JPS6071944A - 酵素活性測定装置 - Google Patents
酵素活性測定装置Info
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- JPS6071944A JPS6071944A JP58179119A JP17911983A JPS6071944A JP S6071944 A JPS6071944 A JP S6071944A JP 58179119 A JP58179119 A JP 58179119A JP 17911983 A JP17911983 A JP 17911983A JP S6071944 A JPS6071944 A JP S6071944A
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- JP
- Japan
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- enzyme
- reaction
- column
- activity
- electrode
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- Pending
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
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- Genetics & Genomics (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の技術分野〕
本発明は電気化学的手法を用い１本の電極を備えた１つ
の測定系で固定化酵素カラムを組み合せた酵素活性測定
装置に関するものである。
の測定系で固定化酵素カラムを組み合せた酵素活性測定
装置に関するものである。
従来、酵素活性の測定は、ある酵素を含む試料液と、そ
の酵素の基質を含む溶液と、更に他の酵素、補酵素およ
び発色試薬等を添加してなる反応系において、酵素作用
によ如酵素基質に化学反応を行なわせ、そのときの反応
系の吸光度を測定する方法で行なわれていた。
の酵素の基質を含む溶液と、更に他の酵素、補酵素およ
び発色試薬等を添加してなる反応系において、酵素作用
によ如酵素基質に化学反応を行なわせ、そのときの反応
系の吸光度を測定する方法で行なわれていた。
例えばＧＰＴの酵素活性を測定する場合、ＧＰＴをその
基質と接触させ、該ＧＰＴの酵素作用によりピルビン酸
を生成し、そのピルビン酸をＬＤＨの酵素作用によって
還元する。このとき、この反応系に所定濃度のニコチン
酸アミドアテニンヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を共存させ
ておくと、時間の経過とともに該ＮＡＤＨが減少し、そ
の濃度が低下する。
基質と接触させ、該ＧＰＴの酵素作用によりピルビン酸
を生成し、そのピルビン酸をＬＤＨの酵素作用によって
還元する。このとき、この反応系に所定濃度のニコチン
酸アミドアテニンヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を共存させ
ておくと、時間の経過とともに該ＮＡＤＨが減少し、そ
の濃度が低下する。
その濃度変化は波長３４０ｍＫおけるＮＡＤＨの吸光度
測定から知ることができる。従って間接的にＧＰＴの酵
素活性を測定できることになる。
測定から知ることができる。従って間接的にＧＰＴの酵
素活性を測定できることになる。
しかしながら、この吸光度測定法にあっては、ＮＡＤＨ
，ＬＤＨｌあるいは各種の発色試薬など高価な試薬を必
要とし、しかもこれら試薬を測定後、廃棄せざるを得な
いため測定コストが高い。また懸濁物を含む反応系に対
しては吸光度測定が不可能と表るため、それらの試料を
測定する場合、予め懸濁物の除去など前処理を必要とす
る。
，ＬＤＨｌあるいは各種の発色試薬など高価な試薬を必
要とし、しかもこれら試薬を測定後、廃棄せざるを得な
いため測定コストが高い。また懸濁物を含む反応系に対
しては吸光度測定が不可能と表るため、それらの試料を
測定する場合、予め懸濁物の除去など前処理を必要とす
る。
このような吸光度測定の欠点を解決するために電気化学
的測定法を応用した装置が従来、提案されている（特開
昭５６−９７８６４号参照）。
的測定法を応用した装置が従来、提案されている（特開
昭５６−９７８６４号参照）。
この装置は、試料中の酵素が関与して生成もしくは消滅
する物質（検知物質）に作用する酵素を固定した膜を添
着した酵素電極を２本相互に離間して配置したフローシ
ステムである。この装置では、試料中に当初から含まれ
ていた検知物質の与える電気信号をベース値とし、更に
試料中の酵素の作用によって、該酵素の活性に対応して
生成若しくは消滅した物質（検知物質）の与える電気信
号を測定し、ベース値との差から試料中の酵素の活性を
測定するものである。
する物質（検知物質）に作用する酵素を固定した膜を添
着した酵素電極を２本相互に離間して配置したフローシ
ステムである。この装置では、試料中に当初から含まれ
ていた検知物質の与える電気信号をベース値とし、更に
試料中の酵素の作用によって、該酵素の活性に対応して
生成若しくは消滅した物質（検知物質）の与える電気信
号を測定し、ベース値との差から試料中の酵素の活性を
測定するものである。
しかしながら、この装置では２本の酵素電極を用いてベ
ース値と測定値を測定するため、両者の出力調整が難し
く、また操作が極めて煩雑である。
ース値と測定値を測定するため、両者の出力調整が難し
く、また操作が極めて煩雑である。
すなわち、感度、応答速度、ゲイン等の電極特性が、両
電極において同じでなく、またその特性の経時変化も同
一でないため、測定時において両電極の出力調整を行な
っても、得られた検量線の直線性、直線領域に相違があ
シ、測定誤差を生じることかあった。またフローシステ
ムの液流路内に２本の電極を相互に離間して配置しであ
るので、液流路内で試料の拡散に基づく希釈現象が発生
し、下流の電極位置では検知物質の濃度が低下し、特に
低活性の酵素を含む微量試料の場合には、両電極の出力
調整、差動増幅時にあっては、その調整は極めて困難と
なる。
電極において同じでなく、またその特性の経時変化も同
一でないため、測定時において両電極の出力調整を行な
っても、得られた検量線の直線性、直線領域に相違があ
シ、測定誤差を生じることかあった。またフローシステ
ムの液流路内に２本の電極を相互に離間して配置しであ
るので、液流路内で試料の拡散に基づく希釈現象が発生
し、下流の電極位置では検知物質の濃度が低下し、特に
低活性の酵素を含む微量試料の場合には、両電極の出力
調整、差動増幅時にあっては、その調整は極めて困難と
なる。
また、液流路内に酵素基質含有緩衝液を一定の流速で流
し、ここに試料液を注入し、両者が流路内を流れる間に
酵素と基質とを接触させて、酵素作用によシ減少若しく
は増加した検知物質の与える電気信号を下流に配設した
電極で検出して酵素の活性を測定する装置も提案されて
いる（特公昭５６−９２４４５．９２４４６号参照）。
し、ここに試料液を注入し、両者が流路内を流れる間に
酵素と基質とを接触させて、酵素作用によシ減少若しく
は増加した検知物質の与える電気信号を下流に配設した
電極で検出して酵素の活性を測定する装置も提案されて
いる（特公昭５６−９２４４５．９２４４６号参照）。
しかしながらこの装置では、試料注入口と電極間の液流
路は酵素と基質の反応の場であるため、長い反応時間を
必要とする低活性酵素の場合は液流路が長くなる。また
、流路が長くなれば、注入した試料の流路での希釈が進
み、その結果、試料注入量を増すか、よシ流路を長くし
て反応時間を長くしなければならないという不都合が生
じる。
路は酵素と基質の反応の場であるため、長い反応時間を
必要とする低活性酵素の場合は液流路が長くなる。また
、流路が長くなれば、注入した試料の流路での希釈が進
み、その結果、試料注入量を増すか、よシ流路を長くし
て反応時間を長くしなければならないという不都合が生
じる。
またこれとは別に１本の電極を用いて酵素活性を測定す
る装置も提案されている（特開昭５６−９２４４５号参
照）。すなわち、一定流速で溶液流路内を７０−セルに
向って流れる基質溶液に所定量の酵素試料溶液を注入し
、該流路内で両者の反応を進行せしめ、そのときの酵素
の作用によシ生成若しくは消滅する検知物質の濃度変化
を１本の電極で電気信号として測定する装置である。
る装置も提案されている（特開昭５６−９２４４５号参
照）。すなわち、一定流速で溶液流路内を７０−セルに
向って流れる基質溶液に所定量の酵素試料溶液を注入し
、該流路内で両者の反応を進行せしめ、そのときの酵素
の作用によシ生成若しくは消滅する検知物質の濃度変化
を１本の電極で電気信号として測定する装置である。
しかし々から、この場合、試料溶液中に測定対象とする
酵素以外の電極感応物質が予め含有されていると電極は
該物質にも感応し、その濃度を電気信号として検出する
ので、予め含有されている電極感応物質濃度に相当する
誤差を生じ、酵素の活性測定が不正確になる欠点があっ
た。
酵素以外の電極感応物質が予め含有されていると電極は
該物質にも感応し、その濃度を電気信号として検出する
ので、予め含有されている電極感応物質濃度に相当する
誤差を生じ、酵素の活性測定が不正確になる欠点があっ
た。
また、これら従来の活性測定装置はいずれも種種の酵素
活性を夫々別個の装置により測定するものであシ装置が
大型化してしまう、付属品のコストが高い、装置の操作
が煩雑である、などの問題があった。
活性を夫々別個の装置により測定するものであシ装置が
大型化してしまう、付属品のコストが高い、装置の操作
が煩雑である、などの問題があった。
本発明は、従来の欠点を改善し１本の電極を用いた電気
化学的手法にょシ、数種の酵素活性を１つの測定系で測
定でき、装置の簡略化を図ると共に測定操作が容易で安
価な酵素活性測定装置を提供するものである。
化学的手法にょシ、数種の酵素活性を１つの測定系で測
定でき、装置の簡略化を図ると共に測定操作が容易で安
価な酵素活性測定装置を提供するものである。
本発明は酵素の作用によって生成した物質を１つ又は数
種のカー） ＩＪッジタイプの固定化酵素カラムを通過
させることで最終的に酵素減少又は過酸化水素生成の反
応系に置換して、１本の酸素又は過酸化水素電極で酸素
減少量又は過酸化水素生成量を測定することによシ酵素
活性を計測することを特徴とした装置である。
種のカー） ＩＪッジタイプの固定化酵素カラムを通過
させることで最終的に酵素減少又は過酸化水素生成の反
応系に置換して、１本の酸素又は過酸化水素電極で酸素
減少量又は過酸化水素生成量を測定することによシ酵素
活性を計測することを特徴とした装置である。
即ち本発明装置は、試料液供給部及び酵素基質含有液供
給部から供給される試料液及び酵素基質含有液を反応さ
せる反応部；と試料と酵素基質が反応して生成した反応
生成物を酸素減少又は過酸化水素生成の系にまで置換す
るような該反応部の後方に接続した１つ以上の各種固定
化酵素カラム；と減少した酸素量又は生成した過酸化水
素量を計測する為の該固定化酵素カラムの後方に接続し
た１本の酸素又は過酸化水素電極から構成されてｂる。
給部から供給される試料液及び酵素基質含有液を反応さ
せる反応部；と試料と酵素基質が反応して生成した反応
生成物を酸素減少又は過酸化水素生成の系にまで置換す
るような該反応部の後方に接続した１つ以上の各種固定
化酵素カラム；と減少した酸素量又は生成した過酸化水
素量を計測する為の該固定化酵素カラムの後方に接続し
た１本の酸素又は過酸化水素電極から構成されてｂる。
本発明においての１つ以上の各種固定化酵素カラムとは
試料と酵素基質が反応して生成した反応生成物を順次分
解して酸素減少又は過酸化水素生成の系へ導いていく反
応生成物の違いによって組み合せ可変なカートリッジタ
イプの固定化酵素カラムのことである。
試料と酵素基質が反応して生成した反応生成物を順次分
解して酸素減少又は過酸化水素生成の系へ導いていく反
応生成物の違いによって組み合せ可変なカートリッジタ
イプの固定化酵素カラムのことである。
さらにこの固定化酵素カラムは、例えば酵素を固定化し
たガラス粒子又はゲルなどをカラムに詰める、カラム（
ガラスチューブ・ナイロンチューブ）に酵素を直接固定
化する、匁どが考えられ、フロータイブで各カラムが接
続可能なものなら何れのものでも良い。
たガラス粒子又はゲルなどをカラムに詰める、カラム（
ガラスチューブ・ナイロンチューブ）に酵素を直接固定
化する、匁どが考えられ、フロータイブで各カラムが接
続可能なものなら何れのものでも良い。
本発明を用いて各酵素活性を測定する方法についてその
原理を簡単に一例をとって説明する。
原理を簡単に一例をとって説明する。
ＣＰＫ （クレアチニンフォスフォキナーゼ）活性、Ｇ
ＯＴ （グルタミン酸オキサル酢酸トランスアミナーゼ
）活性測定の場合 ＣＰＫ ピルビン酸キナーゼ（Ｐ Ｋ） ＡＤＰ＋ホスホエノールピルビン酸 ＡＴＰ＋ピルビン酸 ピルビン酸オキシダーゼ（ｐｏｐ） ピルビン酸＋几ＰＯ４＋０２ 酢酸子〇Ｈ，０ＰＯｓＨｘ ＋ＣＯ２＋Ｈ２０ｇＯＴ ＋レーグルタミン酸 ＋ＣＯ。
ＯＴ （グルタミン酸オキサル酢酸トランスアミナーゼ
）活性測定の場合 ＣＰＫ ピルビン酸キナーゼ（Ｐ Ｋ） ＡＤＰ＋ホスホエノールピルビン酸 ＡＴＰ＋ピルビン酸 ピルビン酸オキシダーゼ（ｐｏｐ） ピルビン酸＋几ＰＯ４＋０２ 酢酸子〇Ｈ，０ＰＯｓＨｘ ＋ＣＯ２＋Ｈ２０ｇＯＴ ＋レーグルタミン酸 ＋ＣＯ。
ピルビン酸オキシダーゼ（ＰＯＰ）
ピルビン酸＋ＨＢ Ｐ ０４ ＋ ０２酢酸＋ＣＨｓＯ
ＰＯａＨｚ ＋ＣＯｘ ＋ Ｈ２０ｇ基質と反応したＣ
ＰＫは、固定化ＰＫカラムさらに固定化ＰＯＰカラムを
通過することにより最終的に溶液中に酸素濃度の減少若
しくは過酸化水素濃度の増加をひきおこす。この酸素濃
度若しくは過酸化水素濃度の変化を酸素若しくは過酸化
水素電極で測定することによりＣＰＫの活性を調べるこ
とができる。さらに、ＧＯＴの活性を測定する為には固
定化ＰＫカラムを固定化ＯＡＣカラムと取シ変えること
によって基質と反応し九ＧＯＴは、固定化ＯＡＣカラム
さらに固定化ＰＯＰカラムを通過することにより最終的
に溶液中に酸素濃度の減少若しくは過酸化水素濃度の増
加をひきおこしこの変化を酸素又は過酸化水素電極で測
定することによりＧＯＴの活性を調べることができる。
ＰＯａＨｚ ＋ＣＯｘ ＋ Ｈ２０ｇ基質と反応したＣ
ＰＫは、固定化ＰＫカラムさらに固定化ＰＯＰカラムを
通過することにより最終的に溶液中に酸素濃度の減少若
しくは過酸化水素濃度の増加をひきおこす。この酸素濃
度若しくは過酸化水素濃度の変化を酸素若しくは過酸化
水素電極で測定することによりＣＰＫの活性を調べるこ
とができる。さらに、ＧＯＴの活性を測定する為には固
定化ＰＫカラムを固定化ＯＡＣカラムと取シ変えること
によって基質と反応し九ＧＯＴは、固定化ＯＡＣカラム
さらに固定化ＰＯＰカラムを通過することにより最終的
に溶液中に酸素濃度の減少若しくは過酸化水素濃度の増
加をひきおこしこの変化を酸素又は過酸化水素電極で測
定することによりＧＯＴの活性を調べることができる。
この他同様な原理で反応式中で次のような○で囲っであ
る酵素を固定化カラムにして、目的の酵素活性を測定す
るときに組み変えれば１つの測定系で種々の酵素活性が
測定するととができる。
る酵素を固定化カラムにして、目的の酵素活性を測定す
るときに組み変えれば１つの測定系で種々の酵素活性が
測定するととができる。
ＰＴ
＋Ｌ−グルタミン酸
十ＣＨ３０ＰＯ３Ｈ２＋ ＣＯ□十Ｈ２０゜ＤＨ
酢酸＋ＣＨ，ＯＰＯｍＨｎ＋ＣＯ□＋Ｈ８０゜α−ＡＭ
Ｙ Ｄ−グルコース ＋ Ｈ＊０＋ ＡＰ Ｌ−ロイシル−Ｐ−ヒドロキシフェネテルア≧ド十Ｈｔ
ＯＡＰ −）Ｌ−ロイシン＋Ｐ−ヒドロキシ７エネチルアミンア
ルデヒド十ＮＨｓ ＋ ＨｇＯ□ ＣＨＥ グルコン酸＋Ｈ！０２ 次に本発明装置の一例を第１図を参照して説明する。１
は反応部で酵素を含む試料液の供給部２及び酵素基質を
含む酵素基質含有液の供給部３がそれぞれ独立して配管
１０’ 、 １０”を介して接続されていて、それぞれ
からは注入用定量ポンプ８１゜Ｂｌｌ＋によって試料液
及び酵素基質含有液が反応部１に所定量供給され、とこ
では両者はマグネティクスターラーによって混合、接触
される。このとき酵素反応は最適なＰＨ，温度、基質濃
度などの条件で行なわれる。４は、カートリッジタイプ
の固た物質を最終的に溶液中の酸素濃度の減少若しくは
、過酸化水素濃度の増加をひきおこすような固定化酵素
カラムの組み合せになっている。さらにこの固定化酵素
カラム４の流路後方に７０−セルに組み込まれた酵素若
しくは過酸化水素電極５が接続されておシ、４の固定化
酵素カラムを通過して酵素濃度の減少若しくは過酸化水
素濃度の増加がおこっている溶液を測定し計測部９で処
理され演算されて酵素活性値が表示される。
Ｙ Ｄ−グルコース ＋ Ｈ＊０＋ ＡＰ Ｌ−ロイシル−Ｐ−ヒドロキシフェネテルア≧ド十Ｈｔ
ＯＡＰ −）Ｌ−ロイシン＋Ｐ−ヒドロキシ７エネチルアミンア
ルデヒド十ＮＨｓ ＋ ＨｇＯ□ ＣＨＥ グルコン酸＋Ｈ！０２ 次に本発明装置の一例を第１図を参照して説明する。１
は反応部で酵素を含む試料液の供給部２及び酵素基質を
含む酵素基質含有液の供給部３がそれぞれ独立して配管
１０’ 、 １０”を介して接続されていて、それぞれ
からは注入用定量ポンプ８１゜Ｂｌｌ＋によって試料液
及び酵素基質含有液が反応部１に所定量供給され、とこ
では両者はマグネティクスターラーによって混合、接触
される。このとき酵素反応は最適なＰＨ，温度、基質濃
度などの条件で行なわれる。４は、カートリッジタイプ
の固た物質を最終的に溶液中の酸素濃度の減少若しくは
、過酸化水素濃度の増加をひきおこすような固定化酵素
カラムの組み合せになっている。さらにこの固定化酵素
カラム４の流路後方に７０−セルに組み込まれた酵素若
しくは過酸化水素電極５が接続されておシ、４の固定化
酵素カラムを通過して酵素濃度の減少若しくは過酸化水
素濃度の増加がおこっている溶液を測定し計測部９で処
理され演算されて酵素活性値が表示される。
溶液注入部６は７の溶液供給部からｇの定量ポンプで４
の固定化ＯＡＣカラム方向へ供給している流路に１の反
応液部から定量ポンプ８で流路１０を通如送液されてく
る反応液を注入する働きをもつ部分である。
の固定化ＯＡＣカラム方向へ供給している流路に１の反
応液部から定量ポンプ８で流路１０を通如送液されてく
る反応液を注入する働きをもつ部分である。
溶液供給部には電極、流路の洗浄液又はＰＨ調整緩衝液
をいれて用いることができる。定量ポンプ８，８’、８
”、８”としては、プランジャータイプ。
をいれて用いることができる。定量ポンプ８，８’、８
”、８”としては、プランジャータイプ。
ペリスタタイプなどのものをあげることができる。
本発明は、つぎのようにして操作される。
まず、定量ポンプＢｌｌ 、 Ｂａ１１を作動して試料
液供給部２から酵素を含む試料溶液を基質含有液供給部
３からは酵素反応の最適条件になるように調整した基質
含有液をそれぞれ所定量反応部１に注入し所定の時間両
者を接触・反応させ、得られた反応液を定量ポンプ８に
よって所定量溶液注入部６へ注入して定量ポンプ８′に
よって７の溶液供給部から送液されてくる溶液と供に４
の固定化酵素カラム内へ送液されさらに５の７０−セル
に組み込まれた電極に送液されて、電気信号（ペース信
号）を得る。
液供給部２から酵素を含む試料溶液を基質含有液供給部
３からは酵素反応の最適条件になるように調整した基質
含有液をそれぞれ所定量反応部１に注入し所定の時間両
者を接触・反応させ、得られた反応液を定量ポンプ８に
よって所定量溶液注入部６へ注入して定量ポンプ８′に
よって７の溶液供給部から送液されてくる溶液と供に４
の固定化酵素カラム内へ送液されさらに５の７０−セル
に組み込まれた電極に送液されて、電気信号（ペース信
号）を得る。
ついで反応部１で酵素と基質との反応を継続させながら
この反応液を所定の時間間隔を置いて定量ポンプ８によ
シ流路１０を通して所定量溶液注入部６へ注入して４の
固定化酵素カラムを通シ５のフローセルに組み込まれた
電極へ通じる。
この反応液を所定の時間間隔を置いて定量ポンプ８によ
シ流路１０を通して所定量溶液注入部６へ注入して４の
固定化酵素カラムを通シ５のフローセルに組み込まれた
電極へ通じる。
このクローセルに組み込まれた酸素又は過酸化水素電極
は酵素と基質の反応生成物が固定化酵素カラム内で溶液
中の酸素消費又は過酸化水素生成へと変換され、この変
化を電気信号として検知するものであり、この電気信号
は計測部９で計測される。よってこれらの所定の時間間
隔をおいて得られる信号とベース信号との差は酸素又は
過酸化水素の濃度の時間あたシの変化量（濃度変化速度
）となる。
は酵素と基質の反応生成物が固定化酵素カラム内で溶液
中の酸素消費又は過酸化水素生成へと変換され、この変
化を電気信号として検知するものであり、この電気信号
は計測部９で計測される。よってこれらの所定の時間間
隔をおいて得られる信号とベース信号との差は酸素又は
過酸化水素の濃度の時間あたシの変化量（濃度変化速度
）となる。
したがって、酸素又は過酸化水素の濃度変化速度と試料
である酵素活性量との関係を検量線として作成しておけ
ば電極からの電気信号から酵素活性が測定できるととＫ
なる。
である酵素活性量との関係を検量線として作成しておけ
ば電極からの電気信号から酵素活性が測定できるととＫ
なる。
そして酵素と基質の反応生成物が酸素又は過酸化水素の
濃度変化へ導くような固定化酵素カラムの組み合せによ
って種々の酵素活性が、１つのフローシステムで測定で
きるようになるのである。
濃度変化へ導くような固定化酵素カラムの組み合せによ
って種々の酵素活性が、１つのフローシステムで測定で
きるようになるのである。
実施例１
第１図の装置によってクレアチニンフォス７オキナーゼ
（ＣＰＫ）とグルタミン酸オキサル酢酸トランスアシナ
ーゼ（ＧＯＴ）の酵素活性を測定した。
（ＣＰＫ）とグルタミン酸オキサル酢酸トランスアシナ
ーゼ（ＧＯＴ）の酵素活性を測定した。
装置における全配管系は、内径１霞のテフロンの管で構
成した。
成した。
固定化酵素カラムは、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、オ
キサル酢酸脱炭酸酵素（ＯＡＣ） 、ピルビン酸オキシ
ダーゼ（ＰＯＰ）の酵素を、それぞれアミン基ヲモッテ
イるガラスピーズ（８０−１２０ｍｅＳｈ）に１チグル
タルアルデヒドを用いて固定化してカートリッジタイプ
のカラム（２ｍφＸ ２ ｃｍ ）に詰めてそれぞれ作
製した。
キサル酢酸脱炭酸酵素（ＯＡＣ） 、ピルビン酸オキシ
ダーゼ（ＰＯＰ）の酵素を、それぞれアミン基ヲモッテ
イるガラスピーズ（８０−１２０ｍｅＳｈ）に１チグル
タルアルデヒドを用いて固定化してカートリッジタイプ
のカラム（２ｍφＸ ２ ｃｍ ）に詰めてそれぞれ作
製した。
まずＣＰＫを測定する際には、固定化ＰＫカラムと固定
化ＰＯＰカラムを流路にはめこみ４．０．１μＫＨ２Ｐ
０４ Ｎ ａ ＯＨ緩衝液に０．０１ｍＭフラピ／ア
デニンジタクレオキド（ＰＡＤ） 、５ｍ Ｍ硫酸マグ
ネシウム、Ｑ、２ｍＭチアミンピロリン酸を添加した溶
液を溶液供給部７から定量ポンプ８′を用いて０．５ｍ
Ｌ／ｍｉｎ で送液した。０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ
７，０）に５０ｍ Ｍクレアチニン、５ｍＭ ＡＴＰ。
化ＰＯＰカラムを流路にはめこみ４．０．１μＫＨ２Ｐ
０４ Ｎ ａ ＯＨ緩衝液に０．０１ｍＭフラピ／ア
デニンジタクレオキド（ＰＡＤ） 、５ｍ Ｍ硫酸マグ
ネシウム、Ｑ、２ｍＭチアミンピロリン酸を添加した溶
液を溶液供給部７から定量ポンプ８′を用いて０．５ｍ
Ｌ／ｍｉｎ で送液した。０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ
７，０）に５０ｍ Ｍクレアチニン、５ｍＭ ＡＴＰ。
ｌＱｍＭ メルカプトエタノール、フォス７オエノール
ピルビン酸５０ｍＭ を添加した溶液が基準含有液供給
部３から５００μを反応部１に注入され、同時にＣＰＫ
含有の試料液２５０μｔを注入して両者を３７℃でマグ
ネティクスターラーで攪拌・混合した。
ピルビン酸５０ｍＭ を添加した溶液が基準含有液供給
部３から５００μを反応部１に注入され、同時にＣＰＫ
含有の試料液２５０μｔを注入して両者を３７℃でマグ
ネティクスターラーで攪拌・混合した。
２分ごとに５０μｔの混合反応液を定量ポンプ８により
溶液注入部６に注入して固定化酵素カラム内へ導入しさ
らに６の７０−セルに組み込まれた過酸化水素電極で電
気信号を数回測定し、過酸化水素生成変化量を９の計測
部よりめＣＰＫ活性を測定した。次にＧＯＴ活性を測定
するには、固定化ＰＫカラムと固定化ＯＡＣカラムを交
換して、基質溶液供給部３は０．１μリン酸緩衝液（Ｐ
Ｈ７，５）に０．１Ｍアスパラギン酸と３０ｍＭα−ヶ
ノーグルタル酸を添加した溶液に交換されＣＰＫ活性測
定と全く同様な方法でＧＯＴ活性を測定した。
溶液注入部６に注入して固定化酵素カラム内へ導入しさ
らに６の７０−セルに組み込まれた過酸化水素電極で電
気信号を数回測定し、過酸化水素生成変化量を９の計測
部よりめＣＰＫ活性を測定した。次にＧＯＴ活性を測定
するには、固定化ＰＫカラムと固定化ＯＡＣカラムを交
換して、基質溶液供給部３は０．１μリン酸緩衝液（Ｐ
Ｈ７，５）に０．１Ｍアスパラギン酸と３０ｍＭα−ヶ
ノーグルタル酸を添加した溶液に交換されＣＰＫ活性測
定と全く同様な方法でＧＯＴ活性を測定した。
測定はすべて３７℃で行なわれた。
コノ結果ＣＰＫは１０〜２００工ｖ／１ｌＧＯＴは２０
〜５００ Ｉ Ｖ／ｌ の範囲で良好か検量線を作成す
ることができた。
〜５００ Ｉ Ｖ／ｌ の範囲で良好か検量線を作成す
ることができた。
実施例２
第１図の装置によってアシラーゼ（α−ＡＭＹ）活性、
アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性。
アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性。
酸性７オスフアターゼ（ＡＣＰ）活性を測定した。
装置における全配管系は、内径１ｍの四沸化エチレンの
チューブを用いた。
チューブを用いた。
固定化酵素カラムは、α−グルコシダーゼ（マルターゼ
）、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）の酵素をそれぞ
れセファロースゲルにＣＮ Ｂ ｒ を用いて、従来の
方法で固定化してカートリッジタイプのカラム（２ｍφ
Ｘ ２ ｃｌＩｔ）に詰めてそれぞれ作製した。
）、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）の酵素をそれぞ
れセファロースゲルにＣＮ Ｂ ｒ を用いて、従来の
方法で固定化してカートリッジタイプのカラム（２ｍφ
Ｘ ２ ｃｌＩｔ）に詰めてそれぞれ作製した。
まずα−ＡＭＹ活性を測定するには固定化マルターゼカ
ラムと固定化ＧＯＤカラムを流路にはめこみ）４．０．
１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ６，５）を、溶液供給部７から
定量ポンプ８１を用いて０．６ｍＬ／ｍｉｎで送壬液し
た。溶液供給部の溶液は溶存酸素を一定にする為にマグ
ネテイツクスターラーを用いて攪拌した。０．１ Ｍ
ＩＪン酸緩衝液（ＰＨ６，０＞に可溶液性スターチ５９
ｍＭ、アミロース５ｏｍＭを添加した溶液が基質含有液
供給部３から４００μを反応部１に注入され、同時にα
−ＡＭＹ含有の試料液２００μｔを注入して両者を３７
℃でマグネテイツクスターラーで攪拌・混合した。
ラムと固定化ＧＯＤカラムを流路にはめこみ）４．０．
１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ６，５）を、溶液供給部７から
定量ポンプ８１を用いて０．６ｍＬ／ｍｉｎで送壬液し
た。溶液供給部の溶液は溶存酸素を一定にする為にマグ
ネテイツクスターラーを用いて攪拌した。０．１ Ｍ
ＩＪン酸緩衝液（ＰＨ６，０＞に可溶液性スターチ５９
ｍＭ、アミロース５ｏｍＭを添加した溶液が基質含有液
供給部３から４００μを反応部１に注入され、同時にα
−ＡＭＹ含有の試料液２００μｔを注入して両者を３７
℃でマグネテイツクスターラーで攪拌・混合した。
２分ごとに４０μｔの混合反応液を定量ポンプ８によシ
溶液注入部６に注入して固定化酵素カラム内へ導入し、
さらに６の７０−セルに組み込まれた酸素電極てい電気
信号を数回測定し、溶存酸素減少量の変化を９の計測部
よ請求めα−ＡＭＹ活性を測定した。
溶液注入部６に注入して固定化酵素カラム内へ導入し、
さらに６の７０−セルに組み込まれた酸素電極てい電気
信号を数回測定し、溶存酸素減少量の変化を９の計測部
よ請求めα−ＡＭＹ活性を測定した。
次にＡＬＰ活性及びＡＣＰ 活性を測定する為に固定化
マルターゼカラムを取シはずして固定化ＧＯＤカラムの
みにシステムを変えた。
マルターゼカラムを取シはずして固定化ＧＯＤカラムの
みにシステムを変えた。
基質溶液供給部３には０．１ Ｍ ） リスーＨＣ１緩
衝液に０．ＩＭＤ−グルコース−６−リン酸を添加し、
Ｐ Ｈ８，０に調製した溶液に交換して、α−ＡＭＹ活
性と全く同様な方法で測定した。さらにＡＣＰ活性は、
ＡＬＰ活性の基質溶液をｏ、 ＩＭ Ｄ−グルコース−
６−リン酸をゲニン酸−Ｎａ！ＨＰＯ４緩衝液に添加し
、Ｐ Ｈ５，０にしてα−ＡＭＹ活性と全く同様な方法
で測定した。測定は全て３７℃で行なった。
衝液に０．ＩＭＤ−グルコース−６−リン酸を添加し、
Ｐ Ｈ８，０に調製した溶液に交換して、α−ＡＭＹ活
性と全く同様な方法で測定した。さらにＡＣＰ活性は、
ＡＬＰ活性の基質溶液をｏ、 ＩＭ Ｄ−グルコース−
６−リン酸をゲニン酸−Ｎａ！ＨＰＯ４緩衝液に添加し
、Ｐ Ｈ５，０にしてα−ＡＭＹ活性と全く同様な方法
で測定した。測定は全て３７℃で行なった。
この結果α−ＡＭＹは４００ Ｉ Ｖ／ｌ で繰シ返し
再現性４．０％と良好な結果が得られＡＬＰ活性は、１
００〜５ｏＯＩＶ／ｚ ％ＡＣＰ活性１ｄ ｌ ００〜
５００ Ｎ／ｌの範囲で良好な検量線を作成することが
できた。
再現性４．０％と良好な結果が得られＡＬＰ活性は、１
００〜５ｏＯＩＶ／ｚ ％ＡＣＰ活性１ｄ ｌ ００〜
５００ Ｎ／ｌの範囲で良好な検量線を作成することが
できた。
以上の説明で明らかなように本発明装置は、１本の酸素
又は過酸化水素電極を用いた１つのシステムでカートリ
ッジタイプの固定化酵素カラムを交換することで種々の
酵素活性が測定でき電極の煩雑な調整作用が不要となる
と同時に、検知物質の変化速度を測定する為、試料液中
に予め含有されていた電極感応物質の影響を除去して精
度よく酵素活性が測定できるのでその工業的価値は大で
ある。
又は過酸化水素電極を用いた１つのシステムでカートリ
ッジタイプの固定化酵素カラムを交換することで種々の
酵素活性が測定でき電極の煩雑な調整作用が不要となる
と同時に、検知物質の変化速度を測定する為、試料液中
に予め含有されていた電極感応物質の影響を除去して精
度よく酵素活性が測定できるのでその工業的価値は大で
ある。
・ 第１図は本発明に係る装置の構成例を示す概要図。
１・・・反応部、２・・・試料液槽、３・・・基質液槽
、４・・・固定化酵素カラム、５・・・フローセルに組
ミ込まれた電極、６・・・反応液注入部、７・・・緩衝
液槽、Ｂ 、 ８１ 、８１１ 、 ｇｌｌ＋・・・定
量ポンプ、９・・・計測部。 代理人 弁理士 則 近 憲 佑（他１名）第 １ 図
、４・・・固定化酵素カラム、５・・・フローセルに組
ミ込まれた電極、６・・・反応液注入部、７・・・緩衝
液槽、Ｂ 、 ８１ 、８１１ 、 ｇｌｌ＋・・・定
量ポンプ、９・・・計測部。 代理人 弁理士 則 近 憲 佑（他１名）第 １ 図
Claims (1)
- 酵素とその基質溶液を反応させる反応槽部と、反応生成
物を分解し酸素減少又は過酸化水素を発生させる反応に
導くような酵素を固定化したカートリッジタイプの固定
化酵素カラム部と、酸素又は過酸化水素電極とを順次組
み合せたフロータイブからなる事を特徴とした酵素活性
測定装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58179119A JPS6071944A (ja) | 1983-09-29 | 1983-09-29 | 酵素活性測定装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58179119A JPS6071944A (ja) | 1983-09-29 | 1983-09-29 | 酵素活性測定装置 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6071944A true JPS6071944A (ja) | 1985-04-23 |
Family
ID=16060335
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58179119A Pending JPS6071944A (ja) | 1983-09-29 | 1983-09-29 | 酵素活性測定装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6071944A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100173399A1 (en) * | 2004-09-20 | 2010-07-08 | Sunho Biodiesel Corporation | Fuel production |
-
1983
- 1983-09-29 JP JP58179119A patent/JPS6071944A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100173399A1 (en) * | 2004-09-20 | 2010-07-08 | Sunho Biodiesel Corporation | Fuel production |
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