CN101344502A - 一种葡萄酒苹果酸-乳酸发酵质量的测定方法 - Google Patents

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孙士青
杨俊慧
马耀宏
李雪梅
赵晓华
孟庆军
杨艳
王丙莲
张利群
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Abstract

本发明涉及一种葡萄酒苹果酸—乳酸发酵质量的测定方法，属生物传感器技术领域。制备方法是将L－乳酸氧化酶固定化后与H2O2电极结合构成L－乳酸酶电极生物传感器，采用0.1mmol.L－1pH 7.2的磷酸盐缓冲液，标准液含L－乳酸500mg.L－1，取标准液25μl注入反应池20s后仪器自动显示酶膜基础活性，按动定标键(Calibrate)定标500，自动清洗后即可测定样品。

Description

一种葡萄酒苹果酸-乳酸发酵质量的测定方法
所属领域
本发明涉及一种葡萄酒的分析测定方法。具体来说，本发明涉及一种对葡萄酒生产中的苹果酸-乳酸发酵液中成分的测定方法。
背景技术
苹果酸-乳酸发酵(malolactic fermentation简称MLF)是葡萄酒生产的酒精发酵结束后，葡萄酒在乳酸菌作用下将苹果酸二次发酵分解成乳酸和二氧化碳的过程：
Figure A20081013921300041
当葡萄酒中苹果酸含量较高时，葡萄酒口感酸涩、粗糙。经过苹果酸-乳酸发酵不仅可以降低生葡萄酒的酸涩和粗糙感，使之柔和、圆润，而且还能提高葡萄酒的感官质量和生物稳定性[1]。所以了解发酵过程中乳酸的变化是十分重要而且必须的。但乳酸的化学分析法一般要进行预分离、衍生化等繁琐的前处理，即使采用HPLC法(高效液相色谱法)分析一份样品也需要10 min以上[2]。
例如：郎永梅等(2006年)采用HPLC法(高效液相色谱法)检测苹果酸-乳酸发酵过程中乳酸、苹果酸含量，由于乳酸的出峰时间在3.83分钟、苹果酸的出峰时间在3.54分钟，两吸收峰相距不到0.5分钟，因峰距过近相互干扰难以消除；其次每次分析从层析柱稳定平衡、进样分析、冲洗再生一个循环至少需要12～15分钟，费时长、干扰重，无法根据结果来快速指导生产；
又如：张诗玲等(2007年)采用纸层析分离苹果酸-乳酸发酵液，用溴酚蓝丁醇液作显色剂层析分离后显色，观察乳酸斑点颜色、位置，该法虽简便易行、成本低廉，但无法准确定量，属于定性或半定量分析，更无法作为葡萄酒发酵生产中的调控依据。
酶电极分析法是将高度立体专一性的生物催化剂酶蛋白分子通过物理化学交联作用固定化做成固定化酶膜，然后与电化学传感器结合构成酶电极(enzyme electrode)用于分析的一项技术[3]，酶电极分析法集酶反应的高专一性、固定化酶的长期稳定性、电化学分析快速灵敏的特点于一体[4]。我国的乳酸酶电极研究始于20世纪80年代末，1990年国产的固定化乳酸酶膜达到实用化水平[5]，主要应用于运动医学的周期性耐力项目运动员血液中L-乳酸测定，以控制训练量[6]。后L-乳酸分析又逐步应用于发酵工业生产[7]。本文采用固定化L-乳酸氧化酶结合H2O2电极构成L-乳酸酶电极生物传感分析仪，用于葡萄酒发酵液中乳酸分析只需将样品稀释50倍即可测定，25秒自动显示、打印结果。
发明内容
为克服现有分析方法的不足，本发明提供一种葡萄酒苹果酸-乳酸发酵质量的测定方法，具体是采用酶电极型生物传感器法定量测定葡萄酒生产中苹果酸-乳酸发酵液中L-乳酸含量，用固定化酶技术将L-乳酸氧化酶(EC 1.1.1.26)制成固定化酶膜，结合过氧化氢型电极构成L-乳酸酶电极生物传感器，用于葡萄酒苹果酸-乳酸发酵液中L-乳酸的含量测定，从而方便、准确、快速地对葡萄酒的发酵质量进行测定。
技术方案
本发明提供的葡萄酒苹果酸-乳酸发酵质量的测定方法，包括下述顺序的步骤：
1固定化L-乳酸酶膜的制备
1.1载体膜圈制备
取直径10mm的核微孔膜片用环氧树脂粘贴在内径9.5mm的橡胶密封圈上，放置过夜使固化完全即得。
1.2载体膜圈表面处理
将载体膜圈置20％甲醇溶液中浸泡15 min，取出用蒸馏水冲净、晾干。
1.3固定化复合酶膜制备
取L-乳酸氧化酶0.1单位、20％牛血清白蛋白5μl、2％戊二醛2μl、均匀喷涂在载体膜圈表面，静置固化15 min，用蒸馏水洗去多余反应物，冷冻干燥即得。将此固定化酶膜装在过氧化氢电极头部便构成酶电极。
2固定化L-乳酸酶膜参数
基础活性＞50，线性：1～270mg/L；各点偏差小于1mg，响应：30s测定值大于60s测定值的90％，膜完整性：亚铁氢化钾测定值-2～6范围内，工作寿命＞25d。
3过氧化氢电极制备
两电极均为长20mm的圆柱体，铂电极表面积4mm2，银电极表面积60mm2，用专用模具置备。两电极之间填充环氧树脂，电极套头端与酶膜圈应嵌合良好，铂电极与酶膜须紧密接触(见附图1)，铂电极为正极；银电极为负极。两电极之间极化电压0.65V，酶电极输出电流0～500nA。
4 L-乳酸酶电极生物传感器结构
L-乳酸酶电极生物传感器由生化反应系统(一次仪表)和电信号处理系统(二次仪表)组成(见附图2)。
5.测定方法
仪器定标：采用0.1mmol·L-1pH7.2的磷酸盐缓冲液，标准液含L-乳酸500mg·L-1，取25μl标准液注入反应池，20s后仪器自动显示酶膜基础活性，按动定标键定标500mg·L-1，自动清洗后即可测定样品。
样品制备：取葡萄酒苹果酸-乳酸发酵溶液2ml，置50ml量瓶中加水适量使溶解，用水稀释至刻度，摇匀，即得，进样量25μl。
有益效果
用固定化L-乳酸氧化酶复合H2O2电极测定葡萄酒苹果酸-乳酸发酵溶液中L-乳酸含量是目前该分析领域最先进的测试手段，其先进性表现为：(1)与HPLC法相比具有方法简单、分析专一性好的优点，能测出单一L-乳酸含量，不受其它组分的干扰；(2)与常规酶法分析相比较，因为采用固定化技术将可溶性酶固定在电极头部反复使用，在测定过程中不会造成酶的流失，从而减低了酶法测定的成本；(3)采用H2O2电极为基础电极，较之pH电极和氧电极其基线电流更加稳定，分析精度高于其它方法。(4)采用酶电极法测定葡萄酒苹果酸-乳酸发酵溶液中的-乳酸含量，由于酶促反应专一性高、样品不需分离直接稀释50倍即可进样分析、处理条件温和、反应时间短暂结果较为可靠，适用于葡萄酒苹果酸-乳酸发酵过程中的L乳酸分析。
附图说明
附图1是L-乳酸酶电极结构示意图；其中：1铂电极；反应(2)，2银电极；反应(3)，3内膜，4固定化L-乳酸氧化酶；反应(1)，5核微孔膜，6密封圈，7底物
附图2是L-乳酸酶电极生物传感器结构示意图；其中：1进样器，2光电开关，3信号处理器，4酶电极，5搅拌子，6电磁搅拌器，7泵1，8缓冲液，9泵2，10废液
具体实施方式
1仪器与试药
1.1试药L-乳酸氧化酶(EC 1.1.1.27)：美国Sigma公司；L乳酸：美国Sigma公司；戊二醛：上海化学试剂采购供应站进口分装；核微孔膜：美国Nucleopore公司(φ0.2μm)；铂、银：中国人民银行济南分行(纯度为99.999％)；其他试剂均为分析纯，葡萄酒发酵液：烟台南山葡萄酒有限公司。
1.2仪器SBA-40型乳酸生物传感分析仪(山东省科学院生物研究所)。
2测定原理：固定化L-乳酸氧化酶结合H2O2电极测定L乳酸原理
Figure A20081013921300062
3 L-乳酸对照品溶液制备：精密称取L-乳酸对照品50mg置100ml容量瓶中，加蒸馏水溶解、定容，作为对照品溶液。
4酶电极专一性试验
取可能的干扰物配成浓度500mg/L的溶液，以500mg/L的L-乳酸标准液在L-乳酸酶电极上的响应为500，测定干扰物溶液在同一酶电极上的相对响应。结果见表1
表1  酶电极专一性试验
Tab l Specificity of enzyme electrode
Figure A20081013921300071
结果：D-乳酸等其它有机酸在L-乳酸氧化酶H2O2电极上的响应为0，表明L-乳酸酶电极具有高度的专一性。
5酶电极最适pH
不同pH磷酸盐缓冲液对肌苷酶电极响应的影响见表2所示，在pH 7.2时酶电极响应值最高，所以本研究采用pH 7.2的磷酸盐缓冲液。
表2不同pH缓冲液对乳酸酶电极响应的影响
6精密度试验
取L-乳酸钠准液50 mg·L-1、250 mg·L-1、500 mg·L-1照“仪器定标”项下操作，对同一标准液连续测定20次，每次进样25μl，结果如下：
50 mg.L-1组RSD＝0.22％、250 mg·L-1组RSD＝0.36％、500 mg·L-1组RSD＝1.0％。
7线性关系试验
用乳酸酶电极分别测定50、100、200、300、400、500 mg·L-1 L-乳酸标准液，以浓度为X，响应值为Y，进行回归分析得线性回归方程：Y＝0.23+0.995X，r＝0.9989。
8加样回收试验
取稀释的苹果酸-乳酸发酵溶液样品分成6份，其中5份加入已知浓度的L-乳酸标准液，按照“样品测定”项下操作，进行回收试验，结果(加入量、测得量单位均为mg·L-1)：加入量分别为：20.3、54.4、111.7、396.8、511.3；测得量分别为：20.4、54.7、112.1、398.4、511.3；对应回收率(％)分别为：100.5、100.6、100.4、100.4、100.2；平均回收率(％)为：100.42，RSD(％)为：0.148
9苹果酸-乳酸发酵样品测定  结果见表2。
表2苹果酸-乳酸发酵样品测定结果
Figure A20081013921300073
Figure A20081013921300081
10结论
采用酶电极生物传感器测定苹果酸-乳酸发酵过程中L-乳酸含量及变化，具有快速、专一、简便的特点，不受发酵液中菌体、颗粒物、颜色的影响；不需要分离直接测定，25秒得到分析结果，有助于葡萄酒二次发酵过程的快速调控。

Claims (1)

  1. 一种葡萄酒苹果酸-乳酸发酵质量的测定方法，包括下述顺序的步骤：
    1固定化L-乳酸氧化酶膜的制备
    1.1载体膜圈制备
    取直径10mm的核微孔膜片用环氧树脂粘贴在内径9.5mm的橡胶密封圈上，放置过夜使固化完全即得。
    1.2载体膜圈表面处理
    将载体膜圈置20％甲醇溶液中浸泡15min，取出用蒸馏水冲净、晾干。
    1.3固定化复合酶膜制备
    取L-乳酸氧化酶0.1单位、20％牛血清白蛋白5μl、2％戊二醛2μl、均匀喷涂在载体膜圈表面，静置固化15min，用蒸馏水洗去多余反应物，冷冻干燥即得。将此固定化复合酶膜装在过氧化氢电极头部便构成酶电极。
    2固定化L-乳酸氧化酶膜参数
    基础活性＞50，线性：1～500mg/L；各点偏差小于1mg，响应：30s测定值大于60s测定值的90％，膜完整性：亚铁氢化钾测定值-2～6范围内，工作寿命＞25d。
    3过氧化氢电极制备
    两电极均为长20mm的圆柱体，铂电极表面积4mm2，银电极表面积60mm2，用专用模具置备。两电极之间填充环氧树脂，电极套头端与酶膜圈应嵌合良好，铂电极与酶膜须紧密接触(见图1)，铂电极为正极；银电极为负极。两电极之间极化电压0.65V，酶电极输出电流0～500nA。
    4L-乳酸酶电极生物传感器结构
    L-乳酸酶电极生物传感器由生化反应系统(一次仪表)和电信号处理系统(二次仪表)组成(见图2)。
    5测定方法
    仪器定标：采用0.1mmol/L pH 7.2的磷酸盐缓冲液，标准液含L-乳酸500mg/L，取标准液25μl注入反应池60s后仪器自动显示酶膜基础活性，按动定标键(Calibrate)定标500，自动清洗后即可测定样品。
    样品制备：取葡萄酒苹果酸-乳酸发酵液溶液2ml，置50ml量瓶中加水适量使溶解，用水稀释至刻度，摇匀，即得，进样量25μl。
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