CN101668760B - 用作蛋白激酶抑制剂的氨基嘧啶类 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用作蛋白激酶抑制剂的化合物(I)。本发明还提供了包含那些化合物的药学上可接受的组合物和使用所述化合物和组合物治疗各种疾病，疾患和病症的方法。本发明还提供了制备本发明化合物的方法。

Description

用作蛋白激酶抑制剂的氨基嘧啶类

本发明的技术领域

本发明涉及用作蛋白激酶抑制剂的化合物。本发明还提供了包含那些化合物的药学上可接受的组合物和使用所述化合物和组合物治疗各种病症的方法。本发明还提供了制备本发明化合物的方法。

发明背景

糖原合酶激酶-3(GSK-3)为由各自被不同基因编码的α和β亚型组成的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶[Coghlan等，Chemistry &Biology 2000，7，793-803；和Kim和Kimmel，Curr.Opinion GeneticsDev.，2000 10，508-514]。蛋白激酶，特别是GSK-3涉及各种疾病，病症和疾患，包括糖尿病，阿尔茨海默病，亨廷顿病，肌萎缩性侧索硬化，帕金森病，双相型情感障碍，精神分裂症，脑中风和心脏肥大[PCT申请：WO 99/65897和WO 00/38675；Haq等，J.Cell Biol.2000，151，117-130；Hirotani等，Circulation Research 10 1，2007，pp.1164-1174]。

抑制GSK-3为治疗这些疾病，病症和疾患的理想手段。在心脏肥大中，活性GSK-3对抑制肥大而言可能是重要的。然而，阻断GSK-3表现为对防止肥大化心肌细胞而言是重要的[Haq等，J.CellBiol.2000，151，117-130；Hirotani等，Circulation Research 101，2007，pp.1164-1174]。

GSK-3调节与各种信号传导途径相关的多种下游效应物。这些蛋白包括为糖原合成所必需的限速酶的糖原合酶，微管相关蛋白Tau，β-连环蛋白的基因转录因子，转录起始因子e1 F2B和ATP柠檬酸裂解酶，轴蛋白，热激因子-1，c-Jun，c-myc，c-myb，CREB和CEPBα。这些不同蛋白靶标涉及细胞代谢，增殖，分化和发育中的许多方面中的GSK-3。

在GSK-3介导的涉及治疗I I型糖尿病的途径中，胰岛素-诱导的信号传导导致细胞葡萄糖摄取和糖原合成。沿该途径，GSK-3为胰岛素-诱导的信号的负调节物。一般而言，胰岛素的存在导致GSK-3介导的磷酸化抑制和糖原合酶失活。抑制GSK-3导致糖原合成和葡萄糖摄取增加[Klein等，PNAS 1996，93，8455-8459；Cross等，Biochem.J.1994，303，21-26)；Cohen，Biochem.Soc.Trans.1993，21，555-567；和Massillon等，Biochem J.1994，299，123-128]。然而，在胰岛素反应受损的糖尿病患者中，尽管存在相对高的胰岛素血中浓度，但是糖原合成和葡萄糖摄取仍然难以增加。这导致最终可能导致心血管疾病，肾衰竭和失明的急性和长期作用的异常高葡萄糖血中浓度。在这类患者中，正常胰岛素-诱导的GSK-3抑制难以出现。还报导在具有II型糖尿病的患者中，GSK-3得到超表达[参见PCT申请：WO 00/38675]。GSK-3的治疗抑制剂由此能够用于治疗患有对胰岛素反应受损的糖尿病患者。

GSK-3活性与阿尔茨海默病相关。该病的标志为聚集的β-淀粉样蛋白肽类形成的胞外斑块和tau蛋白形成胞内神经原纤维缠结。

还证实GSK-3抑制减少了阿尔茨海默病动物模型中的淀粉样蛋白-β肽类。参见435，438页，Phiel等，Nature 423，435-439(2003)。在3周期限内使用锂(GSK-3α抑制剂)治疗的超表达淀粉样前蛋白(APP)的小鼠显示淀粉样蛋白-β肽组织水平下降50％以上。

神经原纤维缠结包含超磷酸化Tau蛋白，其中Tau在异常位点上磷酸化。已知GSK-3使细胞和动物模型中的这些异常位点磷酸化。超表达GSK-3的条件转基因小鼠发生的AD的状况，包括tau高度磷酸化，神经元细胞凋亡和空间学习能力缺失。在这些小鼠中截断GSK-3恢复了正常行为，减少了Tau高度磷酸化和神经元细胞凋亡(Engel T等，J Neuro Sci，2006，26，5083-5090和Lucas等，EMBOJ，2001，20，27-39)。还证实GSK-3抑制剂防止细胞中Tau高度磷酸化[Lovestone等，Current Biology 1994，4，1077-86；和Brownlees等，Neuroreport 1997，8，3251-55]。

在文献中还报导了分别作为精神病和情感障碍，诸如精神分裂症和双极疾病的靶标的GSK-3。在与GSK-3活性增加相关的一组精神分裂症患者中鉴定了AKT单元型缺陷。GSK-3β的单一等位基因敲除导致作为躁狂行为模型中对苯丙胺反应的活动过度减弱。

已经证实用于治疗精神分裂症和双极疾病的几种抗精神病药和情绪稳定剂抑制GSK-3(Emamian等，Nat Genet，2004，36，131-137；Obrien等，J Neurosci，2004，24，6791-6798；Beaulieu等，PNAS，2004，101，5099-5104；Li等，Int J Neuropsychopharmacol，2006，pp 1-13；Gould TD，Expert Opin Ther Targets，2006，10，377-392)。此外，近期的专利US 2004/0039007中描述了在相关小鼠行为模型中表现出抗精神分裂症和抗焦虑作用的GSK-3抑制剂。

GSK-3活性与中风相关。Wang等证实已知的GSK-3抑制剂IGF-1(胰岛素生长因子-1)减小了大鼠中风模型暂时性中脑动脉闭塞(MCAO)后大鼠脑中的梗塞面积[Wang等，Brain Res 2000，859，381-5；Sasaki等，Neurol Res 2001，23，588-92；Hashimoto等，J.Biol.Chem 2002，277，32985-32991]。US 2004/0039007中描述了GSK-3抑制剂在大鼠中风模型MCAO中的作用。这些GSK-3抑制剂在大鼠中显著减轻了纹状体缺血性脑伤并且减少了水肿形成。另外，大鼠“在实验时间期限内表现出神经系统功能的显著改善”。

因所有上述原因，所以对研发用作蛋白激酶抑制剂的化合物存在需求。特别需要研发用作特别是指定目前用于涉及其活化的大部分病症的不适当治疗的GSK-3抑制剂的化合物。

发明概述

本发明提供了用作GSK-3蛋白激酶抑制剂的化合物及其药学上可接受的组合物。

这些化合物或其药学上可接受的盐由式I表示：其中变量如本文中所定义。

这些化合物在阻断GSK-3酶的酪氨酸自磷酸化形式方面具有超过丝氨酸/苏氨酸激酶形式的令人意外的选择性。这些化合物还令人意外地有效增加神经元细胞中的轴突和树突分枝，用于治疗神经变性疾患，诸如中风，阿尔茨海默病，帕金森病，亨廷顿病，肌萎缩性侧索硬化(ALS)多发性硬化(MS)，脊髓损伤，外伤性脑损伤，沙-马-图病，白细胞减少，糖尿病，糖尿病神经病变和骨质疏松症。

这些化合物还有效地作为修复，再生和细胞分化的化学调节剂。

本发明还提供了用于制备这些化合物，组合物，药物组合物的方法和使用这类化合物和组合物抑制蛋白激酶的方法。这些化合物特别用作GSK-3抑制剂。

这些化合物及其药学上可接受的组合物还用于治疗或预防各种疾病，病症或疾患，包括，但不限于自身免疫性，炎症性，增殖性或过度增殖性疾病或神经变性疾病或免疫介导的疾病。

本发明提供的化合物用于抑制体外，体内和离体的激酶。这些化合物还用于研究生物和病理现象中的激酶；研究这类激酶介导的胞内信号转导途径；和对新激酶抑制剂进行对比评价。发明详述本发明提供了式I的化合物或其药学上可接受的盐：

其中：R^X为C_1-3烷基；且R^Y为C_1-3烷基。

在某些实施方案中，R^X为甲基或乙基。在某些实施方案中，R^X为甲基。在某些实施方案中，R^Y为甲基。在某些实施方案中，R^X和R^Y均为甲基。在某些实施方案中，R^X为乙基且R^Y为甲基。

一个实施方案提供了如下表1中所示的化合物。表1

本发明的化合物包括一般上文所述的那些并且进一步由本文披露的类别，亚类和种类例证。除非另作陈述，否则应使用本文所用的下列定义。就本发明的目的而言，按照元素周期表，CAS版，Handbook of Chemistry and Physics，75^th Ed鉴定化学元素。另外，有机化学的一般原理描述在“Organic Chemistry”，Thomas Sorrell，University Science Books，Sausalito：1999和“March′s AdvancedOrganic Chemistry”，5^th Ed.，Ed.：Smith，M.B.和March，J.，JohnWiley & Sons，New York：2001中，将这些文献的全部内容引入本文作为参考。

本文所述的具体的原子数量范围包括其中任意的整数。例如，具有1-4个原子的基团可以具有1，2，3或4个原子。

本文所用的本发明化合物可以任选被一个或多个取代基取代，诸如一般如上文所述的那些或以本发明的具体类别，亚类和种类为典型。可以理解术语“任选取代的”可以与术语“取代或未取代的”互换使用。一般而言，本文所用的术语“取代的”之前无论是否存在本文所用的术语“任选”，都意旨在指定结构上的氢基被指定的取代基取代。除非另作陈述，否则任选取代的基团可以在该基团的每一可取代的位置上带有取代基，并且在任意指定的结构上的一个以上位置可以被一个以上选自指定基团的取代基取代时，该取代基在每一位置上可以相同或不同。本发明关注的取代基组合优选为导致形成稳定或化学上适宜的化合物的那些。

本文所用的术语“稳定的”意旨在为本文披露的一个或多个目的接触对其进行生产，检测，回收，纯化和应用的条件时基本上不改变的化合物。在某些实施方案中，稳定或化学上适宜的化合物为在没有湿度或其它化学反应条件存在下保存在40℃或40℃以下温度下时基本上至少1周不改变的化合物。

本文所用的术语“脂族化合物”或“脂族基团”意旨直链(即非支链)，支链或非支链的取代或未取代的烃链，其为完全饱和的或包含一个或多个不饱和单元并具有与分子剩余部分的单一连接点。除非另作陈述，否则，脂族基团包含1-20个脂族碳原子。在某些实施方案中，脂族基团包含1-10个脂族碳原子。在其它实施方案中，脂族基团包含1-8个脂族碳原子。在其它实施方案中，脂族基团包含1-6个脂族碳原子，且在其它实施方案中，脂族基团包含1-4个脂族碳原子。合适的脂族基团包括，但不限于直链或支链的取代或未取代的烷基，烯基或炔基。具体实例包括，但不限于甲基，乙基，异丙基，正-丙基，仲-丁基，乙烯基，正-丁烯基，乙炔基和叔-丁基。

本文所用的术语“烷基”意旨直链(即非支链)，支链或非支链的取代或未取代的烃链，其为完全饱和的并具有与分子剩余部分的单一连接点。除非另作陈述，否则，烷基包含1-6个烷基碳原子。在某些实施方案中，烷基包含1-4个烷基碳原子。在其它实施方案中，烷基包含1-3个烷基碳原子。实例包括，但不限于甲基，乙基，异丙基，正-丙基，仲-丁基，正-丁基和正-戊基。

本文所用的术语“脂环族化合物”(或“碳环”或“碳环基”或“环烷基”)意旨单环C₃-C₈烃或双环C₈-C₁₂烃，其为完全饱和的或包含一个或多个不饱和单元，但并非芳族的，并具有与分子剩余部分的单一连接点，其中在所述双环环系中的任意单环均具有3-7个成员。合适的脂环族基团包括，但不限于环烷基和环烯基。具体实例包括，但不限于环己基，环丙烯基和环丁基。

本文所用的术语“杂环”，“杂环基”或“杂环的”意旨非-芳族的单环，双环或三环环系，其中一个或多个环成员为独立选择的杂原子。在某些实施方案中，“杂环”，“杂环基”或“杂环的”基团具有3-14个环成员，其中一个或多个环成员为独立地选自氧，硫，氮或磷的杂原子并且所述系统上的每个环均包含3-7个环成员。

合适的杂环包括，但不限于3-1H-苯并咪唑-2-酮，3-(1-烷基)-苯并咪唑-2-酮，2-四氢呋喃基，3-四氢呋喃基，2-四氢噻吩基，3-四氢噻吩基，2-吗啉代，3-吗啉代，4-吗啉代，2-硫代吗啉代，3-硫代吗啉代，4-硫代吗啉代，1-吡咯烷基，2-吡咯烷基，3-吡咯烷基，1-四氢哌嗪基，2-四氢哌嗪基，3-四氢哌嗪基，1-哌啶基，2-哌啶基，3-哌啶基，1-吡唑烷基，3-吡唑烷基，4-吡唑烷基，5-吡唑烷基，1-哌啶基，2-哌啶基，3-哌啶基，4-哌啶基，2-噻唑烷基，3-噻唑烷基，4-噻唑烷基，1-咪唑烷基，2-咪唑烷基，4-咪唑烷基，5-咪唑烷基，二氢吲哚基，四氢喹啉基，四氢异喹啉基，苯并硫戊环(benzothiolane)，苯并二噻烷和1，3-二氢-咪唑-2-酮。

环状基团(例如脂环族基团和杂环)可以为线性稠合，桥连或螺环的。

本文所用的术语“杂原子”意旨氧，硫，氮或磷中的一个或多个(包括氮，硫或磷的任意氧化形式；任意碱性氮的季铵化形式；或杂环的可取代的氮，例如N(作为在3，4-二氢-2H-吡唑基中)，NH(作为在吡咯烷基中)或NR⁺(作为在N-取代的吡咯烷基中))。

本文所用的术语“不饱和的”意旨带有一个或多个不饱和单元的结构部分。

本文所用的术语“烷氧基”或“烷硫基”意旨如上述定义的通过氧(“烷氧基”)或硫(“烷硫基”)原子与主碳链连接的烷基。

术语“卤代烷基”，“卤代烯基”，“卤代脂族基团”和“卤代烷氧基”意旨烷基，烯基或烷氧基，就此而言，可以被一个或多个卤原子取代。术语“卤素”，“卤代”和“hal”意旨F，Cl，Br或I。

术语“芳基”单独使用或作为“芳烷基”，“芳烷氧基”或“芳氧基烷基”的较大结构部分的组成部分意旨总计带有5-14个环成员的单环，双环和三环环系，其中所述系统中的至少一个环为芳族的且其中所述系统中的每个环包含3-7个环成员。本文所用的术语“芳基”可以与本文所用的术语“芳基环”互换使用。本文所用的术语“芳基”还意旨如下文定义的芳基环系。

本文所用的术语“杂芳基”单独使用或作为“杂芳烷基”或“杂芳基烷氧基”的较大结构部分的组成部分意旨总计带有5-14个环成员的单环，双环和三环环系，其中所述系统中的至少一个环为芳族的，所述系统中至少一个环包含一个或多个杂原子且其中所述系统中的每个环包含3-7个环成员。本文所用的术语“杂芳基”可以与本文所用的术语“杂芳基环”或本文所用的术语“杂芳族化合物”互换使用。合适的杂芳基环包括，但不限于2-呋喃基，3-呋喃基，N-咪唑基，2-咪唑基，4-咪唑基，5-咪唑基，苯并咪唑基，3-异噁唑基，4-异噁唑基，5-异噁唑基，2-噁唑基，4-噁唑基，5-噁唑基，N-吡咯基，2-吡咯基，3-吡咯基，2-吡啶基，3-吡啶基，4-吡啶基，2-嘧啶基，4-嘧啶基，5-嘧啶基，哒嗪基(例如3-哒嗪基)，2-噻唑基，4-噻唑基，5-噻唑基，四唑基(例如5-四唑基)，三唑基(例如2-三唑基和5-三唑基)，2-噻吩基，3-噻吩基，苯并呋喃基，苯并噻吩基，吲哚基(例如2-吲哚基)，吡唑基(例如2-吡唑基)，异噻唑基，1，2，3-噁二唑基，1，2，5-噁二唑基，1，2，4-噁二唑基，1，2，3-三唑基，1，2，3-噻二唑基，1，3，4-噻二唑基，1，2，5-噻二唑基，嘌呤基，吡嗪基，1，3，5-三嗪基，喹啉基(例如2-喹啉基，3-喹啉基，4-喹啉基)和异喹啉基(例如1-异喹啉基，3-异喹啉基或4-异喹啉基)。

本文所用的术语“保护基”和“保护基团”可以互换使用并且意旨用于暂时打断多官能化合物上的一个或多个所需反应位点的试剂。在某些实施方案中，保护基具有下列特征中的一个或多个，或优选其全部：a)选择性加入到官能基上以良好产率得到被保护的底物；b)其对其它反应位点中的一个或多个上发生的反应稳定；和c)用不攻击再生的脱保护的官能基的反应剂以良好产率选择性除去。典型的保护基详细描述在Greene，T.W.，Wuts，P.G的“Protective Groupsin Organic Synthesis”，Third Edition，John Wiley & Sons，NewYork：1999(和该书的其它版本)中，将这些文献的全部内容引入本文作为参考。本文所用的术语“氮保护基”意旨用于暂时打断多官能化合物上的一个或多个所需的氮反应位点的试剂。优选的氮保护基还具有上述典型特征，并且某些典型的氮保护基也详细描述在Greene，T.W.，Wuts，P.G的“Protective Groups in Organic Synthesis”，第3版，John Wiley & Sons，New York：1999中的第7章中，将这些的全部内容引入本文作为参考。

在某些实施方案中，烷基或脂族链可以任选被另一个原子或基团取代。这类原子或基团的实例可以包括，但不限于-NR-，-O-，-S-，-CO₂-，-OC(O)-，-C(O)CO-，-C(O)-，-C(O)NR-，-C(＝N-CN)，-NRCO-，-NRC(O)O-，-SO₂NR-，-NRSO₂-，-NRC(O)NR-，-OC(O)NR-，-NRSO₂NR-，-SO-或-SO₂-，其中R如本文定义。除非另作陈述，否则，任选的取代形成化学上稳定的化合物。任选的取代可以发生在链内和链末端上；即在连接点和/或也在末端上。两个任选的取代也可以在链内彼此相邻，以便产生化学上稳定的化合物。任选的取代还可以完全取代链上的所有碳原子。例如，C₃脂族基团可以任选被-NR-，-C(O)-和-NR-打断或取代而形成-NRC(O)NR-(脲)。

除非另作陈述，否则，如果取代发生在末端上，那么取代原子与末端上的H结合。例如，如果-CH₂CH₂CH₃任选被-O-取代，那么所得化合物可以为-OCH₂CH₃，-CH₂OCH₃或-CH₂CH₂OH。

除非另作陈述，否则，本文所示的结构还意旨包括该结构的所有异构体(例如对映异构体，非对映异构体和几何(或构象))形式；例如，不对称中心(Z)和(E)双键异构体和(Z)和(E)构象异构体各自的R和S构型。因此，本发明化合物的单一立体化学异构体和对映异构体，非对映异构体和几何(或构象)混合物属于本发明的范围。

除非另作陈述，否则本发明的所有互变体形式属于本发明的范围。

除非另作陈述，否则取代基可以围绕任意可旋转的键自由旋转。例如，绘制为

的取代基也表示

另外，除非另作陈述，否则本文所示的结构还意旨包括仅在有一个或多个富含同位素的原子存在下不同的化合物。例如，具有本发明结构，但用氘或氚取代氢或用富含¹³C-或¹⁴C的碳取代碳的化合物属于本发明的范围。例如，这类化合物用作生物试验中的分析工具或探针。

还可以理解本发明的化合物可以以游离形式存在以便用于治疗，或如果合适，作为药学上可接受的盐，多种盐或其混合物的形式存在。

本文所用的术语“药学上可接受的盐”意旨在合理医学判断范围内适用于接触人体组织和低等动物，但无过度毒性，刺激，过敏反应并且与合理的有益/风险比相当的化合物的盐。

药学上可接受的盐为本领域众所周知的。例如，S.M.Berge等在J.Pharmaceutical Sciences，1977，66，1-19中详细描述了药学上可接受的盐，将该文献引入本文作为参考。本发明化合物的药学上可接受的盐包括衍生自合适的无机和有机酸和碱的那些。可以在化合物的最终分离和纯化过程中在原位制备这些盐。可以通过下列步骤制备酸加成的盐：1)使游离碱形式的纯化的化合物与合适的有机或无机酸反应和2)分离由此形成的盐。

药学上可接受的无毒性酸加成的盐的实例为使用无机酸或有机酸或通过使用本领域中使用的方法，诸如离子交换形成的氨基的盐。其它药学上可接受的盐包括己二酸盐，藻酸盐，抗坏血酸盐，天冬氨酸盐，苯磺酸盐，苯甲酸盐，硫酸氢盐，硼酸盐，丁酸盐，樟脑酸盐，樟脑磺酸盐，柠檬酸盐，环戊烷丙酸盐，二葡糖酸盐，十二烷基硫酸盐，乙磺酸盐，甲酸盐，富马酸盐，葡庚糖酸盐，甘油磷酸盐，乙醇酸盐，葡糖酸盐，半硫酸盐，庚酸盐，己酸盐，氢碘酸盐，2-羟基-乙磺酸盐，乳糖酸盐，乳酸盐，月桂酸盐，十二烷基硫酸盐，苹果酸盐，马来酸盐，丙二酸盐，甲磺酸盐，2-萘磺酸盐，烟酸盐，硝酸盐，油酸盐，草酸盐，棕榈酸盐，扑酸盐，果胶酸盐，过硫酸盐，3-苯基丙酸盐，磷酸盐，苦味酸盐，新戊酸盐，丙酸盐，水杨酸盐，硬脂酸盐，琥珀酸盐，硫酸盐，酒石酸盐，硫氰酸盐，对-甲苯磺酸盐，十一酸盐，戊酸盐等。衍生自合适的碱的盐包括碱金属，碱土金属，铵和N⁺(C_1-4烷基)₄的盐。本发明还关注本文披露的任意含碱性氮的化合物基团的季铵化。可以通过这类季铵化获得水或油-溶性或可分散的产物。

可以通过下列步骤制备碱加成的盐：1)使酸式纯化化合物与合适的有机或无机碱反应和2)分离由此形成的盐。碱加成的盐包括碱金属或碱土金属盐。有代表性的碱金属或碱土金属盐包括钠，锂，钾，钙，镁等。如果合适，额外的药学上可接受的盐包括使用抗衡离子，诸如卤化物，氢氧化物，羧化物，硫酸盐，磷酸盐，硝酸盐，低级烷基磺酸盐和芳基磺酸盐形成的无毒性的铵，季铵和胺阳离子。尽管自身并非药学上可接受的，但是其它酸和碱可以用于制备用作获得本发明化合物及其药学上可接受的酸或碱加成的盐的中间体。

使用下列缩写：DCM      二氯甲烷EtOAc    乙酸乙酯DMSO     二甲亚砜ATP      腺苷三磷酸DTT      二硫苏糖醇NMR      核磁共振HPLC     高效液相色谱法LCMS     液相色谱法-质谱法TLC      薄层色谱法Rt       保留时间HEPES    4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸FBS      胎牛血清PVDF     聚偏氟乙烯PBST     含Tween 20的磷酸盐缓冲盐溶液TCF/LEF  T细胞因子/淋巴样强化因子DIPEA    二异丙基乙胺

本发明提供了用作蛋白激酶抑制剂的化合物和组合物。在某些实施方案中，所述的蛋白激酶为GSK-3激酶。

作为蛋白激酶抑制剂，本发明的化合物和组合物特别用于治疗或减轻疾病，疾患或病症的严重性，其中所述的疾病，疾患或病症牵涉到蛋白激酶。本发明在一个方面中提供了治疗或减轻疾病，疾患或病症的严重性的方法，其中所述的疾病状态牵涉到蛋白激酶。本发明在另一个方面中提供了治疗或减轻疾病，疾患或病症的严重性，其中治疗所述的疾病牵涉到抑制酶活性。本发明在另一个方面中提供了使用通过结合蛋白激酶抑制酶活性的化合物治疗或减轻疾病，疾患或病症的严重性的方法。另一个方面提供了通过使用蛋白激酶抑制剂抑制酶活性治疗或减轻疾病，疾患或病症的严重性的方法。

在某些实施方案中，所述的蛋白激酶抑制剂为GSK-3抑制剂。

作为蛋白激酶抑制剂，本发明的化合物和组合物还用于生物样品。本发明的一个方面涉及抑制生物样品中蛋白激酶活性，该方法包括使所述的生物样品接触式I的化合物或包含该化合物的组合物。本文所用的术语“生物样品”意旨体外或离体样品，包括，但不限于细胞培养物或其提取物；获自哺乳动物的活检材料或其提取物；和血液，唾液，尿，粪便，精液，泪液或其它体液或其提取物。本文所用的术语“生物样品”不意旨体内样品。

抑制生物样品中的蛋白激酶活性用于本领域技术人员公知的各种目的。这类目的的实例包括，但不限于输血，器官移植和生物样本储存。

本发明的另一个方面涉及生物学和病理学现象中的蛋白激酶研究；这类蛋白激酶介导的胞内信号转导的研究；和新蛋白激酶抑制剂的对比评价。这类应用的实例包括，但不限于生物测定，诸如酶的测定和基于细胞的测定。

可以在体外，体内或细胞系中测定化合物作为蛋白激酶抑制剂的活性。体外测定法包括测定激酶活性或活化的激酶的ATPase活性抑制的测定法。可选择的体外测定法对抑制剂结合蛋白激酶的能力进行了定量，并且可以通过在结合前放射性标记抑制剂，分离抑制剂/激酶复合物并且测定结合的放射性标记的量或通过进行竞争性实验进行测定，在竞争性实验中，将新的抑制剂与结合已知放射性配体的激酶一起孵育。

抑制GSK-3活性与干细胞增殖，分化和神经元可塑性和血管发生相关。这些不同的功能涉及修复和再生。已经证实GSK-3抑制剂支持胚胎干细胞自我更新，促进神经元β-细胞，骨髓和成骨细胞分化(Sato等，Nature Medicine 10，55-63，2004；Ding等，PNAS 100，7632-37，2003；Branco等，J Cell Science 117，5731-37，2004；Trowbridge等，Nature Medicine 12，89-98，2006；Mussmann等，JBC(Epub ahead of print)2007；Kulkarni等，Journal of Bone andMineral Res.21，910-920，2006)。由于神经元可塑性，已经证实GSK-3对调节极性，长时程增强效应(LTP)和神经突/轴突生长而言是重要的(Hooper等，European J of Neuroscience 25，81-86，2007；Kim等，Neuron 52，981-996，2006；Jiang等，Cell 120，123-135，2005)。还证实抑制GSK-3诱导内皮细胞中的血管发生(Skurk等，Circulation Research 96，308-318，2005)。

因此，本发明的一个方面提供了用于细胞修复和再生的化合物。在某些实施方案中，所述的化合物用于促进细胞增殖，细胞分化，神经元可塑性或血管发生。在某些实施方案中，所述的化合物为细胞分化的化学调节剂。在其它实施方案中，所述的化合物为修复和再生的化学调节剂。

在某些实施方案中，所述的化合物用于增加神经元细胞中的轴突和树突分枝。在某些实施方案中，所述的化合物用于促进神经可塑性。在其它实施方案中，所述的化合物用于促进血管发生。在其它实施方案中，所述的化合物用于促进神经发生。在其它实施方案中，所述的化合物用于治疗神经精神病，诸如躁狂和抑郁症。

另一个实施方案提供了用于通过促进β细胞再生治疗糖尿病的化合物。

另一个实施方案提供了用于通过骨胚细胞样转化治疗骨质疏松症的化合物。

GSK-3作为与DYRK激酶家族类似的酪氨酸和丝氨酸/苏氨酸激酶起作用。类似于DYRK激酶家族，GSK-3使其激酶结构域上的关键酪氨酸残基(GSK-3a，Tyr 279和GSK-3b，Tyr 216)自磷酸化。已经证实这种酪氨酸磷酸化对正面调节激酶活性而言是重要的。Locheed等证实这种自磷酸化发生在成熟前的转录后中间步骤时的分子内，并且为蛋白伴侣依赖性的(Lochhead等，Molecular Cell 24，(2006)，pp.627-633)。在成熟后，GSK-3失去了其酪氨酸激酶活性并且唯一地作为针对外源性底物的丝氨酸和苏氨酸激酶起作用。

β-连环蛋白为GSK-3磷酸化的外源性丝氨酸/苏氨酸底物之一。抑制β-连环蛋白磷酰化导致b-连环蛋白水平增加，由此易位至核并且转录控制许多涉及细胞应答和功能的基因。一种对GSK-3抑制剂潜在安全性的关注在于使用这些抑制剂可能通过β-连环蛋白诱导导致增殖过度。因为丝氨酸/苏氨酸激酶GSK-3主要对许多信号传导途径是关键的，这些途径控制多种细胞活性，诸如增殖，分化和代谢。

因此，本发明的一个方面提供了可以部分地减弱GSK-3活性而不会完全阻断酶和影响多种底物，诸如β-连环蛋白的化合物。一个实施方案提供了选择性抑制酶的酪氨酸自磷酸化形式而超过了对丝氨酸/苏氨酸激酶形式的化合物。

在某些实施方案中，所述的酶为GSK-3α；在其它实施方案中，所述的酶为GSK-3β。在某些实施方案中，所述的化合物具有的至少25倍且至多100倍的β-连环蛋白：GSK-3β窗。在某些实施方案中，所述的化合物具有的至少30倍的β-连环蛋白：GSK-3β窗。在其它实施方案中，所述的化合物具有的至少400倍且至多500倍的β-连环蛋白：GSK-3α窗。

令人意外的是，相对于丝氨酸/苏氨酸激酶形式而言选择性抑制GSK-3酶的酪氨酸形式自磷酸化的化合物诸如通过增加神经元细胞中的轴突和树突分枝促进神经元生长和树突形成。增加神经元生长和树突形成为有利的并且在治疗许多类型的变性疾患时提供了令人意外和改善的治疗功效，诸如中风，中风后，脊髓损伤，外伤性脑损伤，阿尔茨海默病，帕金森病，亨廷顿病，多发性硬化，肌萎缩性侧索硬化，糖尿病神经病变，沙-马-图病，白细胞减少，糖尿病和骨质疏松症。

相对于丝氨酸/苏氨酸激酶形式而言选择性抑制GSK-3酶的酪氨酸形式自磷酸化的化合物还促进血管发生，这是有利的并且在治疗许多类型的变性疾患，诸如本文所列的那些时提供了令人意外和改善的治疗功效。

本发明的另一个方面提供了用于治疗疾病，病症和疾患的化合物，所述疾病，病症和疾患包括，但不限于自身免疫疾病，炎性疾病，增殖和过度增殖性疾病，免疫介导的疾病，免疫缺陷病症，免疫调节或免疫抑制病症，骨疾病，代谢性疾病，神经和神经变性疾病，神经营养因子，心血管疾病，激素相关疾病，糖尿病，过敏反应，哮喘和阿尔茨海默病。本发明的另一个方面提供了为蛋白激酶抑制剂且由此用于治疗疾病，病症和疾患与本文所述的其它应用的化合物。

另一个方面提供了包含本文所述的任意化合物且任选包含药学上可接受的载体，佐剂或媒介物的药学上可接受的组合物。在某些实施方案中，这些组合物任选进一步包含一种或多种额外的治疗剂。

本发明的一个方面提供了用于治疗或减轻疾病，病症或疾患的严重性的方法，所述的疾病，病症或疾患选自自身免疫疾病，炎性疾病，增殖和过度增殖性疾病，诸如癌症，免疫介导的疾病，免疫缺陷病症，骨疾病，代谢性疾病，神经和神经变性疾病，心血管疾病，过敏反应，哮喘，阿尔茨海默病或激素相关疾病，该方法包括对有此需要的受试者给予有效量的化合物或包含化合物的药学上可接受的组合物。

本文所用的术语“癌症”包括，但不限于下列癌症：表皮样瘤，口腔：口腔，唇，舌，口，咽；心脏：肉瘤(血管肉瘤，纤维肉瘤，横纹肌肉瘤，脂肪肉瘤)，粘液瘤，横纹肌瘤，纤维瘤，脂肪瘤和畸胎瘤；肺：支气管原癌(鳞状细胞或表皮样，分化不良型小细胞，分化不良型大细胞，腺癌)，肺泡(细支气管)癌，支气管腺瘤，肉瘤，淋巴瘤，软骨错构瘤，间皮瘤；胃肠：食道(鳞状细胞癌，喉，腺癌，平滑肌肉瘤，淋巴瘤)，胃(癌，淋巴瘤，平滑肌肉瘤)，胰腺(导管导管，胰岛素瘤，胰高血糖素瘤，胃泌素瘤，类癌瘤，胰腺瘤)，小肠(smallbowel)或小肠(small intestines)(腺癌，淋巴瘤，类癌瘤，卡波西肉瘤，平滑肌瘤，血管瘤，脂肪瘤，神经纤维瘤，纤维瘤)，大肠(largebowel)或大肠(large intestines)(腺癌，管状腺瘤，绒毛状腺瘤，错构瘤，平滑肌瘤)，结肠，结肠-直肠，结肠直肠；直肠，泌尿生殖道：肾(腺癌，维尔姆斯瘤[肾母细胞瘤]，淋巴瘤，白血病)，膀胱和尿道(鳞状细胞癌，过渡细胞癌，腺癌)，前列腺(腺癌，肉瘤)，睾丸(精原细胞瘤，畸胎瘤，胚胎性癌，畸胎癌，绒毛膜癌，肉瘤，间质细胞癌，纤维瘤，纤维腺瘤，腺瘤样瘤，脂肪瘤)；肝：肝细胞瘤(肝细胞癌)，胆管上皮癌，肝胚细胞瘤，血管肉瘤，肝细胞性腺瘤，血管瘤，胆道；骨：成骨性肉瘤(骨肉瘤)，纤维肉瘤，恶化纤维组织细胞瘤，软骨肉瘤，尤因肉瘤，恶性淋巴瘤(网状细胞肉瘤)，多发性骨髓瘤，恶性巨细胞瘤脊索瘤，osteochronfroma(骨软骨外生骨疣)，良性软骨瘤，软骨母细胞瘤，软骨粘液纤维瘤，骨样骨瘤和巨细胞瘤；神经系统：头盖骨(骨瘤，血管瘤，肉芽肿，黄瘤，变形性骨炎)，脑膜(脑膜瘤，脑膜肉瘤，神经胶质瘤病)，脑(星形细胞瘤，髓母细胞瘤，神经胶质瘤，室管膜瘤，生殖细胞瘤[松果体瘤]，多形性成胶质细胞瘤，少突神经胶质瘤，许旺细胞瘤，视网膜母细胞瘤，先天性肿瘤)，脊髓神经纤维瘤，脑膜瘤，神经胶质瘤，肉瘤)；妇科：子宫(子宫内膜癌)，宫颈(宫颈癌，肿瘤前期宫颈发育不良)，卵巢(卵巢癌[浆液囊腺癌，粘液囊腺癌，无类别癌]，粒膜细胞瘤，塞尔托利-莱迪希细胞瘤，无性细胞瘤，无性细胞瘤)，外阴(鳞状细胞癌，上皮内癌，腺癌，纤维肉瘤，黑素瘤)，阴道(透明细胞癌，鳞状细胞癌，葡萄形肉瘤(胚胎型横纹肌肉瘤)，输卵管(癌)，乳腺；血液：血(髓样白血病[急性和慢性]，急性成淋巴细胞性白血病，慢性淋巴细胞性白血病，骨髓增生性疾病，多发性骨髓瘤，骨髓增生异常综合征)，何杰金病，非何杰金淋巴瘤[恶性淋巴瘤]毛细胞；淋巴样病症；皮肤：恶性黑素瘤，基底细胞癌，鳞状细胞癌，卡波西肉瘤，角化棘皮瘤，发育异常痣，脂肪瘤，血管瘤，皮肤纤维瘤，疤痕疙瘩，银屑病，甲状腺：乳头状甲状腺癌，滤泡性甲状腺癌；甲状腺髓样癌，分化不良型甲状腺癌，2A型多内分泌性腺瘤形成，2B型多内分泌性腺瘤形成，家族性甲状腺髓样癌，嗜铬细胞瘤，副神经节瘤；和肾上腺：神经细胞瘤。因此，本文提供的术语“癌细胞”包括患有上述鉴定的疾患中任意一种的细胞。在某些实施方案中，所述的癌症选自结肠直肠，甲状腺或乳腺癌。

在某些实施方案中，化合物或药学上可接受的组合物的“有效量”为有效治疗所述疾病的用量。可以使用有效治疗或减轻所述疾病严重性的任意用量和任意给药途径给予本发明方法的化合物和组合物。在某些实施方案中，所述的疾病选自过敏性或I型超敏反应，哮喘，糖尿病，阿尔茨海默病，亨廷顿病，帕金森病，AIDS-相关痴呆，双相型情感障碍，肌萎缩性侧索硬化(ALS，Lou Gehrig病)，多发性硬化(MS)，精神分裂症，白细胞减少，心肌细胞肥大，再灌注/局部缺血，中风，脱发，移植物抗宿主病，类风湿性关节炎和实体恶性肿瘤和恶性血液病。在某些实施方案中，所述的疾病选自糖尿病，双相型情感障碍，精神分裂症，中风，亨廷顿病，白细胞减少和心肌细胞肥大。在本发明的某些实施方案中，所述的疾病为蛋白-激酶介导的疾患。在某些实施方案中，所述的蛋白激酶为GSK-3。

本文所用的术语“蛋白-激酶介导的疾患”意旨任意的其中蛋白激酶起作用疾病或其它有害疾患。这类疾患包括，但不限于自身免疫疾病，炎性疾病，增殖和过度增殖性疾病，免疫介导的疾病，免疫缺陷病症，免疫调节或免疫抑制病症，骨疾病，代谢性疾病，神经和神经变性疾病，心血管疾病，激素相关疾病，糖尿病，过敏反应，哮喘和阿尔茨海默病。

本文所用的术语“GSK-3-介导的疾患”意旨任意的其中GSK-3起作用的疾病或其它有害疾患。这类疾患包括，但不限于糖尿病，糖尿病神经病变，骨质疏松症，阿尔茨海默病，亨廷顿病，帕金森病，AIDS-相关痴呆，双相型情感障碍，肌萎缩性侧索硬化(ALS，LouGehrig病)，多发性硬化(MS)，精神分裂症，白细胞减少，心肌细胞肥大，中风，脊髓损伤，外伤性脑损伤，沙-马-图病和类风湿性关节炎。

在某些实施方案中，所述的疾病为变性疾患。在某些实施方案中，所述的变性疾患选自中风，中风后恢复，阿尔茨海默病，帕金森病，亨廷顿病，肌萎缩性侧索硬化(ALS)，多发性硬化(MS)，脊髓损伤，外伤性脑损伤，沙-马-图病，白细胞减少，糖尿病，糖尿病神经病变和骨质疏松症。

在某些实施方案中，在某些实施方案中，所述的疾病为神经变性疾患。在另一个实施方案中，所述的神经变性疾患选自中风，中风后恢复，阿尔茨海默病，帕金森病，亨廷顿病，肌萎缩性侧索硬化(ALS)，多发性硬化(MS)，脊髓损伤，外伤性脑损伤和沙-马-图病。

一个实施方案提供了增加神经元细胞中轴突和树突分枝的方法，所述的方法包括使所述的细胞接触本文所述的化合物的步骤。另一个实施方案提供了促进神经可塑性的方法，所述的方法包括使所述的细胞接触本文所述的化合物的步骤。另一个实施方案提供了促进血管发生的方法，所述的方法包括使所述的细胞接触本文所述的化合物的步骤。另一个实施方案提供了治疗神经精神病，诸如躁狂和抑郁症的方法，所述的方法包括对患者给予本文所述的化合物。

按照本发明的一个方面，所述的神经变性疾病为中风。在某些实施方案中，所述的化合物用于在中风恢复过程中治疗中风患者。在某些情况中，所述的化合物用于中风后给药。治疗期限可以在1个月-1年。在某些实施方案中，在中风发生后给予所述的化合物。在某些实施方案中，所述的给药在局部缺血后即刻进行。在其它实施方案中，所述的给药在局部缺血后48小时到局部缺血后6个月进行。在某些实施方案中，将所述的化合物与其它形式的中风恢复治疗，诸如物理疗法联用。

另一个实施方案提供了治疗糖尿病的方法，所述的方法包括使β细胞接触本文所述的化合物的步骤。在某些实施方案中，所述的化合物促进β细胞再生。

另一个实施方案提供了治疗骨质疏松症的方法，所述的方法包括使骨细胞接触本文所述的化合物的步骤。在某些实施方案中，所述的化合物促进细胞中成骨细胞生成(osteoblastogenesis)。

还可以理解本发明化合物中的某些可以以游离形式存在以便用于治疗，或如果合适，作为其药学上可接受的盐或药学上可接受的衍生物存在。

应理解本发明包括不同药学上可接受的盐的混合物/组合，并且还包括游离形式和药学上可接受的盐形式的化合物的混合物/组合。

如本文所述，本发明药学上可接受的组合物还包含药学上可接受的载体，佐剂或媒介物，正如本文使用的，它们包括任意和所有的溶剂，稀释剂或其它液体媒介物，分散或悬浮助剂，表面活性剂，等渗剂，增稠剂或乳化剂，防腐剂。固体粘合剂，润滑剂等，以便适合于期望的具体剂型。Remington′s Pharmaceutical Sciences，Sixteenth Edition，E.W.Martin(Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1980)中披露了用于配制药学上可接受的组合物的各种载体和用于其制备的公知技术。除任何常用的与本发明化合物不相容的载体介质外，诸如通过它们产生任何不需要的生物作用，否则就是以有害方式与药学上可接受的组合物中的其它成分发生相互作用，在本发明范围内关注其应用。

可以用作药学上可接受的载体的物质的某些实例包括，但不限于离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白，诸如人血清清蛋白，缓冲物质，诸如磷酸盐，甘氨酸，山梨酸或山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物，水，盐或电解质，诸如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶态二氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，聚丙烯酸酯类，蜡，聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物，羊毛脂，糖类，诸如乳糖，葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠，乙基纤维素和乙酸纤维素；西黄蓍胶粉；麦芽；明胶；滑石粉；赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；油，诸如花生油，棉籽油；红花油；芝麻油；橄榄油；玉米油和大豆油；乙二醇类；诸如丙二醇或聚乙二醇；酯类，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；藻酸；无热原水；等渗盐水；林格液；乙醇和磷酸盐缓冲溶液，和其它无毒性相容性润滑剂，诸如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，且根据配制者的判断，着色剂，释放剂，包衣衣料，甜味剂，矫味剂和香味剂，防腐剂和抗氧化剂也可以存在于组合物中。

可以将蛋白激酶抑制剂或其药学上可接受的盐配制成用于对动物或人体给药的药物组合物。包含有效治疗或预防蛋白激酶-介导的疾患的用量的蛋白抑制剂和药学上可接受的载体的这些药物组合物为本发明的另一个实施方案。在某些实施方案中，所述的蛋白激酶-介导的疾患为GSK-3-介导的疾患。在某些实施方案中，为GSK-3-介导的疾患。

治疗所需化合物的确切量在受试者与受试者之间可变，这取决于受试者的种类，年龄和一般状况，感染的严重性，具体的活性剂，其给药方式等。优选将本发明的化合物配制成易于给药和剂量均匀的单位剂型。本文所用的表达方式“单位剂型”意旨适合于治疗患者的活性剂的物理分散单位。然而，可以理解本发明化合物和组合物的总每日应用由主治医师在合理医学判断范围内决定。任何具体患者或生物体的具体有效剂量水平取决于各种因素，包括所治疗的病症和病症的严重性；所用具体化合物的活性；所用的具体组合物；患者的年龄，体重，一般健康状况，性别和膳食；给药时间，给药途径和所用具体化合物的排泄速率；治疗期限；联合用药中或与所用具体化合物同时使用的药物等医学领域众所周知的因素。本文所用的术语“患者”意旨动物，优选哺乳动物且最优选人。

可以将本发明药学上可接受的组合物通过口服，直肠，非肠道，脑池内，阴道内，腹膜内，局部(如通过粉末，软膏剂或滴剂)，口含，作为口腔或鼻部喷雾剂等对人体和其它动物给药，这取决于所治疗感染的严重性。在某些实施方案中，可以通过口服或非肠道以约0.01mg/kg-约50mg/kg且优选约1mg/kg-约5mg/kg受试者体重/天的剂量水平给予本发明的化合物，每日一次或多次，以便获得期望的治疗作用。

用于口服给药的液体剂型包括，但不限于药学上可接受的乳剂，微乳，溶液，糖浆剂和酏剂。除活性化合物外，液体剂型还可以包含本领域中常用的惰性稀释剂，诸如，例如水或其它溶剂，包括增溶剂和乳化剂，诸如乙醇，异丙醇，碳酸乙酯，乙酸乙酯，苄醇，苯甲酸苄酯，丙二醇，1，3-丁二醇，二甲基甲酰胺，油(特别是棉籽油，花生油，玉米油，胚油，橄榄油，蓖麻油和芝麻油)，甘油，四氢糠醇，聚乙二醇类和失水山梨糖醇的脂肪酸酯类及其混合物。除惰性稀释剂外，口服组合物还可以包括佐剂，诸如湿润剂，乳化剂和悬浮剂，甜味剂，矫味剂和香味剂。

可以按照本领域公知的方式，使用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂配制可注射制剂，例如无菌可注射水或油混悬液。无菌可注射制剂还可以为在无毒性非肠道可接受稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液，混悬液或乳剂，例如，作为在1，3-丁二醇中的溶液。在可以使用的可接受的媒介物和溶剂中有水，林格液U.S.P.和等渗氯化钠溶液。此外，无菌固定油常用作溶剂或悬浮介质。为了该目的，可以使用任意温和的固定油，包括合成的单酸甘油酯类或甘油二酯类。此外，脂肪酸，诸如油酸用于制备注射剂。

例如，可以通过经截留细菌的滤膜过滤或通过掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂给可注射制剂灭菌，可以在使用前将其溶于或分散于水或其它可注射介质中。

为了延长本发明化合物的作用，通常需要延缓化合物从皮下或肌内注射中吸收。可以通过使用具有极低水溶性的结晶或非晶形物质的液体混悬液实现这一目的。化合物的吸收速率随即取决于其溶出速率，由此可以取决于晶体粒度和晶型。可选择地，延缓非肠道给药的化合物吸收通过将化合物溶于或悬浮于油媒介物中进行。通过形成化合物在生物可降解聚合物，诸如聚丙交酯-聚乙交酯中的微囊基质制备可注射长效剂型。根据化合物与聚合物的比例和具体使用的聚合物的性质的不同，可以控制化合物的释放速率。其它生物可降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。还通过将化合物截留在与身体组织相容的脂质体或微乳内制备长效可注射制剂。

直肠或阴道给药的组合物优选为栓剂，可以通过将本发明的化合物与合适的无刺激性赋形剂或载体，诸如可可脂，聚乙二醇或栓剂蜡混合制备它们，所述的栓剂蜡在环境温度下为固体，而在体温下为液体，且由此在直肠或阴道内熔化并且释放活性化合物。

用于口服给药的固体剂型包括胶囊，片剂，丸剂，粉剂和颗粒。在这类固体剂型中，将活性化合物与至少一种惰性药学上可接受的赋形剂或载体混合，诸如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或a)填充剂或增充剂，诸如淀粉，乳糖，蔗糖，葡萄糖，甘露糖醇和硅酸，b)粘合剂，诸如，例如，羧甲基纤维素，藻酸盐，明胶，聚乙烯吡咯烷酮，蔗糖和阿拉伯树，c)保湿剂，诸如甘油，d)崩解剂，诸如琼脂，碳酸钙，马铃薯或木薯淀粉，藻酸，某些硅酸盐和碳酸钠，e)溶解阻滞剂，诸如石蜡，f)吸收促进剂，诸如季铵化合物，g)湿润剂，诸如，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯，h)吸收剂，诸如高岭土和皂粘土和i)润滑剂，诸如滑石粉，硬脂酸钙，硬脂酸镁，固体聚乙二醇类，十二烷基硫酸钠及其混合物。就胶囊，片剂和丸剂而言，剂型还可以包含缓冲剂。

相似类型的固体组合物也可以用作使用诸如乳糖(lactose)或乳糖(milk sugar)和高分子量聚乙二醇类等这类赋形剂的软和硬胶囊中的填充剂。可以使用包衣衣料和壳，诸如肠溶衣和其它制药领域众所周知的包衣衣料制备片剂，锭剂，胶囊，丸剂和颗粒形式的固体剂型。它们可以任选包含遮光剂并且还可以具有它们仅或优先以延缓方式在胃肠道中的某些部位释放活性组分的组合物。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物和蜡。相似类型的固体组合物也可以用作使用诸如乳糖(lactose)或乳糖(milk sugar)和高分子量聚乙二醇类等这类赋形剂的软和硬胶囊中的填充剂。

活性化合物可以使用一种或多种如上所述的赋形剂的微囊形式中。可以使用包衣衣料和壳，诸如肠溶衣，控释衣料和其它制药领域众所周知的包衣衣料制备片剂，锭剂，胶囊，丸剂和颗粒形式的固体剂型。在这类固体剂型中，可以将活性化合物与至少一种惰性稀释剂，诸如蔗糖，乳糖或淀粉混合。这类剂型在一般实施时还可以包含非惰性稀释剂的额外的物质，例如压片润滑剂和其它压片助剂，诸如硬脂酸镁和微晶纤维素。就胶囊，片剂和丸剂而言，剂型还可以包含缓冲剂。它们可以任选包含遮光剂并且还可以具有它们仅或优先以延缓方式在胃肠道中的某些部位释放活性组分的组合物。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物和蜡。

本发明局部或透皮给药用剂型包括软膏剂，糊剂，霜剂，洗剂，凝胶，粉剂，溶液，喷雾剂，吸入剂或贴剂。在无菌条件下将活性成分与药学上可接受的载体并且在需要时与任意需要的防腐剂或缓冲剂混合。关注眼科制剂，滴耳剂和滴眼剂属于本发明范围内。另外，本发明关注透皮贴剂的应用，它们具有提供化合物对身体受控递送的附加优点。可以通过将化合物溶于或分散于适当介质中制备这类剂型。吸收促进剂也可以用于增加化合物通过皮肤的流量。可以通过提供速率控制膜或通过将化合物分散于聚合物基质或凝胶中控制速率。

除本发明的化合物外，本发明化合物的药学上可接受的衍生物或前体药物也可以用于组合物中以便治疗或预防上述确定的病症。

“药学上可接受的衍生物或前体药物”意旨本发明化合物的任意药学上可接受的酯，酯的盐或其它衍生物，在对接受者给药时，它们能够直接或间接提供本发明的化合物或其抑制活性代谢物或残留物。特别有利的衍生物或前体药物为在将这类化合物对患者给药时增加本发明化合物生物利用度(例如通过口服给予化合物以便更易于吸收入血液)或相对于母体种类而言促进母体化合物递送至生物隔室(例如脑或淋巴系统)的那些。

本发明化合物的药学上可接受的衍生物或前体药物包括，但不限于酯类，氨基酸酯类，磷酸酯类，金属盐和磺酸酯类。

可以在这些药物组合物中使用的药学上可接受的载体包括，但不限于离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白，诸如人血清清蛋白，缓冲物质，诸如磷酸盐，甘氨酸，山梨酸或山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物，水，盐或电解质，诸如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶态二氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，基于纤维素的物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯类，蜡，聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物，聚乙二醇和羊毛脂。

可以通过口服，非肠道，吸入喷雾剂，局部，直肠，鼻部，口含，阴道或通过植入的储器给予本发明的组合物。本文所用的术语“非肠道”包括，但不限于皮下，静脉内，肌内，关节内，滑液内，胸骨内，鞘内，肝内，病损部位内(intralesional)和颅内注射或输注技术。优选通过口服，腹膜内或静脉内给予所述的组合物。

本发明组合物的可注射形式可以为水或油混悬液。可以按照本领域公知的技术，使用合适的分散或湿润剂和悬浮剂配制这些混悬液。无菌可注射制剂还可以为在无毒性非肠道可接受的稀释剂或溶剂中的溶液或混悬液，例如作为在1，3-丁二醇中的溶液。在可以使用的可接受的媒介物和溶剂中有水，林格液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌固定油常用作溶剂或悬浮介质。为了该目的，可以使用任意温和的固定油，包括合成的单酸甘油酯类或甘油二酯类。此外，脂肪酸，诸如油酸及其甘油酯衍生物用于制备注射剂，因为它们为天然药学上可接受的油，诸如橄榄油或蓖麻油，尤其是以其聚氧乙基化形式。这些油溶液或混悬液还可以包含长链醇稀释剂或分散剂，诸如羧甲基纤维素或常用于药学上可接受的剂型，包括乳剂和混悬液配制的类似分散剂。常用于制备药学上可接受的固体，液体或其它剂型的其它常用的表面活性剂，诸如Tweens，Spans和其它乳化剂或生物利用度促进剂也可以用于配制目的。

可以通过口服以任何口服可接受的剂型给予本发明的药物组合物，包括，但不限于胶囊，片剂，水混悬液或溶液。就用于口服应用的片剂而言，常用的载体包括，但不限于乳糖和玉米淀粉。一般还加入润滑剂，诸如硬脂酸镁。就胶囊形式的口服给药而言，有用的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。当口服应用需要水混悬液时，将活性组分与乳化剂和悬浮剂合并。如果需要，还可以加入一定的甜味剂，矫味剂或着色剂。

可选择地，可以以用于直肠给药的栓剂形式给予本发明的药物组合物。可以通过将活性剂与合适的无刺激性赋形剂混合制备它们，其在室温下为固体，而在直肠温度下为液体且由此在直肠中熔化以便释放药物。这类物质包括，但不限于可可脂，蜂蜡和聚乙二醇类。

还可以通过局部，尤其是在治疗靶标包括易于通过局部施用进入的区域或器官，包括眼，皮肤或下肠道疾病时给予本发明的药物组合物。易于制备用于这些区域或器官的合适的局部用制剂。

可以以直肠用栓剂(参见上文)或合适的灌肠剂进行对下肠道的局部施用。还可以使用局部透皮贴剂。

就局部施用而言，可以将药物组合物配制成包含悬浮于或溶于一种或多种载体的活性成分的合适的软膏剂。用于本发明化合物局部给药的载体包括，但不限于矿物油，液体石蜡，白凡士林，丙二醇，聚氧乙烯，聚氧丙烯化合物，乳化蜡和水。可选择地，可以将药物组合物配制成包含悬浮于或溶于一种或多种药学上可接受的载体的活性成分的合适的洗剂或霜剂。合适的载体包括，但不限于矿物油，硬脂山梨坦，聚山梨醇酯60，鲸蜡酯蜡，鲸蜡硬脂醇，2-辛基十二烷醇，苄酸和水。

就眼科应用而言，可以将药物组合物配制成在等渗的pH调节的无菌盐水中的微粉化混悬液，或优选在等渗的pH调节的含有或不含防腐剂，诸如苯扎氯铵的无菌盐水中的溶液。可选择地，就眼科应用而言，可以将药物组合物配制成软膏剂，诸如凡士林。

还可以通过鼻部喷雾剂或吸入法给予本发明的药物组合物。按照药物制剂领域众所周知的技术制备这类组合物并且可以将它们制备成在使用苄醇或其它合适的防腐剂，提高生物利用度的吸收促进剂和/或其它常用的增溶剂或分散剂的盐水中的溶液。

可以与载体物质合并产生单一剂型的蛋白激酶抑制剂的量根据所治疗宿主，具体给药方式的不同而改变。优选应将组合物配制成可以将0.01-100mg/kg体重/天的抑制剂的剂量给予接受这些组合物的患者。

还应理解用于任何具体患者的具体剂量和治疗方案均取决于各种因素，包括所用具体化合物的活性，年龄，体重，一般健康状况，性别，膳食，给药时间，排泄速率，药物组合物和治疗医生的判断和所治疗具体疾病的严重性。抑制剂的量还取决于组合物中的具体化合物。

本发明的另一个实施方案提供了治疗或预防蛋白激酶-介导的疾患(在某些实施方案中为GSK-3-介导的疾患)的方法，所述的方法包括对患者给予上述药物组合物之一的步骤。本文所用的术语“患者”意旨动物，优选人。

优选该方法用于治疗或预防疾患，其选自癌症，诸如乳腺，结肠，前列腺，皮肤，胰腺，脑，生殖泌尿道，淋巴系统，胃，喉和肺的癌症，包括肺腺癌和小细胞肺癌；中风，糖尿病，骨髓瘤，肝肿大，心脏扩大，阿尔茨海默病，帕金森病，亨廷顿病，肌萎缩性侧索硬化(ALS)，多发性硬化(MS)，脊髓损伤，外伤性脑损伤，沙-马-图病，白细胞减少，糖尿病神经病变，骨质疏松症，囊性纤维化和病毒病或上述任意具体的疾病。

本发明的另一个方面涉及抑制患者的蛋白激酶活性，该方法包括对所述的患者给予式I的化合物或包含该化合物的组合物。

根据所治疗或预防的蛋白激酶-介导的疾患的不同，可以将一般给予治疗或预防该疾患的额外的药物与本发明的抑制剂共同给予。例如，可以将化疗剂或其它抗增殖剂与本发明的蛋白激酶抑制剂联合用于治疗增殖性疾病。

可以与含蛋白激酶抑制剂的化合物或组合物彼此单独给予那些额外的活性剂，或将它们作为多种剂量芳胺的组成部分给予。可选择地，那些活性剂为单一剂型的组成部分，将其与蛋白激酶抑制剂共同混合在单一组合物中。

在某些实施方案中，所述的蛋白激酶抑制剂为GSK-3激酶抑制剂。

本发明还用于不涉及对患者给药的方法中。

可以通过本领域技术人员公知的方法制备本发明的化合物。可以通过公知方法分析那些化合物，包括，但不限于LCMS(液相色谱法质谱法)和NMR(核磁共振)。还可以按照这些实例测试本发明的化合物。应理解如下所示的具体条件仅为实例并且并不意味着限制可以用于制备，分析或测试本发明化合物的本发明的范围。而本发明还包括本领域技术人员公知用于制备，分析和测试本发明化合物的条件。

实施例

本文所用的术语“Rt(min)”意旨涉及化合物的以分钟计的HPLC或LCMS保留时间。

除非另作陈述，否则用于获得报导的保留时间的HPLC方法如下：柱：ACE C8柱，4.6×150mm梯度：0-100％乙腈+甲醇60∶40(20mM Tris磷酸盐)流速：1.5mL/分钟检测：225nm。

使用以具有电喷雾离子化的单一MS模式操作的MicroMass Quattro Micro质谱仪分析LCMS(液相色谱质谱法)样品。使用色谱将样品导入质谱仪。所有质谱分析的流动相均由含有0.2％甲酸或0.1％ TFA作为修饰剂的乙腈-水混合物组成。柱梯度条件为3min梯度时间5min运转时间内10％-90％乙腈，其中使用Waters YMCPro-C18 4.6×50mm柱。流速为1.5ml/min。

使用Bruker DPX 400仪在400MHz记录¹H-NMR光谱。制备下列式I的化合物并且如下分析。中间体1

2-氯苯甲脒(2-chlorobenzimidamide)

在25min内分6部分将2-氯苄腈(26.84g，195mmol)加入到在氮气环境中用冰浴冷却的搅拌的LHMDS(在THF中1M，400mL，400mmol)在乙醚(400mL)中的搅拌溶液中。5min后，除去冷却浴并且持续搅拌过夜。在显示反应完成后(通过LCMS监测)，在冰浴冷却下小心地加入HCl水溶液(3M，400mL)，随后加入乙醚(600mL)和水(600mL)。然后进行萃取。用HCl水溶液(400mL)再萃取有机层。用固体NaOH将合并的水层小心地碱化至pH 14且然后用DCM(x3)萃取。然后干燥有机层(K₂CO₃)，过滤并且在真空中浓缩而得到脒，为白色固体(26.93g，89.3％)。

¹H NMR(DMSO)6.34(3H，s)，7.32-7.40(3H，m)，7.46(1H，dd)。中间体2

2-(2-氯苯基)-5，6-二甲基嘧啶-4-醇

向在乙醇(750mL)中的2-氯苯甲脒(34.07g，220mmol)和三乙胺(44.50g，440mmol)中加入2-甲基-3-氧代丁酸乙酯(38.13g，264mmol)。将该反应体系在90℃下加热4h。再加入部分(6.36g)酯并且将该反应体系搅拌3h。浓缩该反应体系至约500mL并且放置过夜。所需嘧啶醇发生沉淀(22.7g)。浓缩母液并且加入DCM和1MHCl。用DCM将水层萃取7次而在浓缩时又得到批量所需产物(总计：28.9g，56％)，为白色固体。

¹H NMR(DMSO)1.97(3H，s)，2.26(3H，s)，7.44-7.47(1H，m)，7.51-7.59(3H，m)，12.70(1H，br s)。中间体3 4-氯-2-(2-氯苯基)-5，6-二甲基嘧啶

将下列反应分成两部分并且在两个相同的反应容器中同时进行：

将POCl₃(50mL)小心地加入到嘧啶醇(14.45g，61.6mmol)中，将该反应体系搅拌5min。然后再加入部分POCl₃(100mL)并且将该反应体系加热至105℃。在该温度下1h后，浓缩该反应体系。加入冰并且将按照一式两份进行的反应体系借助于DCM合并。用盐水和水洗涤有机层，干燥(MgSO₄)，过滤并且在真空中浓缩而得到氯嘧啶(31.14g，99.8％)，为无色油状物。

¹H NMR(CDCl₃)2.45(3H，s)，2.65(3H，s)，7.36-7.39(2H，m)，7.49-7.51(1H，m)，7.71-7.73(1H，m)。中间体4

合成5-氟-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-3-胺5的总体合成方案如下所示。 试剂和条件：i.Pd(OAc)₂，PPh₃，Et₃N，H₂CO₂；ii.1)(COCl)₂，CH₂Cl₂，催化剂DMF；2)NH₃(g)，二噁烷，iii.TFAA，Et₃N，CH₂Cl₂，0℃；iv.H₂NNH₂·H₂O，正-丁醇，回流2-氯-5-氟烟酸(6)

向在N₂气环境中的圆底烧瓶中加入脱气的DMF(270mL)，Pd(OAc)₂(0.05eq，2.7g，11.9mmol)，PPh₃(0.1eq，6.2g，23.8mmol)和脱气的Et₃N(6eq，200mL，1428.6mmol)。将该混合物搅拌20分钟，然后加入HCOOH(3eq，28mL，714.3mmol)。5分钟后，加入2，6-二氯-5-氟烟酸(50g，238.1mmol)。在50℃下搅拌该混合物。在反应后分析后处理的等分部分(¹H NMR)。当全部原料物质消耗(24h)时，将该混合物冷却至0℃并且加入水(500mL)。20分钟后，将该混合物通过C盐垫过滤，用水冲洗。用30％NaOH水溶液将该混合物碱化至pH 9并且用EtOAc(2x)洗涤。缓慢加入HCl(12N)至pH 1并且用NaCl饱和该溶液。用EtOAc(3x)萃取该混合物。用盐水洗涤合并的有机萃取物，干燥(Na₂SO₄)并且在减压下浓缩至得到37g(88％)浅褐色固体，将其不经进一步纯化用于下一步。¹H NMR(DMSO-d₆，300MHz)：δ8.16(dd，1H)；8.58(d，1H)。2-氯-5-氟烟酰胺(3)

向在0℃下的2-氯-5-氟烟酸6(50g，285mmol)和DMF(2mL，28mmol)在DCM(400mL)中的溶液中滴加草酰氯(64mL，741mmol)。将该反应混合物在室温下搅拌过夜并在真空中浓缩。将所得黄色液体溶于1，4-二噁烷(600mL)，在0℃下冷却并使NH₃(g)通过该溶液发泡30分钟。将该化合物在室温下搅拌过夜。过滤所得混合物并浓缩滤液而得到化合物3(44g，89％)，为浅褐色固体。¹H NMR(DMSO-d₆，300MHz)：δ7.84(s，1H)，7.96(dd，1H)，8.09(s，1H)，8.49(d，1H)。2-氯-5-氟烟腈(4)

将粗化合物3(65g，372.4mmol)和Et₃N(114mL，819.2mmol)在DCM(700mL)中的混悬液冷却至0℃并且滴加TFAA(57mL，409.6mmol)。将所得黄色溶液在0℃下搅拌90分钟，用DCM稀释，用饱和NaHCO₃水溶液和盐水洗涤并且干燥(Na₂SO₄)。过滤该混合物并且浓缩。对残余物进行Kugel Rohr蒸馏(～70℃/1mbar)而得到50g(86％)化合物4，为浅褐色固体。还通过柱色谱法纯化化合物4(SiO₂，8∶1 庚烷∶EtOAc)。¹H NMR(CDCl₃，300MHz)：δ7.78(dd，1H)；8.49(d，1H)。5-氟-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-3-胺(5)

向化合物4(50g，321.7mmol)在1-丁醇(1L)中的溶液中加入肼一水合物(150mL，3.2mol)并且将该混合物回流4h。将该混合物冷却至室温并且浓缩。依次用水(2x)和Et₂O(2x)洗涤沉淀并且在真空中干燥而得到化合物5(44g，88％)，为黄色固体。¹H NMR(DMSO-d₆，300MHz)：δ5.53(s，2H)；7.94(dd，1H)；8.35(dd，1H)；12.02(s，1H)。实施例1(I-1)

N-(2-(2-氯苯基)-5，6-二甲基嘧啶-4-基)-5-氟-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-3-胺

将4-氯-2-(2-氯苯基)-5，6-二甲基嘧啶(31.14g，123mmol)和5-氟-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-3-胺(19.65g，129mmol)在NMP(200mL)中的混合物在135℃下加热3h 30min。然后在真空中浓缩该混合物至约100mL。然后加入饱和NaHCO₃水溶液，水和EtOAc，而沉淀出现在有机层。将其过滤出该整个混合物并且用饱和水溶液NaHCO₃，水和EtOAc和乙醚洗涤残余物。在搅拌下向残余物中加入沸腾的乙醇并且过滤纯的目标化合物。浓缩液体并且将这一研磨操作重复4次而得到目标化合物(25g，55％)，为白色固体。

¹H NMR(DMSO)2.28(3H，s)，2.43(3H，s)，7.28-7.37(2H，m)，7.40-7.46(2H，m)，7.93(1H，dd)，8.49(1H，s)，9.28(1H，br s)，13.39(1H，br s)。

按照与制备化合物I-1所述的方法类似的方式制备化合物I-2。下表2描述了与表1中所示化合物相关的分析数据。表2

化合物#	M+1(obs)	LCMSRt(min)	NMR
				I-1	369.3	1.8	DMSO d6：2.28(3H，s)，2.43(3H，s)，7.28-7.37(2H，m)，7.40-7.46(2H，m)，7.93(1H，dd)，8.49(1H，s)，9.28(1H，br s)，13.39(1H，br s)
I-2	383.1	1.83	DMSO d6：1.23(t，3H)，2.53(s，3H)，2.85(q，2H)，7.40(dd，1H)，7.45(dd，1H)，7.48(dd，1H)，7.56(d，1H)，7.96(dd，1H)，8.51(s，1H)

实施例2：GSK-3抑制试验

使用标准偶联酶系统筛选本发明的化合物抑制GSK-3β(AA 1-420)活性的能力(Fox等，Protein Sci.1998，7，2249)。在包含100mM HEPES(pH 7.5)，10mM MgCl₂，25mM NaCl，300μM NADH，1mM DTT和1.5％DMSO的溶液中进行反应。本试验中的底物终浓度为20μM ATP(Sigma Chemicals，St Louis，MO)和300μM肽(AmericanPeptide，Sunnyvale，CA)。反应在30℃和20nM GSK-3β下进行。偶联酶系统中成分的终浓度为2.5mM磷酸烯醇丙酮酸，300μM NADH，30μg/ml丙酮酸激酶和10μg/ml乳酸脱氢酶。

制备包含上述所有试剂，但不含ATP和本发明测试化合物的试验储备缓冲溶液。在30℃下和96孔平板中将该试验储备缓冲溶液(175μl)与终浓度在0.002μM-30μM的5μl本发明测试化合物一起孵育10min。一般而言，通过在子平板中用本发明化合物的DMSO制备顺序稀释液(来自10mM化合物储备溶液)进行12-点滴定。通过添加20μl ATP(终浓度20μM)启动反应。在30℃下和10min内使用Molecular Devices Spectramax平板读出器(Sunnyvale，CA)获得反应速率。根据作为抑制剂浓度函数的速率数据测定K_i值。经测定本发明的化合物抑制GSK-3。

经测定化合物I-1和I-2抑制GSK-3，Ki值＜5nM。实施例3：GSK-3α和GSK3βp-TYR抑制试验

通过使用给予了所述化合物的Jurkat细胞的蛋白质印迹筛选化合物抑制酪氨酸磷(TYR)酸化的能力。测试的具体TYR残基的磷酸化为GSK3αTYR 279和GSK3βTYR 216。细胞和裂解物的制备

以2×10⁵个细胞/孔的密度将Jurkat细胞接种在12孔平皿中的饥饿培养基(RPMI+1％FBS+P/S)中。在饥饿16小时后，将化合物以0.3％的DMSO终浓度给药入各孔中并且在37℃ 5％CO₂下孵育o/n。第二天，以1500rpm旋转沉降细胞，用PBS洗涤并且在含有β-巯基乙醇的和100uL Laemli样品缓冲液中裂解。蛋白质印迹方案

将15微升(uL)细胞裂解物上10％tris-甘氨酸凝胶并且在120v下运行2小时或直到染色的前部运行出凝胶。然后在100v下将蛋白质转至PVDF膜上60min。然后制成PBST(PBS包含0.1％Tween20，诸如1ml Tween/1L PBS)并且用于全部洗涤和抗体孵育。在5％去脂乳PBST中封闭印迹1小时。

然后在4℃和适度振摇下在5％-去脂乳PBST中加入初级抗体(按照1∶1000稀释的GSK-3α/βpTYR 279/216，Upstatecat#05-413)过夜。然后用PBST洗涤印迹5min。然后将该步骤重复4次。在5％乳PBST中加入二次抗-小鼠-HRP缀合抗体(1∶5000稀释)60min。然后用PBST洗涤印迹5min。也将该步骤重复4次。制备3.0mL显影溶液(ECL+来自Amersham/GE cat# RPN2132的蛋白质印迹检测系统)且然后加入。将该溶液在印迹上涡旋～30秒。然后使用CL-Xposure澄清蓝X-射线胶片使印迹显影。将GAPDH表达水平按照1∶10000稀释用作负荷对照(GAPDH抗体：santa cruz 25-778)。

为了测定GSK-3α和GSK-3βpTYR IC50，将具体化合物浓度下各蛋白质相应的带密度与每次曝光时存在的无化合物DMSO处理的对照组细胞样品比较。将IC50数值定义为GSK-3α或GSK-3β带密度为无化合物的对照组的50％时的化合物浓度。实施例4：β-连环蛋白稳定方案

β-连环蛋白的GSK-3磷酸化使其靶向至蛋白体以便降解。抑制GSK-3导致β-连环蛋白在细胞的胞质溶胶中蓄积，其通过与转录因子TCF/LEF的相互作用易位至核并且驱动Wnt-依赖性基因转录。设计本试验是为了通过在使用给予化合物的Jurkat细胞中的β-内酰胺酶报道分子试验以定量方式测定β-连环蛋白依赖性TCF/LEF转录活性水平。

在烧瓶中的测定培养基(1％ FBS，1x Penstrep，RPMI)中使Jurkat β-连环蛋白细胞饥饿过夜。第二天将Jurkat β-连环蛋白细胞以50,000个细胞/孔的密度接种在96孔平底平板中的100ul体积测定培养基中。向孔中加入终浓度为0.75％的DMSO的化合物并且在37℃ o/n下孵育。接下来的一天向各孔中加入20uL 6x CCF4染料并且在室温下孵育1-2小时。在Cytofluor 4000串联多孔平板读出器上读取平板并且测定460/530比例。通过将460/530比例对化合物的浓度绘图(对数标度)并且使用斜率方程计算比例为50％的最大作用时的点测定诱导β-连环蛋白的GSK-3 IC50。

通过用在实施例4中获得的β-连环蛋白IC50值除以在实施例3中获得的GSK-3α或GSK3βp-TYR IC50值计算β-连环蛋白：GSK-3窗。

经测定化合物I-1和I-2均具有400-500倍的β-连环蛋白：GSK-3α窗。经测定化合物I-1具有75-100倍的β-连环蛋白：GSK-3β窗并且经测定化合物2具有25-50倍的β-连环蛋白：GSK-3β窗。

表3表示了表1选择的化合物的GSK-3α pTYR，GSK-3β pTYR和β-连环蛋白IC50数据。表3

化合物序号	GSK3a pTYR 279：IC50：(uM)	GSK3b pTYR 216：IC50：(uM)	β连环蛋白IC50：(uM)
				I-1	＜0.0005	0.003	0.23
I-2	0.002	0.03	0.94

实施例5：从组织中采集胞质级分

低渗裂解缓冲液由10mM HEPES，10mM KCL，1.5mM MgCl₂，1.0mM EDTA，1.0mM DTT，1x Roche蛋白酶抑制剂混合物和1.0mMAEBSF Calbiochem蛋白酶抑制剂混合物(cat#539134)组成。所有浓度均为终浓度并且用水稀释。

首先，将低渗裂解缓冲液加入到5x重量的组织中。然后使用注射器柱塞端在冰上破碎组织。接下来将样品解冻5次。然后将裂解物转至超速离心管并且在4℃下以100,000g旋转35min。然后收集上清液并且取等分部分以便使用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒(cat#23225)，应用BSA标准曲线测定蛋白质。用包含β-巯基乙醇的laemmli样品缓冲液按照1∶1稀释剩余的蛋白质裂解物。然后校准蛋白质浓度。使样品在95℃下沸腾5min，随后以14,000rpm在小型-离心机中旋转1min。然后用干冰骤冷样品并且储存在-20℃下。Western方案

首先使样品上10％Tris-甘氨酸胶凝(10uL/孔)。然后使凝胶在120V下运行，直到染料标记脱离凝胶。切下PVDF膜并且在使用前浸入甲醇5min。然后将蛋白质转至在100V下的PVDF膜上75min(将转移器具保持在冰上)。然后在RT(室温)下用溶于PBS 0.1％Tween 20的5％脱脂奶粉封闭该膜1h。用封闭缓冲液按照1∶2000稀释加入的初级抗体(SC-7199，Santa Cruz家兔多克隆抗-人β-连环蛋白)。任选可以在相同印迹上以1∶2000运行β微管蛋白负荷对照品(SC-9104)。然后将其在4℃下孵育过夜。

用PBS 0.1％ Tween各自将膜每次5分钟洗涤4次。然后加入抗-家兔二次HRP-缀合抗体(用封闭缓冲液按照1∶5000稀释)。用PBS 0.1％ Tween各自将膜洗涤4次，5min。接下来加入ECL试剂(Pierce)。最终暴露薄膜。通过比较获自化合物治疗的动物的样品中蛋白质带的密度与媒介物治疗的动物的样品中蛋白质带的密度确定β-连环蛋白的诱导。实施例6：来自用干pTYR蛋白质印迹的组织的蛋白质分离

RIPA由0.5ml 10％ SDS，2.5ml 10％脱氧胆酸钠，0.5ml NP40和46.5ml PBS组成。裂解缓冲液由8.3ml RIPA，1.0ml β-甘油磷酸(500mM)，0.1ml NaF(500mM)，0.1ml正钒酸钠(200mM)，0.4ml蛋白酶抑制剂(Roche蛋白酶抑制剂混合物片：将1片溶于2ml水而得到25x储备溶液cat# 11873580001)和0.1ml PBS组成。

将10mL裂解缓冲液(改进的RIPA)加入到组织中(1ml/1/2脑)并且在冰上匀化。然后在4℃下以10000rpm将裂解物离心10min。然后将上清液转至新管内并且保持在冰上。在4℃下以10000rpm再旋转上清液样品10min。然后将上清液转至新管内并且保持在冰上。取上清液的等分部分并且使用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒(cat#23225)，应用BSA标准曲线(用PBS按照1∶25稀释)测定蛋白质。

用加入了β-巯基乙醇的Biorad Laemmli样品缓冲液(cat#161-0737)将剩余的上清液稀释至1ug/ul。使样品在95℃下沸腾5min并且在微量离心机中旋转1分钟。然后用干冰骤冷样品并且储存在-20℃下。然后上10ug蛋白质/泳道(10uL)并且按照实施例3进行蛋白质印迹。通过比较获自化合物治疗的动物的样品中蛋白质带的密度与媒介物治疗的动物的样品中蛋白质带的密度确定GSK-3α/βpTYR的抑制。实施例7：轴突分枝试验

测试化合物促进E16大鼠海马或皮质神经元中轴突分枝的能力。第1天：细胞板的制备

用DI水将1mg/ml PDL储备溶液稀释成100μg/ml。在进行剥离前37℃下给玻璃盖玻片涂片至少1小时。抽吸PDL并且用PBS冲洗平板并且在通风柜中风干。E-16大鼠皮质细胞的剥离

将皮质或海马叶与9mL基础培养基(Neurobasal+青霉素/链霉素)合并并且放在冰上。加入1mL 10X胰蛋白酶溶液并且缓慢蜗旋该混合物。然后通过在37℃水浴中孵育20分钟消化组织。20分钟后，加入10μl/ml DNase(100μL DNase)并且将该混合物再孵育5分钟。

将细胞以1000rpm旋转1分钟。然后除去酶溶液，但不除去任何位于底部的脑碎片。用洗涤培养基(Neurobasal+10％和青霉素/链霉素)将固体洗涤3次。第3次洗涤后，将细胞重新-悬浮于5ml培养基(Neurobasal+B27，L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素)中。通过经火焰-狭窄的玻璃吸量管轻度吸移几次进行机械剖离，小心不要起泡。然后通过70μm细胞滤过器过滤细胞。用血细胞计数器计数细胞并且用涂敷了PDL的玻璃盖玻片插入物以5000-10000细胞/孔接种的24孔平板上。在37℃ o/n下孵育细胞。第2天：细胞维持

第二天，用包含视黄酸(RA)的新鲜培养基改变一半培养基。加入化合物至0.3％DMSO终浓度的所需浓度。改变一半培养基并且每隔3天加入一次新制的化合物。在培养物中将细胞与化合物一起孵育6天。第7天：固定和染色材料：1.磷酸缓冲盐溶液(PBS)-Gibco 14190-1442.洗涤缓冲液＝PBS-T：■PBS■0.1％Tween-20(Bio Rad，170-6531)3.封闭缓冲液＝PBS-T+5％正常驴血清或HBSS-T+5％正常驴血清■10ml PBS■0.1％Tween-20(Bio Rad，170-6531)■0.5ml正常驴血清(Jackson Immuno # 017-000-121)4.Gel Mount Citi-Fluor^tm(Ted Pella AF-1)5.神经丝抗体1∶250 Abcam，MAP2抗体1∶250 Abcam6.用于抗-家兔Alexa 488(神经丝)和抗-小鼠Alexa 568(MAP2)的二次抗体1∶500方法

如果培养基包含血清，那么用PBS将细胞洗涤两次。如果细胞在不含血清的培养基中生长，那么无需洗涤。固定

首先除去培养基或PBS。然后加入500uL HistoChoice以覆盖细胞。将细胞在室温下孵育10分钟。然后用PBS将它们洗涤2次，其中在每次洗涤后孵育5分钟。用量如下所示：■96孔格中100ul PBS/孔■48孔格中200ul PBS/孔■24孔格中400ul PBS/孔

将细胞与封闭缓冲液在室温下孵育30分钟。然后将组织与封闭缓冲液在室温下孵育1小时。用PBS+0.1％Tween+5％驴血清稀释1°抗体。取出封闭缓冲液并且加入足够体积的在封闭缓冲液中的1°抗体以便覆盖。将1°抗体在4℃下孵育过夜。第二天取出1°抗体并且用PBS-T将盖玻片洗涤两次，在每次洗涤之间有5分钟孵育。取出PBS-T并且加入封闭缓冲液。将细胞孵育30分钟。

用PBS+0.1％Tween+5％驴血清稀释2°抗体。将该混合物在室温下孵育30min。用PBS-T将载玻片洗涤三次并且用PBS洗涤一次。加入封固平培养基以便减少荧光染料猝灭。取出玻璃盖玻片并且放置在载玻片上以便显现。分析

在直立显微镜上以10x和20x俘获影象并且通过对每个细胞中的神经丝Alexa 488阈值荧光下的面积进行定量来确定轴突分枝。通过对每个细胞中的MAP2 Alexa 568的阈值荧光下的面积进行定量来确定树突分枝。可选择地，可以通过对每个细胞中的分枝点进行手工计数确定分枝。在同时时间点通过比较化合物处理的培养物中阈值荧光下的面积与DMSO对照组的阈值荧光下的面积评价化合物的作用。用10nM化合物I-1将E16海马神经元处理7天导致轴突和树突分枝增加。当在已经证实诱导β-连环蛋白的浓度下处理E16海马神经元时，轴突生长得到抑制，进一步支持了GSK-3α/βpTYR与β-连环蛋白之间的窗的治疗作用。实施例8：CRMP2磷酸化试验

GSK-3磷酸化调节涉及控制轴突过度生长和分枝的CRMP2(Yoshimura等，2005 Cell，Kim等，2006 Neuron)。GSK-3使CRMP2磷酸化减少了CRMP2与微管结合且由此减少了轴突延伸和分枝。相反，抑制GSK-3，尤其是在选择性影响TYR残基自磷酸化的水平上强化了这些表型。在E16大鼠海马或皮质神经元中测试化合物以便测定增加周体分枝水平的能力。第1天：细胞板的制备

用DI水将1mg/ml PDL储备溶液稀释成100μg/ml。在进行剥离前37℃下给玻璃盖玻片涂片至少1小时。抽吸PDL并且用PBS冲洗平板并且在通风柜中风干。E-16大鼠皮质细胞的剥离

将皮质或海马叶与9mL基础培养基(Neurobasal+青霉素/链霉素)合并并且放在冰上。加入1mL 10X胰蛋白酶溶液并且缓慢蜗旋该混合物。然后通过在37℃水浴中孵育20分钟消化组织。20分钟后，加入10μl/ml DNase(100μL DNase)并且将该混合物再孵育5分钟。

将细胞以1000rpm旋转1分钟。然后除去酶溶液，但不除去任何位于底部的脑碎片。用洗涤培养基(Neurobasal+10％和青霉素/链霉素)将固体洗涤3次。第3次洗涤后，将细胞重新-悬浮于5ml培养基(Neurobasal+B27，L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素)中。通过经火焰-狭窄的玻璃吸量管轻度吸移几次进行机械剖离，小心不要起泡。然后通过70μm细胞滤过器过滤细胞。细胞用血细胞计数器计数并且以50,000细胞/孔接种在12孔平板上。在37℃o/n下孵育细胞。第2天：细胞维持

第二天，用包含视黄酸(RA)的新鲜培养基改变一半培养基。加入化合物至0.3％DMSO终浓度的所需浓度。改变一半培养基并且每隔3天加入一次新制的化合物。在培养物中将细胞与化合物一起孵育6天。第7天：采集裂解物和蛋白质印迹

用PBS洗涤培养物并且在100uL添加了β-巯基乙醇的Laemli样品缓冲液中直接裂解。蛋白质印迹方案

首先使7微升(uL)细胞裂解物上10％Tris-甘氨酸凝胶并且在120V下运行2小时，或直到染料向前脱离凝胶。然后将蛋白质转至在100V下的PVDF膜上60min。然后制成PBST(包含0.1％Tween20，诸如1ml Tween/1L PBS的PBS)并且用于所有的洗涤和抗体孵育。用5％去脂乳PBST将印迹封闭1小时。

然后在4℃和适度振摇下在5％-去脂乳PBST中加入初级抗体(1∶10,000 CRMP2家兔多克隆Abcam#ab36201)过夜。然后用PBST洗涤印迹5min。将该步骤也重复4次。在5％乳PBST中加入二次抗-小鼠-HRP缀合抗体(1∶5000稀释)60min。然后用PBST洗涤印迹5min。也将该步骤重复4次。

制备3.0mL显影溶液(ECL+来自Amersham/GE cat#RPN2132的蛋白质印迹检测系统)且然后加入。将该溶液在印迹上涡旋～30秒。然后使用CL-Xposure澄清蓝X-射线胶片使印迹显影。将GAPDH表达水平按照1∶10000稀释用作负荷对照(GAPDH抗体：santacruz 25-778)。CRMP2抗体检测CRMP2的未磷酸化形式和为GSK-3磷酸化的残基的CRMP2的磷酸化形式(T514)(Kim等，2006Neuron)。将化合物对pCRMP2的IC50定义为过度移动的pCRMP2带密度为无化合物的对照组的50％的化合物浓度。结果

抑制底物CRMP-2的GSK-3磷酸化与用化合物I-1处理7天的E16海马神经元中GSK-3 pTYR抑制相关。在生长的轴突中富含CRMP-2并且未磷酸化的CRMP-2结合微管并且促进轴突分枝。实施例9：使用HUVEC和皮肤成纤维细胞的血管发生体外模型

筛选化合物促进人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中血管发生的能力。采用来自Nakatsu等，Microvas.Res.2003的该方法描述了一种方案，其概括了用于新血管生长：萌发，细胞迁移，细胞增殖，腔形成，分枝和吻合所必需的主要事件。方案：

使用P3与P4之间的HUVEC。在1ml EGM-2(2％FBS)培养基(Clonetics)中将HUVEC与400 HUVEC/珠浓度的葡聚糖包被的cytodex 3微载体(Amersham Pharmacia)混合。然后在37℃和5％CO₂下每隔20min将含有细胞的珠适度振摇4h。在孵育后，将含有细胞的珠转至T-25组织培养烧瓶并且在37℃ 5％CO₂下和5ml EGM-2中保持12-16h。

第二天，用EGM-2将含有细胞的珠洗涤三次并且以200细胞-包被的珠/ml重新悬浮于含有0.15U/ml抑肽酶(Sigma)的pH 7.4的2.5mg/ml血纤蛋白原(Sigma)中。

然后将500u l血纤蛋白原/珠的溶液加入到24孔组织培养平板的一个孔中的0.625U凝血中。使血纤蛋白原/珠的溶液在室温下凝块5min且然后在37℃ 5％ CO₂下凝块20min。然后向各孔中加入含有0.15U/ml抑肽酶的1ml EGM-2并且在37℃和5％ CO₂下使用血纤蛋白凝块平衡30min。

接下来从各孔中取出培养基并且用1ml新鲜培养基替代。将20,000个皮肤成纤维细胞(SF ATCC Detroit 551)在凝块上部铺板并且每隔一天改变一次培养基。

为了进行化合物抑制研究，实施6点剂量响应(1uM终浓度的1∶3稀释液)，其中在平衡后向凝块中加入化合物。

通过对以10x和20x放大倍数在倒置显微镜上俘获的影像进行定量对血管发生的血管长度，血管数量和分枝/珠使用NIHIma ge J软件评分。任选在测定前，可以使用在组成型最低活性TK启动子控制下表达黄色荧光蛋白(YFP)的逆转录病毒载体旋转转导HUVEC，并且对YFP表达进行分选以便促进显影。然后如上所述培养YFP阳性HUVEC并且通过使用NIH Image J软件计算阈值荧光下的面积确定血管形成的量化。在两种情况中，通过在同时间点比较化合物处理的培养物与DMSO对照培养物确定增强的血管发生。

用化合物I-1(10nM)将HUVEC培养物处理7天导致血管增加和网状结构形成。当以证实诱导β-连环蛋白的浓度处理HUVEC培养物时，可抑制血管形成并且观察到细胞增殖增加，从而进一步支持了GSK-3α/β pTYR与β-连环蛋白之间的窗的治疗作用。实施例10：中风后恢复MCAO模型I.一般方法

在一组行为试验时预先训练成年雄性Wistar大鼠，包括：图盘触及，网格步行，前肢不对称(圆柱体支撑)，前肢抑制(游泳试验)(参见下文的试验的详细描述)。在中风前行为评价后，大鼠接受手术，在此过程中，诱导中风。将大鼠假拟随机分成5个等同的组(n＝12)，确保在每个治疗组中右侧和左侧中风的数量相等。第一组接受使用媒介物的假拟手术作为治疗。由承办人确定测试化合物和媒介物的给药(剂量，途径，定时)。将核心体温维持在37℃(+/-1°)。

在手术后，评价所有动物中风后1，7和14d的行为。在行为评价结束时，所有大鼠进行MRI以便确定梗死体积。使用一种方式方差分析比较组行为特征和中风体积以便确定化合物在MCAO中风后功能恢复比例和程度上的治疗有益性。II.中脑动脉闭塞

称重每只动物(平均体重为340g)且然后使用异氟烷麻醉(携带2l/min医用级氧的4％异氟烷以便诱导手术平面且然后是含有2l/min氧的2％以便维持手术平面)。在诱导麻醉后，对每只大鼠分别使用耳穿孔标记并且给予皮下剂量的丁丙诺啡(0.025mg/kg)。监测直肠温度并且在手术过程中维持在37℃+/-1℃，且直到大鼠苏醒和活动为止(约3h)。

然后将大鼠放入定位放置的离体定位仪，使得头侧面面向上。剃刮左眼与耳之间的评分并且用手术用无菌擦洗液洗涤。在右眼眶与外耳道之间的中间位置做纵形切口。切开下面的颞肌，从头盖骨中剥离并且小心地缩回以保护面神经。双缝合线远离头盖骨侧面固定颞肌。从颧骨后开始并且沿头盖骨颞嵴实施颅骨切开术以便前侧延伸耳暴露大脑中动脉(MCA)和嗅觉通路。打开硬脑膜和MCA基底并且将第一分枝的前部电凝固至嗅觉通路前侧，导致右背外侧大脑皮质梗死形成。

在MCA电凝固术完成时注意到中风发生的时间。一旦出血得到控制，就复位颞肌并且缝合皮肤。然后从离体定位仪上取下大鼠并且放回至恢复室。给予第二种皮下剂量的丁丙诺啡(0.025mg/kg)与2cc林格液。在1/2笼中准备好水，湿大鼠食物和温热垫，而在恢复室内也一样。一旦大鼠苏醒并且看到食物和饮水，它就返回到其动物群居的笼中。III.用于行为测试的方法托盘触及

使用采用来自Whishaw，O′Connor和Dunnett(1986)设计的方法的操作确定前爪的应用。使每只动物禁食，以便在每天测试后出现喂食时间。将动物放入由2-mm杆，边缘距边缘9mm构成的具有底部和朝向的测试笼(10×18×10cm高)。将包含鸡饲料颗粒的4-cm宽和5-cm深的托盘固定在每只盒子的外部。要求大鼠前肢伸展通过杆中的缝隙，握住并且取回食物。

每天训练动物20-30min，最少10天或直到50％的采样数达到标准(注意：这指的是两只爪合并为50％)。大部分大鼠趋向于仅使用主要的爪触及。如果大鼠无法达到14天训练内50％采样数的标准，那么从本研究中将其排除。此外，从本研究中排除表现出双爪均使用的任何大鼠。双爪均使用的大鼠使用任一爪触及或通常等同使用每只爪同样成功的触及)。

将“采样数”定义为导致食物颗粒消耗的成功握住和随意再获取食物颗粒。将“未抓到”定义为随意再取食物颗粒不成功(没有适当握住颗粒或在再获取过程抓丢掉了颗粒，使得颗粒无法消耗)。将采样数的百分比计算为期限过程中的采样总数除以触及的总数。对左和右爪单独计算该值(或中风后受影响和未受影响的)。一旦达到50％的标准成功(包括由两只爪触及的)，就在5min触及的过程中给每只大鼠录影。

将本期限的结果用作手术前的基线。手术前的测试期还用于确定每只大鼠的爪的支配地位。在用于触及的优势爪的对侧的脑半球内施加中风损害。手术后测试由测试动物的每周5min触及试验组成。

在监测器上使用每次触及的依次框架分析观察每一期限。由2位不同的记录员对每一期限进行评分。每一记录员最终计算的采样数百分比在彼此5％的范围内。如果最终评分之间出现更大的不一致，那么由2位观察者给该期限重新评分。

在各组中使用一种方式方差分析比较每组中受影响和未受影响的爪的采样数百分比。

在上述模型中测试化合物I-1。中风可靠地产生在手术后7和14天时触及行为缺陷。添加化合物I-1比媒介物治疗明显改善了中风后7和14天时的这一缺陷。网格步行

使用由两个1m长和25cm宽(5mm厚)的沿一个长边上间隔1cm打一个钻孔的树脂玻璃操作盘组成的仪器测定前肢和后肢协调。将操作盘间隔2.5cm放置并且通过几个金属棒(3mm直径)经所述的孔连接。将棒随机间隔1，2或3cm放置。悬挂和定向该仪器，使得在具有25cm高的壁上形成1m长的狭窄通道(2.5cm宽)。这些棒构成底部。

使用3次试验将每只动物导入该仪器，其中将大鼠在每次随后的试验中距离目标盒子较远的距离放置。即在第一次试验时，将大鼠放置在网格近端并且面向目标盒子。一旦大鼠进入了目标盒子，就将其放置的网格上一半路径的点上，再次面对目标盒子。在第三次和最终的试验时，将大鼠放置在入口并且使其横过整个网格到达目标盒子。

在手术前这种训练操作对每只大鼠仅进行一次。在所有随后的测试试验时，将动物各自放置在仪器的入口并且要求它们横过整个网格而到达目标盒子。

在中风前进行3次试验的一个测试期。中风厚的每一测试期包括3次试验。在接近水平面的范围给每次试验录影。由2位观察者使用依次框架分析给录像带评分。对通过网格mid 80％的左侧和右侧(受影响和未受影响)前肢和后肢放置错误的数量进行计数。使用遮蔽胶带在仪器的外部标记mid 80％的网格。无论肢体(部分或全部，即恰好爪或整个腿部)通过棒的水平面如何伸展均被视为错误。在三次试验中对同侧和对侧肢单独计算前肢和后肢错误的总和并且独立分析。使用一种方式方差分析在各组之间比较评分。

在上述模型中测试化合物I-1。中风可靠地产生在手术后7和14天时触及行为缺陷。化合物I-1明显改善了中风后7和14天时的这一缺陷。前爪不对称(圆柱体试验)

通过将大鼠放入直径为25cm的透明丙烯酸圆柱体测定动物的前爪不对称。将该圆柱体放在带有定位的反光镜的透明工作台上，使得可以从下面给动物摄影。这一有利位置提供了在动物探查圆柱体时其前爪的清晰照片。

在探查过程中，大鼠趋向于直立许多。在每次直立时，大鼠将其前爪指向圆柱体的一侧以便提供平衡和支持，同时探查圆柱体。探查包括依靠圆柱体的左侧和右侧(同时直立)和直立向上。正常大鼠同样地左和右前爪以支撑壁。当直立向上探查壁时，大鼠使用两爪支撑。在前20次直立过程中，注意支撑爪。对在直立过程中触及圆柱体壁的第一只爪计数。测试持续至记录了20次直立。由2位观察者给录像带记录评分。对左和右爪壁触及计数。因此，就每次支撑而言，评分可以为L或R或L&R。

一个测试期在手术前进行且在此后是指定的手术后测试期限。手术前试验用于测定大鼠不具有预先存在的爪偏好(即15/20以上的壁触及了一侧)。如果它们确实表现出一侧偏好，那么将它们从本研究中除去。将手术后评分表示为使用受影响的(中风损伤对侧)爪触及的百分比。使用一种方式方差分析对这一评分在各组中进行比较。

在上述模型中测试化合物I-1。中风可靠地产生在手术后7和14天时触及行为缺陷。化合物I-1在低剂量下明显改善了中风后7和14天时的这一缺陷。前肢抑制(游泳试验)

在正常大鼠中，游泳通过后肢进行性中风进行。前肢一般因任何中风而受到抑制并且保持不动和共同在动物下颚下。通过给游泳过程中的动物摄影评价前肢抑制。将动物导入充满了25cm深的室温水(～25℃)的玻璃缸(30w×90l×43h cm)的一端并且在它们游至9.5平方厘米可见平台时摄影，该平台比位于对侧的水面高出2cm。通过对三次放入玻璃缸的左和右前肢中风的数量进行计数进行抑制评分。仅对mid 80％长度进行评分。使用遮蔽胶带在玻璃缸外部标记mid 80％。

如果动物在游泳试验过程中无法触及玻璃缸侧面，那么认为游泳可评分。使用一种方式方差分析对左和右(中风后受影响和未受影响)前肢中风的总数在各组中进行比较。

在上述模型中测试化合物I-1。中风可靠地产生在手术后7和14天时触及行为缺陷。化合物I-1明显改善了中风后7和14天时的这一缺陷。pTYR生物标记分析为了追踪化合物I-1在进行MCAO的大鼠CNS中的活性，在本研究结束时从媒介物治疗和化合物治疗的动物中摘除脑并且获得蛋白质裂解物(如本文实施例6中所述。通过蛋白质印迹分析裂解物(参见实施例3)并且探测GSK-3α/β pTYR水平。化合物I-1在所有剂量下使脑中的pTYR信号均表现出比媒介物治疗的无β-连环蛋白诱导的大鼠明显降低。粘合剂去除试验

使用粘合剂去除试验测试大鼠的前肢躯体感觉缺陷(Schallert T等，1984#3)。每只动物通过在每一测试天时放置包扎带的圆形创口贴(直径约1.2cm)接受3次试验，并且记录从左侧前肢上取下刺激物所需的平均时间(秒)。IV.用于分子和组织学分析的方法分子分析

蛋白质裂解物获自所有媒介物和化合物治疗的动物的大脑并且进行加工，以便通过蛋白质印迹测定法对GSK3 α/β pTYR和β-连环蛋白进行生物标记分析，从而确保化合物对靶标的活性。

脑脊髓液获自所有媒介物和化合物治疗的动物并且通过ELISA分析BDNF水平作为神经元可塑性的可替代标记。组织学分析

石蜡包埋的脑样品获自Neuroinvestigations并且将其切成放置在玻璃载玻片上的6um切片，并且通过免疫组织化学或免疫荧光分析与中风后恢复过程中有益效果相关的标记/表型：干细胞动员/增殖：使用用于对室下区(SVZ)中BrdU阳性细胞定量的Aperio系统染色BrdU并且进行分析。神经发生：对双皮层蛋白(DCX)进行免疫荧光染色并且结合使用用于定量的手工计数的SVZ中的BrdU。血管发生：使用用于对梗死周围中vWF阳性细胞定量的Aperio系统染色冯维勒布兰德因子VIII(vWF)并且进行分析。尽管已经描述了本发明的许多实施方案，但是显而易见，可以改变我们的基础实施例以便提供使用或包括本发明化合物，方法和工艺的其它实施方案。因此，可以理解本发明的范围由待批权利要求定义。

Claims (18)

1.式I-1的化合物：

2.组合物，其包含权利要求1的化合物和药学上可接受的载体，佐剂或媒介物。

3.使用权利要求1的化合物抑制离体或体外生物样品中GSK-3活性的方法。

4.权利要求1的化合物在制备治疗或减轻疾病或疾患的严重性的药物中的用途，所述疾病或疾患选自糖尿病，骨质疏松症，阿尔茨海默病，亨廷顿病，帕金森病，AIDS-相关痴呆，双相型情感障碍，肌萎缩性侧索硬化，多发性硬化，精神分裂症，白细胞减少，中风和类风湿性关节炎。

5.权利要求4所述的用途，其中所述的疾病为中风。

6.权利要求4所述的用途，其中所述的疾病为糖尿病。

7.权利要求4所述的用途，其中所述的疾病为精神分裂症。

8.权利要求4所述的用途，其中所述的疾病为双相型情感障碍。

9.权利要求4所述的用途，其中所述的疾病为白细胞减少。

10.权利要求1的化合物在制备治疗或减轻疾病或疾患的严重性的药物中的用途，所述疾病或疾患选自中风，脊髓损伤，外伤性脑损伤，沙-马-图病和糖尿病神经病变。

11.权利要求10所述的用途，其中所述的疾病或疾患为中风。

12.权利要求11所述的用途，其中在局部缺血发生后给予所述的药物。

13.权利要求11所述的用途，其中所述的药物用于中风后恢复。

14.权利要求10-13中任意一项所述的用途，所述药物与物理疗法联用。

15.权利要求1的化合物在制备增加神经元细胞中轴突和树突分枝的药物中的用途。

16.权利要求1的化合物在制备增加神经元细胞中神经发生的药物中的用途。

17.权利要求1的化合物在制备增加神经元细胞中血管发生的药物中的用途。

18.权利要求1的化合物在制备增加神经元细胞的可塑性的药物中的用途。