５〜１０００１Ｕ１
ｅの範囲で良好に測定することができた。

〔発明の効果〕

以上の説明で明らかなように、本発明方法及び装置は、
１１本の電極を用いるので従来のような電極の煩雑な調
整が不要となる、２酵素と基質は混合系で独立して混合
されるので、流路切換機構とフローセル間の配管（図で
は５″″゛）を可能な限り短くでき、そのため、配管５
″″″内での混合液の拡散・希釈現象を抑制てきる、３
試料液中に予め電極惑応物が存在していてもその影響は
消去される、（例えば、実施例２においてはグリコース
が予め存在する場合）４混合容器への試料液及び基質溶
液の容量を任意に選定して反応を行なわせることができ
る、５しかも、任意の反応時間で混合液をフローセルに
導くことができ、更には任意の時間内に任意の回数導く
ことができる、５したがつて、酵素活性に対応して反応
時間を選定することにより、低活性から高活性までの酵
素の活性測定が可能となり、７複数回に亘り電気信号の
差を求めることにより測定の精度を高めることができる
、などの効果を奏しその工業的価値は大であ″る。

【図面の簡単な説明】

第１図、第４図はいずれも本発明の装置例のブロック図
であり、第２図、第３図は第１図の装置例の流路切換機
構を、第５図、第６図は第４図の装置例の流路切換機構
をそれぞれ説明するための図である。 １・・・・・・混合容器、２・・・・・・試料液槽、３
・・・・・・基質溶液槽、４，４″，４″，４″″″・
・・・・・定量ポンプ、５，５″，５″，５″″″，５
″″″″，５″″″″・・・・配管、６・・・ノ・；・
経路、７・・・・・・緩衝液槽、８・・・・・・フロー
セル、９・・・電極、１０・・・・・・測定・表示機構
、１１・・・・・・流路切換機構、１２・・・・・三方
バルブ、１３・・・・・・廃液路、１４・・・・・・空
気ポンプ。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 酵素と基質を接触させ、電極が感応する検知物質を
   生成若しくは消滅させ、そのときの該検知物質の濃度を
   該電極からの電気信号として測定する酵素活性測定方法
   において、酵素含有試料液と基質含有液を混合し； 得られた混合液の一部を循環経路内に常時循環させ；測
   定時には、循環する該混合液の一部を所定の時間間隔を
   おいて緩衝液と混合して１本の電極を備えるフローセル
   に送液し；該電極の発信する電気信号を測定し； 各電気信号の差から酵素活性を測定することを特徴とす
   る酵素活性測定方法。 ２ 酵素含有試料液と基質含有液を混合する混系と；該
   混合系の混合液の一部を該混合系から導出させ再び帰還
   させる経路から成る混合液循環系と；緩衝液供給系と；
   １本の電極を備えたフローセル及び該電極からの電気信
   号の測定・表示機構を有する測定系とから構成される酵
   素活性測定装置であつて、該混合液循環系と該緩衝液供
   給系とを、流路切換機構を介在させて接続したことを特
   徴とする酵素活性測定装置。 ３ 該流路切換機構が、二方向スライドバルブである特
   許請求の範囲第２項記載の酵素活性測定装置。 ４ 該流路切換機構と該混合系とを結ぶ該混合液循環系
   の経路の任意の個所に、一方が廃液路に接続される三方
   バルブを介在させた特許請求の範囲第３項記載の酵素活
   性測定装置。 ５ 該流路切換機構が、三方向スライドバルブである特
   許請求の範囲第２項記載の酵素活性測定装置。 ６ 該三方向スライドバルブの二方向が、それぞれ該混
   合液循環系、該緩衝液供給系に接続し、残る一方が、該
   緩衝液供給系に挿入された空気管に接続する特許請求の
   範囲第４項記載の酵素活性測定装置。