JPS58201997A - 酵素活性測定方法及びその装置 - Google Patents

酵素活性測定方法及びその装置

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JPS58201997A
JPS58201997A JP57081512A JP8151282A JPS58201997A JP S58201997 A JPS58201997 A JP S58201997A JP 57081512 A JP57081512 A JP 57081512A JP 8151282 A JP8151282 A JP 8151282A JP S58201997 A JPS58201997 A JP S58201997A
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JP
Japan
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solution
electrode
sample
substrate
enzyme
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Pending
Application number
JP57081512A
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English (en)
Inventor
Masao Koyama
小山 昌夫
Masako Notsuke
野附 正子
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Toshiba Corp
Original Assignee
Toshiba Corp
Tokyo Shibaura Electric Co Ltd
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Publication date
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  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の技術分野) 本発明は電気化学的測定手法を用いた酵素活性測定方法
及びその装置に関する。
〔発明の技術的背景とその問題点〕
従来、酵素活性の測定は、ある酵素を含む試料溶液とそ
の酵素の基質を含む溶液と更に他の酵素。
補酵素1発色試薬等を添加して成る反応系において、酵
素作用により#素基質に化学反応を行なわせ、そのとき
の反応系の吸光度t−測測定るという方法で行なわれて
いるつ 例えば、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ(
GPT)の酵素活性の場合、GPTをその基質と接触さ
せて該GPTの酵素作用によりピルビン酸全生成し、そ
のピルビン!lラクテートデヒドロナーゼ(LDH)の
酵素作用で還元する。
このとき、この反応系に所定!II度のニコチン酸アミ
ドアデニノヌクレオチド(NADH)Th共存させてお
くと時間の経過とともに該NADHが減少してその濃度
が低下する。その負度変fヒは波長340nmにおける
NADHの吸光度測定から矧ることかできる。したがっ
て1間通的にGPTの酵素活件が・箇定できることにな
る。
しか(、なから、この吸光度測冗法にあっては。
NAI)H、L[)H!は各種の発色試薬などの高価な
試薬を用いかつそれらは測冗後廃棄せざるを得ないなめ
一1足は極V)てコスト高となる〜また。懸濁物を含む
反応系に対しては吸元度測足が不可能となるたぬ、+れ
ら試料にあっては測足に先立って懸濁物の除去など前処
理を必要とする。
このような吸光度剣足の欠点を解決するために。
電気化学的測定法を適用した装置が提案されている(特
開昭56−97864号参照)。
これは、試料中の酵素が関与して生成若しくは消滅する
物質(検知物質)に作用するある酵素を周定した膜を添
着して成る酵素電極を2本相互に離シ、て配設したフロ
ーシステムであって、試料中罠当初から含まれていた検
知物質の与える電気信号をベース値とし、更に試料中の
酵素の作用により神酵素の活性に対【6して生成若しく
は消滅した−1(検知物質)の与える電気信号を測足し
1両者の差から試料中の酵素の活性を測定する本のであ
る。
しかしながらこの装置にあっては、2本の酵素電極を用
いるため両者の出力調整をすることが容易でになくその
操作が極めて煩雑かつ多大な労力を要するものとなる。
すなわち、感度、応答速度、ゲイン等の亀j特性が全く
同じでかつその特性の経時変rヒも同一である酵素亀礪
金製造することは極めて困難である一七のため、測定時
にあっては各電極の出力の調整が必要となるが、その場
合でも得られ定検量線の直線性、直線領域にそれぞれの
電極では相違が69、そのため測定に誤差が生じる結果
を招く。
また、フローシステムの激流路にあって2本のtmを相
互に離して配設した場合、液流路内で試料の拡散に基づ
く宿駅現象が発生し下流の電極位置では検知物質の濃度
が低下して、2本の電啄間の出力差調整、差動増幅時に
あってはその調整が極めて困難となる。とくに、低活性
の酵素を含む微!の試料の測定にあっては著るしく困虐
である。
また、液流路内に酵素基質含有緩衝i’l[t−一足の
流速で流しておき、ここに試料液を注入し、両者が流路
内?流nる1間に酵素とf質とを接触させて。
酵素作用により4釆少若しくは増加した検知物質の与え
る通気信号全下流ンで配設した1施で検出して酵素活性
t fAll定するという方法も提案されている(特公
昭56−92445.92446号参照)。
しかしながら、この方法にあっては、試料注入口と電1
間の液流路は酵素と基質の反りの場であるため、長い反
、′il;時間を要する低活性酵素の場合は?l!路が
長くなる。また、流路が長くなればなるほど、そnは圧
入した試料の滝路内での希釈が進み、その結果、試料注
入量全増すか、より流路を長くして反3時間を長くしな
けnばならないという不都合が生ずる。
一方、1本の返事を用いても酵素活性を測定することが
できる(特開昭56 92445号参照)。
すなわち、一定流速で@液流路内を70−セルに回か?
て流れる基質@液に、所定量の酵素試料溶液全圧入し、
該流路内で両者の反応を進行せしめ、そのとき酵素の作
用によジ生成若しくは消滅する検知物質の濃度変化全1
本の電極で電気信号として知る方法でちる。
しかしながら、この場合、試料浴液中に則定尉象とする
酵素以外の電標感応#lJ質が予め含Mざnでいると、
電極は該物質にも感応してその濃度を電気信号とするの
で、結局(2該物質の濃度・:て相当する誤差が生じ対
象とする酵素の活性測定が不正確になる。
〔発明の目的〕
本発明は、電気1ヒ学的手法を用いた従来の測定方法及
び装置に゛おける上記した問題点を解決した新規な酵素
活性測定方法及び装置の提供を目的とする。
〔発明の概要」 本発樹者らは、検知物質の濃vt−検矧する電jが1本
である酵素古注測定装置における上記の如き問題点、す
なわち、試料m液中に予め含有されている電項感心吻質
の妨害作用の除去に1し、1意研究を重ねた結果、所定
室の試料@液のみ:?:基づく電電からの電気信号(P
l)と該試料塔頃:て基質Wg液を混合したflIrg
に基づく電極からの電気信号(Pl)との差、すなわち
、 Pt −PI Vi、試料溶液中の1’!極感応物
質による電気信号の値を消去したものであって、測定対
象の酵素活性に基づく検知物質の濃度変化に対応する信
号であるとの事実に着目1−1本発明方法と装置を開発
するに到つ九。
すなわち1本発明方法は、最初に、1本の電極を備えた
フローセルに試料溶に!Lt−注入し、該電極の発信す
る電気信号を測定し、ついで、該試料溶液と基質溶液と
の混合溶液を該フローセルに注入し、該t&の発信する
電気信号′5r:測足し、2つの電気信号の差から酵素
活性を測足することを特徴とする方法であり、また1本
発明の装置り基質浴液槽と、1本の1.極とを備えたフ
ローセルを溶液流路を介して接続した酵素活性測定装置
であって、肪溶液流路の該フローセル直前の位Iには試
料溶液の該$1注入部が、また、該溶液流路の該基質簿
ffIL槽と第1注入部との間の位置には試料溶液の第
2注入部が具備された構造であることを特徴とする。
以下に1本発明装置の1例を概念的に示したブロック図
によV鮮細に説明する。
図において、1は基質溶液槽で、測定対象とする酵素の
基質及び必要な緩衝液等から成る基質溶液が貯留されて
いる。2はフローセルで1本の電極3を内臓する。4は
訓電表示機構であって、電極3と接続され電極からの電
気信号を測定・表]、する。基質溶液槽lとフローセル
20間は溶液流路5によってW−続され1例えばベリス
タボ/ブのような足置ポンプ6を作動することにより、
流路5には図中矢印Aの方向に各種の溶液が送流される
本発明装置の特tは、溶液流路5のフローセル直前の位
置に試料溶液の第1注入部7が配設され。
かつ、その上流であって基質WS液槽1と第1注入部の
間の位置には試料溶液の第2注入部7′が配設されてい
ることである。8は試料WJg、横で、−tの中には1
lllだ対象の酵¥gを含有する試料溶液が貯留され、
該試料溶液F1足最ポンプ6′により、それぞれ第1注
入部7及′び第2注入部7′から溶液陣路5に所定量注
入されるようになっている。
そnぞnの圧入部を通過する芯板は、定型ポンプ6:7
)1用てより70−セル2に送液されていくが、このと
さ、溶液流′i!5が所定の長さをMすることρムら、
各注入部にある瞬間存在していた溶液はFifr足の時
間差をもって順次フローセル2に送液されてそれぞnが
電極3と接触することとなる。
したがって1重重からは順次所定の電気信号か発信さn
ることとなる。
この装置、でおいて、電極としては、測定対象の雪素の
作用によって濃度変1ヒする検知物質t/C感応−して
這気信号金発信する重要であれば何でちってもよいが、
一般に、上電極、アンモニウムイオン電、唾、アンモニ
アガス亀屡、5!素也極、炭酸ガス電j、過酸化水素慮
穫、グルコース、ピルビン酸。
尿素などの7ir機物を噴石できる各種の酵素成極など
を51]定対家の酵素に対5させて適宜に使用すること
ができる。
不発明装責全用いて昇素活性(−次のようにして測足さ
nる。
まず1足置ポンプ6.6′を作動して試料溶液槽8から
同1の試料溶液を第1注入部7、第2注入部7′から溶
液流路5に注入する。このとき、第2注入部7′では、
基質溶液411から送流される所定量の基質溶液と試料
溶液とが混合される。第1注入部7に注入された試料溶
液はブローセルに送液されてそこで電極3が所定の電気
信号(Pl)t−発信する。このとき、第2注入部γで
形成された混合溶液は溶液流路内を通流中であって未だ
フローセルには送液されてこない。所定の時間経過後、
第2注入部7′での混合@液は、溶液流路5内を通流中
に測定対象の酵素と基質との反応が進行し検知物質を生
成又は消失し次状態で70−セル2に送流されて、ここ
で電極3が所定の電気信号(P2)を発信する。これら
゛電気信号はいずれも測定・表示機構で測定されて表示
される。
なお、第2注入部γで注入され念試料は、溶液流路5内
を通流中に、基質浴液と混合され、希釈され次状態にな
るため、第1注入部7で注入し之場合と比べて異なった
信号を与える。従って、同一濃度の電i検知物質を含む
標準試料を用いて。
II注入部7.第2注入部7′から試料を注入した時の
電極信号に対す、る補正係数kl−求めておく。
この宵、気信号P鵞は、浴液流路5内を通流する過程に
おける酵素作用により生成若しくは消失し九検知物質の
#I度の電気信号と試料溶液が含有している電極Jl応
物質の示す固有の電気信号との和である。したがって、
に@P鵞−PIより試料溶液中の電極感応物質による電
気信号は消去されて検知物質の濃度、したがって酵素活
性が測定されることとなる。
なお、試料溶液の注入は、$1注入m7.第2注入部7
′にそれぞれ同時に行なってもよいし、又。
第1注入部7にまず注入し、ついで第2注入部1に注入
するという注入時に時間差を設けて行なって4よい。
いずれにしても、全体の流量、流速を適宜K11節する
仁とにより、まずtR1注入部7に注入した試、料溶液
の電気信号を測定したのち、柩2注入部7′に注入した
試料溶液と基質溶液槽lからの基質溶給との混合溶液の
電気信号を測定できればよい、ま念1本発明装置にあっ
ては、電極3として上記したような酵素なjを便用せず
、各液流路5として所定の酵素を固定化したチューブ又
は#素を固定し念力ラムを用いれば、下流に立置する電
極3は酵素這jではなく徨々のイオン電極、ガス電礪ヲ
用いることができる。
〔発明の実施例〕
グルコース存在下でのα−アミラーゼの酵素活性剣足電
他として、厚み12μmのコラーゲン膜中に約610/
−のグルコースオキシダーゼ(米国シグマ社製、タイプ
■)と約201U/’−のα−グルコシダーゼ(米国シ
グマ社製、タイプI)と約t OIU/−のβ−グルコ
シダーゼ(マイルスラボラ) IJ−ズ社M)と全混合
して包括させた固定化酵素膜で、厚み12μmの四フッ
化工升しノ/六7ノ化プロピレン共重合体膜を備えるポ
ーラログラフ式散素電禾の電凛面を被覆し、更にその外
at非対称孔径分布を有する厚み25μmのセルロース
ジアセテートから成る限外濾過膜の緻密1側で被覆した
ものを用いた。これ全70−セル3に装着した。
浴液概略5ij内径1.0 IIB長さ2mのポリ四フ
ッ化1チレンヲ1足量ポンプ6.6′はいずれもペリス
タポンプを用いた。他の配管はいずれも内径1.0謡の
ポリ四フフ化エチレンのチューブであった。
測定対象の酵素としてはα−アミラーゼ、電極感応物質
としてはグルコースを用いた。基質溶液としては、 P
H6,7の0.05 M りン酸塩緩衝液に10f/l
の可溶性スターチ、5り/lのアミロースを含有させた
ものを用い念。全体を300に維持し九。
グルコースの濃度が0f71.1り/l、3F//。
5り/lであろ4種類のα−アミラーゼ含有の試料溶液
をそれぞれ試料溶液槽8に貯留しておき、ペリスタポン
プ6.6′を作動してml注入部7.@2注入部7′か
ら同時に溶液流路5に注入した。注入1は30μ!であ
った。
各場合につき、h−P+を測定し、これからα−アミラ
ーゼの酵素活性を算出した。その結果を表に示した。
結果から明ら刀)々、ように、1女、感応物質であるグ
ルコースが試料溶液中に存在していても、酵素1舌性の
測定値はその影響を受けないことがわかる。
〔発明の効果〕
以上のように、本発明によれば、試料洛没中に111足
対象の酵素以外に電極@旧物質が混在していても、該電
極感応物質の影響を消去して酵素古注の測定が可ことな
る。
しか毛、[本の1極でJ111足でなるので、従来装置
の如き電極調整の煩雑な操作が不要となり極めて有用で
ある。
【図面の簡単な説明】
図;ま本発明嬰1つ1例を示すブロック図である。 ■・・・基質浴後1,2・・・70−セル、3・・・宣
琢。 4・・・4JI定・表示機構、5・・・溶液流路、  
5 、6’・・足量ポンプ、7・・・第1注入部、τ・
・12注入部、8・・・試料婢液槽

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1、 最初に、1本の電極金偏えたフローセルに試料塔
    !全注入し、該電極の発信する處気信号全測定し、つい
    で、該試料溶液と基質浴液との混合溶液全該70−セル
    に注入し、該電極の発信する電気信号を@足し、2つの
    電気信号の差から酵素活性を測定することを特徴とする
    酵素活性測定方法。 2 基質溶液槽と、1本の電極を備えたフローセルとを
    溶液流路を介して愛玩した酵素活性測定装置であって、
    該浴液禿路の該70−セル直前の位置には・試料溶液の
    第1注入部が、[凱該溶液鬼路の該基質Δ液槽と第1注
    入部との間の位置には試料溶液の該第2圧入部が具備さ
    れた構造であることを特徴とする酵素活性測定装置。
JP57081512A 1982-05-17 1982-05-17 酵素活性測定方法及びその装置 Pending JPS58201997A (ja)

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