CN101679936A - 通过葡糖醛酸发酵来制造葡糖醛酸的方法 - Google Patents

通过葡糖醛酸发酵来制造葡糖醛酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明旨在提供优于特异性氧化葡萄糖的羟甲基的能力的微生物及通过使用该微生物直接氧化葡萄糖而制造葡糖醛酸和/或葡糖醛酸内酯的方法；本发明是可从葡萄糖直接生成葡糖醛酸的微生物，是具有特异性氧化葡萄糖的羟甲基的能力、且对应于16SrRNA的DNA碱基序列具有序列表中SEQ ID NO：1所示的碱基序列的突变菌株，及通过使用该菌株特异性氧化葡萄糖的羟甲基而制造葡糖醛酸和/或葡糖醛酸内酯的方法；可通过本发明以高产率、廉价、容易、且安全地制造、提供D－葡糖醛酸和/或D－葡糖醛酸内酯。

Description

通过葡糖醛酸发酵来制造葡糖醛酸的方法
技术领域
【0001】本发明涉及特异性氧化葡萄糖的羟甲基的微生物及利用该微生物制造葡糖醛酸和/或葡糖醛酸内酯的方法，更具体涉及具有特异性氧化葡萄糖的羟甲基的能力、且具有高选择性地从葡萄糖直接生成葡糖醛酸的能力葡糖醛酸发酵用新型突变菌株以及利用该菌株通过葡糖醛酸发酵制造葡糖醛酸和/或葡糖醛酸内酯的方法。
背景技术
【0002】作为D-葡萄糖的代表性氧化物，已知D-葡萄糖的醛基经氧化的葡萄糖酸、D-葡萄糖的羟甲基经氧化的葡糖醛酸。葡萄糖酸及其内酯-葡萄糖酸内酯可通过微生物的葡萄糖氧化发酵(葡萄糖酸发酵)生成，在工业生产所用的微生物有黑曲霉(Aspergillus niger)或产黄青酶(Penicillium chrysogenum)等。
【0003】已知有各种制造葡糖醛酸及其内酯-葡糖醛酸内酯的方法，但已实现工业化的方法为，利用硝酸等氮氧化物选择性地氧化淀粉等葡萄糖衍生物而将其转化为羧酸、然后水解所述氧化生成物而得到葡糖醛酸或葡糖醛酸内酯(专利文献1)。但是此方法存在氧化反应时生成的副产物气体处理起来繁琐，且目的物质的产率低等问题。
【0004】作为高产葡糖醛酸和葡糖醛酸内酯的方法的现有技术，有人提出了制备氧化了海藻糖的羟甲基的氧化海藻糖，然后水解此氧化海藻糖而得到目的葡糖醛酸和葡糖醛酸内酯的方法(专利文献2)。但这种方法的从原料到目的物质的产率虽良好，却存在必需使用大量氧化铂、氧化钒、钯等氧化催化剂，且在水解氧化海藻糖时，必需在比较剧烈的反应条件下进行，从而制造成本高等问题。
【0005】作为其他方法、也有人提出使用吸附了6，6-四甲基哌啶N-氧等胺氧化物的氧化催化剂树脂，在存在含有卤素的化合物的情况下，氧化葡萄糖衍生物的方法(专利文献3)。此方法由于未使用硝酸等氮氧化物，所以较安全且可高效得到葡糖醛酸及葡糖醛酸内酯，但由于此方法优选使用的葡萄糖衍生物是高价格的甲基-α-D-葡糖苷、异丙基-(α，β)-D-葡糖苷，所以同上述方法一样，存在制造成本高的问题。
【0006】作为制造葡糖醛酸的比较经济的方法，有人提出通过微生物的氧化发酵从蔗糖制备蔗糖羧酸，然后加入具有转化酶活性的微生物，水解蔗糖羧酸来得到葡糖醛酸及葡糖醛酸内酯的方法(专利文献4)。此方法不同于以往的化学合成法，可在温和的条件下高产率获得葡糖醛酸及葡糖醛酸内酯，但此方法在制造过程中必需使用2种不同种类的微生物，过程繁琐。
【0007】正如葡萄糖酸发酵一样，要从葡萄糖直接生成葡糖醛酸，必需特异性氧化葡萄糖的羟甲基。作为氧化葡萄糖的羟甲基的酶，已知有例如乙醇脱氢酶(专利文献5)、乙醇/醛脱氢酶(专利文献6)，而含有这些酶的菌株，已知有假葡糖杆菌(Pseudogluconobacter)类。
【0008】这些菌株有，例如，Pseudogluconobactersaccharoketogenes K591s株(FERM BP-1130，IFO14464)、Pseudogluconobacter saccharoketogenes 12-5株(FERM BP-1129，IFO14465)、Pseudogluconobacter saccharoketogenes TH14-86株(FERM BP-1128，IFO14466)、Pseudogluconobactersaccharoketogenes 12-15株(FERM BP-1132，IFO14482)、Pseudogluconobacter saccharoketogenes 12-4株(FERM BP-1131，IFO14483)及Pseudogluconobacter saccharoketogenes 22-3株(FERMBP-1133，IFO14484)(专利文献7)。
【0009】但是，这些菌株正如在后述实施例中会详细说明的一样，不仅对葡萄糖的羟甲基的氧化特异性低，而且除葡糖醛酸以外，还生成葡萄糖酸、2-酮基葡萄糖酸等葡萄糖氧化物。即，本技术领域目前还未建立同葡萄糖酸发酵一样可从葡萄糖直接生成葡糖醛酸的适合于葡糖醛酸发酵的微生物及利用该微生物的葡糖醛酸发酵来制造葡糖醛酸和/或葡糖醛酸内酯的方法。
【0010】专利文献1：特公昭43-5882号公报
专利文献2：特开平10-251263号公报
专利文献3：特开平11-147043号公报
专利文献4：特开2006-314223号公报
专利文献5：特开平5-68542号公报
专利文献6：特开2003-159079号公报
专利文献7：特开平6-7157号公报
发明内容
发明拟解决的技术课题
【0011】在这种情况下，发明人借鉴以往技术，以开发同葡萄糖酸发酵一样可从葡萄糖直接生成葡糖醛酸的同时，具有对葡萄糖的羟甲基的高氧化特异性的适合于葡糖醛酸发酵的微生物及利用该微生物制造葡糖醛酸和/或葡糖醛酸内酯的方法为目标，重复了锐意研究。其结果，本发明人成功建立了具有特异性氧化葡萄糖的羟甲基的能力的新型突变菌株，及利用该突变菌株或其菌体处理物制造葡糖醛酸和/或葡糖醛酸内酯的方法，从而完成本发明。
【0012】本发明旨在提供具有特异性氧化葡萄糖的羟甲基的能力的新型突变菌株、以及提供包括利用该菌株的葡糖醛酸发酵过程的，高产、廉价、简便且环保的制造葡糖醛酸和/或葡糖醛酸内酯的新方法。
解决课题的技术方案
【0013】旨在解决上述课题的本发明由以下技术方案构成。
(1)一种微生物，其特征在于其是从葡萄糖直接生成葡糖醛酸的微生物，其具有特异性氧化葡萄糖的羟甲基的能力，所述微生物的对应于16SrRNA的DNA碱基序列具有序列表中SEQ ID NO：1所示的碱基序列。
(2)(1)的微生物，所述微生物的对应于16SrRNA的DNA碱基序列与SEQ ID NO：1所示的碱基序列具有97％以上的相同性。
(3)(1)或(2)的微生物，其中所述微生物是保藏号为FERMBP-10820的Pseudogluconobacter saccharoketogenes Rh47-3株。
(4)制造葡糖醛酸和/或葡糖醛酸内酯的方法，其特征在于：将所述(1)-(3)中任一项的微生物或其处理物在葡糖醛酸发酵用反应体系中与葡萄糖接触，特异性氧化葡萄糖的羟甲基，从而生成葡糖醛酸和/或葡糖醛酸内酯。
(5)(4)的方法，其中所述处理物是菌体破碎液、菌体提取液或它们的丙酮粉。
(6)(4)的方法，其中将所述生成葡糖醛酸的反应体系的反应温度调整为10～45℃，将反应液的pH调至pH4～9。
(7)(4)的方法，其在葡糖醛酸发酵过程中进行振荡或通气搅拌，将反应液中葡萄糖几乎被完全氧化的时间点作为反应终点。
(8)(4)的方法，其
●浓缩含有生成的葡糖醛酸的反应液，
●接种葡糖醛酸金属盐的结晶而使结晶化，及
●分离纯化葡糖醛酸金属盐，
或者
●使反应液脱盐后经浓缩，
●接种葡糖醛酸内酯的结晶而使结晶化，及
●分离纯化葡糖醛酸内酯。
【0014】以下对本发明进行更详细的说明。
本发明人为解决上述课题而经锐意研究的结果，通过对Pseudogluconobacter saccharoketogenes K591s株等公知菌株实施突变处理而成功获得了较以往菌株具有特异性氧化葡萄糖的羟甲基的能力，且葡糖醛酸的发酵能力高的Pseudogluconobactersaccharoketogenes Rh47-3株等新型突变菌株。本发明人还通过将所述突变菌株与葡萄糖接触而成功于高选择性地有效产生葡糖醛酸。
【0015】本发明第一方面是特异性氧化葡萄糖的羟甲的能力优良的微生物，是具有对应于16SrRNA的DNA碱基序列，所述对应于16SrRNA的DNA碱基序列具有SEQ ID NO：1所示的碱基序列，至含有与该SEQ ID NO：1所示的碱基序列97％以上相同的碱基序列，且具有特异性氧化葡萄糖的羟甲基的能力的微生物。本发明还是保藏号为FETM BP-10820的保藏于公共保藏单位的Pseudogluconobactersaccharoketogenes Rh47-3株等新型突变菌株。
【0016】本发明第二方面是将上述突变菌株和/或其菌体处理物与葡萄糖接触而进行的葡糖醛酸发酵来制造葡糖醛酸和/或葡糖醛酸内酯的方法，是将上述微生物或其菌体处理物与葡萄糖接触，特异性氧化葡萄糖的羟甲基，从而生成葡糖醛酸为特征的葡糖醛酸和/或葡糖醛酸内酯制造方法。
【0017】本发明涉及到的微生物是属于假葡糖杆菌的微生物，是具有与序列表中的SEQ ID NO：1所示的碱基序列97％以上相同的对应于16SrRNA的DNA的微生物。并且本发明涉及到的微生物有表1所示的微生物学性质。本发明微生物较以往公知的能氧化羟甲基的微生物具有特异性氧化葡萄糖的羟甲基的能力，是适用于葡糖醛酸发酵的微生物。本发明所述特异性氧化葡萄糖的羟甲基的能力指通过氧化葡萄糖的羟甲基而从葡萄糖以50～100％、优选60～100％、更优选70～100％的比例直接生成葡糖醛酸的能力。
【0018】【表1】
Pseudogluconobacter saccharoketogenes Rh47-3株的微生物学性质
  细胞形态   杆菌(0.7-0.9×1.5-3.0μm)
  革兰氏染色   -
  运动性   +
  孢子的有无   -
菌落性状   培养基：山梨醇2.0％，蛋白胨1.0％，酵母提取液1.0％，琼脂2.0％培养时间：48小时直径：1.0-2.0mm色调：淡黄色形状：圆形隆起状态：透镜状边缘：全缘表面形状：圆滑透明度：不透明粘稠度：奶油状
培养时间   37℃：+45℃：+
  过氧化氢酶反应   +
  氧化酶反应   +
  由葡萄糖的酸/气体产生(酸产生/气体产生) -/-
  O/F(氧化/发酵)测试   -/-
  硝酸盐还原   -
  吲哚产生   -
  精氨酸脱水酶   -
  脲酶   -
  七叶苷水解   +
  明胶水解   -
  β-半乳糖苷酶   +
同化性   葡萄糖：-L-阿拉伯糖：-D-甘露糖：-D-甘露醇：-N-乙酰-D-葡萄糖胺：-乳糖：-麦芽糖：-葡萄糖酸钾：-
【0019】序列表中SEQ ID NO：1所示的碱基序列是编码本发明涉及的微生物的16SrRNA的碱基序列。当一个菌株的对应于16SrRNA的DNA碱基序列与已知菌株的碱基序列具有97％以上的相同性时，判断为与该菌株为同属种。所以，具有与序列表中SEQ IDNO：1所示的碱基序列97％以上相同的碱基序列，并具有特异性氧化葡萄糖的羟甲基的能力的微生物都包含在本发明的范围内。
【0020】与序列表中SEQ ID NO：1所示的碱基序列具有97％以上的相同性的微生物是通过向Pseudogluconobactersaccharoketogenes类菌株导入突变而创造出的新型突变株，例如有向亲代菌株Pseudogluconobacter saccharoketogenes K591s株、Pseudogluconobacter saccharoketogenes 12-5、Pseudogluconobactersaccharoketogenes TH14-86株、Pseudogluconobactersaccharoketogenes 12-15株、Pseudogluconobacter saccharoketogenes12-4株、Pseudogluconobacter saccharoketogenes 22-3株导入突变而创造出的突变株。
【0021】向假葡糖杆菌类菌株导入突变的方法例如优选有，通过用紫外线照射、放射线照射、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍等化学诱变剂处理的随机突变法，或者通过基因重组等的位点特异性突变法。由本发明人导入了突变的新型突变菌株Pseudogluconobactersaccharoketogenes Rh47-3株在平成19年4月4日以保藏号FERMP-21286保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，并在平成19年4月26日以保藏号FERM BP-10820移管到同国际保藏单位。
【0022】为了评价本发明的微生物具有特异性氧化葡萄糖的羟甲基的能力，使用了研究微生物对葡萄糖的羟甲基的氧化特异性的方法。对所述方法没有特别限制，例示有通过离心回收培养菌体后，加入到含有1.5％碳酸钙的10％葡萄糖溶液中振荡反应2天，通过高效液相色谱(柱：Shim-pack SCR101H；洗脱液：20mM硫酸；柱温度：25℃；流速：0.5mL/分钟、检测器：差式折射计)确定生成的葡糖醛酸的比例的方法。
【0023】可通过对微生物适用所述方法来评价其是否具有特异性氧化葡萄糖的羟甲基的能力，并评价对象微生物的对应于16SrRNA的DNA碱基序列是否与序列表中SEQ ID NO：1所示的碱基序列具有97％以上的相同性，并确认该微生物是否具有特异性氧化葡萄糖的羟甲基的能力，且可判断所述微生物是否包含在本发明的范围内。
【0024】本发明涉及的微生物可用作制造葡糖醛酸和/或葡糖醛酸内酯的葡糖醛酸发酵用微生物。为了利用此微生物，需对所述微生物进行培养。可将本发明涉及的属于Pseudogluconobactersaccharoketogenes属的微生物在有氧条件下，培养于含有以下物质的液体培养基中：
葡萄糖、蔗糖、淀粉等碳源，
铵盐、尿素、玉米浆、酵母提取液、蛋白胨等氮源，
钠、钾、钙、镁、铁、锰、钴等的无机盐类，及
作为微量营养素的CoA、泛酸、生物素、硫胺素、核黄素等的维生素或辅酶。
【0025】培养时的pH为4～9，优选pH5～8，更优选pH6～7。进行培养的适宜温度范围为10～45℃，优选20～40℃，更优选25～35℃。培养时间随着培养基的组成而异，通常为10～100小时，优选20～70小时。
【0026】将如上培养的菌体供于葡糖醛酸发酵。葡糖醛酸发酵过程是将活菌体或其菌体处理物作用于葡糖醛酸发酵用基质-葡萄糖。所述菌体处理物指，经匀浆器或玻璃珠等物理破碎的菌体破碎液、经表面活性剂或酶等药物处理的菌体提取液、以及它们的丙酮粉。
【0027】此外，可通过将菌体或其处理物固定在载体上，而将其在葡糖醛酸发酵中重复使用。固定方法有，例如，吸附于纤维素载体、陶瓷载体、玻璃珠载体等的方法，或者包含在精氨酸钙、角叉菜胶等的方法。
【0028】葡糖醛酸发酵过程是：将如上制备出的菌体或其处理物加入到葡萄糖基质中，并在根据需要控制反应温度，反应液pH的情况下进行反应。反应液中的葡萄糖浓度通常在1～30％(w/v)的范围内，优选是3～20％(w/v)，更优选是5～10％(w/v)。
【0029】反应温度同培养温度一样为10～45℃，优选20～40℃，更优选25～35℃。反应pH通常是pH4～9，特别优选6～8，为控制反应pH，也可添加氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钙等。反应方法优选振荡、通气搅拌的方法，如果过度反应，则会使生成的葡糖醛酸的醛基开始进一步氧化，所以反应时间优选以反应液中的葡萄糖几乎被完全氧化时为终点。确认终点的方法有，例如，上述高效液相色谱法或者使用市售的葡萄糖测定试剂盒(和光纯药株式会社制造的葡萄糖CII Test Wako)的方法。
【0030】为从如上得到的反应液中分离纯化葡糖醛酸金属盐，将反应也浓缩，接种葡糖醛酸金属盐的结晶而结晶化，并分离纯化。然后可将得到的葡糖醛酸金属盐结晶溶于水，通过常规方法脱盐而得到葡糖醛酸。另外，为了分离纯化葡糖醛酸内酯，通过用常规方法进行脱盐后浓缩，并接种葡糖醛酸内酯结晶而结晶化，并分离纯化。
【0031】在脱盐后的溶液中，葡糖醛酸与葡糖醛酸内酯保持平衡状态，但由于葡糖醛酸内酯容易结晶化，通常浓缩到固体含量为40～80％(w/v)，并接种葡糖醛酸内酯晶种，回收葡糖醛酸内酯结晶。
【0032】另外，也可通过使用以下方法分离纯化葡糖醛酸和/或葡糖醛酸内酯：向反应液中添加有机溶剂而将目的物质沉淀回收的方法，吸附色谱法或离子交换色谱法等柱分离法，通过电透析装置进行的膜分离方法等。
【0033】通过本发明的葡糖醛酸发酵制得的葡糖醛酸和/或葡糖醛酸内酯较通过已知方法获得的葡糖醛酸和/或葡糖醛酸内酯具有相同或更高的纯度，这些产品同以往产品一样，作为具有例如肝功能恢复作用，疲劳恢复作用，抗风湿作用等的物质，在医药品工业、食品工业、化学工业等诸多领域具有广泛的用途。
发明效果
【0034】本发明达到了如下技术效果。
(1)本发明可提供较以往菌株具有特异性直接氧化葡萄糖的羟甲基的能力，且具有优良的葡糖醛酸发酵能力的新型突变菌株。
(2)可通过使用此突变菌株从葡萄糖高选择性且高产率地制造出葡糖醛酸和/或葡糖醛酸内酯。
(3)可提供可通过葡糖醛酸发酵从葡萄糖直接制得葡糖醛酸的葡糖醛酸新制法。
(4)本发明可较以往制造方法低的成本制造出葡糖醛酸和/或葡糖醛酸内酯。
(5)由于本发明的方法不使用硝酸等氮氧化物，所以可安全且不对环境造成影响地制造出葡糖醛酸和/或葡糖醛酸内酯。
实施方式
【0035】以下将通过实施例具体说明本发明涉及到的新型突变菌株及利用该菌株的葡糖醛酸和/或葡糖醛酸内酯的制造，但本发明并不以任何方式限于这些实施例。
实施例
实施例1
【0036】(获得突变菌株)
本实施例尝试使用已知菌株作为亲代菌株来获得了突变菌株。将100μl Pseudogluconobacter saccharoketogenes K591s株的悬浊液涂布于由2.0％山梨醇、1.0％蛋白胨、1.0％酵母提取液、2.0％琼脂构成的平板琼脂培养基上后，通过用紫外线照射使其存活率达1％以下，并在30℃下培养3天。
【0037】将生长的菌株接种于由1.0％乳糖、1.0％酵母提取液、0.3％硫酸铵、2.0％玉米浆、1.0％碳酸钙(pH7.0)构成的200μl前培养基上，在30℃下培养1天，并以150rpm振荡培养。
【0038】接着，向上述培养基中添加由2.0％乳糖、0.5％酵母提取液、1.0％玉米浆、0.3％硫酸铵、0.1％硫酸亚铁，0.01％氯化镧、0.5％碳酸钙(pH7.0)构成的800μl本培养基，培养一天后，通过离心回收菌体。
【0039】将通过上述方法制得的菌株再悬浊于1ml 1.0％的葡萄糖中，在30℃下振荡1天，进行葡糖醛酸发酵。通过高效液相色谱法测定生成的葡糖醛酸量，从中筛选葡糖醛酸发酵能力高的突变株(第一次筛选)。结果获得了较亲代Pseudogluconobacter saccharoketogenesK591s株能大幅提高对葡萄糖的羟甲基的特异性氧化的新突变菌株-Pseudogluconobacter saccharoketogenes Ps18-31株。
【0040】接下来，将上述Pseudogluconobacter saccharoketogenesPs18-31株接种于3ml上述前培养基上，培养1天后，通过离心集菌，并再悬浊于1ml的100mM磷酸缓冲液(pH6.5)中。将N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍加入该悬浊液，使其终浓度达到1mg/ml，实施处理1小时30分钟。稀释此处理液，并涂布于平板琼脂培养基上，并在30℃下培养3天。
【0041】同上述第一次筛选一样培养生长的菌株，进行葡糖醛酸发酵。结果获得了较Pseudogluconobacter saccharoketogenes Ps18-31提高对葡萄糖的羟甲基的氧化特异性的新型突变菌株：Pseudogluconobacter saccharoketogenes Rh24-6株、Pseudogluconobacter saccharoketogenes Rh38-15株、以及Pseudogluconobacter saccharoketogenes Rh47-3株。
实施例2
【0042】(葡糖醛酸发酵)
使用表2所示的各种已知菌株和新型突变菌株，根据实施例1中记载的方法，进行了葡糖醛酸发酵。发酵进行到葡萄糖几乎被完全氧化，并测定相对葡萄糖的葡糖醛酸生成率。其结果如表2所示，新型突变菌株较已知菌株以高产率从葡萄糖生成葡糖醛酸。
【0043】在其中，特别是Pseudogluconobacter saccharoketogenesRh47-3株，以81.2％的产率生成葡糖醛酸。此Pseudogluconobactersaccharoketogenes Rh47-3株以保藏号FERM BP-10820国际保藏于国际保藏单位-独立行政法人产业技术综合研究所的专利生物保藏中心。此Pseudogluconobacter saccharoketogenes Rh47-3株的16S rRNA基因的部分碱基序列如表3及序列表SEQ ID NO：1所示。
【0044】【表2】
葡萄糖的葡糖醛酸生成率
实施例3
【0045】(葡糖醛酸钠盐的制备)
使用500L发酵罐进行葡糖醛酸发酵。向发酵罐内加入30kg葡萄糖和250L水，溶解后，使用实施例1中记载的培养基，添加50L另外培养的Pseudogluconobacter saccharoketogenes Rh47-3株经洗净的菌液，以100L/分的比例进行通气发酵。搅拌200rpm，温度30℃，用12％(w/v)的氢氧化钠溶液将pH调节到6.0，在葡萄糖残留量达到0.5％(w/v)以下的时刻，于90℃下加热30分钟而停止发酵。
【0046】通过发酵使约8成的葡萄糖转变成葡糖醛酸钠盐，所需时间为42小时。其后进行UF膜过滤回收滤液，将滤液浓缩至60％(w/v)后，加入300g葡糖醛酸钠盐晶种，冷却至20℃。离心析出的结晶得到15.6kg葡糖醛酸钠盐粗产物。将此再结晶，得到12.2kg纯度为99.9％以上的葡糖醛酸钠盐纯化产物。
实施例4
【0047】(葡糖醛酸内酯的制备)
依据实施例3所述的方法，从30kg葡萄糖制备出葡糖醛酸钠盐，经UF膜过滤回收滤液。使得到的滤液通过50L强酸性离子交换树脂(
Figure A20088001514700151
PK-216，三菱化学(株)制造)而脱盐。将脱盐液浓缩到72％(w/v)后，使溶液中的葡糖醛酸和葡糖醛酸内酯的平衡比例移动，增加葡糖醛酸内酯的含量，加入300g葡糖醛酸内酯的晶种冷却至20℃而使葡糖醛酸内酯结晶。通过离心回收结晶，得到10.1kg葡糖醛酸内酯粗产物。将此再结晶，得到8.4kg纯度为99.9％以上的葡糖醛酸内酯纯化产物。
【0048】【表3】
GAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTC
GAACGCCCCGCAAGGGGAGTGGCAGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAATCTACCCA
GTTCTTCGGAATAACWSAGGGAAACTTSWGCTAATACCGGATACGCCCTACGGGG
GAAAGATTTATCGGAATTGGATGAGCCCGCGTAAGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAA
CGGCTCACCAAGGCGACGATCTTTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTG
GGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACA
ATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCTTAGGGTTG
TAAAGCTCTTTCAGTAGGGAAGATAATGACGGTACCTACAGAAGAAGCCCCGGCTA
ACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGATTTACT
GGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGATTGTTAAGTTAGGGGTGAAATCCCAGGGCTC
AACCCTGGAACTGCCTTTAATACTGGCAATCTAGAGTCCGGAAGAGGTGAGTGGAA
CTCCTAGTGTAGAGGTGGAATTCGTAGATATTAGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGC
GGCTCACTGGTCCGGTACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGA
TTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACTATGAGAGCTAGCCGTTGGGAWGTTT
ACWTCTCAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGCTCTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGC
AAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGG
TTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGCCCTTGACATCCCGGTCGCGGTT
TTCAGAGATGAATTCCTTCAGTTCGGCTGGACCGGTGACAGGTGCTGCATGGCTGT
CGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCG
CCTTTAGTTGCCATCATTTAGTTGGGCACTCTAGAGGGACTGCCGGTGATAAGCCG
GAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGGCTGGGCTACACA
CGTGCTACAATGGCGGTGACAGAGGGCAGCTACACGGCGACGTGATGCTAATCCC
TAAAAACCGTCTCAGTTCGGATTGCACTCTGCAACTCGGGTGCATGAAGTTGGAAT
CGCTAGEAATCGCAGATCAGCATGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACAC
ACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGTTCTACCCGAAGCCGGTGCGCTAACCGCA
AGGAAGCAGCCGACCACGGTAGGGTCAGCGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTA
GCC
工业实用性
【0049】如上详述，本发明涉及通过葡糖醛酸发酵制造葡糖醛酸的方法，可通过本发明提供具有特异性直接氧化葡萄糖的羟甲基的能力的、适合于制造葡糖醛酸和/或葡糖醛酸内酯的新型突变菌株，及使用该突变菌株制造葡糖醛酸和/或葡糖醛酸内酯的方法。本发明的Pseudogluconobacter saccharoketogenes的新型突变菌株具有适合于葡糖醛酸发酵的能力，可通过使用此微生物以高产率、廉价、简易、且安全地从葡萄糖制造葡糖醛酸和/或葡糖醛酸内酯。本发明的有用之处在于提供了可直接从葡萄糖制造葡糖醛酸的新的葡糖醛酸制造方法。
有关微生物保藏的说明
国际保藏单位的名称：独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心
地址：305-8566日本国茨城县筑波市东1-1-1中央第6(邮政编码305-8566)
保藏日：2007年4月26日
保藏号：FERM BP-10820
微生物标识：Rh47-3
序列表
<110>ENSUIKO SUGAR REFINING CO.，LTD.
<120>通过葡糖醛酸发酵来制造葡糖醛酸的方法
<130>200804F-0707
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<160>1
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1444
<212>DNA
<213>假葡糖杆菌
<400>1
gagtttgatc ctggctcaga acgaacgctg gcggcaggct taacacatgc aagtcgaacg  60
ccccgcaagg ggagtggcag acgggtgagt aacgcgtggg aatctaccca gttcttcgga  120
ataacwsagg gaaacttswg ctaataccgg atacgcccta cgggggaaag atttatcgga  180
attggatgag cccgcgtaag attagctagt tggtgaggta acggctcacc aaggcgacga  240
tctttagctg gtctgagagg atgatcagcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc  300
tacgggaggc agcagtgggg aatattggac aatgggcgca agcctgatcc agccatgccg  360
cgtgagtgat gaaggcctta gggttgtaaa gctctttcag tagggaagat aatgacggta  420
cctacagaag aagccccggc taacttcgtg ccagcagccg cggtaatacg aagggggcta  480
gcgttgttcg gatttactgg gcgtaaagcg cacgtaggcg gattgttaag ttaggggtga  540
aatcccaggg ctcaaccctg gaactgcctt taatactggc aatctagagt ccggaagagg  600
tgagtggaac tcctagtgta gaggtggaat tcgtagatat taggaagaac accagtggcg  660
aaggcggctc actggtccgg tactgacgct gaggtgcgaa agcgtgggga gcaaacagga  720
ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac tatgagagct agccgttggg awgtttacwt    780
ctcagtggcg cagctaacgc attaagctct ccgcctgggg agtacggtcg caagattaaa    840
actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca    900
acgcgaagaa ccttaccagc ccttgacatc ccggtcgcgg ttttcagaga tgaattcctt    960
cagttcggct ggaccggtga caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg    1020
ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc tcgcctttag ttgccatcat ttagttgggc    1080
actctagagg gactgccggt gataagccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aagtcatcat    1140
ggcccttacg ggctgggcta cacacgtgct acaatggcgg tgacagaggg cagctacacg    1200
gcgacgtgat gctaatccct aaaaaccgtc tcagttcgga ttgcactctg caactcgggt    1260
gcatgaagtt ggaatcgcta gtaatcgcag atcagcatgc tgcggtgaat acgttcccgg    1320
gccttgtaca caccgcccgt cacaccatgg gagttggttc tacccgaagc cggtgcgcta    1380
accgcaagga agcagccgac cacggtaggg tcagcgactg gggtgaagtc gtaacaaggt    1440
agcc

Claims (8)

1.一种微生物，其特征在于其是从葡萄糖直接生成葡糖醛酸的微生物，其具有特异性氧化葡萄糖的羟甲基的能力，所述微生物的对应于16SrRNA的DNA碱基序列具有序列表中SEQ ID NO：1所示的碱基序列。
2.权利要求1的微生物，所述微生物的对应于16SrRNA的DNA碱基序列与SEQ ID NO：1所示的碱基序列具有97％以上的相同性。
3.权利要求1或2的微生物，所述微生物是保藏号为FERMBP-10820的Pseudogluconobacter saccharoketogenes Rh47-3株。
4.制造葡糖醛酸和/或葡糖醛酸内酯的方法，其特征在于：
将权利要求1-3中任一项的微生物或其处理物在葡糖醛酸发酵用反应体系中与葡萄糖接触，特异性氧化葡萄糖的羟甲基，从而生成葡糖醛酸和/或葡糖醛酸内酯。
5.权利要求4的方法，其中所述处理物是菌体破碎液、菌体提取液或它们的丙酮粉。
6.权利要求4的方法，其中将所述生成葡糖醛酸的反应体系的反应温度调整为10～45℃，将反应液的pH调至pH4～9。
7.权利要求4的方法，其在葡糖醛酸发酵过程中进行振荡或通气搅拌，将反应液中葡萄糖几乎被完全氧化的时间点作为反应终点。
8.权利要求4的方法，其
●浓缩含有生成的葡糖醛酸的反应液，
●接种葡糖醛酸金属盐的结晶而使结晶化，及
●分离纯化葡糖醛酸金属盐，
或者
●使反应液脱盐后经浓缩，
●接种葡糖醛酸内酯的结晶而使结晶化，及
●分离纯化葡糖醛酸内酯。
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