CN102507690B - 一种构建基于四针状纳米氧化锌乳酸生物酶电极的方法 - Google Patents
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Abstract
一种构建基于四针状纳米氧化锌乳酸生物酶电极的方法，属于纳米材料器件构建领域。特征是先将标准金电极抛光，用酒精和去离子水超声清洗干净；滴加Nafion溶液在清洗好的金电极表面上，对电极表面进行修饰来增强电极稳定性；将T-ZnO在酒精溶液中分散形成悬浊液，滴加悬浊液到电极表面，待酒精挥发后再次滴加，并用模具控制T-ZnO厚度和形状，直至滴加T-ZnO在电极表面形成一层薄膜。滴加磷酸盐缓冲溶液（PBS）浸润T-ZnO层，待溶液挥发后滴加乳酸氧化酶溶液到T-ZnO层。最后滴加Nafion溶液到电极表面。成膜后放置在冰箱里低温保存待用。本发明优点是：采用吸附法首次构建了基于T-ZnO的乳酸生物酶电极，方法简单可行，重复性好，酶电极灵敏度高，线性范围下限低，有着很好的表观米氏常数，响应迅速，实现了低浓度范围内的乳酸测定。
Description
技术领域
本发明属于纳米材料器件构建技术领域，特别是提供了一种构建基于四针状纳米氧化锌乳酸生物酶电极的方法，实现了一定浓度（尤其是低浓度）范围内乳酸的测定。
背景技术
乳酸含量作为人体健康重要指标之一，，早已引起广泛关注，并做了大量研究。它是肌肉连续活动的代谢产物，过多积累意味着疲劳。在初期造成酸痛和倦怠，若长期置之不理，造成体质酸化，可能引起严重的疾病。乳酸的测定有利于基础代谢研究和运动生理研究，在临床诊断、食品加工与贮藏、科学健身等方面都有应用。同时纳米材料科学的发展，为构建生物传感器提供了新的方法和物质基础。Yang等（Yang M L, Wang J, Li H Q, Zheng J G, Wu N Q N. Nanotechnology. 2008, 19: 75502）用三钛酸（H2Ti3O7）纳米管构建了乳酸生物传感器，灵敏度0.24 μA cm-2 mM-1；Huang等（Huang J D, Li J, Yang Y, Wang X S, Wu B Y, Anzai J, Osa T, Chen Q. Materials Science and Engineering C. 2008, 28: 1070–1075）用多层碳纳米管和铂纳米颗粒复合材料构建了乳酸生物传感器，线性范围0.2~2.0 mM。到目前为止尚未看到基于氧化锌 (ZnO) 纳米四针乳酸生物传感器的报道。
ZnO纳米材料过去时期里引起很多人的兴趣并在光电、力电、光催化、气敏传感器、晶体管、能源和场发射器件等领域作了大量研究。通过热蒸发法、水热法和模板法等方法制备出各种ZnO纳米结构，包括纳米线、纳米棒、纳米颗粒、纳米带以及纳米四针等一维或准一维纳米材料。
ZnO纳米材料具有独特的优势如化学稳定性，高比表面积，电化学活性，高等电位点和生物相容性好等特点，适合大量吸附具有低等电点蛋白质或酶，并且为固定的酶提供一个良好的微环境，能够很好地保持酶的活性和稳定性。特别是四针状纳米氧化锌（T-ZnO）良好的电输运性和多电子传输通道能提供酶活性中心和电极表面的直接电子传输通道。鉴于T-ZnO在生物传感器领域有着得天独厚的应用优势，已有研究者开展了一些应用研究。然而，ZnO纳米材料在生物探测领域的研究大多集中在葡萄糖探测方面，如Lei等（Lei Y, Yan X Q, Luo N, Song Y, Zhang Y. Colloids and Surfaces A. 2010, 361: 169–173）用T-ZnO网络状结构构建葡萄糖生物传感器，灵敏度高，响应快。但迄今为止，ZnO纳米材料在乳酸探测方面鲜有报道，T-ZnO纳米材料则尚未有报道。
发明内容
本发明目的是为了解决目前在乳酸探测领域灵敏度不高，探测下限不够低这一问题，通过改进酶电极制备工艺，构建了酶电极，并大幅提高灵敏度，降低了探测下限。此外，简化构建工艺也是我们的重要的目的。
本发明的具体工艺通过如下五个步骤实现：
1、将标准金电极抛光，用酒精和去离子水超声清洗干净；
2、滴加Nafion溶液在清洗好的金电极表面上，对电极表面进行修饰来增强电极稳定性；
3、先将薄且平整的软模具固定在金电极上，将四针状氧化锌（T-ZnO）纳米材料在酒精溶液中分散形成悬浊液，滴加悬浊液到电极表面，待酒精挥发后再次滴加。固定在金电极表面的模具能够限制T-ZnO悬浊液的流动，使T-ZnO更好地沉积在金电极表面，并且只在金电极表面沉积。滴加完成后，T-ZnO在电极表面形成一层薄膜。
4、滴加磷酸缓冲溶液（PBS）浸润T-ZnO层，用以改善电极表面微环境。溶液挥发后滴加乳酸氧化酶溶液到T-ZnO层，通过静电作用吸附到T-ZnO表面。
5、最后滴加Nafion溶液到电极表面。成膜后放置在冰箱低温保存以待使用。
实验过程中发现T-ZnO层厚度和T-ZnO层在金电极表面的覆盖面积变化，以及稳定性改变都会影响电极性能。增加T-ZnO层厚度，电极性能降低，认为从酶活性中心到电极表面距离变长，因而电阻变大，响应电流不稳定，灵敏度降低；增加T-ZnO层在金电极表面的覆盖面积，电极性能提高，认为是T-ZnO为吸附的乳酸氧化酶提供了良好的微环境，避免了乳酸氧化酶与金电极表面发生强烈吸附而使乳酸氧化酶失去生物活性；同时增强电极稳定性，电极性能大幅提高。初步认为当生物酶电极放入乳酸溶液中，吸附在ZnO上的乳酸氧化酶催化乳酸与水中的O2反应生成丙酮酸和H2O2，H2O2发生氧化还原产生的电子，经ZnO传输到电极表面，流经外电路回到辅助电极与H+ 和O2反应生成H2O，形成回路。电流在外电路生成探测信号。
实验在pH=7.4的缓冲溶液中，在室温下进行测试，得到T-ZnO乳酸生物酶电极性能：探测下限1.2 μM，线性范围0.0036~0.6 mM，灵敏度 23.5 μA cm-2 mM-1，表观米氏常数Kapp,M=0.58 mM，响应时间小于10 s。
本方法首次构建了基于T-ZnO的乳酸生物酶电极,并实现了一定浓度范围内的乳酸测定。通过采用T-ZnO纳米材料吸附乳酸氧化酶，进而构建了乳酸生物酶电极，方法简单可行，重复性好，实现了一定浓度（尤其是低浓度）范围内的乳酸测定。同时制备出的乳酸生物酶电极至今未见报道。
本发明的优点在于：
1．采用吸附法首次构建了基于T-ZnO的乳酸生物酶电极，方法简单可行，重复性好，并且这一方法对于构建基于其他一维ZnO纳米材料的生物酶电极也将有积极的借鉴意义。
2．我们较大地提高了乳酸生物酶电极的灵敏度，降低了线性范围的下限，电极有着很好的表观米氏常数，响应迅速。
附图说明
图1为不同电极在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中的循环伏安(CV)曲线。
图2为氧化锌乳酸酶电极分别在PBS和0.3 mM乳酸溶液中的CV曲线。
图3为不同扫描速率下氧化锌乳酸酶电极的CV曲线及其相应峰值电流与扫描速率平方根的关系图。
图4为不同乳酸酶电极在乳酸溶液中的计时电流曲线对比。
图5为氧化锌乳酸酶电极在乳酸溶液中的计时电流标定曲线及局部放大。
图6为氧化锌乳酸酶电极在乳酸溶液中对应的米氏方程拟合曲线。
图1、2、3是循环伏安法测试电极性能的曲线。其中，图1表明T-ZnO纳米材料能够增强响应电流，这是由于这种材料本身良好的导电性以及多电子传输通道引起的，并且在分别0.55 V和0.36 V处出现了两个峰，分别对应ZnO的氧化峰和还原峰。这两个峰的出现，由ZnO自身的氧化还原所产生。图2显示在有乳酸的情况下得到的循环伏安曲线在0.3 V至0.52 V处响应电流有明显增加，这表明酶电极在乳酸溶液中催化乳酸发生反应，乳酸酶可以通过T-ZnO固定在金电极上，并保持一定生物活性。图3表明峰值电流与扫描速率的平方根成正比，并且具有良好的线性关系（R2 = 0.9973），呈现出一个典型的扩散控制电化学行为。
图4、5、6是计时电流法测试电极性能的曲线。其中，图4表明T-ZnO存在时，背底电流增大，并且当溶液中乳酸浓度增加时，响应电流变化明显，随着乳酸浓度增加量的增大而相应地增大，认为T-ZnO良好的电输运性能以及多电子传输通道提高了响应电流，改善了电极性能，同时T-ZnO很好地保持了所吸附乳酸氧化酶的活性，让其在乳酸催化过程中充分发挥作用。得到的探测下限为1.2 μM。根据图5曲线的斜率计算得到T-ZnO乳酸生物酶电极灵敏度为23.5 μA cm-2 mM-1，乳酸探测线性范围0.0036~0.6 mM。从图6可计算得出Kapp,M = 0.58 mM，非常适于在乳酸生物酶电极领域研究应用。
具体实施方式
在以下电极制备工艺下制得的乳酸生物酶电极性能最优：
首先将商业化的标准金电极抛光，分别用酒精和去离子水超声清洗干净，使用高纯氮气将电极吹干待用。
将准备好的金电极表面向上垂直固定于基座上，滴加可供离子交换的Nafion溶液在清洗好的金电极表面上，对电极表面进行修饰来增强电极稳定性和吸附性。
将结晶性良好的T-ZnO在酒精溶液中分散形成悬浊液，滴加悬浊液到Nafion修饰后的电极表面，待酒精充分挥发后再次滴加，并用聚四氟乙烯模具控制T-ZnO层的厚度和形状，逐次滴加后直至T-ZnO在金电极表面形成一层T-ZnO/Nafion薄膜。
随后滴加pH=7.4的PBS浸润T-ZnO层，待缓冲溶液充分挥发后滴加乳酸氧化酶溶液到T-ZnO层，形成乳酸氧化酶/T-ZnO/Nafion膜层，最后再滴加一层起保护作用的Nafion溶液到电极表面。成膜后将电极放置在冰箱中低温保存以待使用。
将构建好的乳酸氧化酶纳米四针氧化锌生物电极采用循环伏安法进行分析测试，根据循环伏安曲线中的氧化还原峰可证明酶电极在乳酸溶液中催化乳酸发生反应，确认乳酸酶可以通过T-ZnO固定在金电极上，并保持良好的生物活性，且呈现出典型的扩散控制电化学行为，有利于电子和离子在整个体系中的迁移。
使用时先用计时电流法对电极进行标定，通过逐步定量加入不同浓度的标准乳酸溶液，观察记录加入后相应的响应电流值，根据电流和浓度之间的关系曲线，可以确定并通过计算得出T-ZnO乳酸生物酶电极的探测下限为1.2 μM，检测灵敏度为23.5 μA cm-2 mM-1，对乳酸浓度的探测线性范围为0.0036~0.6 mM，对被测底物乳酸的亲和力极强（Kapp,M=0.58 mM），证明该工艺构建的T-ZnO乳酸生物酶电极性能良好。
最后，标定好的T-ZnO乳酸生物酶电极可以用于实际对未知浓度的乳酸溶液进行定性定量检测。
Claims (1)
1.一种构建基于四针状纳米氧化锌乳酸生物酶电极的方法，其特征在于制备的工艺步骤为：
1）、将标准金电极抛光，用酒精和去离子水超声清洗干净；
2）、滴加Nafion溶液在清洗好的金电极表面上，对电极表面进行修饰来增强电极稳定性；
3）、先将薄且平整的软模具固定在金电极上，将T-ZnO纳米材料在酒精溶液中分散形成悬浊液，滴加悬浊液到电极表面，待酒精挥发后再次滴加；固定在金电极表面的模具能够限制T-ZnO悬浊液的流动，使T-ZnO更好地沉积在金电极表面，并且只在金电极表面沉积；滴加完成后，T-ZnO在电极表面形成一层薄膜；
4）、滴加磷酸缓冲溶液浸润T-ZnO层，用以改善电极表面微环境；溶液挥发后滴加乳酸氧化酶溶液到T-ZnO层，通过静电作用吸附到T-ZnO表面；
5）、最后滴加Nafion溶液到电极表面，成膜后放置在冰箱低温保存以待使用。
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