JPS6152425B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はグルコース等の基質を分析するフロー
セル形酵素利用分析装置に関する。

最近、酵素を或種の物質に固定化する技術が進
歩して来たので、酵素を或種のチユーブや膜に包
括固定化したり、多孔性ガラスビーズ等に結合固
定化することが可能となつた。そこでこれらの酵
素固定化物質で電極を被覆したりカラムに充填し
て置き、これに接触して流通する試料液と緩触衝
液とを反応させる際に触媒作用を行わせている。
即ち、フロースルー方式で酵素の接触酸化作用を
利用して試料液中の基質を酸化させている。この
反応では流通液中の溶存酸素量が減少するので、
適当な酸素電極を用いて酸素量を測定すれば、試
料液中の基質の濃度を知ることができる。

第１図はフローセル形酵素利用基質分析装置の
測定原理を示す系統図である。例えば燐酸塩を水
に所定濃度溶解した緩衝液１は送液ポンプ２によ
つて試料注入部３に送られるが、試料注入部３に
一定量の試料、例えば血清等を注入すれば、緩衝
液１の流れに乗つて酵素反応器４を流通する。酵
素反応器４は円筒状ガラスカラムに酵素を固定し
た多孔性のガラスビーズを充填したもので、この
カラム中を流通する液中では次の反応が起る。こ
こでは酵素としてグルコースオキシターゼを用い
て血清中のグルコースを分析する場合について説
明する。

即ち、グルコースC₆H₁₂O₆はグルコースオキシ
ターゼの酸化触媒作用によつて、グルコン酸
C₆H₁₂O₇と過酸化水素とを生じる。なお、O₂は緩
衝液１中に溶存している酸素である。

このようにして酵素の接触反応によつて酸化さ
れた基質を含む緩衝液１はフローセル６に送ら
れ、酵素電極５によつて溶存酵素量が検知され
る。即ち試料と緩衝液１とが混してフローセル６
を流通するときは、(1)式に示すごとく溶存酸素量
が減少しているのでその減少量を酵素電極５が検
知する。酵素電極５が検知した電気量の変化は増
幅器７で増幅され、記録計等の表示装置８に表示
される。グルコースオキシターゼはグルコースの
みに作用してグルコン酸を生ずるので、上記溶存
酸素の減少量を測定すれば試料中のグルコース量
を正確に知ることができる。

しかるに、酸素電極５の感度は緩衝液１の流速
や電極自体の劣化によつて変化する。第２図は緩
衝液中に注入したグルコース量と感度（酸素消費
量）との関係を示す線図で、横軸はグルコース濃
度をμｇで示し、縦軸は感度を10^-8クーロンの単
位で示している。緩衝液の流速はパラメータとし
て示されており、線ａは流速が0.75ml／min、線
ｂは流速が1.32ml／min、線ｃは1.77ml／min、
線ｄは2.62ml／minの場合である。この実験結果
によれば、緩衝液の流速が増加すると感度は低下
しており、グルコース量が増加しても感度はそれ
に比して増加していない。

第３図は緩衝液の流速と感度との関係を示す線
図で、横軸は緩衝液の流速をml／minで示し、縦
軸は第２図と同様な表示で感度を示している。こ
の場合は0.2％亜硫酸水素ナトリウム溶液20μ
を第１図に示してある試料注入部３に注入しフロ
ーセル６を流れる緩衝液中の溶存酸素量を測定し
た結果である。亜硫酸水素ナトリウムは溶存酸素
を消費するので、フローセル６を流れる緩衝液中
の溶存酵素量は減少するが、第２図の場合と同様
に流速が大になる程感度は低下している。

このように緩衝液１の流速増加によつて感度が
低下する原因は、緩衝液中の酸素分子の酸素電極
膜中への拡散比率が低下するためである。したが
つて、このフローセル形酵素利用基質分析装置
は、緩衝液の流速が変動するとその感度が敏感に
変動し、分析装置が低下するという欠点をもつて
いた。

本発明は、常に高精度の分析を行うことができ
る酵素利用分析装置を提供することを目的とす
る。

本発明の特徴とするところは、緩衝液流路の酵
素反応器の上流側に設けられ、緩衝液中の溶存酸
素と結合しうる還元剤の溶液を供給する導入部
と、緩衝液流路に設けられ緩衝液の流速を測定す
る流速計と、上記酸素電極の出力信号に応じて感
度を校正する機能と演算する機能を有する制御部
とを設け、上記導入部から還元剤溶液の一定量の
導入に伴つて上記流速計からの信号に対応して流
速に応じた感度補正係数を求め、上記酸素電極か
らの出力信号に乗ずるように構成したことにあ
る。

また、望ましい実施例では、酸素反応器の充填
材に固定化した酵素で酸化される基質溶液を導入
する電磁弁を酸素反応器前の流路に設けると共
に、増幅器に接続したシステム校正器を設け、電
磁返を作動させて基質溶液の一定量を導入し、シ
ステム校正器によつて増幅器の増幅度を調節する
ことにより基質表示値を一定にするように構成し
た。

即ち本発明は、第３図に示すように緩衝液の流
速が変化すると酸素電極の感度は数倍も変化する
が、その曲線は単純な形状をしていることに着目
してなされたもので、次のような変換操作を施し
たものである。

第４図は第３図のＳ点の感度（酸素消費量）を
１としたときの緩衝液の流速と感度補正係数との
関係を示す線図で、Ｓ点は緩衝液が1.32ml／min
の場合である。第３図のＳ点以外の測定値につい
てはＳ点との感度比率の逆数をプロツトすると直
線ｆ上に並ぶという結果が得られた。この直線ｆ
は緩衝液１の流速に対する酸素電極５の感度補正
係数となる。即ち、酸素電極５の出力に緩衝液１
の流速に応じた第４図の感度補正係数を乗ずれば
正確な酸素消費量が示されることになる。このこ
とを確認するために次の実験を行つた。

第５図は注入したグルコース量と感度（酸素消
費量）との関係を示す線図で、緩衝液流速に応じ
た第４図の補正係数を乗じた結果である。緩衝液
１の流速を第２図に示す線ａ〜ｄと同様に変化さ
せて実測すると線ｂ（感度補正係数を１とし点Ｓ
に対応する）にほとんど重なる結果を得た。この
ことは第４図の感度補正係数を乗ずれば、緩衝液
の流量を変化させても正確な酸素消費量、即ちグ
ルコース量が得られることを立証するものであ
る。

第６図は本発明の一実施例であるフローセル形
酵素利用基質分析装置の系統図であり、第１図と
同じ部分には同一符号を付してある。緩衝液１は
流路の最後に設置された送液ポンプ２によつて吸
引され、一定流速で試料注入部３、酵素反応器
４、フローセル６および流量計１４を通つて排出
される。緩衝液１の容器と試料注入部３とを結ぶ
流路には電磁弁９，９′が設置されており、電磁
弁９によつて緩衝液１の流路を短時間閉止し還元
剤溶液１０の容器の流路を開けば、還元剤溶液１
０の一定量が緩衝液流路に導入される。同様に電
磁弁９′を操作すれば基質標準溶液１１の一定量
が緩衝液流路に導入される。還元剤溶液１０は亜
硫酸水素ナトリウムの既知濃度溶液、基質標準溶
液１１はグルコースの既知濃度溶液である。酸素
電極５の信号増幅器７にはシステム校正器１２と
感度校正機能および演算機能を有する制御部１３
が接続されており、流量計１４の緩衝液の流量信
号が制御部１３に入力されている。

実際の試料の基質分析を行う場合はまず次の校
正を実施する。最初に酸素電極の感度校正を行う
が、電磁弁９を一定時間操作して還元剤溶液１０
の一定量を緩衝液１の流れに導入する。この還元
剤溶液１０は緩衝液１中の溶存酸素を消費し酵素
反応器４内を素通りしてフローセル６を通過す
る。このとき酸素電極５によつて緩衝液１中の溶
存酸素量の変化（還元剤溶液１０によつて消費さ
れた溶存酸素量）が検出され、その信号は増幅器
７に送られる。増幅器７に接続された制御部１３
には流速計１４の信号によつて感度補正係数信号
が選択される回路を設けてあるが、この回路は第
４図の関係に設定されている。したがつて、緩衝
液１の流速を実験条件に合わせて変化させた場合
でも、同量の還元剤溶液１０を導入した場合は緩
衝液１の流速の如何に拘らず同一の増幅信号値を
表示装置８に表示させることが可能となる。な
お、緩衝液１の流速を一定にして同一量の還元剤
溶液１０を導入すれば、例えば酸素電極の劣化、
例えば酸素電極膜の汚れや変質を確認することが
できる。したがつて、酸素電極膜を洗浄又は変換
して回復させる手段を適時実施すれば、酸素電極
の感度を常に一定な状態に維持することが可能と
なる。

次に基質分析装置全体のシステム校正を行うに
は、電磁弁９′を一定短時間操作して一定量の基
質標準溶液１１を緩衝液１の流れに導入する。基
質標準溶液１１中の一定量のグルコースは酸素反
応器４で緩衝液中の溶存酸素の一定量を消費し、
その溶存酸素量の変化が酸素電極５で検知され
る。もし酵素反応器４中の担体に固定化されてい
るグルコースオキシターゼが劣化した場合は(1)式
で示す接触反応が完全に行われないので、同一量
のグルコースを導入しても消費される溶存酸素量
が異なり同一値を表示しないことになる。酵素反
応器４中の充填物は比較的長期間使用するもので
あるがこれを変換したり、或いは異種の基質を分
析するために異なる酵素反応器と交換した場合は
装置全体としての校正を行う必要がある。このよ
うな場合の装置全体としての校正を行うのがシス
テム校正器１２で、システム校正器１２には増幅
器７の増幅度を調節するための回路を備えてい
る。したがつて、酵素反応器４の変化又は装置全
体としての条件が変化した場合でも、同じ基質量
を導入したときに同一表示値を得るように校正す
ることが可能である。

このように本実施例の装置は、酸素電極と、酵
素反応器との性能を別々に確認して別個に校正す
ることができるので、この基質分析装置を高精度
の分析可能な状態に管理することができる。

以上本実施例のフローセル形酵素利用基質分析
装置は、緩衝液流路の酵素反応器上流側に還元剤
溶液と基質標準溶液の定量導入手段を設けると共
に、緩衝液の流速によつて変動する酸素電極の感
度を校正する機能を有する制御部と、増幅器の増
幅度を調整することによつて、装置全体の感度校
正をおこなうシステム校正器を設けることによつ
て、高精度の基質分析を行うことができるという
効果をもつている。

上記実施例は試料液中のグルコースを分析する
場合の装置について主として説明したが、コレス
テロールを分析する場合はコレストロールを選択
的に酸化させる酵素を固定化した充填材を収容し
た酵素反応４を用いると共に、既知濃度のコレス
テロール溶液を基質標準溶液１１とし、緩衝液の
流速と感度補正係数との関係を求めることによつ
て、コレステロールの分析の場合も同様に高精度
の分析が可能となる。また、他の基質についても
同様である。なお、第６図の装置においては送液
ポンプ２を緩衝液流路の最後に設置したが、試料
導入部３と電磁弁９′との間に設置しても良い。

以上説明したように、本発明による感度校正機
構を備えた酵素利用分析装置は、緩衝液の流速の
変化によつておこる酸素電極の感度変動を校正す
ることができるので、常に高精度の分析を行うこ
とができるという効果をもつている。

【図面の簡単な説明】

第１図はフローセル形酵素利用基質分析装置の
測定原理を示す系統図、第２図は緩衝液流に流入
したグルコース量と感度（酸素消費量）との関係
を示す線図、第３図は緩衝液の流速と感度との関
係を示す線図、第４図は第３図のＳ点の感度を１
としたときの緩衝液の流速と感度補正係数との関
係を示す線図、第５図は注入したグルコース量と
感度との関係を示す線図、第６図は本発明の一実
施例であるフローセル形酵素利用基質分析装置の
系統図である。 １……緩衝液、２……送液ポンプ、３……試料
注入部、４……酵素反応器、５……酸素電極、６
……フローセル、７……増幅器、８……表示装
置、９，９′……電磁弁、１０……還元剤溶液、
１１……基質標準溶液、１２……システム校正
器、１３……制御部、１４……流量計。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 送液ポンプによつて流通される緩衝液の流路
   に上流側より順に試料注入部、固定化した酵素を
   備えた酵素反応器およびフローセルを設置し、上
   記フローセルに装置された酵素電極よつて上記緩
   衝液中の溶存酸素量の変化を検知する酵素利用分
   析装置において、上記流路の上記酵素反応器より
   上流側に設けられ緩衝液中の溶存酸素と結合し得
   る還元剤の溶液を供給する導入部と、上記流路に
   設けられ上記緩衝液の流速を測定する流速計と、
   上記酸素電極の出力信号に応じて感度を校正する
   機能と演算する機能を有する制御部とを設け、上
   記導入部から還元剤溶液の一定量の導入に伴つて
   上記流速計からの信号に対応して流速に応じた感
   度補正係数を求め、上記酸素電極からの出力信号
   に乗ずるように構成したことを特徴とする酵素利
   用分析装置。