CN111398386A - 一种固定化酶电极、固定化酶传感器及其酶膜抗干扰的检测方法 - Google Patents

一种固定化酶电极、固定化酶传感器及其酶膜抗干扰的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种固定化酶电极、固定化酶传感器及其酶膜抗干扰的检测方法，属于生物传感器技术领域。本发明中所述固定化酶电极，包括检测电极和辅助电极；所述辅助电极包括依次连接的基础电极、固定化失活酶层和载体膜，所述固定化失活酶层固定的酶为失活的酶。本发明在样品测定时，测试检测电极和辅助电极基准值，由检测电极和辅助电极同时修正干扰所引起的信号的波动和变化，从而避免了由于酶膜“完整性”问题所造成的电极信号的干扰，提高测定准确性。

Description

一种固定化酶电极、固定化酶传感器及其酶膜抗干扰的检测 方法
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，尤其涉及一种固定化酶电极、固定化酶传感器及其酶膜抗干扰的检测方法。
背景技术
生物传感器是以生物分子识别为基础、以生物活性材料为敏感元件，通过适当的理化换能器及信号放大装置将被测物质的浓度转换为数字信号的检测仪器。其中，采用固定化酶膜的经典电流型酶电极是商品化最早、应用市场最大的生物传感器类型。
电流型酶电极多采用固定化氧化酶(葡萄糖氧化酶膜、乳酸氧化酶膜等)为识别元件、以H2O2基础电极为换能器。其显著优势是具有很高的选择性，被测样品中多种组分可以不经前处理分离就可直接测定。但由于样品来源不同，组分种类差别很大，特别是一些样品中残存的电活性组分会产生干扰信号，影响测定的准确性，如血液样品中微量的抗坏血酸、食品样品中残留的H2O2等对葡萄糖、乳酸等检测结果有干扰。
为避免样品中残存电活性组分的干扰，固定化酶电极中的酶膜采用了三层结构(图1)。以葡萄糖氧化酶(GOD)为例，有(1)固定化GOD酶膜包括聚碳酸酯微孔膜(载体膜)、(2)固定化酶层和(3)醋酸纤维素内膜三层膜。GOD固定在碳酸酯微孔膜上，样品中的葡萄糖和氧分子可透过聚碳酸酯微孔膜与GOD接触，发生催化反应，产生过氧化氢。过氧化氢透过醋酸纤维膜扩散到电极表面，产生电流。电流大小与样品中的葡萄糖浓度有比例关系。通常酶膜粘附在一个橡胶圈上，形成酶膜器件，便于储存和使用，也起到与反应池连接的密封作用，保持酶膜(内膜)的完整性是防止样品中电活性物质干扰的关键。
但在酶膜制备或运输、储藏、安装、使用过程中，可能会造成内膜的损伤、或不完整，形成内膜“泄露”，不能阻止小分子的电活性干扰物通过内膜扩散到电极表面，产生干扰。另外，有些食品样品中残存H2O2能穿过内膜，也造成结果偏差。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种固定化酶电极、固定化酶传感器及其酶膜抗干扰的检测方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
一种固定化酶电极，包括检测电极和辅助电极；所述辅助电极包括依次连接的基础电极、固定化失活酶层和载体膜，所述固定化失活酶层固定的酶为失活的酶。
优选的，所述检测电极包括依次连接的基础电极、醋酸纤维素膜、固定化酶层和载体膜。
优选的，所述载体膜为聚碳酸酯微孔膜。
优选的，所述检测电极包括葡萄糖氧化酶电极和/或乳酸酶氧化酶电极。
优选的，所述基础电极为过氧化氢电极。
本发明提供了一种固定化酶传感器，包括所述的固定化酶电极。
优选的，所述固定化酶电极中的检测电极和辅助电极分别安装在固定化酶反应器的反应池腔的不同侧面；所述检测电极、辅助电极的前端分别通过橡胶圈与反应池腔封闭连接；所述检测电极、辅助电极的后端分别通过电极导线与主机连接。
优选的，所述检测电极包括葡萄糖氧化酶电极和乳酸酶氧化酶电极。
本发明提供了一种固定化酶电极酶膜抗干扰的检测方法，包括以下步骤：
1)采用标准电极活性物的溶液进行电极内膜完整性测试，检测电极对标准电极活性物的电信号响应值为An，辅助电极对标准电极活性物的电信号响应值为A0；
2)采用标准品溶液进行定标；所述标准品溶液为包括确定浓度目标物质的溶液；
3)对样品进行检测，检测电极对样品的电信号响应值为Xn，辅助电极对样品的电信号响应值为X0，根据电信号响应值计算样品中目标物质的含量；样品中目标物质的含量＝Xn×(100/Sn)-(A0/An)×(100/Sn)；其中n为≥1的自然数。
优选的，所述标准电极活性物为亚铁氰化钾溶液，所述目标物质包括葡萄糖和乳酸。
本发明的有益效果：本发明提供一种固定化酶电极，包括检测电极和辅助电极；所述辅助电极包括依次连接的基础电极、固定化失活酶层和载体膜。本发明中辅助电极不包括醋酸纤维素内膜，并且所述固定化失活酶层固定的酶为失活的酶；在样品测定时，测试检测电极和辅助电极基准值，由检测电极和辅助电极同时修正干扰所引起的信号的波动和变化，从而避免了由于酶膜“完整性”问题所造成的电极信号的干扰，提高测定准确性。根据实施例记载，在加入电活性干扰物的实验样品中葡萄糖、乳酸含量的测定结果与未加干扰物的对照样品的两指标的测定结果无明显差异，即电活性干扰物的存在，对于本发明利用辅助电极的进行的抗干扰检测方法没有明显影响；说明本发明提供的固定化酶电极和抗干扰检测方法，检测结果准确，不受电活性干扰物质的影响，具有显著优势。
附图说明
图1为检测电极固定化酶膜与基础电极结构；
图2为实施例中固定化酶传感器的反应池及三电极结构，其中上图为主视图，下图为剖视图；其中1.反应池模块；2.反应池腔；3.酶膜的‘o’型圈；4.进样和废液流出通道；5.反应池顶帽；6.进样帽；7.进样光传感器；8.酶电极；9.酶电极旋钮；10.缓冲液进口和废液排空管；11.废液吸出管；12.电磁搅拌子；13.辅助酶电极；14.电极导线。
具体实施方式
本发明提供了一种固定化酶电极，包括检测电极和辅助电极；所述辅助电极包括依次连接的基础电极、固定化失活酶层和载体膜，所述固定化失活酶层固定的酶为失活的酶。
在本发明中，所述辅助电极包括依次连接的基础电极、固定化失活酶层和载体膜；所述载体膜优选为聚碳酸酯微孔膜，所述固定化失活酶层固定的酶为失活的酶，所述失活的酶优选的通过高温加热灭活。在本发明中，所述辅助电极不包括作为“内膜”的醋酸纤维素膜；所述辅助电极的作用为校正检测数据，排除电活性干扰物，提高检测结果的准确度。
在本发明中，所述检测电极包括依次连接的基础电极、醋酸纤维素膜、固定化酶层和载体膜。在本发明中，所述载体膜优选为聚碳酸酯微孔膜。在本发明中，所述检测电极的结构优选的如图1所示。
在本发明中，所述检测电极包括葡萄糖氧化酶电极和/或乳酸酶氧化酶电极，优选的包括葡萄糖氧化酶电极和乳酸酶氧化酶电极；当所述检测电极为葡萄糖氧化酶电极和乳酸酶氧化酶电极时，所述基础电极优选为过氧化氢电极。在本发明中，所述检测电极中的葡萄糖氧化酶电极和乳酸酶氧化酶电极的固定化酶层分别涂布有活性的葡萄糖氧化酶和乳酸酶氧化酶。
在本发明中，所述检测电极的载体膜前端还包括橡胶密封圈，所述检测电极通过所述橡胶密封圈与反应池密封连接。
本发明对所述检测电极和辅助电极的原料包括基础电极、醋酸纤维素膜、固定化酶层和载体膜的来源没有特殊限定，采用本领域常规的市售产品或自行制备获得。
本发明提供了一种固定化酶传感器，包括所述的固定化酶电极。在本发明中，所述固定化酶电极中的检测电极和辅助电极分别安装在固定化酶反应器的反应池腔的不同侧面；所述检测电极、辅助电极的前端分别通过橡胶圈与反应池腔封闭连接；所述检测电极、辅助电极的后端分别通过电极导线与主机连接。
在本发明中，所述固定化酶传感器的结构优选的如图2所示，其中1.反应池模块；2.反应池腔；3.酶膜的‘o’型圈；4.进样和废液流出通道；5.反应池顶帽；6.进样帽；7.进样光传感器；8.酶电极；9.酶电极旋钮；10.缓冲液进口和废液排空管；11.废液吸出管；12.电磁搅拌子；13.辅助酶电极；14.电极导线。
在本发明中，所述反应池模块优选的采用方形有机玻璃块制成；所述反应池在反应池模块模块的中心位置，所述反应池优选为一个圆柱形空腔，所述空腔的腔体积优选为300～500μL，更优选为400μL。在本发明中，所述反应池腔的底端设置有进液管，所述进液管兼作排液管；所述反应池的顶端设置有溢流腔和废液抽出管。在本发明中，所述反应池的腔底部设置有磁性搅拌子。在本发明中，当所述检测电极包括葡萄糖氧化酶电极和乳酸酶氧化酶电极时，所述葡萄糖氧化酶电极、乳酸酶氧化酶电极和辅助电极分别安装在固定化酶反应器的反应池腔的不同侧面；所述葡萄糖氧化酶电极、乳酸酶氧化酶电极和辅助电极的前端分别通过密封橡胶圈与反应池腔密封连接。
本发明还提供了一种固定化酶电极酶膜抗干扰的检测方法，包括以下步骤：1)采用标准电极活性物的溶液进行电极内膜完整性测试，检测电极对标准电极活性物的电信号响应值为An，辅助电极对标准电极活性物的电信号响应值为A0；2)采用标准品溶液进行定标；所述标准品溶液为包括确定浓度目标物质的溶液；3)对样品进行检测，检测电极对样品的电信号响应值为Xn，辅助电极对样品的电信号响应值为X0，根据电信号响应值计算样品中目标物质的含量，样品中目标物质的含量＝Xn×(100/Sn)-(A0/An)×(100/Sn)；其中n为≥1的自然数。
在本发明中，在所述固定化酶传感器使用之前，优选的将所述所述固定化酶传感器装于SBA生物传感分析仪中进行预处理；所述预处理包括接通电源、开机、开启清洗泵、排空泵，确保传感系统所需的pH值为7.0的缓冲液充满反应池，确保生物传感系统稳定。在本发明中，采用标准电极活性物的溶液进行电极内膜完整性测试，检测电极对标准电极活性物的电信号响应值为An，辅助电极对标准电极活性物的电信号响应值为A0。在本发明中，所述葡萄糖氧化酶电极对样品的电信号响应值为A1，所述乳酸氧化酶电极对样品的电信号响应值为A2。在本发明中，所述标准电极活性物优选为亚铁氰化钾溶液，所述亚铁氰化钾溶液的浓度优选为0.04～0.06mol/L，更优选为0.05mol/L；所述亚铁氰化钾溶液的体积优选为20～30μL，更优选为25μL。在本发明具体实施过程中，优选的将所述亚铁氰化钾置于反应池腔体内20～30s后，测定所述检测电极和辅助电极的电信号响应值。在本发明中，当所述检测电极产生电信号响应值时，说明检测电极的内膜不完整；根据辅助电极与检测电极对电极活性物质产生的信号比例关系，进行校正。
本发明在所述电极内膜完整性测试完成后，进行标准品的定标；当所述目标物质包括葡萄糖和乳酸时，所述标准品为葡萄糖和乳酸的混合溶液；在本发明中，所述标准品中葡萄糖的浓度优选为0.8～1.2mg/mL，更优选为1.0mg/mL；所述标准品中乳酸的浓度优选为0.8～1.2mg/mL，更优选为1.0mg/mL。在本发明中，将标准品置于反应池中，20s后检测电信号响应值。在本发明中，优选的连续测定3～5次，当连续两次测定的结果，葡萄糖氧化酶检测电极和乳酸氧化酶检测电极的响应值误差均≤1％，定标通过。
本发明在所述定标通过后，进行样品的检测。在本发明中，将所述样品置于反应池中，20s后检测电信号响应值。根据电信号响应值计算样品中目标物质的含量，样品中目标物质的含量＝Xn×(100/Sn)-(A0/An)×(100/Sn)；其中n为≥1的自然数。在本发明中，所述葡萄糖氧化酶电极对样品的电信号响应值为X1，所述乳酸氧化酶电极对样品的电信号响应值为X2；辅助电极对样品的电信号响应值为X0。
在本发明中，所述检测的次数优选为1～5次，更优选为3次；所述检测的电信号响应值优选为1～5次检测的平均值。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(1)酶电极制备：按图1结构制备葡萄糖氧化酶电极、乳酸氧化酶电极。辅助酶电极不涂布作为“内膜”的醋酸纤维素膜，且所用氧化酶经加热灭活。将三个电极按图2反应池结构安装后，装于SBA生物传感分析仪，接通电源，开机，开启清洗泵、排空泵，传感系统所需pH值为7.0缓冲液充满反应池，生物传感系统稳定。所述pH值为7.0缓冲液为0.1mmol磷酸缓冲液；常温保存，有效期为24个月。
(2)酶电极内膜完整测试：吸取25μL、0.05mol/L亚铁氰化钾注入反应池，20s反应结束，分别记录葡萄糖氧化酶电极、乳酸氧化酶电极、辅助酶电极所对应电信号，葡萄糖氧化酶电极电信号响应值为A1，乳酸氧化酶电极电信号响应值为A2，辅助电极电信号响应值为A0，重复三次，取平均值，
Figure BDA0002487624430000071
分别为15、18、138，以
Figure BDA0002487624430000072
分别作为葡萄糖电极内膜、乳酸电极内膜完整性及抗干扰性能指标。
(3)定标：准确吸取25μL葡萄糖(100mg/100ml)+乳酸(100mg/100ml)混合标准液注入反应池。20s反应结束后，仪器分别自动记录葡萄糖电极电信号值S1(1238)、乳酸电极电信号值S2(2146)、辅助电极电信号值A0(程序后台记录值并比对)。连续测定3～5次，连续两次进样葡萄糖电极响应值分别为S1(1220、1214)乳酸电极响应值分别为S2(2120、2099)，两电极响应值误差≤1％，定标通过。
表1电极定标检测结果
Figure BDA0002487624430000073
程序以最后一次电信号响应值测试标准值，本发明中葡萄糖电极S1、乳酸电极S2分别记为1214、2099。
(4)葡萄糖、乳酸样品测定：运行检测样品程序，定标通过后，向反应池中注入25μL含葡萄糖、乳酸底物的发酵液。20s反应结束，葡萄糖氧化酶电极对样品的响应值为X1，乳酸氧化酶电极对样品的响应值为X2，重复测定3次，通过如下公式：
Figure BDA0002487624430000074
Figure BDA0002487624430000075
计算并显示测定结果，结果如表2。
表2样品测定结果
Figure BDA0002487624430000081
实施例2
(1)按实施例1中(1)、(2)、(3)步骤所述，制备葡萄糖电极、乳酸电极以及辅助酶电极，并测试了两电极内膜抗干扰性能，后对仪器进行了定标。
(2)取实施例1中所述发酵液，分成等体积的两份，其中一份加入等体积，浓度为2g/L的葡萄糖、乳酸混合液，制成加标样品，另一份发酵液作为对照样品。
(3)运行检测样品程序，定标通过后，向反应池中注入25μL对照样品。经20s反应结束，仪器记录并显示电信号响应值，重复测定3次，得平均值
Figure BDA0002487624430000082
再次启动样品测定程序，注入25μL加标样品，由仪器记录并显示信号响应值，重复测定3次，得平均值
Figure BDA0002487624430000083
通过公式：
Figure BDA0002487624430000084
Figure BDA0002487624430000085
分别计算对照样品、加标样品中葡萄糖、乳酸含量，并计算加标回收率。结果如表3所示。
表3加标样品测定结果
Figure BDA0002487624430000091
实施例3
(1)按实施例1中(1)、(2)、(3)步骤所述，制备葡萄糖电极、乳酸电极以及辅助酶电极，测试两电极内膜抗干扰性能，标定仪器后待用。
(2)取实施例1中所述发酵液，分为三份，一份用作对照样品直接进行葡萄糖、乳酸含量测定。另两份分别加入抗坏血酸、H2O2等易残留的电活性干扰物，制备抗坏血酸、H2O2终浓度分别为50mg/100ml、20mg/100ml的实验样品，备用待测。
(3)运行检测样品程序，定标通过后，向反应池中注入25μL对照样品。经20s反应结束，仪器记录并显示电信号响应值，重复测定3次。再次启动样品测定程序，注入25μL实验样品，由仪器记录并显示信号响应值，重复测定3次。通过公式：
Figure BDA0002487624430000092
Figure BDA0002487624430000093
分别计算对照样品、实验样品中葡萄糖、乳酸含量，计算标准差，并通过t检验比较对照样品和实验样品的差异性，结果如表4所示。
表4电活性干扰物质对检测结果的影响
Figure BDA0002487624430000101
本实施例中，加入电活性干扰物的实验样品中葡萄糖、乳酸含量的测定结果与未加干扰物的对照样品的两指标的测定结果无明显差异，即电活性干扰物的存在，对于本发明通过添加辅助酶电极的抗干扰检测方法没有明显影响。
由上述实施例可知，本发明通过加入辅助酶电极，测试检测电极、辅助电极基准值，由两电极同时修正干扰所引起的信号的波动和变化，能够避免点活性干扰物质的干扰，提高检测的准确度。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种固定化酶电极，其特征在于，包括检测电极和辅助电极；所述辅助电极包括依次连接的基础电极、固定化失活酶层和载体膜，所述固定化失活酶层固定的酶为失活的酶。
2.根据权利要求1所述的固定化酶电极，其特征在于，所述检测电极包括依次连接的基础电极、醋酸纤维素膜、固定化酶层和载体膜。
3.根据权利要求1或2所述的固定化酶电极，其特征在于，所述载体膜为聚碳酸酯微孔膜。
4.根据权利要求1所述的固定化酶电极，其特征在于，所述检测电极包括葡萄糖氧化酶电极和/或乳酸酶氧化酶电极。
5.根据权利要求1或4所述的固定化酶电极，其特征在于，所述基础电极为过氧化氢电极。
6.一种固定化酶传感器，其特征在于，包括权利要求1～5任意一项所述的固定化酶电极。
7.根据权利要求6所述的固定化酶传感器，其特征在于，所述固定化酶电极中的检测电极和辅助电极分别安装在固定化酶反应器的反应池腔的不同侧面；所述检测电极、辅助电极的前端分别通过橡胶圈与反应池腔封闭连接；所述检测电极、辅助电极的后端分别通过电极导线与主机连接。
8.根据权利要求7所述的固定化酶传感器，其特征在于，所述检测电极包括葡萄糖氧化酶电极和乳酸酶氧化酶电极。
9.一种固定化酶电极酶膜抗干扰的检测方法，包括以下步骤：
1)采用标准电极活性物的溶液进行电极内膜完整性测试，检测电极对标准电极活性物的电信号响应值为An，辅助电极对标准电极活性物的电信号响应值为A0；
2)采用标准品溶液进行定标；所述标准品溶液为包括确定浓度目标物质的溶液；
3)对样品进行检测，检测电极对样品的电信号响应值为Xn，辅助电极对样品的电信号响应值为X0，根据电信号响应值计算样品中目标物质的含量，样品中目标物质的含量＝Xn×(100/Sn)-(A0/An)×(100/Sn)；其中n为≥1的自然数。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述标准电极活性物为亚铁氰化钾溶液，所述目标物质包括葡萄糖和乳酸。
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