JPS629312B2 - - Google Patents
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Landscapes
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
〔発明の技術分野〕
本発明は電気化学的手法を用い１本の電極を備
えた１つの測定系でGOT、GPT、LDHの３種類
の酵素活性を測定する装置に関するものである。 〔発明の技術的背景とその問題点〕 従来、酵素活性の測定は、ある酵素を含む試料
液と、その酵素の基質を含む溶液と、更に他の酵
素、補酵素および発色試薬等を添加してなる反応
系において、酵素作用により酵素基質に化学反応
を行なわせ、そのときの反応系の吸光度を測定す
る方法で行なわれていた。 例えばGPTの酵素活性を測定する場合、GPT
をその基質と接触させ、該GPTの酵素作用によ
りピルビン酸を生成し、そのピルビン酸をLDH
の酵素作用によつて還元する。このとき、この反
応系に所定濃度のニコチン酸アミドアデニンヌク
レオチド（NADH）を共存させておくと、時間の
経過とともに該NADHが減少し、その濃度が低下
する。その濃度変化は波長340mmにおけるNADH
の吸光度測定から知ることができる。従つて間接
的にGPTの酵素活性を測定できることになる。 しかしながら、この吸光度測定法にあつては、
NADH、LDH、あるいは各種の発色試薬など高
価な試薬を必要とし、しかもこれら試薬を測定
後、廃棄せざるを得ないため測定コストが高い。
また懸濁物を含む反応系に対しては吸光度測定が
不可等となるため、それらの試料を測定する場
合、予め懸濁物の除去など前処理を必要とする。 このような吸光度測定の欠点を解決するために
電気化学的測定法を応用した装置が従来、提案さ
れている（特開昭56−97864号参照）。 この装置は、試料中の酵素が関与して生成若し
くは消滅する物質（検知物質）に作用する酵素を
固定した膜を添着した酵素電極を２本相互に離間
して配置したフローシステムである。この装置で
は、試料中に当初から含まれていた検知物質の与
える電気信号をベース値とし、更に試料中の酵素
の作用によつて、該酵素の活性に対応して生成若
しくは消滅した物質（検知物質）の与える電気信
号を測定し、ベース値との差から試料中の酵素の
活性を測定するものである。 しかしながら、この装置では２本の酵素電極を
用いてベース値と測定値を測定するため、両者の
出力調整が難しく、また操作が極めて煩雑であ
る。 すなわち、感度、応等速度、ゲイン等の電極特
性が、両電極において同じでなく、またその特性
の径時変化も同一でないため、測定時において両
電極の出力調整を行なつても、得られた検量線の
直線性、直線領域に相違があり、測定誤差を生じ
ることがあつた。またフローシステムの液流路内
に２本の電極を相互に離間して配置してあるの
で、液流路内で試料の拡散に基づき希釈現象が発
生し、下流の電極位置では検知物質の濃度が低下
し、特に低活性の酵素を含む微量試料の場合に
は、両電極の出力調整、差動増幅時にあつては、
その調整は極めて困難となる。 また、液流路内に酵素基質含有緩衝液を一定の
流速で流し、ここに試料液を注入し、両者が流路
内を流れる間に酵素と基質とを接触させて、酵素
作用により減少若しくは増加した検知物質の与え
る電気信号を下流に配設した電極で検出して酵素
の活性を測定する装置も提案されている（特公昭
56−92445、92446号参照）。 しかしながらこの装置では、試料注入口と電極
間の液流路は酵素と基質の反応の場であるため、
長い反応時間を必要とする低活性酵素の場合は液
流路が長くなる。また、流路が長くなれば、注入
した試料の流路での希釈が進み、その結果、試料
注入量を増すか、より流路を長くして反応時間を
長くしなければならないという不都合が生じる。 またこれとは別に１本の電極を用いて酵素活性
を測定する装置も提案されている（特開昭56−
92445号参照）。すなわち、一定流速で溶液流路内
をフローセルに向つて流れる基質溶液に所定量の
酵素試料溶液を注入し、該流路内で両者の反応を
進行せしめ、そのときの酵素の作用により生成若
しくは消滅する検知物質の濃度変化を１本の電極
で電気信号として測定する装置である。 しかしながら、この場合、試料溶液中に測定対
象とする酵素以外の電極感応物質が予め含有され
ていると電極は該物質にも感応し、その濃度を電
気信号として検出するので、予め含有されている
電極感応物質濃度に相当する誤差を生じ、酵素の
活性測定が不正確になる欠点があつた。 またこれら従来の活性測定装置は何れも
GOT、GPT、LDHを夫々別個の装置により測定
するものであり、測定時間がかかる上、装置の操
作が煩雑であり、特に簡便迅速な検査が要求され
る臨床検査において問題があつた。 〔発明の目的〕 本発明は、従来の欠点を改善し、１本電極を用
いた電気化学的手法により、３種の酵素活性を１
つの測定系で測定でき、装置の簡略化を図ると共
に、測定操作が容易で且つ高精度なGOT、
GPT、LDHの活性化測定装置を提供するもので
ある。 〔発明の概要〕 本発明はGOT、GPT、LDHの作用により直接
的に生成、あるいは他の酵素との組み合せにより
生成するピルビン酸を１本の電極を用いた一つの
電気化学測定系により計測することを特徴とする
ものである。 即ち本発明装置は GOT、GPT、LDHの各反応液を選択的に切
換えて送液する反応液供給部と、 GOTにより生成されたオキサル酢酸をピル
ビン酸に変換する変換部と、 １本電極で構成されたピルビン酸測定部と、 該測定部に緩衝液を供給する緩衝液供給部
と、 該緩衝液供給部に前記反応液供給部から送液
された反応液を供給する流路切換部と、 から構成されている。 本発明においてGOT、GPT、LDHの各酵素
に、夫々に対応する基質を反応させてピルビン酸
を生成させるが、GOTは一段階の反応でピルビ
ン酸を生成することができないので他の酵素を反
応させてピルビン酸を生成する。 この場合GOTに対する基質としてはＬ−アス
パラギン酸とα−ケトグルタル酸の混合液を用
い、更にピルビン酸を生成させるためにオキサル
酢酸脱炭酸酵素を用いる。 またGPTに対する基質としてはＬ−アラニン
とα−ケトグルタル酸の混合液を用いる。 更にLDHに対する基質としてはNADと乳酸リ
チウムを用いる。 本発明においてピルビン酸測定部としては、例
えば、ピルビン酸オキシダーゼを微粒子等に固
定化して形成したカラムあるいはチユーブ内壁に
固定化したものと、酸素または過酸化水素を検出
する電気化学測定電極を組合せた装置、または
ピルビン酸オキシターゼを固定化した膜と、酸素
または過酸化水素を検知する電気化学測定電極を
組み合せた装置などピルビン酸濃度を測定できる
ものであれば何れのものでも良い。 本発明装置を用いて各酵素活性を測定する方法
についてその原理を簡単に説明する。
えた１つの測定系でGOT、GPT、LDHの３種類
の酵素活性を測定する装置に関するものである。 〔発明の技術的背景とその問題点〕 従来、酵素活性の測定は、ある酵素を含む試料
液と、その酵素の基質を含む溶液と、更に他の酵
素、補酵素および発色試薬等を添加してなる反応
系において、酵素作用により酵素基質に化学反応
を行なわせ、そのときの反応系の吸光度を測定す
る方法で行なわれていた。 例えばGPTの酵素活性を測定する場合、GPT
をその基質と接触させ、該GPTの酵素作用によ
りピルビン酸を生成し、そのピルビン酸をLDH
の酵素作用によつて還元する。このとき、この反
応系に所定濃度のニコチン酸アミドアデニンヌク
レオチド（NADH）を共存させておくと、時間の
経過とともに該NADHが減少し、その濃度が低下
する。その濃度変化は波長340mmにおけるNADH
の吸光度測定から知ることができる。従つて間接
的にGPTの酵素活性を測定できることになる。 しかしながら、この吸光度測定法にあつては、
NADH、LDH、あるいは各種の発色試薬など高
価な試薬を必要とし、しかもこれら試薬を測定
後、廃棄せざるを得ないため測定コストが高い。
また懸濁物を含む反応系に対しては吸光度測定が
不可等となるため、それらの試料を測定する場
合、予め懸濁物の除去など前処理を必要とする。 このような吸光度測定の欠点を解決するために
電気化学的測定法を応用した装置が従来、提案さ
れている（特開昭56−97864号参照）。 この装置は、試料中の酵素が関与して生成若し
くは消滅する物質（検知物質）に作用する酵素を
固定した膜を添着した酵素電極を２本相互に離間
して配置したフローシステムである。この装置で
は、試料中に当初から含まれていた検知物質の与
える電気信号をベース値とし、更に試料中の酵素
の作用によつて、該酵素の活性に対応して生成若
しくは消滅した物質（検知物質）の与える電気信
号を測定し、ベース値との差から試料中の酵素の
活性を測定するものである。 しかしながら、この装置では２本の酵素電極を
用いてベース値と測定値を測定するため、両者の
出力調整が難しく、また操作が極めて煩雑であ
る。 すなわち、感度、応等速度、ゲイン等の電極特
性が、両電極において同じでなく、またその特性
の径時変化も同一でないため、測定時において両
電極の出力調整を行なつても、得られた検量線の
直線性、直線領域に相違があり、測定誤差を生じ
ることがあつた。またフローシステムの液流路内
に２本の電極を相互に離間して配置してあるの
で、液流路内で試料の拡散に基づき希釈現象が発
生し、下流の電極位置では検知物質の濃度が低下
し、特に低活性の酵素を含む微量試料の場合に
は、両電極の出力調整、差動増幅時にあつては、
その調整は極めて困難となる。 また、液流路内に酵素基質含有緩衝液を一定の
流速で流し、ここに試料液を注入し、両者が流路
内を流れる間に酵素と基質とを接触させて、酵素
作用により減少若しくは増加した検知物質の与え
る電気信号を下流に配設した電極で検出して酵素
の活性を測定する装置も提案されている（特公昭
56−92445、92446号参照）。 しかしながらこの装置では、試料注入口と電極
間の液流路は酵素と基質の反応の場であるため、
長い反応時間を必要とする低活性酵素の場合は液
流路が長くなる。また、流路が長くなれば、注入
した試料の流路での希釈が進み、その結果、試料
注入量を増すか、より流路を長くして反応時間を
長くしなければならないという不都合が生じる。 またこれとは別に１本の電極を用いて酵素活性
を測定する装置も提案されている（特開昭56−
92445号参照）。すなわち、一定流速で溶液流路内
をフローセルに向つて流れる基質溶液に所定量の
酵素試料溶液を注入し、該流路内で両者の反応を
進行せしめ、そのときの酵素の作用により生成若
しくは消滅する検知物質の濃度変化を１本の電極
で電気信号として測定する装置である。 しかしながら、この場合、試料溶液中に測定対
象とする酵素以外の電極感応物質が予め含有され
ていると電極は該物質にも感応し、その濃度を電
気信号として検出するので、予め含有されている
電極感応物質濃度に相当する誤差を生じ、酵素の
活性測定が不正確になる欠点があつた。 またこれら従来の活性測定装置は何れも
GOT、GPT、LDHを夫々別個の装置により測定
するものであり、測定時間がかかる上、装置の操
作が煩雑であり、特に簡便迅速な検査が要求され
る臨床検査において問題があつた。 〔発明の目的〕 本発明は、従来の欠点を改善し、１本電極を用
いた電気化学的手法により、３種の酵素活性を１
つの測定系で測定でき、装置の簡略化を図ると共
に、測定操作が容易で且つ高精度なGOT、
GPT、LDHの活性化測定装置を提供するもので
ある。 〔発明の概要〕 本発明はGOT、GPT、LDHの作用により直接
的に生成、あるいは他の酵素との組み合せにより
生成するピルビン酸を１本の電極を用いた一つの
電気化学測定系により計測することを特徴とする
ものである。 即ち本発明装置は GOT、GPT、LDHの各反応液を選択的に切
換えて送液する反応液供給部と、 GOTにより生成されたオキサル酢酸をピル
ビン酸に変換する変換部と、 １本電極で構成されたピルビン酸測定部と、 該測定部に緩衝液を供給する緩衝液供給部
と、 該緩衝液供給部に前記反応液供給部から送液
された反応液を供給する流路切換部と、 から構成されている。 本発明においてGOT、GPT、LDHの各酵素
に、夫々に対応する基質を反応させてピルビン酸
を生成させるが、GOTは一段階の反応でピルビ
ン酸を生成することができないので他の酵素を反
応させてピルビン酸を生成する。 この場合GOTに対する基質としてはＬ−アス
パラギン酸とα−ケトグルタル酸の混合液を用
い、更にピルビン酸を生成させるためにオキサル
酢酸脱炭酸酵素を用いる。 またGPTに対する基質としてはＬ−アラニン
とα−ケトグルタル酸の混合液を用いる。 更にLDHに対する基質としてはNADと乳酸リ
チウムを用いる。 本発明においてピルビン酸測定部としては、例
えば、ピルビン酸オキシダーゼを微粒子等に固
定化して形成したカラムあるいはチユーブ内壁に
固定化したものと、酸素または過酸化水素を検出
する電気化学測定電極を組合せた装置、または
ピルビン酸オキシターゼを固定化した膜と、酸素
または過酸化水素を検知する電気化学測定電極を
組み合せた装置などピルビン酸濃度を測定できる
ものであれば何れのものでも良い。 本発明装置を用いて各酵素活性を測定する方法
についてその原理を簡単に説明する。
次に図面に示す装置を用い、以下の条件により
GOT、GPT、LDHの各酵素活性を具体的に測定
した。 基質溶液 GOT用：0.05Mリン酸緩衝液（PH7.4）の中にＬ
−アスパラギン酸100ｍＭ、α−ケトグルタル
酸20ｍＭ、塩化マグネシウム２ｍＭを含有せし
めたものを300μGOT反応液槽１に入れた。 GPT用：0.05Mリン酸緩衝液（PH7.4）の中にＬ
−アラニン200ｍＭ、α−ケトグルタル酸10ｍ
Ｍを含有せしめたものを300mlをGPT反応液槽
２に入れた。 LDH用：0.05Mトリス緩衝液（PH9.0）の中に
NAD10ｍＭ、乳酸リチウム200ｍＭを含有せし
めたもの300μをLDH反応液槽３に入れた。 OAC固定化カラム６：ガラスビーズ（80〜120メ
ツシユ）の表面に共有結合させたOAC（酵素
活性10IU／mg）を内径４mmφ、長さ３cmのカ
ラムに詰め、これをGOTの反応で生成したオ
キサル酢酸の流れる流路７ａに設けた。 ピルビン酸測定電極１８：過酸化水素透過性膜で
白金陰極を被覆したポーラログラフ式過酸化水
素電極の感応面を、ピルビン酸オキシダーゼ
（POP）固定化コラーゲン膜（厚み35μｍ、酵
素活性約45IU／cm2で被覆し更にその上をセル
ロースジアセテートの限外過膜（厚み48μ
ｍ）の粗密層で被覆して構成したピルビン酸酵
素電極を用い、これをフローセル１５内に装着
した。 ピルビン酸電極用緩衝液：0.01Mリン酸緩衝液
（PH7.4）の中に0.01ｍＭフラビンアデニンジヌ
クレオチド（FAD）、0.2ｍＭチアミンピロリ
ン酸、10ｍＭ塩化マグネシウムを含有せしめた
ものを緩衝液槽１２に入れ、定量ポンプ１６で
１ml／minの流速で送液し、ピルビン酸定量の
ためのフローシステムを形成した。 試料液：測定対象のGOT、GPT、LDHを含有す
る血清試料を用い、測定の際に各反応液槽１，
２，３に夫々100μずつ添加して、マグネテ
イツクスターラーで撹拌した。 測定は、一定時間ごとに流路切換バルブ５を
切換えて、各反応液槽１，２，３から順次ポン
プ１０で切換バルブ８まで送液し、これを切換
えて50μずつ、緩衝液と共にフローセル１５
に送り、ここでピルビン酸の生成量を測定電極
１８で測定し、各時点における測定値の差から
ピルビン酵濃度を測定した。 この結果、GOTの活性は50〜1000IU／、
GPTの活性は５〜800IU／、LDHは50〜
1000IU／の検量線が得られた。これらの値
は、従来の比色法との相関係数は0.96〜0.98と
良好な結果を得ることができた。 〔発明の効果〕 以上説明した如く、本発明に係わるGOT、
GPT、LDHの活性測定装置によれば、１本の電
極を用いた１つの電気化学的測定系で、３種の酵
素活性を容易に且つ高精度に測定できると共に、
装置の簡略化を図れ、特に臨床検査において顕著
な効果を発揮することができる。
GOT、GPT、LDHの各酵素活性を具体的に測定
した。 基質溶液 GOT用：0.05Mリン酸緩衝液（PH7.4）の中にＬ
−アスパラギン酸100ｍＭ、α−ケトグルタル
酸20ｍＭ、塩化マグネシウム２ｍＭを含有せし
めたものを300μGOT反応液槽１に入れた。 GPT用：0.05Mリン酸緩衝液（PH7.4）の中にＬ
−アラニン200ｍＭ、α−ケトグルタル酸10ｍ
Ｍを含有せしめたものを300mlをGPT反応液槽
２に入れた。 LDH用：0.05Mトリス緩衝液（PH9.0）の中に
NAD10ｍＭ、乳酸リチウム200ｍＭを含有せし
めたもの300μをLDH反応液槽３に入れた。 OAC固定化カラム６：ガラスビーズ（80〜120メ
ツシユ）の表面に共有結合させたOAC（酵素
活性10IU／mg）を内径４mmφ、長さ３cmのカ
ラムに詰め、これをGOTの反応で生成したオ
キサル酢酸の流れる流路７ａに設けた。 ピルビン酸測定電極１８：過酸化水素透過性膜で
白金陰極を被覆したポーラログラフ式過酸化水
素電極の感応面を、ピルビン酸オキシダーゼ
（POP）固定化コラーゲン膜（厚み35μｍ、酵
素活性約45IU／cm2で被覆し更にその上をセル
ロースジアセテートの限外過膜（厚み48μ
ｍ）の粗密層で被覆して構成したピルビン酸酵
素電極を用い、これをフローセル１５内に装着
した。 ピルビン酸電極用緩衝液：0.01Mリン酸緩衝液
（PH7.4）の中に0.01ｍＭフラビンアデニンジヌ
クレオチド（FAD）、0.2ｍＭチアミンピロリ
ン酸、10ｍＭ塩化マグネシウムを含有せしめた
ものを緩衝液槽１２に入れ、定量ポンプ１６で
１ml／minの流速で送液し、ピルビン酸定量の
ためのフローシステムを形成した。 試料液：測定対象のGOT、GPT、LDHを含有す
る血清試料を用い、測定の際に各反応液槽１，
２，３に夫々100μずつ添加して、マグネテ
イツクスターラーで撹拌した。 測定は、一定時間ごとに流路切換バルブ５を
切換えて、各反応液槽１，２，３から順次ポン
プ１０で切換バルブ８まで送液し、これを切換
えて50μずつ、緩衝液と共にフローセル１５
に送り、ここでピルビン酸の生成量を測定電極
１８で測定し、各時点における測定値の差から
ピルビン酵濃度を測定した。 この結果、GOTの活性は50〜1000IU／、
GPTの活性は５〜800IU／、LDHは50〜
1000IU／の検量線が得られた。これらの値
は、従来の比色法との相関係数は0.96〜0.98と
良好な結果を得ることができた。 〔発明の効果〕 以上説明した如く、本発明に係わるGOT、
GPT、LDHの活性測定装置によれば、１本の電
極を用いた１つの電気化学的測定系で、３種の酵
素活性を容易に且つ高精度に測定できると共に、
装置の簡略化を図れ、特に臨床検査において顕著
な効果を発揮することができる。
図面は本発明の概略構成を示すブロツク図であ
る。 １……GOT反応液槽、２……GPT反応液槽、
３……LDH反応液槽、４ａ，４ｂ，４ｃ……流
路、５……流路切換バルブ、６……OAC固定化
カラム、７，９，１０，１１……流路、８……切
換バルブ、１２……緩衝液槽、１３，１６……定
量ポンプ、１４，１７……廃液槽、１５……フロ
ーセル、１８……測定電極、１９……測定表示機
構。
る。 １……GOT反応液槽、２……GPT反応液槽、
３……LDH反応液槽、４ａ，４ｂ，４ｃ……流
路、５……流路切換バルブ、６……OAC固定化
カラム、７，９，１０，１１……流路、８……切
換バルブ、１２……緩衝液槽、１３，１６……定
量ポンプ、１４，１７……廃液槽、１５……フロ
ーセル、１８……測定電極、１９……測定表示機
構。
Claims (1)
- １ グルタミン酸オキサル酢酸トランスアミナー
ゼ（GOT）と、グルタミン酸ピルビン酸トラン
スアミナーゼ（GPT）とラクテートデヒドロナ
ーゼ（LDH）の各反応液を選択的に切換えて送
液する反応液供給部と、GOTにより生成された
オキサル酢酸をピルビン酸に変換する変換部と、
１本電極で構成されたピルビン酸測定部と、該測
定部に緩衝液を供給する緩衝液供給部と、該緩衝
液供給部に、前記反応液供給部から送液された反
応液を供給する流路切換部とからなることを特徴
とするGOT、GPT、LDHの活性測定装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57209665A JPS5998681A (ja) | 1982-11-30 | 1982-11-30 | Ｇｏｔ，ｇｐｔ，ｌｄｈの活性測定装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57209665A JPS5998681A (ja) | 1982-11-30 | 1982-11-30 | Ｇｏｔ，ｇｐｔ，ｌｄｈの活性測定装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5998681A JPS5998681A (ja) | 1984-06-07 |
| JPS629312B2 true JPS629312B2 (ja) | 1987-02-27 |
Family
ID=16576573
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57209665A Granted JPS5998681A (ja) | 1982-11-30 | 1982-11-30 | Ｇｏｔ，ｇｐｔ，ｌｄｈの活性測定装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5998681A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4719928B2 (ja) * | 2009-01-22 | 2011-07-06 | Ｎｅｃインフロンティア株式会社 | 電子機器用筐体と支持装置との組み物およびこの組み物と電子機器とのセット |
-
1982
- 1982-11-30 JP JP57209665A patent/JPS5998681A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5998681A (ja) | 1984-06-07 |
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