JPS5998680A

JPS5998680A - グルタミン酸オキサル酢酸トランスアミナ−ゼ活性測定装置

Info

Publication number: JPS5998680A
Application number: JP57209656A
Authority: JP
Inventors: Masako Notsuke; 野附　正子; Masao Koyama; 小山　昌夫
Original assignee: Toshiba Corp
Current assignee: Toshiba Corp
Priority date: 1982-11-30
Filing date: 1982-11-30
Publication date: 1984-06-07

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔発明の技術分野〕本発明は電気化学的測定手法を用いたグルタミン酸オキ
サル酢酸トランスアミナーゼの活性測定装置に関するも
のである。

〔発明の技術的背景とその問題点〕

従来、酵素活性の測定は、ある酵素を含む試料液と、そ
の酵素の基質を含む溶液と、更に他の酵素、補酵素およ
び発色試薬等全添加してなる反応系において、ｔ’＋’
ｌ素作用に工作用素基質に化学反応を行なわせ、そのと
きの反応系の吸光Ｉｆ’を測定する方法で行なわれてい
た。

例えばグルタミン酸オキサル酢酸トランスアミナーゼ（
ＧＯＴ）の酵素測定は、ＧＯＴと基質を接触させ、該Ｇ
ＯＴ　１７）酵素作用によってオキザル酢酸ケ生成させ
、更にこれにニコチン酸アミドアデニンヌクレオチド（
ＮＡＤＨ）とリンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＨ）を作用させ
ることによシ、時間の経過とともに該ＮＡＤＨの濃度減
少変化が起きることから、とれを波長３４０　ｎｍの吸
光度測定から知ることによりＣＯＴ活性測定ができる。

しかしながら、この吸光度測定法にあっては、ＮＡＤＨ
％ＭＪ）Ｈｌあるいは各種の発色試県など高価な試薬を
必要とし、しかもこれら試り、＋４を測定後、廃禁せざ
るを得ないため測定コストが高い。まだ懸濁物を含む反
応系に対しては吸光度１１１１定が不可能となるため、
それらの試料を測定する場合、予め懸濁物の除去など前
処理全必要とする。

このような吸光度測定の欠点を解決するために電気化学
的測定法を応用した装置が従来、提案されている（特開
昭５６−９７８６４号参照）。

この装置は、試料中の酵素が関与して生成若しくは消滅
する物質（検知物質）に作用する酵素を固定した膜を添
着した酵素゛解極全２本相互に離間して配置したフロー
システムである。この装置では、試料中に当初から含ま
れていた検知物質の与える電気信号をベース値とし、更
に試料中の酵素の作用によって、該酵素の活性に対応し
て生成若しくは消滅した物質（検知物質）の与える電気
信号を測定し、ベース値との差から試料中の酵素の活性
を測定するものである。

しかしながら、この装置では２本の酵素電極を用いて、
ベース値と測定値を測定するため、両者の出力調整が難
しく、また操作が極めて煩雑である。

すなわち、感度、応答速度、ケ゛イン等の電極特性が、
両電極において同じでなく、またその特性の経時変化も
同一でないため、測定時において両電極の出力調整を行
なっても、得られた検量線のｉｆ線性、直線領域に相違
があシ、測定誤差を生じることがあった。またフローシ
ステムの液流路内に２本の電極を相互に離間して配置ｉ
ｆ　Ｌ、であるので、液流路内で試料の拡散に基づく希
釈現象が発生し、下流の電極位置では検知物質の濃度が
低下し、特に低活性の酵素を含む微量試料の場合には、
両電極の出力調部、差ｌ増幅時にあっては、その調整は
極めて困難となる。

また、液流路内に酵素基質含有緩１’４！ｊ液と一定の
流速で流し、ここに試料液を注入し、両者が流路内を流
れる間に酵素と基質とを接触させて、酵素作用により減
少若しくは増加した検知物質の与える電気信号を下流に
配設した電極で検出して酵素の活性全測定する装置も提
案されている（　％公昭５６−９２４４５．９２４４６
号参照）。

しかしながらこの装置では、試料注入口と電極間の液流
路は酵素と基質の反応の場であるため、長い反応時間全
必要とする低活性酵素の場合は液流路が長くなる。また
、流路が長くなれば、注入した試料の流路での希釈が進
み、その結果、試料注入量を増すか、よ多流路を長くし
て反応時間を長くしなければならないという不都合が生
じる。

またこれとは別に１本の電極を用いて酵素活性全測定す
る装置も提案されている（特開昭５６−９２４４５号参
照）。すなわち、一定流法で溶液流路内を７０−セルに
向って流れる基ｙｉ浴溶液所定量の酵素試料溶液を注入
し、該流路内で両者の反応を進行せしめ、そのときの酵
素の作用によシ生成若しくは消滅する検知物質のｔ逢度
変化を１本の電極で電気信号として側淀する装置である
。

しかしながら、この場合、試料溶液中に測定対象とする
酵素以外の電極感応物質が予め含有されていると、電極
は該物質にも感応し、その濃度を電気信号として検出す
るので、予め含有されている電極感応物質４度に相当す
る誤差を生じ、酵素の活性測定が不正確になる欠点があ
った。

〔発明の目的〕

本発明は、従来の欠点を改善し、１本電極を用いた電気
化学的手法によジ、低活性のものでも短時間に且つ正確
に測定することができると共に、装置の小型化を図り、
しかも測定操作が芥易なグルタミン酸オキサル酢酸トラ
ンスアミナーゼ（ＧＯＴ）活性測定装置を提供するもの
であるＯ〔発明の概要〕本発明装置は ■　ＧＯＴ含有試料液とＧＯＴ基質含有液ヲ混合する混
合系と ■　該混合系の混合液全循環させる混合液循環系と ■　前記混合系でＧＯＴによって生成されたオキザル酢
酸を固定化オキサル酢酸脱炭酸酵素（ＯＡＣ）を用いて
ピルビン酸に変換するピルビン酸変換系と ■　該ピルビン酸を固定化ピルビン酸酸化酵素（ｐｏｐ
　）により電極感応物質に変換する電極感応■　該電極
感応物質を１本の一極により電気信号として検出する検
出系と ■　該検出系に緩衝液を供給する緩衝液供給系と ■　該緩衝液供給系に前記混合液循環系内の混合液の一
部を供給する流路切換機イ・清とから構成されたもので
ある。

前記ＧＯＴ基質としてはＬ−アス・ぐラギン酸とα−ケ
トグルタル酸との混合液を用いる。

また本発明において用いる１本電極としては酵素電極、
または酸素電極、若しくは過酸化水素電極を用いること
ができる。

更に固定化ＯＡＣと固定化ＰＯＰの形としては、カムラ
、チューブ、膜など何れの形状で用いても良いが、固定
化ＯＡＣによるピルビン酸変換系は固定化ＰＯＰによる
電極感応物質変換系の前に配置する必要がある。例えば
固定化ＯＡＣを検出系の前に配置し、固定化ＰＯＰ　’
ｉ検出系に配置しても良く、また固定化ＯＡＣ、固定化
ＰＯＰとも検出系の前に、若しくは両者とも検出系に設
けても良い。更に検出系の電極が過酸化水素電極の場合
には固定化ＯＡＣ、固定化ｐｏｐ共、混合液循環系に配
置しても良い。

更に本発明において、緩衝液供給系に、混合液循環系内
の混合液の一部を供給する流路切換機構としては三方向
スライド／Ｊルブを用いることが好ましい。この場合、
三方向スライド・々ルプの二方向が夫々混合液循環系、
緩衝液供給系に接続し、残る一方が該Ｍ衝液供給系に連
通ずる空気供給管に接続されている。

本発明装置を用いてＧＯＴ活性ｆ：　？１ｌｌｌ定する
方法についてその原理全簡単に説明すると ■　Ｌ−アスパラギン酸十α−ケトグルタル酸（ＧＯＴ
）オキザル酢酸＋Ｌ−グルタミン散・・（混合系） ■　オキサル酢酸（ＯＡＣ）ピルビン酸＋ＣＯ２・・・
（ピルビンＩ＋少変換系） ■　ピルビン酸＋ｐｉ　十ｏ２　（ｐｏｐ）　ＣＨｓＯ
Ｐｏ２）ｔ２＋アセテート＋　ＣＯ２−１−ｌＩ２０・
・・（電植感応物質変換系）上記反応により酸素あるい
は過酸化水素の生成若しくは消滅した濃度を、酸素電極
または過酸化水素電極を設けた検出系で、電気信号とし
て検知する。この場合、流路切換機構を適宜の間隔で切
シ換えて、その都度、濃度を測定し、測定値の差から濃
度変化を求めることにより、試料中に予め電極感応物質
を含む場合においても、精度良（ＧＯＴ活性を測定する
ことができる。

次に本発明装置の一例を第１図乃至第３図全参照して説
明する。

第１図は流路切換機構として三方向スライドバルブを用
いた場合の装置のブロック図を示すものである。

図において１はＧＯＴ含有試料液槽、２はＧＯＴ基質液
槽で、これらは定量ポンプ３ｈａＥｂを設けた管路４ａ
、４ｂによｐ混合容器５に接続されている。この混合容
器５内には例えばマグネチツクスターラーが設けられて
いる。更にこの混合容器５と三方向スライド／クルレグ
６とは、ポンプ３Ｃを設けた管路４Ｃによシ混合液循屓
系が形成され、混合液は矢印Ｐ方向に常時訪環するよう
になっている。

７は所定計の緩衝液を貯留する緩１萌液槽で、これは管
路４ｄ、４ｅｆ介して前Ｂｃ三方向スライドパルプ６に
接続している。

８は空気ポンプで、これに接続された空気供給（ａｙは
、前記三方向スライドバルブ６を介して、前記管路４ｄ
に接続している。

１０はフローセルで、管路４ｆを介して前記三方向スラ
イドパルプ６に接続している。このフローセル１０内に
は１本の電極１）が装着され、更にこの電極Ｊ７ｉｄ表
示機構１２に接続されて検７１１糸を形成している。

なおボンデ３ｄは、前記緩向液１゛、ツ７、管路４Ｑ、
三方向スライドパルプ６、管路４ｆ、とにより緩衝液供
給系を構成している。

固定化ＯＡＣと固定化ＰＯＰとは、固定化ＰＯＰの前に
固定化ＯＡＣが位置するように、管路４ｃａ管路４ｆ、
フローセル１ｏまたは電極１ノの任意の位置に配置され
ている。

次に三方向スライドパルプ６の操作を第２１￥ｊおよび
第３図を参照して説明する。

三方向スライドパルプブ６の内部には三方向の経路、即
ち内部経路ＣＩＣ２Ｃ３Ｃ４と、内部経路ＤＩＤ２Ｄ３
Ｄ４卦よび内部経路Ｅ１Ｅ２Ｅ３　Ｅ４とが形成されて
いる。

先ず三方向スライドバルブ６全第２図の状態にセットす
る。このとき混合液は管路４ｃ全通ってバルブ６の内部
経路ＣＩ　Ｃ２Ｃａ　Ｃ４ｋ通って、Ｐ方向に流れて、
混合容＋５５に戻る混合液循環系を形成している。緩衝
液は管路４ｅがらバルブ６の内部経路ＤＩ　Ｄ２　Ｄ３
　ＤＡ　ｋ通り、管路４ｆを経て７０−セルｌｏ内に送
液される。

このとき空気供給管９はパルゾロの内部経路ＥＩ　Ｅ２
　Ｅ３　Ｅ４　ｔ”経て、管路４ｄを通シ緩衝液槽７に
連通しておシ、常時空気ポンプ８を作動させて、緩衝液
全攪拌ニー、溶存空気を一定にしておく。

測定時にはバルブ６ｔ−矢印Ｒ方向に１２０度回転させ
て第３図の状態にする。このとき第２図のバルブ６の内
部経路ｃ、ｃ２　ｃ３Ｃ４内に存在し、その内部容積に
相当する訊の混合液は２１′ｒ、３図の内部経路Ｄｔ　
Ｄ２　Ｄ３　ＤＡ　Ｋ！’）、そのまま管路４ｅからの
緩衝液と共に運ばれ、管路４ｆｆ経て、例えばこの途中
に配置された固定化ＯＡＣによりピルビン酸に変換され
て、フロー七ル１０内に送液する。このフローセル１０
内には、例えば表面に固定化ｐｏｐを被覆した１本の電
極１ノが設けられ、前記ピルビン酸は固定化ｐｏｐによ
り電極感応物質に変換され、その生成または消減量から
電極１１により電極感応物質の濃度を測定する。

一方、第２図のバルブ６の内部経路り、Ｄ２Ｄ３Ｄ４は
第３図の内部経路ＥＩＤ２１）３　Ｅ４となシ、この中
に存在していた緩衝液は空気ポンプ８からの空気により
緩衝液槽７に丙び戻される。また第２図の空気の存在す
る内部経路Ｅ１　Ｅ２Ｅ３Ｅ４はバルブ６の回転によシ
第３図の内部経路ｃＩＥ２Ｅ３　ｃ、となるが、この内
部には空気しか存在しないので混合液を希釈することが
ない。

このようにして所定時間経過ごとに、バルブ６を１２０
度ずつ切換えて行くことによシ、その都度電極１１で電
極感応物質の濃度を測定し、この測定値の差から、混合
容器５内でのＧＯＴ試料とＧＯＴ基質の反応による経時
的なピルビン（生成の変化からＧＯＴ活性を測定するこ
とができるＯ〔発明の実施例〕（実施例１）第１図の装置を用いて、以下の条件でＧＯＴ活性全測定
した。

基質溶液：０．０５Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ７，４）の中
にＬ−アスパラギン酸１００ｍＭとα−ケトゲルタン酸
２０ｍＭを含有したものを基質液槽２に貯留した。

試料液：測定対象のＧＯＴ　’に含有する血清試料を用
い、これを試料液槽１に貯留した。

緩衝液：０．０１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ７，４）の中Ｋ
Ｏ，０１ｍＭフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ
）と、０．２　ｍＭチーアミンビロリン酸と、１０ｍＭ
ｆｌ化マグネシウムを含有させたものを用い、これ全Ｑ
受′ｇｉ液＋”：Ｉ　７に貯留した。

固定化ＯＡＣカラム：ガラスピーズ（８０〜１２０メツ
シユ）の表面に共有結合させたＯＡＣ（酵素活性１０　
Ｕ／ｒｎｙ）　ｉ内径４１Ｔｍφ、長さ３　ｃｍＯカラ
ムに詰め、第１図の管路４ｆに配置した。

電極：過酸化水素透過性膜で白金１１λ柄を被覆した７
１？−ラログラフ式過酸化水素Ｔｆｆ、　極の感応面を
、ピルビン酸オキシダーゼ（ｐｏｐ）固定化コラーケ９
ン膜（厚み３５μｍ、酵素活性約４５　ＩＵｈｎ）で破
僚し、更にその上をセルロースジアセテートの限外沢過
膜（厚み４８μｍ）の粗密層て破傷して構成したピルビ
ン酸酵素′直極全用い、これをフローセル１０内に装着
した。

先ずパルプ６を第２図の状態にセットし、ボンデ３ｄｆ
作動してフローセル１０内に緩衝液を０．５　ｒｎ４／
ｍ＋　＋１の流量で流しておく。更に空気ポンプ８を作
動させてＣ衝液に空気全供給しておく。

次に定量ポンプＪ　ａ　ｒ　Ｊ　ｂを作動して、試料液
１００μ！、基質溶液９００μＡｋ混合容器５に注入し
、マグネチツクスターラーで両者全攪拌・混合し、直ち
にポンプ３Ｃを作動して混合液を管路４ｃ内に循環させ
た。

次いでバルブ６ｆ：１２０度ずつ２分間隔で回転させて
、混合液を２１μＺずつ、固定化ＯＡＣカラムを通して
、フローセル１０に導びき、′電極１１に被着した固定
化ＰＯＰによシミ極感応物質に変換し、電極１１で各時
点における電気信号を測定した。

この測定値から、その差を求め−で処理することにより
５０〜８００１Ｕ／ｌの範囲で良好なＧＯＴ活性の検量
線を得ることができた。

（実施例２）基質溶液、緩衝液、固定化ＯＡＣカラムは上記実施例１
と同様のものを用いた。

固定化ＰＯＰカラム：ガラスピーズ（８０〜１２０メツ
シユ）の表面に共有結合させたｐｏｐ　（酵素活性５山
〜）を内径４問φ、長さ３ｍのカラムにつめた。

この固定化ＰＯＰカラムを管路４ｆの流路内の固定化Ｏ
ＡＣカラムの後方に配置し、またフローセル１０内に１
本の酸素電極１１を装着した。

この装置を用いてＧＯＴの酵素活性全測定したところ５
０〜１０００１Ｕ／ｌの範囲で比色法との相関が０．９
７と良好な結果を得ることができた。

（実施例３）基質溶液、緩衝液は上記実施例１と同様のものを用いた
。まだＰＯＰとＯＡＣとを二層に固定化したコラーケ°
ン膜（厚み３０μｍ％ＰＯＰ固定化量５０　ＩＵ／２ｍ
　、ＯＡＣ固定化量１ｏ　ｏ　ｘｕｙｃｎ？　）を過酸
化水素電極の感応面に装着し、さらにセルロースジアセ
テートの限外濾過膜（厚み４８μｍ）の粗密層で被覆し
て構成した０ＡＣ−ＰＯＰ複合電極１１全フローセル１
０内に装着した。

この装置を用いてＧＯＴ活性を測定したところ、８０〜
８００１Ｕ／ｌの範囲で良好な検量線ヲ得ることができ
た。

〔発明の効果〕

以上説明した如く、本発明に係わるＧＯＴ活性測定装置
によれば０１本の電極を用いるので、従来のような電極
の煩雑な調整が不要となり、■酵素と基質とは混合系で
独立して混合され、流路切換機構と検出系との管路を短
縮できると共に、該管路内での混合液の拡散・希釈を抑
制できる。■試料液および基質溶液の容量の調整、反応
時間の選定、測定間隔の調整、並びに回数を任意に選定
することができるので低活性から高活性までのＧＯＴの
活性測定が可能であシ、■複数回の電気信号測定値の差
４求めることによシ、試料液中に予め電極感応物質を含
む場合においても高精度に活性測定を行なうことができ
るなど顕著な効果を有するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明装置のブロック図、ど４２図および第３
図は第１図の流路切換機構の動作を示す説明図である。１・・・試料液槽、２・・・基質液槽、Ｊ　ａ　ａ　Ｊ
　ｂ・・・定□量ヂンプ、３ｃ＊３ｄ・・・ポンプ、４
ａ〜４ｆ・・・管路、５・・・混合容器、６・・・三方
向スライドパルプ、７・・・緩衝液槽、８・・・空気ポ
ンプ０．９・・・空気供給管、１０・・・フローセル、
１１・・・電極、１２・・・表示機構。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）グルタミン酸オキサル酢酸トランスアミナーゼ含
有試料液とグルタミン酸オキサル酢酸トランスアミナー
ゼの基質含有液を混合する混合系と、該混合系の混合液
を循環させる混合液循環系と、前記混合系でグルタミン
畝オキサル酢瞳トランスアミナーゼによって生成された
オキサル酢酸を固定化オキサル酢酸脱炭−り酵素を用い
てピルビン酸に変換するピルビン鹸変俟系と、該ピルビ
ン酸を固定化ピルビン敗ｔツタ化酵素により電極感応物
質に変換する電極感応物質変換系と、該電極感応物質を
１本の亀１へによシミ気信号として検出する検出系と、
該検出系に緩衝液を供給する緩衝液供給系と、該緩衝液
供給系に前記混合液循環系内の混合６ダの一部を供給す
る流路切換機構とからなることを特徴とするグルタミン
酸オキサル酢酸トランスアミナーゼ活性測定装置。
（２）流路切換機構が、三方向スライドパルプである特
許請求の範囲第１項記載のグルタミン酸オキサル酢酸ト
ランスアミナーゼ活性測定装＃０
（３）三方向スライドバルブの二方向が混合液循環系、
緩衝液供給系に接続し、残る一方が該緩衝液供給系に連
通ずる空気供給管に接続する特許請求の範囲第２項記載
のグルタミン酸オキサル酢酸トランスアミナーゼ活性測
定装置。