CN101580815B - 产生ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或其内酰胺的重组细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及产生ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或其内酰胺的重组细胞。具体地，本发明涉及一种细胞，该细胞与其野生型相比通过如下方式进行基因工程修饰：使得该细胞能够比其野生型从羧酸或羧酸酯产生更多的ω-氨基羧酸、更多的ω-氨基羧酸酯或者更多的从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺。此外，本发明还涉及一种转基因细胞的制备方法，可通过该方法获得的细胞；ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生的内酰胺的制备方法，可通过该方法获得的ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生的内酰胺；基于ω-氨基羧酸或者基于内酰胺的聚酰胺的制备方法，以及可通过该方法获得的聚酰胺。

Description

产生ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或其内酰胺的重组细胞
技术领域
本发明涉及相对于其野生型转基因的细胞；转基因细胞的制备方法，以及可通过该方法获得的细胞；ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生的内酰胺的制备方法，以及可通过该方法获得的ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生的内酰胺；基于ω-氨基羧酸或者内酰胺的聚酰胺的制备方法，以及可通过该方法获得的聚酰胺。 
背景技术
聚酰胺是是其重复单元(单体)具有酰胺基作为特征的聚合物。“聚酰胺”这一名称通常作为合成工程使用的热塑性塑料的名称，并且以此将该物质类型区别于具有类似化学结构的蛋白质。几乎所有重要的聚酰胺均从伯胺衍生而来，也就是在其重复单元内均会出现官能团-CO-NH-。此外也存在源于仲胺(-CO-NR-，R＝有机基团)的聚酰胺。尤其可将氨基羧酸、内酰胺和/或二胺和二元羧酸作为聚酰胺的单体。 
基于内酰胺制备聚酰胺的方法尤为重要。例如，可通过开环聚合ε-己内酰胺来获得工业上常用的产品“聚酰胺6”，而通过开环聚合月桂内酰胺则可获得工业上同样重要的“聚酰胺12”。内酰胺的共聚物也有很大的工业意义，例如ε-己内酰胺和月桂内酰胺的共聚物(“聚酰胺6/12”)。 
ε-己内酰胺的制备通常是让环己酮与硫酸氢盐或者羟胺盐酸盐进行反应形成环己酮肟，通过Beckmann重排法将其转换成ε-己内酰胺，通常使用浓硫酸作为催化剂。通常通过环己烷与空气氧的催化氧化反应来制备环己酮，通过苯的加氢反应获得环己烷。 
月桂内酰胺的制备特别费事。其工业规模的制备方法为：首先使丁二烯进行三聚反应形成环十二碳三烯。接着对环十二碳三烯进行加氢反应形成环十二烷，然后对以此得到的环十二烷氧化得到环十二酮。然后将以此获得的环十二酮与羟胺进行反应形成环十二酮肟，然后再利用Beckmann重排法将其转换成月桂内酰胺。 
这些由现有技术已知的利用Beckmann重排法由酮肟制备内酰胺的方法的缺点在于：会形成大量的必须加以处置的盐类副产物，例如硫酸钠。因此在现有技术条件下，也有人对没有这些缺点的其它内酰胺制备方法进行了描述。例如专利EP-A-0 748 797就描述了一种用二腈制备内酰胺的方法，即对二腈进行加氢反应形成氨基腈，然后通过环化水解使得氨基腈转变成内酰胺。按照该发明所述，使用例如酸性沸石、硅酸盐和非沸石分子筛的分子筛、金属磷酸盐和金属氧化物或者混合金属氧化物作为环化水解的催化剂。但是该方法的主要缺点在于：通过环化水解使氨基腈转变的选择性很小，因此会形成大量的副产物。除此之外，按照现有技术描述的这种内酰胺制备方法，要使用裂解汽油或石油获得的苯或者丁二烯之类的碳氢化合物，因此源自于不可再生的原料。因此从生态角度来看，基于这样制备的内酰胺制备聚酰胺的方法存在缺点。 
发明内容
本发明的任务在于，克服现有技术的缺点。 
本发明的任务尤其在于阐述一种可以用尽可能少的方法步骤，并且在副产物尽可能少的情况下形成内酰胺尤其是月桂内酰胺的方法。 
本发明的另一项任务就是阐述一种能够使用可再生原料制备内酰胺尤其是月桂内酰胺的方法。 
有助于解决上述任务的是一种细胞，该细胞相比于其野生型以如下方式进行基因工程修饰：使得该细胞能够比其野生型由羧酸或羧酸酯产生更多的ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯，或者产生更多从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺。可以使用这种细胞以发酵方法制备由羧酸或羧酸酯(例如月桂酸或月桂酸酯)来制备ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯，或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺。 
“使得该细胞能够比其野生型由羧酸或羧酸酯产生更多的ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯，或者产生更多从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺”这一表述也涉及这种情况，即转基因细胞的野生型根本不能形成ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯，或者不能形成从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺，至少不能形成可检出数量的这些化合物，且只有经过转基因(gentechnischen 
Figure G2008101910545D00021
)之后，才能形成可检出数量的这些成分。 
所谓“野生型”细胞，尤其指其基因组(Genom)处在自然进化状态的细胞。这一概念既可用于整个细胞，也可用于单个的基因。因此“野生型”这一概念 并不包括那些人类利用重组方法至少部分改变了其基因序列的细胞或者基因。 
按照本发明优选的是，对转基因细胞进行如下方式的基因工程修饰，使其能够在限定的时间间隔之内，优选在2小时之内，更优选在8小时之内，且最优选在24小时之内，形成为野生型细胞的至少2倍之多、尤其至少10倍、此外优选至少100倍、此外更优选至少1000倍以及最好优选至少10000倍的ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺。例如可通过下述方式测定形成产物的增加量：在相同条件下(相同的细胞密度，相同的培养基( )，相同的培养条件)，将本发明所述的细胞与野生型细胞在适当的培养基中培养一定的时间，然后测定培养基内的目标产物含量(ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺)。 
本发明所述的细胞可以是原核生物或真核生物。其可以是哺乳动物细胞(如人的细胞)、植物细胞或者如酵母、真菌或细菌之类的微生物，其中微生物是尤其优选的，且细菌和酵母是最为优选的。 
适合作为细菌、酵母或真菌的尤其是Deutschen Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH(德国微生物与细胞培养菌种保藏中心)(DSMZ)作为细菌、酵母或真菌菌株保存的那些细菌、酵母或真菌。本发明所述的适用细菌属于下列网站上列出的种类 
http://www.dsmz.de/species/bacteria.htm 
本发明所述的适用酵母属于下列网站上列出的种类 
http://www.dsmz.de/species/yeasts.htm 
本发明所述的适用真菌属于下列网站上列出的种类 
http://www.dsmz.de/species/fungi.htm 
本发明所述特别适用的细胞来自于棒状杆菌属(Corynebac terium)、短杆菌属(Brevibacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维氏酵母属(Kluveromyces)、糖酵母属(Saccharomyces)、埃希氏菌属(Escherichia)、发酵单孢菌属(Zymomonas)、耶氏酵母属(Yarrowia)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、劳尔氏菌属(Ralstonia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia) 以及梭菌属(Clostridium)，其中特别适用的是大肠杆菌(Escherichiacoli)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，最为适用的是大肠杆菌(Escherichia coli)。 
按照本发明所述细胞的一种优选实施方案，该细胞与其野生型相比，具有至少一种下述酶的增强活性： 
i)酶EI，其将羧酸或者羧酸酯催化转换成相应的ω-羟基羧酸或者ω-羟基羧酸酯； 
ii)酶EII，其将ω-羟基羧酸或者ω-羟基羧酸酯催化转换成相应的ω-氧代羧酸或者ω-氧代羧酸酯； 
iii)酶EIII，其将ω-氧代羧酸或者ω-氧代羧酸酯催化转换成相应的ω-氨基羧酸或者ω-氨基羧酸酯。 
“酶的增强活性”这一概念，例如就上述酶EI及随后实施方案中所使用的酶EII等等而言，优选理解为细胞内的活性增强。 
下述用来提高细胞内酶活性的实施方案既适用于提高酶EI的活性，也适用于任选地能提高其活性的所有随后提及的酶。 
原则上可以提高酶活性的方式为：提高用来编码酶的一个或多个基因序列的拷贝数、使用强启动子，或者使用针对相应的酶以增强活性进行编码的基因或者等位基因和视需要这些措施的组合。例如可通过转化、转导、接合作用，或者将这些方法与一种载体结合起来产生本发明所述的转基因细胞，所述载体含有所需的基因、该基因的等位基因或者其部分和含有能够表达该基因的载体。尤其可将基因或者等位基因整合入细胞染色体，或者整合在染色体外复制的载体之中，从而实现异源表达。 
专利DE-A-100 31 999以丙酮酸羧化酶为例，概述了增强细胞内酶活性的可能方法，本发明将该文献以参考的形式引入，因此该专利关于细胞内酶活性增强的可能方法的公开内容构成本发明公开的一部分。 
可借助一维及二维蛋白质凝胶分离法，然后使用相应的分析软件来光学鉴定凝胶内的蛋白质浓度，检测上述以及下述所有酶或基因的表达。如果仅仅以增强基因表达为基础来增强酶活性，就能以简单的方式，通过比较野生型和转基因细胞之间的一维或二维蛋白质分离结果，定量测定酶活性的增强水平。制备棒状杆菌的蛋白质凝胶以及鉴定蛋白质的常见方法是Hermann等人 (Electrophoresis，22：1712.23(2001))所描述的方法。同样也可以使用待检蛋白质的特异性抗体进行Western-Blot-Hybridisierung(Western印迹杂交)(Sambrook等人，Molecular Cloning：a laboratory manual，(分子克隆：实验室手册)第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，美国纽约Cold Spring Harbor，1989)，然后使用相应的浓度测定软件进行光学分析(Lohaus和Meyer(1989)Biospektrum杂志第5期第32-39页；Lottspeich(1999)，Angewandte Chemie(应用化学)第111期第2630-2647页)，从而分析出蛋白质浓度。可以利用DNA条带转移分析(DNA-Band-Shift-Assays)(也称作凝胶阻滞分析)来测定DNA结合蛋白的活性(Wilson等人(2001)Journal of Bacteriology(细菌学杂志)第183期第2151-2155页)。通过报道基因分析法所述的各种方法，可以很好地检测DNA结合蛋白对其它基因表达的影响(Sambrook等人，Molecular Cloning：a laboratory manual，第2版.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.USA，1989)。可以根据各种所述的方法测定细胞内酶活性(Donahue等人(2000)Journal of Bacteriology(细菌学杂志)第182卷第19期第5624-5627页；Ray等人(2000)Journal ofBacteriology(细菌学杂志)第182卷第8期第2277-2284页；Freedberg等人(1973)Journal of Bacteriology(细菌学杂志)第115卷第3期第816-823页)。如果在下述实施方案中没有指明某种酶活性的具体测定方法，则优选利用Hermann等人在2001年Electophoresis(电泳技术杂志)第22期第1712-23页、Lohaus等人在1998年Biospektrum杂志第5期第32-39页、Lottspeich在1999年Angewandte Chemie(应用化学杂志)第111期第2630-2647页以及Wilson等人在2001年Journal of Bacteriology(细菌学杂志)第183期第2151-2155页上所描述的方法，来测定酶活性的增强水平，也可测定酶活性的减弱程度。 
如果通过内源基因突变来增强酶活性，则要么根据经典方法以无定向方式产生此类突变(例如通过紫外辐射或者能引起突变的化学药剂)，或者利用诸如删除、插入、和/或核苷酸交换之类的基因工程方法来有目的地实现。通过这些突变方法可获得转基因细胞。特别优选的酶突变体尤其也可以是那些不可以反馈抑制的，或者与野生型酶相比反馈抑制能力有所减少的酶。 
如果以增强酶表达水平的方式来增强酶活性，则可以例如增大相应基因的拷贝数，或者使得结构基因上游的启动子和调节区(Regulationsregion)发生突变。植入在结构基因上游的表达盒以相同方式发挥作用。通过可诱导的启动子还可以在任何时刻提高表达水平。此外，也可以将所谓“增强子”分配给酶基因作为调节序列，这些增强子可改善RNA聚合酶与DNA之间的相互作用，因此同样也可增强基因表达。采用延长m-RNA寿命的措施同样也可改善表达水平。此外，阻止酶蛋白分解同样也可增强酶活性。基因或基因构建体要么存在于具有不同拷贝数的质粒之中，或者整合在染色体内并在其中扩增。备选地，还可以通过改变培养基组成以及培养进程的方式，达到相关基因的过度表达。专业人士可在下述文献中查阅相关说明：Martin等人(1987年Bio/Technology(生物/技术杂志)第5期第137-146页)、Guerrero等人(1994年Gene(基因杂志)第138期第35-41页)、Tsuchiya和Morinaga(1988年Bio/Technolog(生物/技术杂志)第6期第428-430页)、Eikmanns等人(1991年Gene(基因杂志)第102期第93-98页)、EP-A-0 472 869、US 4,601,893、Schwarzer和Pühler(1991年Bio/Technolog(生物/技术杂志)第9期第84-87页)、Reinscheid等人(1994年Applied and Environmental Microbiology(应用与环境微生物学杂志)第60期第126-132页)、LaBarre等人(1993年Journal of Bacteriology(细菌学杂志)第175期第1001-1007页)、WO-A-96/15246、Malumbres等人(1993Gene(基因杂志)第134期第15-24页)、JP-A-10-229891、Jensen和Hammer(1998年Biotechnology andBioengineering(生物技术与生物工程)第58期第191-195页)以及已知的遗传学与分子生物学教科书。上述措施也可以与突变一样产生转基因细胞。 
例如可以使用附加体质粒来增强各个基因的表达水平。适合作为质粒的尤其是在棒状杆菌中复制的那些质粒。大量已知的质粒载体例如pZ1(Menkel等人，1989年Applied and Environmental Microbiology(应用与环境微生物学)第64期第549-554页)、pEKEx1(Eiknanns等人，1991年Gene(基因杂志)第107期第69-74页)或者pHS2-1(Sonnen等人，1991年Gene(基因杂志)第107期第69-74页)均基于隐蔽性质粒pHM1519、pBL1或者pGA1。同样也可使用其它质粒载体，例如基于pCG4(US 4,489,160)或者pNG2(Serwold-Davis等人，1990年FEMS Microbiology Letters(FEMS微生 物学快报)第66期第119-124页)或者pAG1(US 5,158,891)的那些质粒。 
此外合适的还有，借助其可通过整合在染色体之中来用于基因扩增方法的质粒载体，例如Reinscheid等人(1994年Applied and EnvironmentalMicrobiology(应用与环境微生物学杂志)第60期第126-132页)所描述的用来复制或扩增hom-thrB-操纵子的方法。这种方法可将完整的基因克隆在一种质粒载体之中，该质粒载体可以在宿主(典型的有大肠杆菌)之中复制，但是不可以在谷氨酸棒状杆菌之中复制。可以作为载体使用的例如有pSUP301(Simon等人，1983年Bio/Technology(生物/技术杂志)第1期第784-791页)、pK18mob或者pK19mob( 
Figure G2008101910545D00071
等人，1994年Gene(基因杂志)第145期第69-73页)、pGEM-T(Promiga Corporation，Madison，Wisconsin，USA)、pCR2.1-TOPO(Shuman，1994年Journal of Biological Chemistry(生物化学杂志)第269期第32678-84页)、 
Figure G2008101910545D00072
Blunt(Invitrogen，Groningen，Niederlande)、pEM1(Schrumpf等人，Journal of Bacteriology(细菌学杂志)第173期第4510-4516页)或者pBGS8(Spratt等人，1986年Gene(基因杂志)第41期第337-342页)。随后通过接合或者转化作用，将含有待扩增基因的质粒载体转移到谷氨酸棒状杆菌的所需菌株之中。例如 
Figure G2008101910545D00073
等人在1994年Applied and Environmental Microbiology(应用与环境微生物学杂志)第60期第756-759页中就描述了这种接合方法。例如Thierbach等人在1988年Applied Microbiology and Biotechnology(应用微生物学与生物技术杂志)第29期第356-362页、Dunican和Shivnan在1989年Bio/Technology(生物/技术杂志)第7期第1067-1070页以及Tauch等人在1994年FEMS Microbiology Letters(FEMS微生物学快报)第123期第343-347页中描述了相关的转化方法。利用某种“交换(cross-over)”事件进行同源重组之后，所形成的菌株将包含相关基因的至少两个拷贝。 
上述及下述实施方案中使用的“酶Ex相对于其野生型的增强活性”这一说法，优选理解成各酶Ex的活性增强到至少2倍、尤其至少10倍、此外优选至少100倍、此外更优选至少1000倍且最好优选至少10000倍。此外，本发明所述的具有“相对于其野生型增强了酶Ex活性”的细胞也包括其野生型没有或者至少检测不出酶Ex活性、且只有在例如通过过度表达增强酶活性之后才能检测出这种酶Ex活性的细胞。就此而言，“过度表达”或者下述实施方案 中使用的“增强过量表达”也包括这种情况，即原始细胞(例如野生型细胞)没有或者至少没有可检测表达，且只有通过重组方法才诱导酶Ex的可检测表达。 
此外，根据本发明优选的是，所述细胞具有酶EI和EII、酶EI和EIII、酶EII和EIII的增强活性，或者具有所有酶EI、EII和EIII的增强活性。 
此外，就本发明所述细胞的上述优选实施方案而言， 
-酶EI是烷烃单加氧酶或二甲苯单加氧酶，或者，优选和 
-酶EII是，或者优选是，烷烃单加氧酶、醇脱氢酶或醇氧化酶，或者，优选和 
-酶EIII是ω-转氨酶。 
优选的酶EI是，尤其是优选的烷烃单加氧酶是，源于恶臭假单胞菌-GPOl的经过alkBGT基因编码的烷烃单加氧酶。例如van Beilen等人在2002年Journal of Bacteriology，第184卷第6期第1733-1742页发表的“Functional Analysis of Alkane Hydroxylases from Gram-Negativeand Gram-Positive Bacteria”一文中就描述了alkBGT基因序列的分离方法。此外可以作为烷烃单加氧酶使用的还有细胞色素-P450-单加氧酶，尤其是源于假丝酵母属例如热带假丝酵母(Candida tropicalis)或者源于植物例如鹰嘴豆(Cicer arietinum L.)的细胞色素-P450-单加氧酶。例如专利WO-A-00/20566就公开了源于热带假丝酵母的合适细胞色素-P450-单加氧酶的基因序列，关于源于鹰嘴豆的合适细胞色素-P450-单加氧酶的基因序列例如可查阅Barz等人在2000年Plant Science(植物科学杂志)第155卷第101-108页上发表的文章“Cloning and characterization of eight cytochromeP450 cDNAs from chickpea(Cicer arietinum L.)cell suspensioncultures(鹰嘴豆(Cicer arietinum L.)细胞悬浮培养物的八个细胞色素P450cDNA的克隆与分析)”。关于alkB基因的其它同系物也可以查阅van Beilen等人在2003年“Oil&Gas Science and Technology(石油与天然气科学技术)”第58卷第4期第427-440页上发表的文章。适用于二甲苯单加氧酶的基因例如是xylM或xylA基因，其中包含这两种基因的质粒具有基因库登录号M37480。 
优选的酶EII尤其是醇脱氢酶例如是经过alkJ基因编码的醇脱氢酶(EC 1.1.99-2)，尤其是源于恶臭假单胞菌GPo1经过alkJ基因编码的醇脱氢酶。关于源于恶臭假单胞菌GPo1、泊库岛食烷菌(Alcanivorax borkumensis，)、副百日咳博德特氏杆菌(Alcanivorax borkumensis，)、支气管败血性博德特氏杆菌(Bordetella bronchiseptica)或者源于脱氮玫瑰杆菌(Roseobacter denitrificans)经过alkJ基因编码的醇脱氢酶，例如可查阅KEGG基因数据库。 
适用的ω-转氨酶例如有专利US-A-2007/0092957中以序列号248、250、252和254表示的那些ω-转氨酶。 
优选的酶EIII是，尤其是优选的ω-转氨酶是，源于紫色色杆菌(Chromobac terium violaceum)DSM30191的ω-转氨酶(Kaulmann等人，2007；Substrate spectrum ofω-transaminase from Chromobacteriumviolaceum DSM30191 and its potential for biocatalysis(紫色色杆菌DSM30191ω-转氨酶的底物范围及其生物分析学潜力)，Enzyme andMicrobial Technology(酶和微生物技术杂志)第41卷第628-637页)，其基因序列编码为SEQ.-ID.-No.01。 
有利的是使用可从植物中分离出的ω-转氨酶作为酶EIII。这里优选选用源自下述植物的ω-转氨酶；拟南芥(Arabidopsis thaliana)、燕麦(Avenasativa)、甜菜(beta vulgaris)、大豆(Glycine max)、大麦(Hordeumvulgare)、百脉根(Lotus japonicus)、番茄(Solanum lycopersicum)、木薯(Manihot esculenta)、水稻(Oryza sativa)、小麦(Traeticumaestivum)、玉米(Zea mays)、菠菜(Spinacia oleracea)、斑叶疆南星(Arum maculatum)、多年生山靛(Mercurialis perennis)以及荨麻(Urtica dioica)，其中特别优选的是拟南芥。适合作为ω-转氨酶的尤其是经过核酸编码的酶，所述核酸具有与SEQ.-ID.-No.39序列90％、优选为95％、尤其优选为99％、最特别优选为100％的同一性( 
Figure G2008101910545D00091
)。这里可利用已知的方法测定相对于SEQ.-ID-No.39的核苷酸同一性。通常可在考虑特殊要求的情况下使用具有相关算法的特别计算机程序。优选的同一性测定方法首先在待比较序列之间产生最大的一致性。用于确定同一性的计算机程序包括(但并不仅限于此)GCG程序包，包含 
-GAP(Deveroy，J.等人，1984年Nucleic Acid Research(核酸研 究杂志)第12期第387页，Genetics Computer Group University ofWisconsin，Medicine(Wi)(威斯康辛大学遗传学计算机集团，医疗工程(Wi))，以及 
-BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S.等人，1990年Journal ofMolecular Biology(分子生物学杂志)第215期第403-410页)。BLAST程序可由National Center For Biotechnology Information(国家生物技术信息中心)(NCBI)及其它来源获得(BLAST Handbuch，Altschul S.等人，NCBI NLM NIH Bethesda ND 22894；Altschul S.等人)。 
同样也可使用已知的Smith-Waterman算法来确定核苷酸同一性。 
优选的核苷酸比较参数包括下列： 
-Needleman和Wunsch算法，Journal of Molecular Biology(分子生物学杂志)48(1970)，第443-453页 
-比较矩阵 
匹配＝+10 
错配＝0 
空位罚分＝50 
空位长度罚分＝3 
GAP程序同样也适合与上述参数一起使用。上述参数是核苷酸序列比较过程中的默认参数。 
此外还适用源于β-Ala子群(Untergruppe)的酶：丙酮酸转氨酶。其中包括例如源于恶臭假单胞菌W619(gi：119860707，gi：119855857，gi：119856278)、恶臭假单胞菌KT2440(gi：24984391)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PA01(gi 15595330，gi：15600506，gi 15595418，gi 9951072)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)(gi：3319731)、阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)MA 4680(gi：29831094，gi：29829154)以及源于紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)ATCC12472(gi 34102747)的转氨酶。上述转氨酶的氨基酸序列在SEQ.-ID.-No.19～SEQ.-ID.-No.30序列之中给出。 
对于打算使用本发明所述细胞由羧酸酯出发来制备ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者基于ω-氨基羧酸的内酰胺的情况而言，如果除了增强酶EI、EII和EIII 中的至少一种酶的活性之外，尤其是除了酶EI和EIII或者EI、EII和EIII的增强活性之外，本发明所述的细胞还具有酶EIV的增强活性，其中该酶EIV将ω-氨基羧酸酯催化转换成相应的ω-氨基羧酸酯，则更为有益；所述的酶EIV优选是细胞所分泌的酯酶。通过细胞分泌酯酶的优点在于：在细胞之外才断裂酯键。以这种方式，由于ω-氨基羧酸酯具有比ω-氨基羧酸更好的膜渗透性，能保证有充分的目标产物离开细胞并转移到细胞周围的培养基之中。 
本发明所述的优选酯酶尤其是脂肪酶，作为合适脂肪酶的实例提及源自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluoreszenz)HU380的脂肪酶LipA(ACC CodeQ76D26，Kojima和Shimizu在2003年Journal of Bioscience andBioengineering(生物学与生物工程杂志)第96卷第3期第219-226页上发表的文章“Purification and Characterization of the Lipase fromPseudomonas fluorescens HU380(荧光假单胞菌HU380脂肪酶的净化与性质)”)。为了保证分泌酯酶，可以按照专业人士已知的方式，赋予其保证进行分泌的相应信号序列。当例如上述来自荧光假单胞菌HU380的脂肪酶LipA在大肠杆菌中过度表达时，就可以使其具有铜绿假单胞菌细胞表面上自然出现的酯酶EstA的信号序列(Becker等人在2005年FEBS Letters(FEBS快讯)第579卷第1177-1182页上发表的文章“A generic system for theEscherichia coli cell-surface display of lipolytic enzymes(大肠杆菌细胞表面显示脂肪分解酶的通用系统)”)。其它适用的酶是南极假丝酵母(C.antarctica)、米黑毛霉(M.miehei)以及洋葱假单胞菌(P.cepacia)的脂肪酶(Vaysse等人，2002年Enzyme and Microbial Technology(酶与微生物技术杂志)第31卷第648-655页)。也可以按照传统方式分裂所分泌的ω-氨基羧酸酯，以便获得ω-氨基羧酸，例如可通过氢氧化物(例如氢氧化钠)水溶液将ω-氨基羧酸酯皂化即水解的方式。 
按照本发明所述，如果除了酶EI、EII和EIII中至少一种酶的增强活性之外，优选除了酶EI和EIII或者EI、EII和EIII的增强活性以及视需要除了上述酶EIV的增强活性之外，本发明所述的细胞也具有酶EV的增强活性，其中酶EV将ω-氨基羧酸催化转换成相应的内酰胺，则较为有益；如果从细胞分泌这种酶EV，也较为有益。以这种方式可以将直接由细胞形成的ω-氨基羧酸或者在细胞外分裂ω-氨基羧酸酯才产生的ω-氨基羧酸转移到相应的内酰胺之中，从而便于在视 需要提纯目标产物。 
按照本发明所述细胞的另一种特殊实施方案，该细胞除了具有一种或多种酶EI、EII或EIII的增强活性以及任选地酶EIV和/或EV的增强活性之外，也具有酶EVI的增强活性，其中酶EVI将α-酮羧酸催化转换成氨基酸，这种酶EVI优选是氨基酸脱氢酶。这种细胞修饰方式的优点在于：如果使用氨基酸作为NH2基团的供体，即在通过转氨酶(EIII)介导ω-氧代羧酸或者ω-氧代羧酸酯反应形成相应的ω-氨基羧酸、相应的ω-氨基羧酸酯或者相应的ω-氨基羧酸酯的过程中所需的基团，则可以再生这些氨基酸。作为氨基酸脱氢酶的优选是枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的丙氨酸脱氢酶(EC No.1.4.1.1；基因ID：936557)，用基因序列SEQ.-ID.-No.02对其进行编码。其它适用的氨基酸脱氢酶有丝氨酸脱氢酶、天冬氨酸脱氢酶、苯丙氨酸脱氢酶以及谷氨酸脱氢酶。 
有助于解决开头所述任务的还有转基因细胞制备方法，包括增强细胞内至少一种下列酶的活性的方法步骤； 
i)酶EI，其将羧酸或者羧酸酯催化转换成相应的ω-羟基羧酸或者ω-羟基羧酸酯； 
ii)酶EII其将ω-羟基羧酸或者ω-羟基羧酸酯催化转换成相应的ω-氧代羧酸或者ω-氧代羧酸酯，或者 
iii)酶EIII，其将ω-氧代羧酸或者ω-氧代羧酸酯催化转换成相应的ω-氨基羧酸或者ω-氨基羧酸酯， 
其中优选通过前述方法来增强酶活性。 
按照上述方法的一种特殊实施方案，在该方法的过程中除了增强酶EI、EII和/或EIII的活性之外，也增强酶EIV的活性，该酶EIV将ω-氨基羧酸酯催化转换成相应的ω-氨基羧酸；和/或增强酶EV的活性，该酶EV将ω-氨基羧酸催化转换成相应的内酰胺，方法是增强这些酶的表达水平；其中优选从细胞分泌所述的酶EIV和/或者EV。 
有助于解决开头所述任务的还有可通过上述方法获得的转基因细胞。 
有助于解决开头所述细胞的还有用于制备ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺的方法，包括下列方法步骤： 
I)在能够使得细胞从羧酸或者从羧酸酯形成ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺的条件下，使本发明所述的细胞与含有羧酸 或者羧酸酯的培养基接触，或者与邻接含有羧酸或羧酸酯的有机相的培养基接触； 
II)视需要分离出所形成的ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺。 
在本发明所述方法的方法步骤I)中，首先让细胞与含有羧酸或者羧酸酯的培养基接触，或者与邻接含有羧酸或羧酸酯的有机相的培养基接触，且在能够使得细胞从羧酸或羧酸酯形成ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺的条件下进行接触。 
可以采用批次法(batch-Verfahren)(批次培养(Satzkultivierung))、进料批次法(fed-batch-Verfahren)(回流法(Zulaufverfahren))或者重复进料批次法(repeated-fed-batch-Verfahren)(重复回流法(repetitives Zulaufverfahren))，以连续或不连续方式，使得本发明所述的转基因细胞与培养基进行接触、培养，以便产生ω-氨基羧酸或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺。也可以考虑使用GB-A-1009370所述的半连续法。在Chmiel的教科书(“Bioprozesstechnik 1.Einführung in dieBioverfahrenstechnik(生物过程工程初探)”(斯图加特Gustav Fischer出版社1991年出版))或者Storhas的教科书(“Bioreaktoren undperiphere Einrichtungen(生物反应器与外围设备)”，布伦斯维克/威斯巴登Vieweg出版社1994年出版)中有关于已知培养方法的综述。 
所使用的培养基必须以恰当方式满足相应菌株的要求。有关各种微生物培养基的描述可参阅美国细菌学协会(der American Society forBacteriology)的“Manual of Methods for General Bacteriolog(通用细菌学方法手册)”(Washington D.C.，USA，1981)。 
除了羧酸或羧酸酯之外，可以作为碳源使用的碳水化合物例如还有葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素、油和脂肪(例如豆油，葵花籽油，花生油及椰子油)、脂肪酸(例如棕榈酸，硬脂酸及亚油酸)、醇类(例如丙三醇和甲醇)、烃类(例如甲烷)、氨基酸类(例如L-谷氨酸或者L-缬氨酸)或者有机酸(例如醋酸)。可以单独使用这些物质，或者作为混合物使用。特别优选使用碳水化合物，尤其是单糖、寡糖或者多糖，例如US 6,01,494和US 6,136,576所述的那些，C5-糖或者丙三醇。 
可以作为氮源使用的含氮有机化合物例如有蛋白胨、酵母提取物、肉浸膏、麦芽浸膏、玉米浆、大豆粉、尿素或者无机化合物，例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵以及硝酸铵。可以单独使用氮源，或者作为混合物使用。 
可以作为磷源使用的有磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或者相应的含钠盐类。培养基还必须含有生长所需的其它金属盐类，例如硫酸镁或者硫酸铁。除了上述物质之外，最后还可以使用必需生长物质如氨基酸和维生素。此外，还可以将适当的前体加入培养基之中。可以将所述物质以一次性批料形式加入培养基之中，或者在培养过程中以适当的方式加入。 
以适当的方式使用碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水，或者使用酸性化合物如磷酸或硫酸来控制培养基的pH值。可以使用消泡剂(例如脂肪酸聚乙二醇酯)来控制泡沫形成。可以在培养基中添加适当的选择性作用物质(例如抗生素)，以维持质粒的稳定性。可将氧气或者含氧混合气(例如空气)通入培养基之中，以便维持好氧条件。培养基温度通常为20℃～45℃，优选为25℃～40℃。 
按照本发明所述的ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺制备方法的一种特别优选的实施方案，使用源于大肠杆菌细胞的重组细胞作为本发明所述的细胞，根据Riesenberg等人在1990年ApplMicrobiol and Biotechnololgy(应用微生物与生物技术杂志)第34卷第1期第77-82页上发表的文章“High cell density fermentation ofrecombinan t Escherichia coli expressing human interferon alpha1(表达人干扰素alpha I的大肠杆菌的高细胞密度发酵)”所述，使用含有氨比西林、氯霉素及卡那霉素的无机盐培养基作为培养基。 
优选在能够使得细胞从羧酸或羧酸酯形成ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺的条件下，在方法步骤I)中使得本发明所述的细胞与培养基接触。可作为羧酸或羧酸酯使用的是碳原子数为6～20、优选为6～15、尤其优选为6～12的羧酸，且月桂酸特别优选作为羧酸。可作为羧酸酯使用的是上述羧酸的甲酯或乙酯，且月桂酸甲酯特别优选作为羧酸酯。 
可以考虑在方法步骤I)中采用不同的方法来制备ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺。 
按照本发明所述方法的一种实施方案，首先在培养基中培养用于产生生物 质的细胞，所述培养基不含羧酸或羧酸酯，尤其不含上述的优选羧酸或羧酸酯。只有在获得一定的生物质之后，才将羧酸或羧酸酯加入到培养基之中，或者使得细胞与含有羧酸或羧酸酯的新培养基接触。就此而言，在形成ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺的过程中，羧酸或羧酸酯的含量优选为1～200g/l，特别优选为20～200g/l。 
按照本发明所述方法的另一种实施方案，在两相系统内执行该方法，所述两相系统包括 
A)水相，以及 
B)有机相， 
在方法步骤I)中在水相中通过细胞形成ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺，然后在有机相中使得所形成的ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺富集。以这种方式可以在原位提取所形成的ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺。 
即使对于本发明所述方法的这种实施方案而言，可能有益的是首先在培养基中培养用来产生生物质的细胞，所述培养基不含羧酸或羧酸酯，尤其不含上述的优选羧酸或羧酸酯。只有在获得一定的生物质之后，才将细胞悬浮液作为水相A)与有机相B)接触，其中特别地，有机相B)的羧酸或羧酸酯含量优选为1～200g/l，特别优选为20～200g/l。如果作为羧酸或羧酸酯使用的底物对于所使用的细胞而言没有毒性，例如月桂酸甲酯，那么有机相的这些羧酸或羧酸酯含量可以明显高一些。在这种情况下，可以使用纯羧酸或纯羧酸酯(例如月桂酸甲酯)作为有机相。 
可以作为有机相使用的是中等链长的链烷烃，优选是logP值大于4(起沫少)的链烷烃，或者使用物理上类似的芳族化合物或芳族化合物酯，或者优选如以上实施方案所述，使用月桂酸酯，尤其是月桂酸甲酯、BEHP(双(2-乙基己基)邻苯二甲酸酯)或者长链脂肪酸酯(生物柴油)。 
此外，本发明优选的是，至少在形成ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺的过程中，使得方法步骤I)中所用的培养基含有氨基团供体(例如氨或氨离子)或者氨基酸，尤其是丙氨酸或天冬氨酸，这些物质在通过转氨酶将ω-氧代羧酸或者ω-氧代羧酸酯催化转换成相应ω-氨基羧 酸或者ω-氨基羧酸酯的过程中起到氨基供体的作用。 
在本发明所述方法的方法步骤II)中，视需要可分离出所形成的ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺，且优选采用至少两个步骤的提纯法进行分离，包括 
a)提取步骤：从培养基中提取ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺，以及 
b)提纯步骤：采用蒸馏法或者选择性结晶法，对方法步骤a)中获得的提取物进一步提纯，获得纯度至少为99.8％的ω-氨基羧酸相、ω-氨基羧酸酯相或者内酰胺相。 
方法步骤a)中的提取操作尤其可以配置为所谓“原位”提取，其中同时执行本发明所述的ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺制备方法的方法步骤I)和II)。以上已经对这种“原位”提取操作进行过描述。 
例如可以采用蒸馏或结晶法，在方法步骤II)中进行精细提纯。 
按照本发明所述的ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺制备方法的一种特殊实施方案，在额外的方法步骤中使用常规化学方法将方法步骤I)中形成的ω-氨基羧酸酯转变成ω-氨基羧酸；优先选用的常规化学方法是皂化反应，其中利用碱的水溶液尤其是氢氧化物的水溶液，优选使用氢氧化钠水溶液将ω-氨基羧酸酯转换成ω-氨基羧酸。 
这种方法优选用于由月桂酸酯优选月桂酸甲酯来制备ω-氨基月桂酸； 
有助于解决开头所述任务的还有可通过上述方法获得的ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺；且所述的内酰胺优选是按照本发明所述方法的方法步骤I)使用月桂酸或月桂酸酯作为羧酸或羧酸酯来制备从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺时所获得的月桂内酰胺，所述的ω-氨基羧酸优选是ω-氨基月桂酸，且ω-氨基羧酸酯优选是ω-氨基月桂酸甲酯。 
有助于解决开头所述任务的还有制备基于ω-氨基羧酸的聚酰胺的方法，包括下列方法步骤； 
(α1)通过采用上述某一种制备ω-氨基羧酸的方法，尤其是上述由月桂酸或月桂酸酯制备ω-氨基羧酸的方法，制备ω-氨基羧酸； 
(α2)聚合ω-氨基羧酸，获得聚酰胺。 
按照本发明所述用于制备基于ω-氨基羧酸的聚酰胺的的方法的方法步骤(α2)，将方法步骤(α1)中获得的ω-氨基羧酸、尤其是将方法步骤(α1)中获得的ω-氨基月桂酸在聚合反应中转化为聚酰胺，视需要也可使用各种ω-氨基羧酸组成的混合物，其中至少一种ω-氨基羧酸、视需要所有ω-氨基羧酸均可采用本发明所述的ω-氨基羧酸制备方法进行制备。 
可以采用已知的方法用ω-氨基羧酸来制备聚酰胺，例如L.Notarbartolo、Ind.Plast Mod.10(1958)2第44页、JP 01-074224、JP 01-051433、JP63286428、JP58080324或者JP60179425所述的方法。 
有助于解决开头所述任务的还有制备基于内酰胺的聚酰胺的方法，包括下列方法步骤； 
(β1)制备内酰胺，其采用上述制备从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺的方法，尤其是采用上述用月桂酸或月桂酸酯制备月桂内酰胺的方法进行； 
(β2)开环聚合或者缩聚月桂内酰胺获得聚酰胺。 
按照本发明所述用于制备基于内酰胺的聚酰胺的方法步骤(β2)，以开环聚合或者通过缩聚反应将方法步骤(β1)中获得的内酰胺，尤其是将方法步骤(β1)中获得的月桂内酰胺转变成聚酰胺，视需要也可使用各种内酰胺组成的混合物，尤其是月桂内酰胺与ε-己内酰胺组成的混合物，其中的至少一种内酰胺、视需要所有内酰胺均可采用本发明所述的制备从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺的方法进行制备。 
可采用已知的方法用内酰胺制备聚酰胺，例如DE-A-14 95 198、DE-A-25 58480、EP-A-0 129 196或者1977年纽约Interscience杂志第424-467页、尤其是第444-446页上的文章“Polymerization Processes”所述的方法。 
可通过上述方法获得的聚酰胺也有助于解决开头所述的任务。其中特别优选的是，聚酰胺的重量百分比的至少10％、特别优选至少25％、更优选至少50％、最优选至少75％基于月桂酸、月桂酸酯或者月桂内酰胺，它们采用本发明所述制备月桂酸、月桂酸酯或来自月桂酸或月桂酸酯的月桂内酰胺的方法来获得。 
附图说明
以下将根据非限制性附图和实施例，对本发明进行说明。 
附图1示意性示出用来将alk基因染色体整合入大肠杆菌之中的重组质粒(tnp：转座酶基因；bla：氨比西林抗性基因，oriT RP4：移动区；I和O标记微转座子Tn5的“反向重复”)。 
附图2示意性示出在控制阿拉伯糖可诱导启动子情况下表达转氨酶和丙氨酸脱氢酶的重组质粒(bla：氨比西林抗性基因；CV2025：青紫色色杆菌ω-转氨酶的基因；ald：枯草杆菌丙氨酸脱氢酶的基因；araC：转录调节因子)。 
附图3示意性示出用来表达大肠杆菌的LipA的重组质粒以及细胞表面上的酶(colE1，ColE1：复制起点；estA*，estA：用丙氨酸相对于丝氨酸进行氨基酸替换的基因(Codon #38)，cat：氯霉素抗性基因；phoA：针对碱性磷酸酶前导序列进行编码的基因片段)。 
附图4示出由酶分析确定紫色色杆菌转氨酶的活性，其中通过来自紫色色杆菌的ω-转氨酶转化12-氧代月桂酸甲酯。通过光度计测定以两次测定法(活性1，活性2)测定活性。使用不含协同底物L-丙氨酸的批次(o.Cos)、含有热灭活酶的批次(非活性)、以及大肠杆菌表达培养基与空载体组成的批次(空载体)，类似于ω-TA进行提纯，作为阴性对照。 
附图5示出在基准测量开始之时(上)(参比物质12-氨基月桂酸甲酯，10.2分钟时达到峰值)以及使用提纯后的转氨酶进行培养2小时之后(下)(经过2小时后的转化率，10.2分钟时达到峰值)，底物12-氨基月桂酸甲酯的色谱图。 
附图6示出经过24小时酶分析之后(上)(经过24小时后的转化率，10.2分钟时达到峰值)以及底物增加之后(对照组，下)(经过24小时后的转化率，参比物质增加，10.2分钟时达到峰值)，底物12-氨基月桂酸甲酯的色谱图。 
附图7示出将酶进行热灭活之后(上)(对比：热灭活蛋白质，经过24小时后的转化率。没有产物可检出)以及经过0小时之后(下)(对比：经过0小时后的转化率。没有产物可检出)，底物12-氨基月桂酸甲酯的色谱图。 
附图8示出用于作为alkBGTS扩增模板的起始质粒pGEc47。 
附图9示出所使用的引物以及由此而得到的PCR产物alkBFG和alkT。 
附图10示出用于合成羟基月桂酸甲酯和氧代月桂酸甲酯的重组载体pBT10。 
附图11示出标准物12-氧代月桂酸甲酯的GC-色谱图。 
附图12示出标准物12-羟基月桂酸甲酯的GC-色谱图。 
附图13示出月桂酸甲酯生物反应器内静息细胞生物转化作用产生的有机相的色谱图，时刻0分钟。 
附图14示出月桂酸甲酯生物反应器内静息细胞生物转化作用产生的有机相的色谱图，时刻150分钟。 
附图15示出含AT3G22200的pGJ3130的表达载体。 
附图16示出通过耦合酶分析检测酶活性(非活性，热灭活蛋白质；o.Cos.，没有添加丙氨酸；akt，提纯后的活性酶)。 
附图17示出通过HPLC检测异源表达的蛋白质AT3G22200。上：10.8分钟时经过20分钟培养后的产物；下：10.8分钟时的参比物质。 
附图18示出表达含转氨酶基因ppta5(pPPTA5)的载体pET-21a(+)的载体卡。 
附图19示出含转氨酶基因psta(pPSTA)的表达载体pET-21a(+)的载体卡。 
附图20示出5mM 12-氧代月桂酸甲酯与转氨酶PPTA5的胺化反应。为了进行分析，由所得的中性和酸性提取物的色谱图，将12-氧代月桂酸甲酯和12-氨基月桂酸甲酯的峰面积相加进行分析，然后计算进料物或产物的百分比含量。 
附图21示出5mM 12-氧代月桂酸甲酯与转氨酶PSTA的胺化反应。为了进行分析，由所得的中性和酸性提取物的色谱图，将12-氧代月桂酸甲酯和12-氨基月桂酸甲酯的峰面积相加，然后计算进料物或产物的百分比含量。 
具体实施方式
实施例 
A.将月桂酸或月桂酸甲酯转换成月桂内酰胺
给大肠杆菌补充所需的单加氧酶、醇脱氢酶、ω-转氨酶、丙氨酸脱氢酶以及脂肪酶，将月桂酸或者月桂酸甲酯转换成月桂内酰胺。在大肠杆菌中过度表达这些酶，各个酶的表达水平取决于各个反应的动力学，必须使其彼此最优匹配。通过添加适量诱导物调整表达水平。使用正辛烷诱导表达单加氧酶和醇脱氢酶，使用阿拉伯糖诱导转氨酶和丙氨酸脱氢酶，使用IPTG诱导脂肪酶。 
A1.克隆各个酶
羟基化与成醛反应 
使用来自恶臭假单胞菌GPo1的烷烃羟化酶系alkBGT进行月桂酸或月桂酸甲酯的羟基化反应。通过醇脱氢酶alkJ催化第二个成醛步骤。 
在大肠杆菌中通过插入到微转座子Tn5之中的方式，将这些反应所需的基因alkBGJT染色体整合入大肠杆菌的基因组之中(de Lorenzo等人，1990年JBacteriol杂志第172卷第11期第6568-6572页和第6557-6567页；1999年 Appl and Environm.Microbiol.(应用与环境微生物学杂志)第5619-5623页)。应在控制alkB启动子和正调节子alkS的情况下来表达基因。借助Panke等人1999年在上述杂志上描述的可移动质粒pUT-Km，将Tn5-alkBGFJST-构建体转移到大肠杆菌靶标生物体上。 
在alkBFGHJKL操纵子之外组织alkST基因座与表达相关的调节因子alKS，然后在恶臭假单胞菌的基因组中反向排列。在克隆到载有转座子的质粒之中时保持基因的排列。依次将片段alkST和alkBFGJ整合到该质粒之中。 
在恶臭假单胞菌中也就是在操纵子alkBFGHJKL中组织待克隆的基因alkB(SEQ.-ID.-No.03)、alkG(SEQ.-ID.-No.04)和alkJ(SEQ.-ID.-No.05)，但是将其与针对醛脱氢酶进行编码的基因alkH分开。该酶可能会重新分解所需的中间产物，也就是月桂酸的醛，因此必须将其隔离在alkBGJ基因的克隆过程之外。 
为了简化alkB和alkG的克隆操作，将基因alkF与alkB和alkG一起进行扩增、克隆。AlkF对于待催化的反应而言无关紧要。在两个分开的PCR批次中扩增基因alkBFG和alkJ，然后通过SOE-PCR将其相互融合(Horton等人，1989年Gene(基因杂志)第77卷第61-68页)。作为目标DNA的是恶臭假单胞菌GPo1的OCT质粒。 
A2.克隆策略：
使用alkT上游的NotI切位点对片段alkST＝4077bp(SEQ.-ID.-No.06(alkS)和SEQ.-ID.-No.07(alkT))进行PCR扩增： 
引物 
alkT-正向-NotI(SEQ.-ID.-No.08) 
5’ACGTAGCGGCCGCCTAATCAGGTAATTTTATAC 
alkS-反向(SEQ.-ID.-No.09) 
5’GAGCGAGCTATCTGGT 
将PCR片段克隆到载有转座子的载体pUT-Km之中。为此可在Tn5之内利用NotI切开载体，然后采用平末端(blund-end)连接反应将其与alkST片段连接在一起。重组质粒的名称为pUT-Km-alkST。 
A3.利用SOE-PCR技术合成alkBFGJ构建体：
合成片段1：alkBFG+alkB上游启动子及5’-末端的NotI切位点(产物 大小；1409bp)： 
引物 
alkBFG-正向-NotI(SEQ.-ID.-No.10) 
5’TCGTAGCGGCCGCCCAGCAGACGACGGAGCAA 
al kBFG-反向-SOE(SEQ.-ID.-No.11) 
5’ATTTTATCTTCTCGAGGCTTTTCCTCGTAGAGCACAT 
利用与5’-末端上的a lkG和3’-末端上的Not I-切位点互补的末端合成片段3、alkJ(产物大小：1723bp)； 
引物 
alkJ-正向-SOE(SEQ.-ID.-No.12) 
5’TGCTCTAACGAGGAAAAGCCTCGAGAAGATAAAATGTA 
alkJ-反向-NotI(SEQ.-ID.-No.13) 
5’ATTGACGCGGCCGCTTACATGCAGACAGCTATCA 
通过SOE-PCR将两个单一片段相互融合。(需要3个分开的PCR反应)。使用NotI切割、连接重组质粒pUT-Km-alkST和alkBFGJ构建体。在大肠杆菌HB101之中转化新的重组质粒pUT-Km-alkBGJST(见附图1)，然后通过接合质粒转移转移到大肠杆菌JM101上。 
A4.胺化反应与氨基供体再生
利用重组质粒pBAD-CV2025-ald转化载有Tn5：alkBGJST的大肠杆菌菌株JM101，用于进行胺化反应形成ω-氨基月桂酸酯，并且再生氨基供体。该质粒基于载体pBAD30(Guzman等人在1995年Bacteriol杂志第177卷第14期第4121-4130页上发表的文章“Tight Regulation，Modulation，and High-LevelExpression by Vectors Containing the Arabinose PBAD Promotor”)。pBAD-CV2025-ald载有来自紫色色杆菌DSM30191的转氨酶CV2025的基因(SEQ：-ID.No.01；Kaulmann等人在2007年Enzyme and MicrobialTechnology(酶与微生物技术杂志)第41卷第628-637页发表的文章)并且载有针对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.Subtilis)的丙氨酸脱氢酶进行编码的基因ald(SEQ.-ID.-No.02；NP_391071)。这些基因受到阿拉伯糖可诱导的启动子的控制。 
A5.克隆策略
利用紫色色杆菌DSM30191的染色体DNA对转氨酶基因进行PCR扩增(产物大小：1415bp)： 
引物 
CV2025-正向-SacII(SEQ.-ID.-No.14) 
5’CGAGGAGCTCAGGAGGATCCAAGCATGCAGAAGCAACGTACG 
CV2025-反向-KpnI(SEQ.-ID.-No.15) 
5’GTCATGTACCCCTAAGCCAGCCCGCGCGCCT 
正向引物除了含有XbaI切位点之外，还含有可用于克隆到载体pBAD30之中的核糖体结合位点。通过切位点SacI和KpnI连接到载体pBAD30之中。重组载体的名称为pBAD-CV2025。 
利用枯草芽孢杆菌的染色体DNA(NP_391071)对丙氨酸脱氢酶基因ald进行PCR扩增(产物大小：1171bp)。 
引物 
AlaDH-正向-XbaI(SEQ.-ID.-No.16) 
5’ACCTATCTAGAAGGAGGACGCATATGATCATAGGGGTTCCT 
AlaDH-反向-PstI(SEQ.-ID.-No.17) 
5’AACCTCTGCAGTTAAGCACCCGCCAC 
为了克隆到重组载体pBAD-CV2025之中，正向引物除了含有XbaI切位点之外，还含有核糖体结合位点。通过切位点XbaI和PstI克隆到载体之中。所得到的质粒的名称为pBAD-CV2025-ald(参见附图2)。 
A6.针对密码子优化表达的来自紫色色杆菌DSM 30191的ω-转氨酶基因备选地克隆到大肠杆菌中
Geneart公司已针对大肠杆菌密码子的使用优化合成了ω-转氨酶的编码基因(SEQ.-ID.-No.42)并且已经将其克隆到载体pGA 15(Geneart)之中。已在基因合成过程中在侧面植入基因合成切位点SacI和KpnI，并且在使用SacI和KpnI进行消解之后，将其克隆到之前利用SacI和KpnI进行了线性化处理的载体pGA15之中。使用限制性核酸内切酶SacI和KpnI消解所得到的载体，提纯片段(转氨酶)，然后连接到表达载体paCYCDuet-1(Novagen)之中。采用限制性分析法检查正确的质粒。所得到的载体称作paCYCDuet-1::ω转氨酶。 
A7.通过6xHis-Tag提纯异源表达蛋白质
将载体(paCYCDuet-1::ω转氨酶)转化到大肠杆菌XL1blue之中后，在温度为28℃的条件下，在含有抗生素氨比西林(100μg/ml)的双份YT培养基(dYT)中培养所的转化菌株，直到密度OD600nm＝0.3-0.4。在控制Plac启动子的情况下使用IPTG(最终浓度1mM)诱发表达。溶解细菌表达培养基；将50ml培养基以2360x g离心分离，然后将其重新悬浮于含有5mM EDTA、300mM NaCl和1mg/ml溶菌酶的5ml磷酸钠缓冲液(pH 8)之中，在室温下培养1小时。以2360x g将溶解产物离心分离10分钟，然后通过ProtinoNi-TED 2000填充柱(根据制造商说明；Macherey-Nagel，Düren)提纯上清液。利用Bradford测定蛋白质浓度。 
A8.采用偶联分析检测酶活性
以偶联分析测定活性，在第二步骤中使作为转氨酶反应副产物出现的丙酮酸继续反应，将NADH氧化成NAD+。在340nm光度计中测定NADH浓度的下降率(原理：测定消光系数下降程度)，将浓度下降率作为活性评估尺度。 
Figure G2008101910545D00231
加入5μl 12-ODME(50mg/ml)开始进行分析。在340nm及室温条件下每分钟测定一次，连续测定最多20分钟。使用灭活蛋白质及不含协同底物的批次进行对比。附图4可以看出使用光度计测定的消光率变化。 
A9.通过HPLC检测异源表达的蛋白质
Figure G2008101910545D00232
Figure G2008101910545D00241
在室温条件下培养4小时之后，使用1Vol.MeOH终止反应 
使用邻苯二甲醛(oPA)衍化批次进行HPLC分析，然后从中取250μl进行分析。使用50mM NaAC pH 4∶乙腈4∶1(v∶v)作为流动相A。 
流动相B是含有5％50mM NaAC pH 4的乙腈。梯度在4分钟内从30％B变为60％B，在2分钟内从60％B变为100％B。流速为1.2ml/分钟。 
通过Agilent Zorbax RP18色谱柱(Agilent Technologies，USA)进行分离。 
色谱柱温度为40℃。 
附图5和6所示12-氧代月桂酸甲酯的标准以及下降程度。热灭活酶作为阴性对照(附图7)。 
A6.酯分解
使用来自荧光假单胞菌的脂肪酶LipA(Q76D26)(Kojima&Shimizu，2003年J.of Bioscience and Bioengin.(生物科学与生物工程杂志)第96卷第3期第219-226页)将ω-氨基月桂酸甲酯分解成ω-氨基月桂酸。使用含有荧光假单胞菌染色体DNA的引物LipA-SfiI-up和LipA-SfiI-down扩增基因，然后通过SfiI切位点将其克隆到载体pEST 100之中。重组质粒的名称为pEST-lipA(参见附图3)。 
通过克隆将lipA(SEQ.-ID.-No.18)融合在来自铜绿假单胞菌的碱性磷酸酶phoA的信号序列和酯酶EstA的自动转运域上，从而可通过细胞质膜转移脂肪酶，并且在大肠杆菌的细胞表面上显示出来。相关操作方法可参阅Becker等人在2005年FEBS Letters(FEBS快讯)第579期第1177-1182页上发表的文章“A generic system for the Escherichia coli cell-surfacedisplay of lipolytic enzymes(大肠杆菌细胞表面显示脂肪分解酶的通用系统)”。在控制Plac启动子的情况下使用IPTG(最终浓度1mM)诱发表达(产物大小：1894bp)。 
引物 
引物lipA-Sfi-up(SEQ.-ID.-No.19) 
5’AACAAAAGGGCCGCAATGGCCATGGGTGTGTATGACTAC 
引物lipA-Sfi-down(SEQ.-ID.-No.20) 
5’TACAGGGGCCACCACGGCCTCAGGCGATCACAATTCC 
B利用恶臭假单胞菌GPo1的AlkBGT烷烃羟化酶系从月桂酸甲酯出发合成12-羟基月桂酸甲酯和12-氧代月桂酸甲酯
B1.构建alkBGT表达载体
从pCOM出发 
从pCOM系(Smits等人，2001 Plasmid 64：16-24)制备构建体pBT10(附图10，SEQ.-ID.-No.31)，该构建体含有氧化成醛所需的恶臭假单胞菌的烷烃羟化酶(AlkB)、红素氧还蛋白(AlkG)及红素氧还蛋白还原酶(AlkT)这三种成分。将alkBFG基因序列置于alkB启动子的控制之下和将alkT基因置于alkS启动子的控制之下，来表达这三种基因。 
B2.克隆策略
为了简化alkB和alkG的克隆操作，将基因alkF与alkB和alkG一起进行扩增、克隆。AlkF对于待催化的反应而言无关紧要。 
利用alkB的上游NdeI切位点以及alkG的下游SalI切位点，对片段alkBFG＝2524bp(参见SEQ.-ID.-No.03(alkB)和SEQ.-ID.-No.04(alkG))进行PCR扩增： 
引物：alkBFG正向(SEQ.-ID.-No.32) 
AAGGGAATTCCATATGCTTGAGAAACACAGAGTTC 
引物：alkBFG反向(SEQ.-ID.-No.33) 
AAAATTCGCGTCGACAAGCGCTGAATGGGTATCGG 
PCR扩增片段alkT(2958bp)(参见Seq.ID.-No.07(alkT)) 
引物alkT正向(SEQ.-ID.-No.34) 
TGAGACAGTGGCTGTTAGAG 
引物alkT反向(SEQ.-ID.-No.35) 
TAATAACCGCTCGAGAACGCTTACCGCCAACACAG 
利用PCR扩增片段alkBFG和alkT。使用质粒pGEc47(附图12)作为模 板(Eggink等人在1987年J.Biol.Chem.第262期第17712-17718页上发表的文章)。 
利用亚克隆载体 
Figure G2008101910545D00261
HCKan(Lucigen Corporation)进行克隆。需要这一附加步骤，因为直接克隆不会成功。为此将市面上能买到的、已经过线性化处理且配有平头末端的载体 
Figure G2008101910545D00262
HCKan(Lucigen)与相应的平头末端PCR产物(附图9)连接起来。 
接着使用限制性酶NdeI和SalI切割alkBFG片段，然后使用亚克隆载体的限制性酶PacI和XhoI切割alkT片段。在琼脂糖凝胶(1％)中分离这些片段，从凝胶中将其切除，然后使用凝胶提取试剂盒将其分离出。依次将片段连接到载体pCOM10之中(Smits，T.H.M.，Seeger，M.A.，Witholt，B.&vanBeilen，J.B.(2001)Plasmid 46.16-24)。在第一个步骤中通过切位点NdeI和SalI将alkBFG置于pCOM10之中，然后在第二步骤中通过切位点PacI和XhoI进行克隆。 
首先在大肠杆菌DH5α中转化重组质粒。在含有卡那霉素的LB培养基上选择载有质粒的克隆。通过酶切分析和排序控制从中分离出的质粒。质粒名称为pBT10(附图10)。 
B3.在生物反应器中将月桂酸甲酯生物转化成羟基月桂酸甲酯和12-氧代月桂酸甲酯
为了生物转化，在42℃条件下热激2分钟，将质粒pBT10转化成为化学感受态大肠杆菌菌株W3110。在30℃条件下以180rpm转速在M9培养基中培养一夜大肠杆菌W3110-pBT10，收获合成羟基月桂酸甲酯和12-氧代月桂酸甲酯。在含有0.5％葡萄糖的M9培养基中吸收生物质，直至达到OD450＝0.2。生长4小时之后使用双环丙基酮诱发表达，然后继续培养4小时。重新离心分离出细胞，将细胞团块重新悬浮于KPi缓冲液(50mM，pH 7.4)之中，然后放入生物反应器之中。将生物质浓度调整到约为1.8gCDW/L。一边猛烈搅拌(1500转/分钟)，一边按照1∶3比例将底物月桂酸甲酯加入到细胞悬浮液之中(100ml细胞悬浮液，50ml月桂酸甲酯)。保持30℃恒温。 
对反应批次进行色谱分析，检测产物羟基月桂酸甲酯和12-氧代月桂酸甲酯的形成情况。经过0分钟后从反应批次的有机相中取样作为阴性对照(附图13)，经过150分钟后(附图14)从反应批次的有机相中取样，然后使用GC (Thermo Trace GC Ultra)进行分析。将Varian Inc.FactorFourTM VF-5m作为色谱柱，长度：30m，膜厚：0.25μm，内径：0.25mm。 
分析条件： 
炉温            80-280℃ 
斜坡            15℃/分钟 
分流比          15 
进样量          1μl 
载流            1.5ml/分钟 
PTV进样器       80-280℃，斜坡为15℃/s 
检测器基本温度：320℃ 
通过注入纯物质显示12-氧代月桂酸甲酯(附图11)和12-羟基月桂酸甲酯(附图12)的检测。 
C将12-氧代月桂酸甲酯转化成12-氨基月桂酸甲酯
C1：
Figure G2008101910545D00271
、表达拟南芥的转氨酶
对拟南芥的已知转氨酶进行分析。分析结果令人惊奇：4-氨基丁酸转氨酶(at3g22200，SEQ.-ID.-No.38)展现出异源表达蛋白质相对于12-氧代十二烷酸甲酯的活性约为14U/mg。利用HPLC确认产物12-氨基十二烷酸甲酯。 
如果没有其它说明，所有方法均根据Sambrook，J.，Fritsch.，E.F.，&Maniatis，T(1989).Molecular cloning，第2版，纽约：冷泉港实验室出版社所描述的程序进行。 
Figure G2008101910545D00272
拟南芥的4-氨基丁酸转氨酶(at3g22200)
按照制造商QIAGEN GmbH(Hilden)的说明，利用RNeasy Mini Kit从一种完整的开花拟南芥植物中分离出RNA。然后根据制造商的说明，利用RTSkript Kit(USB Europe GmbH，Staufen)合成cDNA。按照制造商(Thermo FisherScientific Inc.Waltham USA)的说明，利用Nanodrop测定RNA质量/数量。 
拟南芥cDNA的PCR以嵌入切位点
使用下列引物将编码为SEQ.-ID.-No.39的4-氨基丁酸转氨酶的DNA克隆到已消解了NaeI、BamHI的载体之中。 
正向引物嵌入蛋白酶切位点和NaeI，SEQ.-ID.-No.36 
GCCGGCGAGAACCTGTACTTTCAGATGGCAAGTAAGTATGCCACTTG 
反向引物嵌入BamHI，SEQ.-ID.-No.37 
GGATCCTCACTTCTTGTGCTGAGCCTTG 
根据下列程序进行PCR： 
Figure G2008101910545D00281
使用 
Figure G2008101910545D00282
Extract II Kit(Macherey-Nagel，德国，根据制造商说明)提纯得到的PCR产物。 
表达异源蛋白质
使用上述PCR产物，通过标准分子生物学方法制备载体pGJ3130(附图15，SEQ.-ID.-No.43)，然后在大肠杆菌XL1blue中进行转化。在28℃条件下，在含有抗生素氨比西林(100μg/ml)并且加入了0.5mM IPTG的双份YT培养基(dYT)中培养转化后的大肠杆菌菌株，直至密度达到OD600nm＝0.3-0.4。 
通过6xHis-Tag提纯异源表达蛋白质
溶解细菌表达培养基；将50ml培养基以2360x g离心分离，然后将其重新悬浮于含有5mM EDTA、300mM NaCl和1mg/ml溶菌酶的5ml磷酸钠缓冲液(pH 8)之中，在室温下培养1小时。以2360x g将溶解物离心分离10分钟，然后通过Protino Ni-TED 2000填充柱(根据制造商说明；Macherey-Nagel，Düren)提纯上清液。利用Bradford测定蛋白质浓度。 
采用偶联分析检测酶活性
以偶联分析测定活性，在第二步骤中使作为转氨酶反应副产物出现的丙酮酸继续反应，将NADH氧化成NAD+。在340nm光度计中测定NADH浓度的下降率(原理：测定消光系数下降程度)，将浓度下降率作为活性评估尺度。 
  批次
 
  50mM        磷酸钠pH 7.5  50mM      L-丙氨酸  100μM    磷酸吡哆醛  250μg    12-氧代十二烷酸甲酯  1.25mM    NADH  10U       乳酸脱氢酶  10μg     异源表达的蛋白质  使用H2O二次蒸馏  补充至1ml
加入5μl 12-ODME(50mg/ml)开始进行分析。在340nm及室温条件下每分钟测定一次，连续测定最多20分钟。使用灭活蛋白质及不含协同底物的批次进行对比。附图16可以看出使用光度计测定的消光率变化。 
通过HPLC检测异源表达的蛋白质
  批次
  50mM    磷酸钠pH 7.5  50mM    L-丙氨酸  100μM  磷酸吡哆醛  250μg  12-氧代十二烷酸甲酯  50μg   异源表达的蛋白质  使用H2O二次蒸馏 补充至500μl
在室温条件下培养4小时之后，使用1Vol.MeOH终止反应 
使用邻苯二甲醛(oPA)衍化批次进行HPLC分析，然后从中取250μl进行分析。使用50mM NaAC pH 4∶乙腈4∶1(v∶v)作为流动相A。 
流动相B是含有5％50mM NaAC pH 4的乙腈。梯度在4分钟内从30％B变为60％B，在2分钟内从60％B变为100％B。流速为1.2ml/分钟。 
通过Agilent Zorbax RP18色谱柱(Agilent Technologies，USA)进行分离。色谱柱温度为40℃。附图17(上)示出12-氨基月桂酸甲酯形成情况。附图17下方示出参比试样。 
D将12-氧代月桂酸甲酯与来自假单胞菌属的PPTA5和PSTA进行胺化反应
D1.克隆PPTA5和PSTA
使用大肠杆菌BL21(DE3)/PPTA5和大肠杆菌BL21(DE3)/PSTA菌株进行12-氧代月桂酸甲酯的胺化反应。按照如下所述构建这些菌株。选择表达载体pET-21a(+)(Novagen)来克隆两个转氨酶基因。针对ppta5基因(SEQ.-ID.-No.40)构建引物，这些引物应可在末端将限制性切位点NdeI和XhoI添加到基因上；引物PPTA5_NdeI： 
GGAATTCCATATGAGCGTCAACAACCCGCAAACCCG(SEQ.-ID.-No.44)和引物PPTA5_XhoI：CCGCTCGAGTTATCGAATCGCCTCAAGGGTCAGGTCC(SEQ.-ID.-No.45)。对于psta基因(SEQ.-ID.-No.41)，在末端添加含有NdeI和BamHI的引物；引物PSTA_NdeI： 
GGAATTCCATATGAGCGATTCGCAAACCCTGCACTGGC(SEQ.-ID.-No.46)和引物PSTA_BamHI：CGCGGATCCTCAGCCCAGCACATCCTTGGCTGTCG(SEQ.-ID.-No.47) 
在PCR过程中使用这些引物。然后使用限制性酶NdeI和XhoI或者NdeI和BamHI限制提纯后的PCR产物以及载体pET-21a(+)。使用虾的碱性磷酸酶对剪切的载体进行去磷酸化处理。使用T4 DNA连接酶与感受态表达菌株大肠杆菌XL1-Blue进行连接之后，使用NdeI和XhoI剪切的载体和ppta5基因以及使用NdeI和BamHI剪切的载体和psta基因进行转化。培育一些克隆之后，利用下列限制酶切分析法与凝胶电泳分析法分离出质粒。通过序列分析确认所获得的克隆物(pPPTA5或pPSTA)的转氨酶序列。附图18示出表达载体的质粒卡(Plasmidkarte)。 
D2.表达PPTA5和PSTA
将载体pPPTA5和pPSTA转化成感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞进行表达。将每一个单菌落在5ml LB-Amp-培养基(氨比西林浓度为100μg/ml)中进行接种，并且在37℃条件下振摇一夜。接着在1％的200ml LB-Amp-培养基中进行接种，在37℃条件下振摇，在OD600达到0.5之后，使用0.5mM IPTG诱导基因表达。在30℃条件下振摇20小时之后，收获细胞，并且在-20℃条件下存放。 
为了分解大肠杆菌BL21(DE3)/pPPTA5和大肠杆菌BL21(DE3)/pPSTA菌株，使用pH值为7.2的100mM Tris-HCl缓冲液分别将0.4g细胞处理成25％的细胞悬浮液，同时使用超声波(Bandelin Sonoplus HD2070；探针MS73； 50％强度)将其处理90秒钟各两次。经过离心分离之后抽取上清液。将所获得的提取物用于12-氧代月桂酸甲酯的转化反应。400μl-批次含有5mM 12-氧代月桂酸甲酯，溶于N，N-二甲基甲酰胺、500mM DL-丙氨酸、1mM吡哆醛-5’-磷酸盐以及80μl提取物溶于pH值为7.0的10mM Kpi-缓冲液之中。在25℃温度下振摇。经过一定时间之后，分别取样20μl，使用1μl 1％的NaOH溶液将一部分调整到碱性pH范围，然后加入100μl醋酸乙酯充分振摇。对有机相进行气相色谱分析(Perkin Elmer公司的气相色谱仪，配有火焰离子探测器的Clarus 500)。为此使用Optima 5-色谱柱(0.25μm，30m，0.25mm，Macherey-Nagel)与下列程序： 
80℃ 
25℃/分钟        180℃ 
5℃/分钟         215℃ 
20℃/分钟        280℃ 
12-氧代月桂酸甲酯和12-氨基月桂酸甲酯的保留时间为7.2或7.7分钟。 
附图20和21示出转化结果。为了评估，由中性和酸性提取物的色谱图，将12-氧代月桂酸甲酯和12-氨基月桂酸甲酯的峰面积相加，然后计算进料物或产物的百分比含量。 
序列表 
<110>Evonik Degussa GmbH 
<120>生产ω-氨基羧酸或其内酰胺的， 
重组细胞 
<130>200700667 
<160>47 
<170>PatentIn版本3.4 
<210>1 
<211>1380 
<212>DNA 
<213>紫色色杆菌 
<400>1 
atgcagaagc aacgtacgac cagccaatgg cgcgaactgg atgccgccca tcacctgcat   60 
ccgttcaccg ataccgcatc gctgaaccag gcgggcgcgc gcgtgatgac gcgcggagag  120 
ggcgtctacc tgtgggattc ggaaggcaac aagatcatcg acggcatggc cggactgtgg  180 
tgcgtgaacg tcggctacgg ccgcaaggac tttgccgaag cggcgcgccg gcagatggaa  240 
gagctgccgt tctacaacac cttcttcaag accacccatc cggcggtggt cgagctgtcc  300 
agcctgctgg ctgaagtgac gccggccggt ttcgaccgcg tgttctatac caattccggt  360 
tccgaatcgg tggacaccat gatccgcatg gtgcgccgct actgggacgt gcagggcaag  420 
ccggagaaga agacgctgat cggccgctgg aacggctatc acggctccac catcggcggc  480 
gccagcctgg gcggcatgaa gtacatgcac gagcagggcg acttgccgat tccgggcatg     540 
gcccacatcg agcagccttg gtggtacaag cacggcaagg acatgacgcc ggacgagttc     600 
ggcgtggtgg ccgcgcgctg gctggaagag aagattctgg aaatcggcgc cgacaaggtg     660 
gccgccttcg tcggcgaacc catccagggc gccggcggcg tgatcgtccc gccggccacc     720 
tactggccgg aaatcgagcg catttgccgc aagtacgacg tgctgctggt ggccgacgaa     780 
gtgatctgcg gcttcgggcg taccggcgaa tggttcggcc atcagcattt cggcttccag     840 
cccgacctgt tcaccgccgc caagggcctg tcctccggct atctgccgat aggcgcggtc     900 
tttgtcggca agcgcgtggc cgaaggcctg atcgccggcg gcgacttcaa ccacggcttc     960 
acctactccg gccacccggt ctgcgccgcc gtcgcccacg ccaacgtggc ggcgctgcgc    1020 
gacgagggca tcgtccagcg cgtcaaggac gacatcggcc cgtacatgca aaagcgctgg    1080 
cgtgaaacct tcagccgttt cgagcatgtg gacgacgtgc gcggcgtcgg catggtgcag    1140 
gcgttcaccc tggtgaagaa caaggcgaag cgcgagctgt tccccgattt cggcgagatc    1200 
ggcacgctgt gccgcgacat cttcttccgc aacaacctga tcatgcgggc atgcggcgac    1260 
cacatcgtgt cggcgccgcc gctggtgatg acgcgggcgg aagtggacga gatgctggcg    1320 
gtggcggaac gctgtctgga ggaattcgag cagacgctga aggcgcgcgg gctggcttag    1380 
<210>2 
<211>1137 
<212>DNA 
<213>枯草芽孢杆菌 
<400>2 
atgatcatag gggttcctaa agagataaaa aacaatgaaa accgtgtcgc attaacaccc     60 
gggggcgttt ctcagctcat ttcaaacggc caccgggtgc tggttgaaac aggcgcgggc    120 
cttggaagcg gatttgaaaa tgaagcctat gagtcagcag gagcggaaat cattgctgat    180 
ccgaagcagg tctgggacgc cgaaatggtc atgaaagtaa aagaaccgct gccggaagaa    240 
tatgtttatt ttcgcaaagg acttgtgctg tttacgtacc ttcatttagc agctgagcct    300 
gagcttgcac aggccttgaa ggataaagga gtaactgcca tcgcatatga aacggtcagt    360 
gaaggccgga cattgcctct tctgacgcca atgtcagagg ttgcgggcag aatggcagcg    420 
caaatcggcg ctcaattctt agaaaagcct aaaggcggaa aaggcattct gcttgccggg    480 
gtgcctggcg tttcccgcgg aaaagtaaca attatcggag gaggcgttgt cgggacaaac    540 
gcggcgaaaa tggctgtcgg cctcggtgca gatgtgacga tcattgactt aaacgcagac    600 
cgcttgcgcc agcttgatga catcttcggc catcagatta aaacgttaat ttctaatccg    660 
gtcaatattg ctgatgctgt ggcggaagcg gatctcctca tttgcgcggt attaattccg    720 
ggtgctaaag ctccgactct tgtcactgag gaaatggtaa aacaaatgaa acccggttca    780 
gttattgttg atgtagcgat cgaccaaggc ggcatcgtcg aaactgtcga ccatatcaca    840 
acacatgatc agccaacata tgaaaaacac ggggttgtgc attatgctgt agcgaacatg    900 
ccaggcgcag tccctcgtac atcaacaatc gccctgacta acgttactgt tccatacgcg    960 
ctgcaaatcg cgaacaaagg ggcagtaaaa gcgctcgcag acaatacggc actgagagcg   1020 
ggtttaaaca ccgcaaacgg acacgtgacc tatgaagctg tagcaagaga tctaggctat   1080 
gagtatgttc ctgccgagaa agctttacag gatgaatcat ctgtggcggg tgcttaa      1137 
<210>3 
<211>1206 
<212>DNA 
<213>恶臭假单胞菌 
<400>3 
atgcttgaga aacacagagt tctggattcc gctccagagt acgtagataa aaagaaatat     60 
ctctggatac tatcaacttt gtggccggct actccgatga tcggaatctg gcttgcaaat    120 
gaaactggtt gggggatttt ttatgggctg gtattgctcg tatggtacgg cgcacttcca    180 
ttgcttgatg cgatgtttgg tgaggacttt aataatccgc ctgaagaagt ggtgccgaaa    240 
ctagagaagg agcggtacta tcgagttttg acatatctaa cagttcctat gcattacgct    300 
gcattaattg tgtcagcatg gtgggtcgga actcagccaa tgtcttggct tgaaattggt    360 
gcgcttgcct tgtcactggg tatcgtgaac ggactagcgc tcaatacagg acacgaactc    420 
ggtcacaaga aggagacttt tgatcgttgg atggccaaaa ttgtgttggc tgtcgtaggg    480 
tacggtcact tctttattga gcataataag ggtcatcacc gtgatgtcgc tacaccgatg    540 
gatcctgcaa catcccggat gggagaaagc atttataagt tttcaatccg tgagatccca    600 
ggagcattta ttcgtgcttg ggggcttgag gaacaacgcc tttcgcgccg tggccaaagc    660 
gtttggagtt tcgataatga aatcctccaa ccaatgatca tcacagttat tctttacgcc    720 
gttctccttg ccttgtttgg acctaagatg ctggtgttcc tgccgattca aatggctttc   780 
ggttggtggc agctgaccag tgcgaactat attgaacatt acggcttgct ccgtcaaaaa   840 
atggaggacg gtcgatatga gcatcaaaag ccgcaccatt cttggaatag taatcacatc   900 
gtctctaatc tagtgctgtt ccaccttcag cggcactcgg atcaccacgc gcatccaaca   960 
cgttcttatc agtcacttcg ggattttccc ggcctgccgg ctcttccgac gggttaccct  1020 
ggtgcatttt tgatggcgat gattcctcag tggtttagat cagttatgga tcccaaggta  1080 
gtagattggg ctggtggtga ccttaataag atccaaattg atgattcgat gcgagaaacc  1140 
tatttgaaaa aatttggcac tagtagtgct ggtcatagtt cgagtacctc tgcggtagca  1200 
tcgtag 
1206 
<210>4 
<211>519 
<212>DNA 
<213>恶臭假单胞菌 
<400>4 
atggctagct ataaatgccc ggattgtaat tatgtttatg atgagagtgc gggtaatgtg    60 
catgaggggt tttctccagg tacgccttgg caccttattc ctgaggattg gtgctgcccc   120 
gattgcgccg ttcgagacaa gcttgacttc atgttaattg agagcggcgt aggtgaaaag   180 
ggcgtcacct caacccatac ttcgccaaat ttatccgagg ttagtggcac aagtttaact   240 
gctgaagcag tggttgcgcc gacaagctta gagaaattgc ctagtgccga cgttaaaggc    300 
caagatctat ataaaactca acctccaagg tctgatgccc aaggcgggaa agcatacttg    360 
aagtggatat gtattacttg tggccatata tatgatgagg cgttgggcga tgaggccgag    420 
ggttttactc caggtactcg ctttgaggat attcctgatg actggtgctg tccggattgc    480 
ggggctacga aagaagacta tgtgctctac gaggaaaag                           519 
<210>5 
<211>1677 
<212>DNA 
<213>恶臭假单胞菌 
<400>5 
atgtacgact atataatcgt tggtgctgga tctgcaggat gtgtgcttgc taatcgtctt     60 
tcggccgacc cctctaaaag agtttgttta cttgaagctg ggccgcgaga tacgaatccg    120 
ctaattcata tgccgttagg tattgctttg ctttcaaata gtaaaaagtt gaattgggct    180 
tttcaaactg cgccacagca aaatctcaac ggccggagcc ttttctggcc acgaggaaaa    240 
acgttaggtg gttcaagctc aatcaacgca atggtctata tccgagggca tgaagacgat    300 
taccacgcat gggagcaggc ggccggccgc tactggggtt ggtaccgggc tcttgagttg    360 
ttcaaaaggc ttgaatgcaa ccagcgattc gataagtccg agcaccatgg ggttgacgga    420 
gaattagctg ttagtgattt aaaatatatc aatccgctta gcaaagcatt cgtgcaagcc    480 
ggcatggagg ccaatattaa tttcaacgga gatttcaacg gcgagtacca ggacggcgta    540 
gggttctatc aagtaaccca aaaaaatgga caacgctgga gctcggcgcg tgcattcttg     600 
cacggtgtac tttccagacc aaatctagac atcattactg atgcgcatgc atcaaaaatt     660 
ctttttgaag accgtaaggc ggttggtgttt cttatataa agaaaaatat gcaccatcaa     720 
gtcaagacaa cgagtggtgg tgaagtactt cttagtcttg gcgcagtcgg cacgcctcac     780 
cttctaatgc tttctggtgt tggggctgca gccgagctta aggaacatgg tgtttctcta     840 
gtccatgatc ttcctgaggt ggggaaaaat cttcaagatc atttggacat cacattgatg     900 
tgcgcagcaa attcgagaga gccgataggt gttgctcttt ctttcatccc tcgtggtgtc     960 
tcgggtttgt tttcatatgt gtttaagcgc gaggggtttc tcactagtaa cgtggcagag    1020 
tcgggtggtt ttgtaaaaag ttctcctgat cgtgatcggc ccaatttgca gtttcatttc    1080 
cttccaactt atcttaaaga tcacggtcga aaaatagcgg gtggttatgg ttatacgcta    1140 
catatatgtg atcttttgcc taagagccga ggcagaattg gcctaaaaag cgccaatcca    1200 
ttacagccgc ctttaattga cccgaactat cttagcgatc atgaagatat taaaaccatg    1260 
attgcgggta ttaagatagg gcgcgctatt ttgcaggccc catcgatggc gaagcatttt    1320 
aagcatgaag tagtaccggg ccaggctgtt aaaactgatg atgaaataat cgaagatatt    1380 
cgtaggcgag ctgagactat ataccatccg gtaggtactt gtaggatggg taaagatcca    1440 
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gcgtcaatta tgccgcactt ggtcgcgggt aacacaaacg ctccaactat tatgattgca    1560 
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<210>6 
<211>2649 
<212>DNA 
<213>恶臭假单胞菌 
<400>6 
atgaaaataa taataaataa tgatttcccg gtcgctaagg tcggagcgga tcaaattacg     60 
actctagtaa gtgccaaagt tcatagttgc atatatcggc caagattgag tatcgcggat    120 
ggagccgctc ccagagtatg cctttacaga gccccacctg gatatgggaa aaccgttgct    180 
cttgcgttcg agtggctacg ccacagaaca gccggacgtc ctgcagtgtg gctttcttta    240 
agagccagtt cttacagtga atttgatatc tgcgcagaga ttattgagca gcttgaaact    300 
ttcgaaatgg taaaattcag ccgtgtgaga gagggtgtga gcaagcctgc gctcttgcga    360 
gaccttgcat ctagtctttg gcagagcacc tcgaataacg agatagaaac gctagtttgt    420 
ttggataata ttaatcatga cttagacttg ccgttgttgc acgcacttat ggagtttatg    480 
ttaaatacac caaaaaatat caggtttgca gttgcaggca atacaataaa agggttctcg    540 
cagcttaaac ttgcaggcgc tatgcgggag tacaccgaga aagacttggc ctttagcgca    600 
gaagaggcgg tggcgttagc ggaggcagag tctgttcttg gagttcctga agaacagata    660 
gagaccttgg tgcaagaagt tgaggggtgg cctgctcttg tagttttttt gttaaagcgt    720 
gagttgccgg ccaagcatat ttcagcagta gttgaagtag acaattactt tagggatgaa    780 
atatttgagg cgattcccga gcgctatcgt gtttttcttg caaattcttc attgctcgat     840 
ttcgtgacgc ctgatcaata caattatgta ttcaaatgcg tcaatggggt ctcatgtatt     900 
aagtatttaa gcactaatta catgttgctt cgccatgtga gcggtgagcc agcgcagttt     960 
acactgcatc cagtactgcg taattttcta cgagaaatta cttggactga aaatcctgct    1020 
aaaagatcct acctgcttaa gcgtgcagct ttctggcatt ggcgtagagg tgaataccag    1080 
tatgcaatac gaatatccct acgggcgaat gactgtcgct gggcagtcag catgtctgag    1140 
agaataattt tagatttgtc atttcgtcag ggcgaaatag atgcgctgag acagtggctg    1200 
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caatccgata aaaaaaataa atggcaagaa aaggaatggc tgcagcttgt gcttgcaata    1380 
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gagttacatt atgaattgcg ctgcttggac acctcagaag aaaagctctc caaaatttta    1800 
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gcttggcggc ttggaaggag tgacctaaat ggctccattg agatattgga gtgggcgaag    1920 
gcgcatgcgg ttgaaaaaaa tctaccaaga ttggaagtta tgagccaaat tgagatctat    1980 
cagcgcttag tctgtcaagg cataacgggc ataaataatt taaaaactct tgaagatcat    2040 
aagattttct ccggacagca ctcagccccc ctaaaagcac gcctgctgct tgttcaatca    2100 
ctagtgcttt cccgagatcg gaactttcat agtgccgcgc acagagcgtt attggctatt    2160 
cagcaagccc gtaaaattaa cgcgggccag ctggaagtcc gtggattatt gtgtttggcc    2220 
ggagcgcagg caggtgccgg tgatttaaaa aaggctcagc ttaacattgt ttatgcagtg    2280 
gagatagcaa aacagcttca atgctttcaa acagttcttg atgaagtatg tttaattgag    2340 
cgaataatac cggcttcatg tgaagccttc acagcagtta atttagatca agcgattggg    2400 
gcttttagtc ttccgcgaat agttgagatt ggaaagtccg cagagaataa agctgacgct    2460 
ttattgacac ggaagcagat tgctgtcttg aggcttgtaa aagaggggtg ctcaaacaaa    2520 
caaatagcaa caaatatgca tgtcaccgaa gatgctataa agtggcatat gaggaaaata    2580 
tttgccacct tgaatgtagt gaatcgcacg caagcaacaa ttgaagctga gcgtcaagga    2640 
attatctaa 
2649 
<210>7 
<211>1158 
<212>DNA 
<213>恶臭假单胞菌 
<400>7 
atggcaatcg ttgttgttgg cgctggtaca gctggagtaa atgctgcgtt ctggcttcgt   60 
caatatggtt ataaagggga aattaggatt tttagcaggg agtctgtggc gccttatcag  120 
cggcctcctc tatccaaggc ttttctgaca agtgagattg cagaatccgc agtgccatta  180 
aagccagaag gtttttatac gaataacaat attaccattt cgttaaatac accgattgta  240 
tcaatcgacg tggggcgtaa gatagtttct tctaaagatg gaaaagaata cgcgtatgaa  300 
aaattgattc ttgcaacacc tgctagcgca cgtaggttaa cctgcgaggg gtctgaactg  360 
tctggggtct gctatttacg cagtatggaa gacgccaaaa atttacgtag gaaacttgtg  420 
gagagtgcgt ctgttgttgt gttgggcggc ggagtaatcg ggcttgaagt cgcctcagct  480 
gcggtgggct tagggaagag ggtcacagtg atagaagcca ccccgcgtgt aatggcgcgc  540 
gtggttacgc cggcagcagc aaacttagtc agagcccgcc tggaggctga aggaattgag  600 
ttcaagctga atgcgaaatt aacgtctata aagggcagga atggccatgt tgaacaatgc  660 
gtacttgaaa gtggagaaga aattcaggcg gatctgattg tagttggaat cggtgctatc  720 
ccagagctag agctggcaac tgaggcggcc cttgaagtga gtaatggtgt tgtggtcgat  780 
gatcagatgt gtacatcgga tacaagtata tatgcaatcg gcgactgcgc aatggctaga  840 
aatccttttt ggggaacgat ggtacgttta gagacaattc ataatgcggt tacacacgct  900 
caaattgtcg caagtagcat ctgtggcaca tcaacaccag caccaacccc accacggttc  960 
tggtctgatc ttaaagggat ggcgctgcaa ggacttggtg ctctaaagga ctacgataaa    1020 
ctcgttgttg caattaataa cgaaactctt gaactagaag tccttgcgta caagcaggag    1080 
cgactgattg caactgagac aataaatttg cctaaacgtc aaggtgcgct tgcagggagt    1140 
ataaaattac ctgattag 
1158 
<210>8 
<211>33 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>引物 
<400>8 
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<210>9 
<211>16 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>引物 
<400>9 
gagcgagcta tctggt 
16 
<210>10 
<211>32 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>引物 
<400>10 
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<210>11 
<211>37 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>引物 
<400>11 
attttatctt ctcgaggctt ttcctcgtag agcacat               37 
<210>12 
<211>38 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>引物 
<400>12 
tgctctaacg aggaaaagcc tcgagaagat aaaatgta              38 
<210>13 
<211>34 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>引物 
<400>13 
attgacgcgg ccgcttacat gcagacagct atca            34 
<210>14 
<211>42 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>引物 
<400>14 
cgaggagctc aggaggatcc aagcatgcag aagcaacgta cg   42 
<210>15 
<211>31 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>引物 
<400>15 
gtcatgtacc cctaagccag cccgcgcgcc t 
31 
<210>16 
<211>41 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>引物 
<400>16 
acctatctag aaggaggacg catatgatca taggggttcc t                        41 
<210>17 
<211>26 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>引物 
<400>17 
aacctctgca gttaagcacc cgccac 
26 
<210>18 
<211>1853 
<212>DNA 
<213>荧光假单胞菌 
<400>18 
atgggtgtgt atgactacaa aaacttcggc acggcggatt ccaaggcgtt gttcagcgat    60 
gccatggcga tcacgctgta ttcctaccac aacctcgata acggttttgc cgccggttat    120 
agcacaacgg ttttggcctt ggcctgccgg cgacgctggt cacggcgttg ctcggcggta    180 
ccgattccca gggcgtcatc cccggcattc cgtggaatcc cgattcggaa aaactcgccc    240 
tcgaagccgt gaaaaaggcc ggctggacgc cgatcacggc ctcgcaactg ggctacgacg    300 
gcaagaccga cgcacgcgga accttctttg gcgagaaggc cggttactcg acagcgcagg    360 
tcgagattct cggcaagtac gacgcccagg gccatctcac agaaatcggc atcgcctttc    420 
gcggcaccag cggcccgcgc gagaacctga tccttgattc catcggcgac gtgatcaacg    480 
acttgctcgc cgcgttcggc cccaaggatt acgccaagaa ctacgtcggc gaagcgttcg    540 
gcaacctgct caatgacgtg gtcgcctttg ccaaggccaa tggcctcagc ggcaaggacg    600 
tgctggtcag cggccacagc ctcggcgggc tggcggtcaa cagcatggcg gatttgagcg    660 
gcggcaagtg gggcgggttc ttcgccgact ccaactacat cgcctatgcc tcgccgaccc    720 
agagcagcac cgacaaagtg ctcaacgtcg gctacgagaa cgacccggtg ttccgcgccc    780 
tcgacggttc gaatttcacc ggcgcctcga ttggcgtgca cgacgcgccg aaggaatcgg    840 
ccaccgacaa catcgtcagc ttcaacgatc actacgcctc gacggcgtgg aatctgctgc    900 
cgttctccat cctcaacatc ccgacctgga tctcgcacct gccaaccgct tacggcgacg    960 
gcatgaaccg ggtgatcgag tcgaagttct acgacctgac cagcaaggac tcgacgatca   1020 
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acgccgaaac ccacaagggc agcaccttca tcatcggcag cgacgccaac gatctgattc  1140 
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gcggcggcta caacatcatc ctgggcgggc agggcagcaa tacgctggac ttgcagaagt  1260 
cggtgaatac cttcgacttc gccaacgacg gcgccggcaa tctgtacatt cgcgatgcca  1320 
acggcgggat cagcatcacc cgcgacatcg gcgccatcgt caccaaagag ccgggcttcc  1380 
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gcaacaacct gaccgcctac gagtcgagcg tgaagggcag caacggcgcc gacacgctca  1500 
aggcgcatgc cggcggcgac tggttgttcg gcctcgacgg caacgatcat ctgatcggcg  1560 
gggcgggcaa cgatgtgttt gttggcggcg ccggtaacga tctgatggag tccgggggcg  1620 
gggcggatac gttcctgttc aacggcgcgt tcggccagga tcgggtggtg ggattcacgt  1680 
ccaacgacaa actggtgttt ctcggcgtgc agggtgtgtt gcctggcgat gacttccgag  1740 
cgcatgcctc ggcagccggg caggataccg tgctgaagtt cggcggcgat tcggtgacat  1800 
tggttggcgt ttcgctgggg agtttgagtg gcgatggaat tgtgatcgcc tga         1853 
<210>19 
<211>503 
<212>PRT 
<213>恶臭假单胞菌W619 
<400>19 
Met Ser Lys Ser Leu Thr Trp Ala Arg Gly Ser Gly Arg Arg Leu Ile 
1                5                    10                   15 
Ser Leu Val Leu Arg Tyr Leu Lys Ile Arg Asn Val Val Phe Phe Arg 
             20                  25                   30 
Leu Tyr Pro Arg Ala Asn Leu Ala Ala Thr Thr Ser Ile Val Ala Tyr 
        35                   40                   45 
Ser Phe Phe Glu Glu Pro Pro Met Asn Met Pro Glu Thr Ala Pro Ala 
    50                   55                   60 
Gly Ile Ala Ser Gln Leu Lys Leu Asp Ala His Trp Met Pro Tyr Thr 
65                   70                   75                   80 
Ala Asn Arg Asn Phe His Arg Asp Pro Arg Leu Ile Val Ala Ala Glu 
                 85                   90                   95 
Gly Asn Tyr Leu Val Asp Asp Lys Gly Arg Arg Ile Phe Asp Ala Leu 
             100                  105                 110 
Ser Gly Leu Trp Thr Cys Gly Ala Gly His Thr Arg Lys Glu Ile Thr 
        115                  120                  125 
Glu Ala Val Ala Arg Gln Leu Gly Thr Leu Asp Tyr Ser Pro Ala Phe 
    130                  135                  140 
Gln Phe Gly His Pro Leu Ser Phe Gln Leu Ala Glu Lys Ile Thr Ala 
145                  150                  155                  160 
Leu Thr Pro Gly Asp Leu Asn His Val Phe Tyr Thr Asn Ser Gly Ser 
                 165                  170                  175 
Glu Cys Ala Asp Thr Ala Leu Lys Met Val Arg Ala Tyr Trp Arg Leu 
             180                 185                  190 
Lys Gly Gln Ala Thr Lys Thr Lys Ile Ile Gly Arg Ala Arg Gly Tyr 
        195                  200                  205 
His Gly Val Asn Ile Ala Gly Thr Ser Leu Gly Gly Val Asn Gly Asn 
    210                  215                  220 
Arg Lys Met Phe Gly Gln Leu Leu Asp Val Asp His Leu Pro His Thr 
225                  230                  235                  240 
Val Leu Pro Val Asn Ala Phe Ser Lys Gly Leu Pro Glu Glu Gly Gly 
                 245                  250                  255 
Ile Ala Leu Ala Asp Glu Met Leu Lys Leu Ile Glu Leu His Asp Ala 
             260                  265                 270 
Ser Asn Ile Ala Ala Val Ile Val Glu Pro Leu Ala Gly Ser Ala Gly 
        275                  280                  285 
Val Leu Pro Pro Pro Lys Gly Tyr Leu Lys Arg Leu Arg Glu Ile Cys 
    290                  295                  300 
Thr Gln His Asn Ile Leu Leu Ile Phe Asp Glu Val Ile Thr Gly Phe 
305                  310                  315                  320 
Gly Arg Met Gly Ala Met Thr Gly Ala Glu Ala Phe Gly Val Thr Pro 
                 325                  330                  335 
Asp Leu Met Cys Ile Ala Lys Gln Val Thr Asn Gly Ala Ile Pro Met 
             340                  345                  350 
Gly Ala Val Ile Ala Ser Ser Glu Ile Tyr Gln Thr Phe Met Asn Gln 
         355                 360                  365 
Pro Thr Pro Glu Tyr Ala Val Glu Phe Pro His Gly Tyr Thr Tyr Ser 
    370                  375                  380 
Ala His Pro Val Ala Cys Ala Ala Gly Ile Ala Ala Leu Asp Leu Leu 
385                  390                  395                  400 
Gln Arg Glu Asn Leu Val Gln Ser Ala Ala Glu Leu Ala Pro His Phe 
                 405                  410                  415 
Glu Lys Leu Leu His Gly Val Lys Gly Thr Lys Asn Val Val Asp Ile 
             420                  425                 430 
Arg Asn Tyr Gly Leu Ala Gly Ala Ile Gln Ile Ala Ala Arg Asp Gly 
        435                  440                  445 
Asp Ala Ile Val Arg Pro Tyr Glu Val Ala Met Lys Leu Trp Lys Ala 
    450                  455                  460 
Gly Phe Tyr Val Arg Phe Gly Gly Asp Thr Leu Gln Phe Gly Pro Thr 
465                  470                  475                  480 
Phe Asn Thr Thr Pro Gln Gln Leu Asp Arg Leu Phe Asp Ala Val Gly 
                 485                  490                  495 
Glu Asn Leu Asn Leu Ile Asp 
             500 
<210>20 
<211>460 
<212>PRT 
<213>铜绿假单胞菌PA01 
<400>20 
Met Thr Ala Gln Leu Asn Pro Gln Arg Asp Thr Arg Asp Tyr Gln Gln 
1                5                    10                   15 
Leu Asp Ala Ala His His Ile His Ala Phe Leu Asp Gln Lys Ala Leu 
             20                  25                   30 
Asn Arg Glu Gly Pro Arg Val Met Val Arg Gly Asp Gly Leu Gln Leu 
         35                  40                   45 
Trp Asp Asn Asp Gly Lys Arg Tyr Leu Asp Gly Met Ser Gly Leu Trp 
    50                   55                   60 
Cys Thr Asn Leu Gly Tyr Gly Arg Gln Asp Leu Ala Ala Ala Ala Ser 
65                   70                   75                   80 
Arg Gln Leu Glu Gln Leu Pro Tyr Tyr Asn Met Phe Phe His Thr Thr 
                 85                  90                    95 
His Pro Ala Val Val Glu Leu Ser Glu Met Leu Phe Ser Leu Leu Pro 
             100                  105                 110 
Asp His Tyr Ser His Ala Ile Tyr Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ala Asn 
        115                  120                  125 
Glu Val Leu Ile Arg Thr Val Arg Arg Tyr Trp Gln Ile Leu Gly Lys 
    130                  135                  140 
Pro Gln Lys Lys Ile Met Ile Gly Arg Trp Asn Gly Tyr His Gly Ser 
145                  150                  155                  160 
Thr Leu Gly Ser Thr Ala Leu Gly Gly Met Lys Phe Met His Glu Met 
                 165                   170                 175 
Gly Gly Met Leu Pro Asp Phe Ala His Ile Asp Glu Pro Tyr Trp Tyr 
             180                  185                 190 
Ala Asn Gly Gly Glu Leu Ser Pro Ala Glu Phe Gly Arg Arg Ala Ala 
        195                  200                  205 
Leu Gln Leu Glu Glu Lys Ile Leu Glu Leu Gly Ala Glu Asn Val Ala 
    210                  215                  220 
Ala Phe Val Ala Glu Pro Phe Gln Gly Ala Gly Gly Met Ile Phe Pro 
225                  230                  235                  240 
Pro Gln Ser Tyr Trp Pro Glu Ile Gln Arg Ile Cys Arg Gln Tyr Asp 
                 245                  250                  255 
Val Leu Leu Cys Ala Asp Glu Val Ile Gly Gly Phe Gly Arg Thr Gly 
             260                  265                 270 
Glu Trp Phe Ala His Glu His Phe Gly Phe Gln Pro Asp Thr Leu Ser 
        275                  280                  285 
Ile Ala Lys Gly Leu Thr Ser Gly Tyr Ile Pro Met Gly Gly Leu Val 
    290                  295                  300 
Leu Gly Lys Arg Ile Ala Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Gly Val Phe 
305                  310                  315                  320 
Ala His Gly Leu Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Ala Ala Ala Val Ala 
                 325                  330                  335 
Ile Ala Asn Leu Lys Ala Leu Arg Asp Glu Gly Val Val Thr Arg Val 
            340                   345                 350 
Arg Glu Glu Thr Gly Pro Tyr Leu Gln Arg Cys Leu Arg Glu Val Phe 
         355                 360                  365 
Gly Asp His Pro Leu Val Gly Glu Val Gln Gly Ala Gly Phe Val Ala 
    370                  375                  380 
Ala Leu Gln Phe Ala Glu Asp Lys Val Thr Arg Lys Arg Phe Ala Asn 
385                  390                  395                  400 
Glu Asn Asp Leu Ala Trp Arg Cys Arg Thr Ile Gly Phe Glu Glu Gly 
                 405                  410                  415 
Val Ile Ile Arg Ser Thr Leu Gly Arg Met Ile Met Ala Pro Ala Leu 
            420                  425                  430 
Val Ala Gly Arg Ala Glu Ile Asp Glu Leu Ile Asp Lys Thr Arg Ile 
        435                  440                  445 
Ala Val Asp Arg Thr Ala Arg Glu Ile Gly Val Leu 
    450                  455                  460 
<210>21 
<211>448 
<212>PRT 
<213>铜绿假单胞菌PA01 
<400>21 
Met Asn Gln Pro Leu Asn Val Ala Pro Pro Val Ser Ser Glu Leu Asn 
1                5                   10                    15 
Leu Arg Ala His Trp Met Pro Phe Ser Ala Asn Arg Asn Phe Gln Lys 
             20                  25                   30 
Asp Pro Arg Ile Ile Val Ala Ala Glu Gly Ser Trp Leu Thr Asp Asp 
         35                  40                   45 
Lys Gly Arg Lys Val Tyr Asp Ser Leu Ser Gly Leu Trp Thr Cys Gly 
    50                   55                   60 
Ala Gly His Ser Arg Lys Glu Ile Gln Glu Ala Val Ala Arg Gln Leu 
65                   70                   75                   80 
Gly Thr Leu Asp Tyr Ser Pro Gly Phe Gln Tyr Gly His Pro Leu Ser 
                 85                   90                   95 
Phe Gln Leu Ala Glu Lys Ile Ala Gly Leu Leu Pro Gly Glu Leu Asn 
             100                  105                 110 
His Val Phe Phe Thr Gly Ser Gly Ser Glu Cys Ala Asp Thr Ser Ile 
        115                  120                  125 
Lys Met Ala Arg Ala Tyr Trp Arg Leu Lys Gly Gln Pro Gln Lys Thr 
    130                  135                  140 
Lys Leu Ile Gly Arg Ala Arg Gly Tyr His Gly Val Asn Val Ala Gly 
145                  150                  155                  160 
Thr Ser Leu Gly Gly Ile Gly Gly Asn Arg Lys Met Phe Gly Gln Leu 
                 165                  170                  175 
Met Asp Val Asp His Leu Pro His Thr Leu Gln Pro Gly Met Ala Phe 
             180                  185                  190 
Thr Arg Gly Met Ala Gln Thr Gly Gly Val Glu Leu Ala Asn Glu Leu 
        195                  200                  205 
Leu Lys Leu Ile Glu Leu His Asp Ala Ser Asn Ile Ala Ala Val Ile 
    210                  215                  220 
Val Glu Pro Met Ser Gly Ser Ala Gly Val Leu Val Pro Pro Val Gly 
225                  230                  235                  240 
Tyr Leu Gln Arg Leu Arg Glu Ile Cys Asp Gln His Asn Ile Leu Leu 
                 245                 250                  255 
Ile Phe Asp Glu Val Ile Thr Ala Phe Gly Arg Leu Gly Thr Tyr Ser 
             260                  265                 270 
Gly Ala Glu Tyr Phe Gly Val Thr Pro Asp Leu Met Asn Val Ala Lys 
        275                  280                  285 
Gln Val Thr Asn Gly Ala Val Pro Met Gly Ala Val Ile Ala Ser Ser 
    290                  295                  300 
Glu Ile Tyr Asp Thr Phe Met Asn Gln Ala Leu Pro Glu His Ala Val 
305                  310                  315                  320 
Glu Phe Ser His Gly Tyr Thr Tyr Ser Ala His Pro Val Ala Cys Ala 
                 325                  330                  335 
Ala Gly Leu Ala Ala Leu Asp Ile Leu Ala Arg Asp Asn Leu Val Gln 
             340                  345                 350 
Gln Ser Ala Glu Leu Ala Pro His Phe Glu Lys Gly Leu His Gly Leu 
         355                 360                  365 
Gln Gly Ala Lys Asn Val Ile Asp Ile Arg Asn Cys Gly Leu Ala Gly 
    370                  375                  380 
Ala Ile Gln Ile Ala Pro Arg Asp Gly Asp Pro Thr Val Arg Pro Phe 
385                  390                  395                  400 
Glu Ala Gly Met Lys Leu Trp Gln Gln Gly Phe Tyr Val Arg Phe Gly 
                 405                  410                  415 
Gly Asp Thr Leu Gln Phe Gly Pro Thr Phe Asn Ala Arg Pro Glu Glu 
            420                  425                   430 
Leu Asp Arg Leu Phe Asp Ala Val Gly Glu Ala Leu Asn Gly Ile Ala 
        435                  440                  445 
<210>22 
<211>444 
<212>PRT 
<213>铜绿假单胞菌PA01 
<400>22 
Met Thr Met Asn Asp Glu Pro Gln Ser Ser Ser Leu Asp Asn Phe Trp 
1                5                    10                   15 
Met Pro Phe Thr Ala Asn Arg Gln Phe Lys Ala Arg Pro Arg Leu Leu 
             20                  25                    30 
Glu Ser Ala Glu Gly Ile His Tyr Ile Ala Gln Gly Gly Arg Arg Ile 
        35                   40                   45 
Leu Asp Gly Thr Ala Gly Leu Trp Cys Cys Asn Ala Gly His Gly Arg 
    50                   55                   60 
Arg Glu Ile Ser Glu Ala Val Ala Arg Gln Ile Ala Thr Leu Asp Tyr 
65                   70                   75                   80 
Ala Pro Pro Phe Gln Met Gly His Pro Leu Pro Phe Glu Leu Ala Ala 
                 85                   90                   95 
Arg Leu Thr Glu Ile Ala Pro Pro Ser Leu Asn Lys Val Phe Phe Thr 
             100                 105                   110 
Asn Ser Gly Ser Glu Ser Ala Asp Thr Ala Leu Lys Ile Ala Leu Ala 
        115                  120                  125 
Tyr Gln Arg Ala Ile Gly Gln Gly Thr Arg Thr Arg Leu Ile Gly Arg 
    130                  135                  140 
Glu Leu Gly Tyr His Gly Val Gly Phe Gly Gly Leu Ser Val Gly Gly 
145                  150                  155                  160 
Met Val Asn Asn Arg Lys Ala Phe Ser Ala Asn Leu Leu Pro Gly Val 
                 165                  170                  175 
Asp His Leu Pro His Thr Leu Asp Val Ala Arg Asn Ala Phe Thr Val 
             180                  185                 190 
Gly Leu Pro Glu His Gly Val Glu Lys Ala Glu Glu Leu Glu Arg Leu 
        195                  200                  205 
Val Thr Leu His Gly Ala Glu Asn Ile Ala Ala Val Ile Val Glu Pro 
    210                  215                  220 
Met Ser Gly Ser Ala Gly Val Val Leu Pro Pro Lys Gly Tyr Leu Gln 
225                  230                  235                  240 
Arg Leu Arg Glu Ile Thr Arg Lys His Gly Ile Leu Leu Ile Phe Asp 
                245                   250                  255 
Glu Val Ile Thr Gly Phe Gly Arg Val Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gln 
            260                   265                 270 
Arg Trp Gly Val Val Pro Asp Leu Leu Thr Cys Ala Lys Gly Leu Thr 
        275                  280                  285 
Asn Gly Ser Ile Pro Met Gly Ala Val Phe Val Asp Glu Lys Ile His 
    290                  295                  300 
Ala Ala Phe Met Gln Gly Pro Gln Gly Ala Ile Glu Phe Phe His Gly 
305                  310                  315                  320 
Tyr Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Ala Cys Ala Ala Ala Leu Ala Thr 
                 325                  330                  335 
Leu Asp Ile Tyr Arg Arg Asp Asp Leu Phe Gln Arg Ala Val Glu Leu 
             340                  345                  350 
Glu Gly Tyr Trp Gln Asp Ala Leu Phe Ser Leu Arg Asp Leu Pro Asn 
        355                  360                  365 
Val Val Asp Ile Arg Ala Val Gly Leu Val Gly Gly Val Gln Leu Ala 
    370                  375                  380 
Pro His Ala Asp Gly Pro Gly Lys Arg Gly Tyr Asp Val Phe Glu Arg 
385                  390                  395                  400 
Cys Phe Trp Glu His Asp Leu Met Val Arg Val Thr Gly Asp Ile Ile 
                 405                  410                  415 
Ala Met Ser Pro Pro Leu Ile Ile Asp Lys Pro His Ile Asp Gln Ile 
             420                  425                 430 
Val Glu Arg Leu Ala Gln Ala Ile Arg Ala Ser Val 
        435                  440 
<210>23 
<211>468 
<212>PRT 
<213>铜绿假单胞菌PA01 
<400>23 
Met Asn Ala Arg Leu His Ala Thr Ser Pro Leu Gly Asp Ala Asp Leu 
1                5                    10                   15 
Val Arg Ala Asp Gln Ala His Tyr Met His Gly Tyr His Val Phe Asp 
             20                  25                   30 
Asp His Arg Val Asn Gly Ser Leu Asn Ile Ala Ala Gly Asp Gly Ala 
         35                  40                   45 
Tyr Ile Tyr Asp Thr Ala Gly Asn Arg Tyr Leu Asp Ala Val Gly Gly 
    50                   55                   60 
Met Trp Cys Thr Asn Ile Gly Leu Gly Arg Glu Glu Met Ala Arg Thr 
65                   70                   75                   80 
Val Ala Glu Gln Thr Arg Leu Leu Ala Tyr Ser Asn Pro Phe Cys Asp 
                 85                   90                   95 
Met Ala Asn Pro Arg Ala Ile Glu Leu Cys Arg Lys Leu Ala Glu Leu 
            100                   105                  110 
Ala Pro Gly Asp Leu Asp His Val Phe Leu Thr Thr Gly Gly Ser Thr 
        115                  120                  125 
Ala Val Asp Thr Ala Ile Arg Leu Met His Tyr Tyr Gln Asn Cys Arg 
    130                  135                  140 
Gly Lys Arg Ala Lys Lys His Val Ile Thr Arg Ile Asn Ala Tyr His 
145                  150                  155                  160 
Gly Ser Thr Phe Leu Gly Met Ser Leu Gly Gly Lys Ser Ala Asp Arg 
                165                   170                  175 
Pro Ala Glu Phe Asp Phe Leu Asp Glu Arg Ile His His Leu Ala Cys 
             180                  185                  190 
Pro Tyr Tyr Tyr Arg Ala Pro Glu Gly Leu Gly Glu Ala Glu Phe Leu 
         195                 200                  205 
Asp Gly Leu Val Asp Glu Phe Glu Arg Lys Ile Leu Glu Leu Gly Ala 
    210                  215                  220 
Asp Arg Val Gly Ala Phe Ile Ser Glu Pro Val Phe Gly Ser Gly Gly 
225                  230                  235                  240 
Val Ile Val Pro Pro Ala Gly Tyr His Arg Arg Met Trp Glu Leu Cys 
                 245                  250                  255 
Gln Arg Tyr Asp Val Leu Tyr Ile Ser Asp Glu Val Val Thr Ser Phe 
             260                  265                  270 
Gly Arg Leu Gly His Phe Phe Ala Ser Gln Ala Val Phe Gly Val Gln 
         275                 280                  285 
Pro Asp Ile Ile Leu Thr Ala Lys Gly Leu Thr Ser Gly Tyr Gln Pro 
    290                  295                  300 
Leu Gly Ala Cys Ile Phe Ser Arg Arg Ile Trp Glu Val Ile Ala Glu 
305                 310                   315                  320 
Pro Asp Lys Gly Arg Cys Phe Ser His Gly Phe Thr Tyr Ser Gly His 
                325                   330                  335 
Pro Val Ala Cys Ala Ala Ala Leu Lys Asn Ile Glu Ile Ile Glu Arg 
             340                  345                 350 
Glu Gly Leu Leu Ala His Ala Asp Glu Val Gly Arg Tyr Phe Glu Glu 
         355                 360                  365 
Arg Leu Gln Ser Leu Arg Asp Leu Pro Ile Val Gly Asp Val Arg Gly 
    370                  375                  380 
Met Arg Phe Met Ala Cys Val Glu Phe Val Ala Asp Lys Ala Ser Lys 
385                  390                  395                  400 
Ala Leu Phe Pro Glu Ser Leu Asn Ile Gly Glu Trp Val His Leu Arg 
                405                   410                 415 
Ala Gln Lys Arg Gly Leu Leu Val Arg Pro Ile Val His Leu Asn Val 
             420                 425                  430 
Met Ser Pro Pro Leu Ile Leu Thr Arg Glu Gln Val Asp Thr Val Val 
        435                  440                  445 
Arg Val Leu Arg Glu Ser Ile Glu Glu Thr Val Glu Asp Leu Val Arg 
    450                  455                  460 
Ala Gly His Arg 
465 
<210>24 
<211>460 
<212>PRT 
<213>恶臭假单胞菌W619 
<400>24 
Met Asn Ala Pro Phe Gln Pro Gln Arg Asp Thr Arg Asp Tyr Gln Ala 
1                5                    10                   15 
Ser Asp Ala Ala His His Ile His Ala Phe Leu Asp Gln Lys Ala Leu 
             20                   25                   30 
Asn Ala Glu Gly Pro Arg Val Ile Thr Arg Gly Glu Arg Leu Tyr Leu 
         35                  40                   45 
Trp Asp Asn Asp Gly Arg Arg Tyr Leu Asp Gly Met Ser Gly Leu Trp 
    50                   55                   60 
Cys Thr Gln Leu Gly Tyr Gly Arg Lys Asp Leu Thr Ala Ala Ala Ala 
65                   70                   75                   80 
Ala Gln Met Asp Gln Leu Ala Tyr Tyr Asn Met Phe Phe His Thr Thr 
                 85                   90                   95 
His Pro Ala Val Ile Glu Leu Ser Glu Leu Leu Phe Ser Leu Leu Pro 
             100                 105                  110 
Gly His Tyr Ser His Ala Ile Tyr Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ala Asn 
        115                   120                 125 
Glu Val Leu Ile Arg Thr Val Arg Arg Tyr Trp Gln Val Val Gly Gln 
    130                  135                  140 
Pro Asn Lys Lys Val Met Ile Gly Arg Trp Asn Gly Tyr His Gly Ser 
145                  150                  155                  160 
Thr Leu Ala Ala Thr Ala Leu Gly Gly Met Lys Phe Met His Glu Met 
                165                   170                  175 
Gly Gly Leu Ile Pro Asp Val Ala His Ile Asp Glu Pro Tyr Trp Tyr 
             180                  185                  190 
Ala Glu Gly Gly Glu Leu Thr Pro Ala Glu Phe Gly Arg Arg Cys Ala 
        195                  200                  205 
Leu Gln Leu Glu Glu Lys Ile Leu Glu Leu Gly Ala Glu Asn Val Ala 
    210                  215                  220 
Gly Phe Val Ala Glu Pro Phe Gln Gly Ala Gly Gly Met Ile Phe Pro 
225                  230                  235                  240 
Pro Glu Ser Tyr Trp Pro Glu Ile Gln Arg Ile Cys Arg Gln Tyr Asp 
                 245                  250                  255 
Val Leu Leu Cys Ala Asp Glu Val Ile Gly Gly Phe Gly Arg Thr Gly 
             260                  265                 270 
Glu Trp Phe Ala His Glu Tyr Phe Gly Phe Glu Pro Asp Thr Leu Ser 
        275                  280                  285 
Ile Ala Lys Gly Leu Thr Ser Gly Tyr Val Pro Met Gly Gly Leu Val 
    290                  295                  300 
Leu Ser Lys Arg Ile Ala Glu Ala Leu Val Glu Arg Gly Gly Val Phe 
305                  310                  315                  320 
Ala His Gly Leu Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Ala Ala Ala Val Ala 
                 325                  330                  335 
Ile Ala Asn Leu Lys Ala Leu Arg Asp Glu Gly Ile Val Arg Gln Val 
            340                   345                 350 
Lys Asp Asp Thr Gly Pro Tyr Leu Gln Arg Ile Leu Arg Glu Val Phe 
         355                 360                  365 
Ala Asn His Pro Leu Ile Gly Gln Val Gln Gly Ala Gly Leu Val Ala 
    370                  375                  380 
Ala Leu Gln Phe Ala Glu Asp Lys Gly Ser Arg Lys Arg Tyr Ala Asn 
385                  390                  395                  400 
Glu Asn Asp Leu Ala Trp Gln Cys Arg Thr Tyr Gly Phe Glu Glu Gly 
                 405                  410                  415 
Val Ile Ile Arg Ser Thr Leu Gly Arg Met Ile Met Ala Pro Ala Leu 
             420                  425                  430 
Val Ala Thr His Gly Glu Leu Asp Glu Leu Val Asp Lys Thr Arg Ile 
         435                  440                  445 
Ala Val Asp Arg Thr Ala Arg Gly Leu Gly Ile Leu 
    450                  455                  460 
<210>25 
<211>459 
<212>PRT 
<213>恶臭假单胞菌KT2440 
<400>25 
Met Ser Thr His Ser Ser Thr Val Gln Asn Asp Leu Ala Ala Leu Ile 
1                5                    10                   15 
His Pro Asn Thr Asn Leu Ala Gln His Arg Glu Val Gly Pro Leu Val 
             20                   25                   30 
Ile Ala Arg Gly Asp Gly Val Arg Val Phe Asp Glu Gln Gly Asn Ala 
         35                  40                   45 
Tyr Ile Glu Ala Met Ser Gly Leu Trp Ser Ala Ala Leu Gly Phe Ser 
    50                   55                   60 
Glu Gln Arg Leu Val Asp Ala Ala Val Glu Gln Phe Lys Gln Leu Pro 
65                   70                   75                   80 
Tyr Tyr His Ser Phe Ser His Lys Thr Asn Ala Pro Ala Ala Ala Leu 
                 85                   90                   95 
Ala Ala Lys Leu Ala Ala Leu Ala Pro Gly Asp Leu Asn His Val Phe 
            100                  105                  110 
Phe Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ala Asn Asp Ser Val Val Lys Met Val 
        115                  120                  125 
Trp Tyr Val Asn Asn Ala Leu Gly Arg Pro Ala Lys Lys Lys Phe Ile 
    130                  135                  140 
Ser Arg Gln Gln Ala Tyr His Gly Ala Thr Val Ala Ala Ala Ser Leu 
145                  150                  155                  160 
Thr Gly Ile Pro Ser Met His Arg Asp Phe Asp Leu Pro Ala Ile Pro 
                 165                  170                  175 
Val His His Leu Thr Cys Pro Asn Phe Tyr Arg Phe Ala Arg Pro Gly 
             180                  185                  190 
Glu Ser Gln Glu Ala Phe Thr Val Arg Le uAla Asn Glu Leu Glu Arg 
        195                  200                  205 
Tyr Ile Leu Ala Glu Gly Pro Glu Thr Ile Ala Ala Phe Ile Gly Glu 
    210                  215                  220 
Pro Val Ile Ala Ala Gly Gly Val Ile Pro Pro Pro Thr Gly Tyr Trp 
225                  230                  235                  240 
Ala Ala Ile Gln Ala Val Cys Lys Arg Tyr Asp Ile Leu Val Val Ile 
                 245                  250                  255 
Asp Glu Ile Ile Thr Gly Phe Gly Arg Leu Gly Thr Met Phe Gly Ser 
            260                  265                  270 
Gln Leu Tyr Gly Ile Gln Pro Asp Ile Met Val Leu Ser Lys Gln Leu 
         275                 280                  285 
Thr Ser Ser Tyr Gln Pro Leu Ala Ala Val Val Val Ser Asp Ala Met 
    290                  295                  300 
Asn Asp Val Leu Val Ser Gln Ser Gln Arg Leu Gly Ala Phe Ala His 
305                  310                  315                  320 
Gly Leu Thr Cys Thr Gly His Pro Val Ala Thr Ala Val Ala Leu Glu 
                 325                  330                  335 
Asn Ile Arg Ile Ile Glu Glu Arg Asp Leu Val Gly His Val Gln His 
             340                  345                  350 
Leu Ala Pro Val Phe Gln Arg His Leu Arg Ala Phe Glu Asp His Pro 
         355                 360                   365 
Leu Val Gly Asn Val Arg Gly Val Gly Leu Met Gly Gly Ile Glu Leu 
    370                  375                  380 
Val Ala Asp Lys Ala Thr Arg Gln Pro Phe Ala Gln Pro Gly Thr Leu 
385                  390                  395                  400 
Gly Gly Tyr Val Phe Lys Gln Ala His Lys His Gly Leu Ile Ile Arg 
                 405                  410                  415 
Ala Ile Tyr Asp Thr Ile Ala Phe Cys Pro Pro Leu Ile Thr Thr Gln 
            420                  425                  430 
Asp Asp Ile Glu Ala Ile Phe Ser Ala Phe Glu Arg Thr Leu Ala Asp 
        435                  440                  445 
Ala Thr Asp Trp Ala Arg Ser Gln His Leu Leu 
    450                  455 
<210>26 
<211>490 
<212>PRT 
<213>恶臭假单胞菌W619 
<400>26 
Met Arg Ile Ser Ser Val Ser Ser Ala Pro Gly Ser Val Ser Ser Cys 
1                5                    10                   15 
Cys Leu Leu Cys Asp Gln Pro Leu Arg Pro Pro Ala Gly Gly Leu Trp 
             20                  25                   30 
Thr Leu Glu Lys His Met Ser Val Lys Asn Pro Gln Thr Arg Asp Trp 
        35                    40                  45 
Gln Thr Leu Ser Gly Glu His His Leu Ala Pro Phe Ser Asp Tyr Lys 
    50                   55                   60 
Gln Leu Lys Glu Lys Gly Pro Arg Ile Ile Thr Lys Ala Gln Gly Val 
65                   70                   75                   80 
His Leu Trp Asp Ser Glu Gly His Lys Ile Leu Asp Gly Met Ala Gly 
                 85                   90                   95 
Leu Trp Cys Val Ala Val Gly Tyr Gly Arg Glu Glu Leu Val Gln Ala 
             100                  105                  110 
Ala Glu Lys Gln Met Arg Glu Leu Pro Tyr Tyr Asn Leu Phe Phe Gln 
        115                  120                  125 
Thr Ala His Pro Pro Ala Leu Glu Leu Ala Lys Ala Ile Thr Asp Val 
    130                  135                  140 
Ala Pro Glu Gly Met Thr His Val Phe Phe Thr Gly Ser Gly Ser Glu 
145                  150                   155                  160 
Gly Asn Asp Thr Val Leu Arg Met Val Arg His Tyr Trp Ala Leu Lys 
                 165                  170                  175 
Gly Lys Pro Gln Lys Gln Thr Ile Ile Gly Arg Ile Asn Gly Tyr His 
            180                  185                  190 
Gly Ser Thr Val Ala Gly Ala Ser Leu Gly Gly Met Ser Gly Met His 
        195                  200                  205 
Glu Gln Gly Gly Leu Pro Ile Pro Gly Ile Val His Ile Pro Gln Pro 
    210                  215                  220 
Tyr Trp Phe Gly Glu Gly Gly Asp Met Ser Pro Asp Asp Phe Gly Val 
225                  230                  235                  240 
Trp Ala Ala Glu Gln Leu Glu Lys Lys Ile Leu Glu Val Gly Glu Asp 
                 245                  250                  255 
Asn Val Ala Ala Phe Ile Ala Glu Pro Ile Gln Gly Ala Gly Gly Val 
            260                  265                   270 
Ile Ile Pro Pro Glu Thr Tyr Trp ProLys Val Lys Glu Ile Leu Ala 
        275                   280                 285 
Lys Tyr Asp Ile Leu Phe Val Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly 
    290                  295                  300 
Arg Thr Gly Glu Trp Phe Gly Ser Asp Tyr Tyr Asp Leu Lys Pro Asp 
305                  310                  315                  320 
Leu Met Thr Ile Ala Lys Gly Leu Thr Ser Gly Tyr Ile Pro Met Gly 
                 325                  330                  335 
Gly Val Ile Val Arg Asp Lys Val Ala Lys Val Leu Ser Glu Gly Gly 
            340                  345                  350 
Asp Phe Asn His Gly Phe Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Ala Ala Ala 
        355                  360                  365 
Val Gly Leu Glu Asn Leu Arg Ile Leu Arg Glu Glu Lys Ile Val Glu 
    370                  375                  380 
Lys Val Arg Thr Glu Val Ala Pro Tyr Leu Gln Lys Arg Leu Arg Glu 
385                  390                  395                  400 
Leu Gln Asp His Pro Leu Val Gly Glu Val Arg Gly Leu Gly Leu Leu 
                 405                  410                  415 
Gly Ala Ile Glu Leu Val Lys Asp Lys Ala Ser Arg Ser Arg Tyr Glu 
             420                  425                  430 
Gly Lys Gly Val Gly Met Val Cys Arg Asn Phe Cys Phe Asp Asn Gly 
        435                  440                  445 
Leu Ile Met Arg Ala Val Gly Asp Thr Met Ile Ile Ala Pro Pro Leu 
    450                  455                  460 
Val Ile Ser His Ala Glu Val Asp Glu Leu Val Glu Lys Ala Arg Lys 
465                  470                  475                  480 
Cys Leu Asp Leu Thr Leu Glu Ala Ile Arg 
                 485                  490 
<210>27 
<211>457 
<212>PRT 
<213>天蓝色链霉菌A3(2) 
<400>27 
Met Ser Thr Asp Ser Pro Lys Asp Leu Ser Arg Thr Ala Tyr Asp His 
1                5                    10                   15 
Leu Trp Met His Phe Thr Arg Met Ser Ser Tyr Glu Asn Ala Pro Val 
             20                  25                   30 
Pro Thr Ile Val Arg Gly Glu Gly Thr His Ile Tyr Asp Asp Lys Gly 
        35                   40                   45 
Arg Arg Tyr Leu Asp Gly Leu Ala Gly Leu Phe Val Val Gln Ala Gly 
    50                   55                   60 
His Gly Arg Gln Glu Leu Ala Glu Thr Ala Ser Lys Gln Ala Gln Glu 
65                   70                   75                   80 
Leu Ala Phe Phe Pro Val Trp Ser Tyr Ala His Pro Lys Ala Val Glu 
                 85                  90                    95 
Leu Ala Glu Arg Leu Ala Asn Glu Ala Pro Gly Asp Leu Asn Lys Val 
            100                  105                  110 
Phe Phe Thr Thr Gly Gly Gly Glu Ala Val Glu Thr Ala Trp Lys Leu 
        115                  120                  125 
Ala Lys Gln Tyr Phe Lys Leu Thr Gly Lys Pro Thr Lys Tyr Lys Val 
    130                  135                  140 
Ile Ser Arg Ala Val Ala Tyr His Gly Thr Pro Gln Gly Ala Leu Ser 
145                  150                  155                  160 
Ile Thr Gly Leu Pro Ala Leu Lys Ala Pro Phe Glu Pro Leu Val Pro 
                 165                  170                  175 
Gly Ala His Lys Val Pro Asn Thr Asn Ile Tyr Arg Ala Pro Ile His 
             180                  185                  190 
Gly Asp Asp Pro Glu Ala Tyr Gly Arg Trp Ala Ala Asp Gln Ile Glu 
        195                  200                  205 
Gln Gln Ile Leu Phe Glu Gly Pro Glu Thr Val Ala Ala Val Phe Leu 
    210                  215                  220 
Glu Pro Val Gln Asn Ala Gly Gly Cys Phe Pro Pro Pro Pro Gly Tyr 
225                  230                  235                  240 
Phe Gln Arg Val Arg Glu Ile Cys Asp Gln Tyr Asp Val Leu Leu Val 
                 245                  250                  255 
Ser Asp Glu Val Ile Cys Ala Phe Gly Arg Leu Gly Thr Thr Phe Ala 
             260                 265                   270 
Cys Asp Lys Phe Gly Tyr Val Pro Asp Met Ile Thr Cys Ala Lys Gly 
        275                  280                  285 
Met Thr Ser Gly Tyr Ser Pro Ile Gly Ala Cys Val Ile Ser Asp Arg 
    290                  295                  300 
Leu Ala Glu Pro Phe Tyr Lys Gly Asp Asn Thr Phe Leu His Gly Tyr 
305                  310                  315                  320 
Thr Phe Gly Gly His Pro Val Ser Ala Ala Val Gly Ile Ala Asn Leu 
                 325                  330                  335 
Asp Leu Phe Glu Arg Glu Gly Leu Asn Gln His Val Leu Asp Asn Glu 
             340                  345                  350 
Gly Ala Phe Arg Ala Thr Leu Glu Lys Leu His Asp Leu Pro Ile Val 
        355                  360                  365 
Gly Asp Val Arg Gly Asn Gly Phe Phe Tyr Gly Ile Glu Leu Val Lys 
    370                  375                  380 
Asp Lys Ala Thr Lys Glu Ser Phe Asp Glu Glu Glu Thr Glu Arg Val 
385                  390                  395                  400 
Leu Tyr Gly Phe Leu Ser Lys Lys Leu Phe Glu Asn Gly Leu Tyr Cys 
                 405                  410                  415 
Arg Ala Asp Asp Arg Gly Asp Pro Val Ile Gln Leu Ala Pro Pro Leu 
             420                 425                   430 
Ile Ser Asn Gln Glu Thr Phe Asp Glu Ile Glu Gln Ile Leu Arg Ala 
         435                  440                 445 
Thr Leu Thr Glu Ala Trp Thr Lys Leu 
    450                  455 
<210>28 
<211>459 
<212>PRT 
<213>阿维链霉菌MA 4680 
<400>28 
Met Gly Asn Pro Ile Ala Val Ser Lys Asp Leu Ser Arg Thr Ala Tyr 
1                5                    10                   15 
Asp His Leu Trp Met His Phe Thr Arg Met Ser Ser Tyr Glu Asn Ala 
            20                    25                   30 
Pro Val Pro Thr Ile Val Arg Gly Glu Gly Thr Tyr Ile Tyr Asp Asp 
         35                  40                   45 
Lys Gly Lys Arg Tyr Leu Asp Gly Leu Ser Gly Leu Phe Val Val Gln 
    50                   55                   60 
Ala Gly His Gly Arg Thr Glu Leu Ala Glu Thr Ala Phe Lys Gln Ala 
65                   70                   75                   80 
Gln Glu Leu Ala Phe Phe Pro Val Trp Ser Tyr Ala His Pro Lys Ala 
                 85                   90                   95 
Val Glu Leu Ala Glu Arg Leu Ala Asn Tyr Ala Pro Gly Asp Leu Asn 
             100                  105                  110 
Lys Val Phe Phe Thr Thr Gly Gly Gly Glu Ala Val Glu Thr Ala Trp 
        115                  120                  125 
Lys Leu Ala Lys Gln Tyr Phe Lys Leu Gln Gly Lys Pro Thr Lys Tyr 
    130                  135                  140 
Lys Val Ile Ser Arg Ala Val Ala Tyr His Gly Thr Pro Gln Gly Ala 
145                  150                  155                  160 
Leu Ser Ile Thr Gly Leu Pro Ala Leu Lys Ala Pro Phe Glu Pro Leu 
                 165                  170                  175 
Val Pro Gly Ala His Lys Val Pro Asn Thr Asn Ile Tyr Arg Ala Pro 
             180v                 185                 190 
Leu Phe Gly Asp Asp Pro Glu Ala Phe Gly Arg Trp Ala Ala Asp Gln 
        195                  200                  205 
Ile Glu Gln Gln Ile Leu Phe Glu Gly Pro Glu Thr Val Ala Ala Val 
    210                  215                  220 
Phe Leu Glu Pro Val Gln Asn Ala Gly Gly Cys Phe Pro Pro Pro Pro 
225                  230                  235                  240 
Gly Tyr Phe Gln Arg Val Arg Glu Ile Cys Asp Gln Tyr Asp Val Leu 
                 245                  250                  255 
Leu Val Ser Asp Glu Val Ile Cys Ala Phe Gly Arg Leu Gly Thr Met 
            260                  265                  270 
Phe Ala Cys Asp Lys Phe Gly Tyr Val Pro Asp Met Ile Thr Cys Ala 
        275                  280                  285 
Lys Gly Met Thr Ser Gly Tyr Ser Pro Ile Gly Ala Cys Ile Val Ser 
    290                  295                  300 
Asp Arg Ile Ala Glu Pro Phe Tyr Lys Gly Asp Asn Thr Phe Leu His 
305                  310                  315                  320 
Gly Tyr Thr Phe Gly Gly His Pro Val Ser Ala Ala Val Gly Val Ala 
                 325                  330                  335 
Asn Leu Asp Leu Phe Glu Arg Glu Gly Leu Asn Gln His Val Leu Asp 
            340                   345                 350 
Asn Glu Ser Ala Phe Leu Thr Thr Leu Gln Lys Leu His Asp Leu Pro 
        355                  360                  365 
Ile Val Gly Asp Val Arg Gly Asn Gly Phe Phe Tyr Gly Ile Glu Leu 
    370                  375                  380 
Val Lys Asp Lys Ala Thr Lys Glu Thr Phe Thr Asp Glu Glu Ser Glu 
385                  390                  395                  400 
Arg Val Leu Tyr Gly Phe Val Ser Lys Lys Leu Phe Glu Tyr Gly Leu 
                 405                  410                  415 
Tyr Cys Arg Ala Asp Asp Arg Gly Asp Pro Val Ile Gln Leu Ser Pro 
            420                   425                 430 
Pro Leu Ile Ser Asn Gln Ser Thr Phe Asp Glu Ile Glu Ser Ile Ile 
        435                  440                  445 
Arg Gln Val Leu Thr Glu Ala Trp Thr Lys Leu 
    450                  455 
<210>29 
<211>450 
<212>PRT 
<213>阿维链霉菌MA 4680 
<400>29 
Met Thr Pro Gln Pro Asn Pro Gln Val Gly Ala Ala Val Lys Ala Ala 
1                5                    10                   15 
Asp Arg Ala His Val Phe His Ser Trp Ser Ala Gln Glu Leu Ile Asp 
            20                    25                  30 
Pro Leu Ala Val Ala Gly Ala Glu Gly Ser Tyr Phe Trp Asp Tyr Asp 
         35                   40                   45 
Gly Arg Arg Tyr Leu Asp Phe Thr Ser Gly Leu Val Phe Thr Asn Ile 
    50                   55                   60 
Gly Tyr Gln His Pro Lys Val Val Ala Ala Ile Gln Glu Gln Ala Ala 
65                   70                   75                   80 
Ser Leu Thr Thr Phe Ala Pro Ala Phe Ala Val Glu Ala Arg Ser Glu 
                 85                   90                   95 
Ala Ala Arg Leu Ile Ala Glu Arg Thr Pro Gly Asp Leu Asp Lys Ile 
             100                 105                  110 
Phe Phe Thr Asn Gly Gly Ala Asp Ala Ile Glu His Ala Val Arg Met 
        115                   120                 125 
Ala Arg Ile His Thr Gly Arg Pro Lys Val Leu Ser Ala Tyr Arg Ser 
    130                  135                  140 
Tyr His Gly Gly Thr Gln Gln Ala Val Asn Ile Thr Gly Asp Pro Arg 
145                  150                  155                  160 
Arg Trp Ala Ser Asp Ser Ala Ser Ala Gly Val Val His Phe Trp Ala 
                 165                  170                 175 
Pro Tyr Leu Tyr Arg Ser Arg Phe Tyr Ala Glu Thr Glu Gln Gln Glu 
            180                  185                  190 
Cys Glu Arg Ala Leu Glu His Leu Glu Thr Thr Ile Ala Phe Glu Gly 
        195                  200                  205 
Pro Gly Thr Ile Ala Ala Ile Val Leu Glu Thr Val Pro Gly Thr Ala 
    210                  215                  220 
Gly Ile Met Val Pro Pro Pro Gly Tyr Leu Ala Gly Val Arg Glu Leu 
225                  230                  235                  240 
Cys Asp Lys Tyr Gly Ile Val Phe Val Leu Asp Glu Val Met Ala Gly 
                 245                  250                 255 
Phe Gly Arg Thr Gly Glu Trp Phe Ala Ala Asp Leu Phe Asp Val Thr 
             260                 265                  270 
Pro Asp Leu Met Thr Phe Ala Lys Gly Val Asn Ser Gly Tyr Val Pro 
        275                  280                  285 
Leu Gly Gly Val Ala Ile Ser Gly Lys Ile Ala Glu Thr Phe Gly Lys 
    290                  295                  300 
Arg Ala Tyr Pro Gly Gly Leu Thr Tyr Ser Gly His Pro Leu Ala Cys 
305                  310                  315                  320 
Ala Ala Ala Val Ala Thr Ile Asn Val Met Ala Glu Glu Gly Val Val 
                 325                  330                  335 
Glu Asn Ala Ala Asn Leu Gly Ala Arg Val Ile Glu Pro Gly Leu Arg 
             340                  345                  350 
Glu Leu Ala Glu Arg His Pro Ser Val Gly Glu Val Arg Gly Val Gly 
        355                  360                  365 
Met Phe Trp Ala Leu Glu Leu Val Lys Asp Arg Glu Thr Arg Glu Pro 
    370                  375                  380 
Leu Val Pro Tyr Asn Ala Ala Gly Glu Ala Asn Ala Pro Met Ala Ala 
385                  390                  395                  400 
Phe Gly Ala Ala Ala Lys Ala Asn Gly Leu Trp Pro Phe Ile Asn Met  
                 405                 410                  415 
Asn Arg Thr His Val Val Pro Pro Cys Asn Val Thr Glu Ala Glu Ala 
            420                  425                  430 
Lys Glu Gly Leu Ala Ala Leu Asp Ala Ala Leu Ser Val Ala Asp Glu 
        435                  440                  445 
Tyr Thr 
    450 
<210>30 
<211>446 
<212>PRT 
<213>紫色色杆菌ATCC 12472 
<400>30 
Met Asn His Pro Leu Thr Thr Arg Ser Glu Phe Asp His Leu Asp Leu 
1                5                   10                   15 
Arg Ala His Trp Met Pro Phe Ser Ala Asn Arg Asn Phe Gln Arg Asp 
            20                   25                   30 
Pro Arg Leu Ile Val Ser Gly Glu Gly Asn Tyr Leu Thr Asp Ala Asp 
         35                  40                   45 
Gly Arg Arg Ile Phe Asp Ser Leu Ser Gly Leu Trp Cys Cys Gly Ala 
    50                   55                   60 
Gly His Ser Arg Lys Glu Ile Ala Glu Ala Ala Tyr Arg Gln Leu Ser 
65                   70                   75                   80 
Thr Leu Asp Tyr Ser Pro Gly Phe Gln Phe Gly His Pro Leu Ser Phe 
                 85                   90                   95 
Arg Leu Ala Glu Arg Val Ala Ala Met Ala Pro Gly Ala Leu Asn His 
             100                  105                 110 
Val Phe Phe Thr Asn Ser Gly Ser Glu Cys Ala Asp Thr Ala Val Lys 
        115                  120                  125 
Met Ala Arg Ala Tyr Trp Arg Leu Lys Gly Gln Ala Ser Lys Thr Lys 
    130                  135                  140 
Leu Ile Gly Arg Ala Arg Gly Tyr His Gly Val Asn Ile Ala Gly Thr 
145                  150                  155                  160 
Ser Leu Gly Gly Met Asn Gly Asn Arg Lys Leu Phe Gly Pro Leu Met 
                 165                  170                  175 
Asp Ala Asp His Leu Pro His Thr Leu Leu Pro Ala Asn Ala Phe Ser 
            180                  185                   190 
Arg Gly Leu Pro Glu Gln Gly Ala Glu Leu Ala Asp Asp Leu Leu Arg 
        195                  200                  205 
Leu Ile Glu Leu His Asp Ala Ser Asn Ile Ala Ala Val Ile Val Glu 
    210                  215                  220 
Pro Met Ala Gly Ser Ala Gly Val Ile Val Pro Pro Gln Gly Tyr Leu 
225                  230                  235                  240 
Gln Arg Leu Arg Glu Ile Cys Thr Gln His Gly Ile Leu Leu Ile Phe 
                 245                  250                  255 
Asp Glu Val Ile Thr Gly Phe Gly Arg Thr Gly Ser Leu Phe Gly Ala 
             260                  265                 270 
Asp His Phe Gly Val Thr Pro Asp Ile Met Asn Leu Ala Lys Gln Leu 
        275                  280                  285 
Thr Asn Gly Ala Val Pro Met Gly Ala Val Val Ala Ser Ser Glu Ile 
    290                  295                  300 
Tyr Asp Ala Phe Met Ala Gln Ala Thr Pro Glu Tyr Ala Val Glu Phe 
305                  310                  315                  320 
Ala His Gly Tyr Thr Tyr Ser Ala His Pro Val Ala Cys Ala Ala Ala 
                 325                  330                  335 
Leu Ala Ala Leu Asp Val Leu Glu Gln Glu Asn Leu Val Ala Arg Ala 
             340                 345                  350 
Ala Glu Leu Ala Pro His Phe Glu Arg Gly Ile His Gly Leu Lys Gly 
        355                  360                  365 
Leu Pro His Val Ile Asp Ile Arg Asn Cys Gly Leu Ala Gly Ala Val 
    370                  375                  380 
Gln Ile Ala Pro Ser Gly Gly Asp Ala Ile Val Arg Pro Tyr Glu Ala 
385                  390                  395                  400 
Ala Met Ala Leu Trp Arg Lys Gly Phe Tyr Val Arg Tyr Gly Gly Asp 
                 405                  410                  415 
Ala Leu Gln Phe Gly Pro Pro Phe Thr Ala Thr Pro Gln Glu Leu Asp 
            420                  425                  430 
Ser Leu Phe Asp Ala Val Gly Glu Thr Leu Ala Lys Leu Ala 
        435                  440                  445 
<210>31 
<211>11539 
<212>DNA 
<213>人工 
<220> 
<223>载体 
<400>31 
gaaaaccgcc actgcgccgt taccaccgct gcgttcggtc aaggttctgg accagttgcg     60 
tgagcgcata cgctacttgc attacagttt acgaaccgaa caggcttatg tcaattcgcc    120 
tctcaggcgc cgctggtgcc gctggttgga cgccaagggt gaatccgcct cgataccctg    180 
attactcgct tcctgcgccc tctcaggcgg cgatagggga ctggtaaaac ggggattgcc    240 
cagacgcctc ccccgcccct tcaggggcac aaatgcggcc ccaacggggc cacgtagtgg    300 
tgcgtttttt gcgtttccac ccttttcttc cttttccctt ttaaaccttt taggacgtct     360 
acaggccacg taatccgtgg cctgtagagt ttaaaaaggg acggatttgt tgccattaag     420 
ggacggattt gttgttaaga agggacggat ttgttgttgt aaagggacgg atttgttgta     480 
ttgtgggacg cagatacagt gtccccttat acacaaggaa tgtcgaacgt ggcctcaccc     540 
ccaatggttt acaaaagcaa tgccctggtc gaggccgcgt atcgcctcag tgttcaggaa     600 
cagcggatcg ttctggcctg tattagccag gtgaagagga gcgagcctgt caccgatgaa     660 
gtgatgtatt cagtgacggc ggaggacata gcgacgatgg cgggtgtccc tatcgaatct     720 
tcctacaacc agctcaaaga agcggccctg cgcctgaaac ggcgggaagt ccggttaacc     780 
caagagccca atggcaaggg gaaaagaccg agtgtgatga ttaccggctg ggtgcaaaca     840 
atcatctacc gggagggtga gggccgtgta gaactcaggt tcaccaaaga catgctgccg     900 
tacctgacgg aactcaccaa acagttcacc aaatacgcct tggctgacgt ggccaagatg     960 
gacagcaccc acgcgatcag gctttacgag ctgctcatgc aatgggacag catcggccag    1020 
cgcgaaatag aaattgacca gctgcgaaag tggtttcaac tggaaggccg gtatccctcg    1080 
atcaaggact tcaagttgcg agtgcttgat ccagccgtga cgcagatcaa cgagcacagc    1140 
ccgctacagg tggagtgggc gcagcgaaag accgggcgca aggtcacaca tctgttgttc    1200 
agttttggac cgaagaagcc cgccaaggcg gtgggtaagg ccccagcgaa gcgcaaggcc    1260 
gggaagattt cagatgctga gatcgcgaaa caggctcgcc ctggtgagac atgggaagcg    1320 
gcccgcgctc gactaaccca gatgccgctg gatctggcct agaggccgtg gccaccacgg    1380 
cccggcctgc ctttcaggct gcattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc    1440 
ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaaaga gtttgtagaa acgcaaaaag    1500 
gccatccgtc aggatggcct tctgcttaat ttgatgcctg gcagtttatg gcgggcgtcc    1560 
tgcccgccac cctccgggcc gttgcttcgc aacgttcaaa tccgctcccg gcggatttgt    1620 
cctactcagg agagcgttca ccgacaaaca acagataaaa cgaaaggccc agtctttcga    1680 
ctgagccttt cgttttattt gatgcctggc agttccctac tctcgcatgg ggagacccca    1740 
cactaccatc ggcgctacgg cgtttcactt ctgagttcgg catggggtca ggtgggacca    1800 
ccgcgctact gccgccaggc aaattctgtt ttatcagacc gcttctgcgt tctgatttaa    1860 
tctgtatcag gctgaaaatc ttctctcatc cgccaaaaca gaagcttggc tgcaggtcga    1920 
caagcgctga atgggtatcg gcactagagt ttaacttggc taggctaatt ggtatggtca    1980 
tttttatttt gtcctgaatt acctagaatg acttgaagtt ttaatcttca cttttcctcg    2040 
tagagcacat agtcttcttt cgtagccccg caatccggac agcaccagtc atcaggaata    2100 
tcctcaaagc gagtacctgg agtaaaaccc tcggcctcat cgcccaacgc ctcatcatat    2160 
atatggccac aagtaataca tatccacttc aagtatgctt tcccgccttg ggcatcagac    2220 
cttggaggtt gagttttata tagatcttgg cctttaacgt cggcactagg caatttctct    2280 
aagcttgtcg gcgcaaccac tgcttcagca gttaaacttg tgccactaac ctcggataaa    2340 
tttggcgaag tatgggttga ggtgacgccc ttttcaccta cgccgctctc aattaacatg    2400 
aagtcaagct tgtctcgaac ggcgcaatcg gggcagcacc aatcctcagg aataaggtgc    2460 
caaggcgtac ctggagaaaa cccctcatgc acattacccg cactctcatc ataaacataa    2520 
ttacaatccg ggcatttata gctagccata ctcatcacca tgtcaaattg ttattttgcg    2580 
ttgcggcaaa tttgcgttat ttatttctca tcttcttcct tgtggaagat tttcttacaa    2640 
cctgtggggt gctcgcctga tcaagaactt cagtcttagc cgcacagccc tcatttttat    2700 
tttcttgatt aagtgggatc actaattctg cggccaaaac tgccattcca gttggagtag    2760 
catctgaaat accactttcc gagttggcaa gctgactatt cacccctagc tgtgtttctt    2820 
tcgagggaga atccgcgaga aagataaagt ccaccttgtc tcgaactgcg cagtccgggc    2880 
atgcccaatc tttggggata tcattccagc tggtgttcgg gtggaaacct tcgtgcggct    2940 
cccccttatt ttcatcatag atatactgac aatctggaca ctggtacctt gacattctcc    3000 
cactctccta ttaactcagc gttagtcgct gctccgacaa cttcatcaga gtgtaactat    3060 
cggagcaggt cgccttcaaa gcaattacag agaggcaatc aaccctcagc actttagcga    3120 
agtgcactct ttgtgagagc tttcaacgcc gcacataaaa ttgaagcact tattgtaaat    3180 
atcgaccgcc gggctctgcg tgctcacata actacgatgc taccgcagag gtactcgaac    3240 
tatgaccagc actactagtg ccaaattttt tcaaataggt ttctcgcatc gaatcatcaa    3300 
tttggatctt attaaggtca ccaccagccc aatctactac cttgggatcc ataactgatc    3360 
taaaccactg aggaatcatc gccatcaaaa atgcaccagg gtaacccgtc ggaagagccg    3420 
gcaggccggg aaaatcccga agtgactgat aagaacgtgt tggatgcgcg tggtgatccg    3480 
agtgccgctg aaggtggaac agcactagat tagagacgat gtgattacta ttccaagaat    3540 
ggtgcggctt ttgatgctca tatcgaccgt cctccatttt ttgacggagc aagccgtaat    3600 
gttcaatata gttcgcactg gtcagctgcc accaaccgaa agccatttga atcggcagga    3660 
acaccagcat cttaggtcca aacaaggcaa ggagaacggc gtaaagaata actgtgatga    3720 
tcattggttg gaggatttca ttatcgaaac tccaaacgct ttggccacgg cgcgaaaggc    3780 
gttgttcctc aagcccccaa gcacgaataa atgctcctgg gatctcacgg attgaaaact    3840 
tataaatgct ttctcccatc cgggatgttg caggatccat cggtgtagcg acatcacggt    3900 
gatgaccctt attatgctca ataaagaagt gaccgtaccc tacgacagcc aacacaattt    3960 
tggccatcca acgatcaaaa gtctccttct tgtgaccgag ttcgtgtcct gtattgagcg    4020 
ctagtccgtt cacgataccc agtgacaagg caagcgcacc aatttcaagc caagacattg    4080 
gctgagttcc gacccaccat gctgacacaa ttaatgcagc gtaatgcata ggaactgtta    4140 
gatatgtcaa aactcgatag taccgctcct tctctagttt cggcaccact tcttcaggcg    4200 
gattattaaa gtcctcacca aacatcgcat caagcaatgg aagtgcgccg taccatacga    4260 
gcaataccag cccataaaaa atcccccaac cagtttcatt tgcaagccag attccgatca    4320 
tcggagtagc cggccacaaa gttgatagta tccagagata tttcttttta tctacgtact    4380 
ctggagcgga atccagaact ctgtgtttct caagcatatg gaattctcca atttttatta    4440 
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cttcagacct tccctagtaa atattttgca ccaccgatca tgccgactac acttaagtgt    4800 
agttttaata tttaacaccg taacctatgg tgaaaatttc cagtcagctg gcgcgagaat    4860 
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gttgctcttg cgttcgagtg gctacgccac agaacagccg gacgtcctgc agtgtggctt    5100 
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gaaactttcg aaatggtaaa attcagccgt gtgagagagg gtgtgagcaa gcctgcgctc    5220 
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gtttgtttgg ataatattaa tcatgactta gacttgccgt tgttgcacgc acttatggag    5340 
tttatgttaa atacaccaaa aaatatcagg tttgcagttg caggcaatac aataaaaggg    5400 
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cctgctaaaa gatcctacct gcttaagcgt gcagctttct ggcattggcg tagaggtgaa    5940 
taccagtatg caatacgaat atccctacgg gcgaatgact gtcgctgggc agtcagcatg    6000 
tctgagagaa taattttaga tttgtcattt cgtcagggcg aaatagatgc gctgagacag    6060 
tggctgttag agctgccgaa gcaggcctgg caccaaaaac ccatagtgct tattagttac    6120 
gcgtgggtat tgtatttcag tcagcaaggc gcgcgagcag agaagttaat taaagaccta    6180 
tcttcacaat ccgataaaaa aaataaatgg caagaaaagg aatggctgca gcttgtgctt    6240 
gcaataggta aagcaaccaa agatgaaatg ctttcgagtg aggagctctg taataagtgg    6300 
attagtttat ttggggattc aaacgcagtt ggaaaagggg ccgcgctaac ctgtttggct    6360 
tttatttttg ccagtgagta tagatttgca gagttggaga aggtgctggc tcaggcccaa    6420 
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gagcttgagt tacattatga attgcgctgc ttggacacct cagaagaaaa gctctccaaa    6660 
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gcagtggaga tagcaaaaca gcttcaatgc tttcaaacag ttcttgatga agtatgttta    7200 
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attggggctt ttagtcttcc gcgaatagtt gagattggaa agtccgcaga gaataaagct    7320 
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caaggaatta tctaaaataa tcggcattaa gtgatatagt gaaaagtata ccggagagag    7560 
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atgcgtactt gaaagtggag aagaaattca ggcggatctg attgtagttg gaatcggtgc    8280 
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tagaaatcct ttttggggaa cgatggtacg tttagagaca attcataatg cggttacaca    8460 
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gttctggtct gatcttaaag ggatggcgct gcaaggactt ggtgctctaa aggactacga    8580 
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ggcccaggct gttatgtggc gcttgggcgg ggaagtattg ccatatttgg tgatgaccgt    8880 
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tttggcaaaa tcctgtatat cgtgcgaaaa aggatggata taccgaaaaa atcgctataa    9420 
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tcgtggccag ccacgatagc cgcgctgcct cgtcctgcag ttcattcagg gcaccggaca    11280 
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cttgatcaga tcttgatccc ctgcgccatc agatccttgg cggcaagaaa gccatccagt    11520 
ttactttgca gggcttccc 
11539 
<210>32 
<211>35 
<212>DNA 
<213>人工 
<220> 
<223>引物 
<400>32 
aagggaattc catatgcttg agaaacacag agttc                        35 
<210>33 
<211>35 
<212>DNA 
<213>人工 
<220> 
<223>引物 
<400>33 
aaaattcgcg tcgacaagcg ctgaatgggt atcgg                        35 
<210>34 
<211>20 
<212>DNA 
<213>人工 
<220> 
<223>引物 
<400>34 
tgagacagtg gctgttagag 
20 
<210>35 
<211>35 
<212>DNA 
<213>人工 
<220> 
<223>引物 
<400>35 
taataaccgc tcgagaacgc ttaccgccaa cacag                 35 
<210>36 
<211>47 
<212>DNA 
<213>人工 
<220> 
<223>引物 
<400>36 
gccggcgaga acctgtactt tcagatggca agtaagtatg ccacttg    47 
<210>37 
<211>28 
<212>DNA 
<213>人工 
<220> 
<223>引物 
<400>37 
ggatcctcac ttcttgtgct gagccttg 
28 
<210>38 
<211>446 
<212>PRT 
<213>拟南芥 
<400>38 
Met Val Val Ile Asn Ser Leu Arg Arg Leu Ala Arg Thr Thr Gln Val 
1                5                    10                   15 
His Leu His Ser Lys Tyr Ala Thr Cys Met Ser Gly Asn Ser Thr Ser 
             20                   25                   30 
Arg Arg Ile Phe Thr Thr Glu Ala Ala Pro Glu Lys Gly Asn Glu Pro 
         35                  40                   45 
Arg Leu Val Ser Ala Ala Val Glu Gln Leu Asn Thr Leu Pro Phe Tyr 
    50                   55                   60 
His Ser Phe Trp Asn Arg Thr Thr Lys Pro Ser Leu Asp Leu Ala Lys 
65                   70                   75                   80 
Val Leu Leu Glu Met Phe Thr Ala Asn Lys Met Ala Lys Ala Phe Phe 
                 85                   90                   95 
Thr Ser Gly Gly Ser Asp Ala Asn Asp Thr Gln Val Lys Leu Val Trp 
            100                   105                 110 
Tyr Tyr Asn Asn Ala Leu Gly Arg Pro Glu Lys Lys Lys Phe Ile Ala 
        115                  120                  125 
Arg Lys Lys Ser Tyr His Gly Ser Thr Leu Ile Ser Ala Ser Leu Ser 
    130                  135                  140 
Gly Leu Pro Pro Leu His Gln Asn Phe Asp Leu Pro Ala Pro Phe Val 
145                  150                  155                  160 
Leu His Thr Asp Cys Pro His Tyr Trp Arg Phe His Leu Pro Gly Glu 
                 165                  170                  175 
Thr Glu Glu Glu Phe Ser Thr Arg Leu Ala Lys Asn Leu Glu Asp Leu 
             180                 185                  190 
Ile Ile Lys Glu Gly Pro Glu Thr Ile Gly Ala Phe Ile Ala Glu Pro 
        195                  200                  205 
Val Met Gly Ala Gly Gly Val Ile Pro Pro Pro Ala Thr Tyr Phe Glu 
    210                  215                  220 
Lys Val Gln Ala Val Val Lys Lys Tyr Asp Ile Leu Phe Ile Ala Asp 
225                  230                  235                  240 
Glu Val Ile Cys Ala Phe Gly Arg Leu Gly Thr Met Phe Gly Cys Asp 
                 245                  250                  255 
Lys Tyr Asn Ile Lys Pro Asp Leu Val Thr Leu Ala Lys Ala Leu Ser 
            260                   265                 270 
Ser Ala Tyr Met Pro Ile Gly Ala Ile Leu Met Ser Gln Glu Val Ala 
         275                 280                  285 
Asp Val Ile Asn Ser His Ser Ser Lys Leu Gly Val Phe Ser His Gly 
    290                  295                  300 
Phe Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Ser Cys Ala Val Ala Ile Glu Ala 
305                  310                  315                  320 
Leu Lys Ile Tyr Lys Glu Arg Asn Ile Pro Glu Tyr Val Ala Lys Val 
                 325                  330                  335 
Ala Pro Arg Phe Gln Asp Gly Val Lys Ala Phe Ala Ser Gly Ser Pro 
             340                  345                  350 
Ile Ile Gly Glu Thr Arg Gly Thr Gly Leu Ile Leu Gly Thr Glu Phe 
        355                  360                   365 
Val Asp Asn Lys Ser Pro Asn Glu Pro Phe Pro Pro Glu Trp Gly Val 
    370                  375                  380 
Gly Ala Phe Phe Gly Ala Glu Cys Gln Lys His Gly Met Leu Val Arg 
385                  390                  395                  400 
Val Ala Gly Asp Gly Ile Leu Met Ser Pro Pro Leu Ile Ile Ser Pro 
                 405                  410                  415 
Glu Glu Ile Asp Glu Leu Ile Ser Ile Tyr Gly Lys Ala Leu Lys Ala 
            420                  425                  430 
Thr Glu Glu Lys Val Lys Glu Leu Lys Ala Gln His Lys Lys 
        435                  440                  445 
<210>39 
<211>1515 
<212>DNA 
<213>拟南芥 
<400>39 
atggtcgtta tcaacagtct ccgacgcttg gcgcgtacca ctcaggttca tttgcacagt   60 
aagtatgcca cttgcatgtc tgggaactcc acttccagga ggattttcac tactgaggca  120 
gcacctgaga agaaaaacac tgttgggtct aaagggcatg atatgcttgc accttttact  180 
gctggatggc agagtgctga tttagatccc ttggtcattg caaagtctga gggaagttat  240 
gtgtatgatg atactgggaa aaaatatctt gactctctcg ctggtttatg gtgtactgcc  300 
ttaggaggaa atgagccaag gcttgtttct gccgctgttg aacagttgaa caccttgccg  360 
ttttatcact ccttttggaa ccgtactact aaaccttctc tggatcttgc taaggttctt  420 
ttagagatgt tcacggccaa caaaatggcc aaagcatttt ttacaagcgg tggatcagat  480 
gccaacgata cccaggtcaa gctggtttgg tattacaata acgcacttgg aaggcccgag     540 
aagaaaaagt ttatcgcgag aaagaaatcg taccatggct ccactctaat atcagcaagt     600 
ttgtccggcc ttcccccgct acaccaaaat tttgatttac ctgcaccatt tgtgttgcac     660 
acagattgcc ctcattattg gcgttttcat cttccaggcg aaacggaaga ggagttctca     720 
accagattag ccaagaattt agaggatcta atcatcaaag aaggaccaga aactattggt     780 
gcttttatag ctgaaccagt catgggtgct gggggtgtga tacctccacc tgctacctac     840 
tttgaaaagg ttcaagctgt tgttaagaaa tatgatatct tgttcattgc tgatgaggtg     900 
atatgtgcat ttggaaggct cgggacaatg tttggctgtg acaaatacaa cattaagcca     960 
gatcttgtga ccttagctaa ggcactgtct tcagcatata tgccgattgg agccattctt    1020 
atgagccaag aagtggcaga tgtcataaat tctcatagca gcaagctagg cgttttctcc    1080 
catggattta cttattctgg tcatccagtt tcgtgtgctg tagcaattga agcgttaaag    1140 
atatacaagg agaggaacat accagagtat gtcgccaaag ttgccccaag gtttcaagat    1200 
ggagttaaag cgtttgcctc tggtagtcct attattggag agacaagagg aacaggtttg    1260 
attcttggga ctgagtttgt agacaataaa tctccgaacg aaccatttcc accagaatgg    1320 
ggtgttggcg cattctttgg agccgagtgc cagaagcacg ggatgttagt ccgtgttgca    1380 
ggtgatggca ttttgatgtc tccaccgctc attatctcac ctgaagagat tgatgagttg    1440 
atttctatct atgggaaagc attgaaggca acggaagaga aggtaaaaga actcaaggct    1500 
cagcacaaga agtga 
1515 
<210>40 
<211>1362 
<212>DNA 
<213>假单胞菌属 
<400>40 
atgagcgtca acaacccgca aacccgtgaa tggcaaaccc tgagcgggga gcaccatctc   60 
gcacctttca gtgactacaa gcagctgaag gagaaggggc cgcgcatcat caccaaggcc  120 
cagggggtgc atttgtggga cagcgagggg cacaagatcc tcgacggcat ggcgggcctg  180 
tggtgcgtgg cggtgggtta cggccgtgaa gagctggttc aggcagcaga aaagcagatg  240 
cgcgagctgc cgtactacaa cctgttcttc cagacggccc acccgcctgc actggaactg  300 
gccaaggcca ttaccgatgt ggcgcccgag ggcatgaccc atgtgttctt caccggctcc  360 
ggctccgaag gcaacgacac cgtgctgcgc atggtgcgcc actactgggc gttgaagggc  420 
aagccgcaca agcagaccat catcggccgt atcaacggct accacggctc caccttcgcc  480 
ggtgcttgcc tgggcggcat gagcggcatg cacgagcagg gcggcctgcc gatcccgggc  540 
atcgtgcaca tcccgcagcc gtactggttc ggcgaaggcg gtgacatgac cccggatgcg  600 
ttcggtatct gggcggccga acagctggag aagaaaatcc tcgaagtcgg cgaagacaac  660 
gtcgccgcct tcatcgccga gcctatccag ggcgcaggcg gcgtgatcat cccgccggaa  720 
acctactggc cgaaggtgaa ggagattctc gccaagtacg acatcctgtt cgttgccgac  780 
gaagtcatct gtggtttcgg ccgtaccggc gagtggttcg gctctgatta ctacgacctc   840 
aagcccgacc tgatgaccat cgccaagggc ctgacctccg gttacatccc catgggcggt   900 
gtgatcgtgc gtgacaaagt ggccaaggtg atcagcgaag gcggtgactt caaccacggc   960 
ttcacctatt cgggccaccc ggtagcggcg gcggtgggcc tggaaaacct gcgcatcctg  1020 
cgcgacgagc aaattgtcga gaaggcgcgt actgaagcgg caccgtattt gcaaaagcgt  1080 
ttgcgtgagc tgcaggacca cccgctggtg ggtgaagtgc gcggccttgg catgcttggc  1140 
gcgatcgagc tggtgaaaga caaggccacc cgcagccgtt acgagggcaa gggcgtgggc  1200 
atgatctgcc gcaccttctg cttcgaaaac ggcctgatca tgcgtgcggt gggtgacacc  1260 
atgatcatcg cgccgccgct ggtcatcagc catgcggaaa tcgacgaact ggtggaaaag  1320 
gcacgcaaat gcctcgacct gacccttgag gcgattcgat aa    1362 
<210>41 
<211>1359 
<212>DNA 
<213>假单胞菌属 
<400>41 
atgagcgatt cgcaaaccct gcactggcaa gcgctgagcc gcgaccatca tctgccgccg    60 
ttcaccgatt acaaggcgct gaacgccaaa ggcacgcgca tcatcaccaa ggcgtcaggc   120 
gtctacctgt gggacagcga aggccacaag atcctcgacg ccatggccgg gctctggtgc   180 
gtcaacctgg gctatggccg cgaggagctg gtcgaggccg cgaccaggca gatgcgcgag   240 
ctgccgtact acaacctgtt cttccagacc gcccacccgc cggccgtggc gctggccaag    300 
gcgattgccg acatcgcgcc ggccgggatg aaccatgtgt tcttcaccgg ctccggctcg    360 
gaggccaacg acaccgtgct gcgcatggtg cgccattact gggcgatcaa gggccagccg    420 
gcgaagaagg tggtcatcgg ccgctggaat ggctatcacg gctcgaccat cgctggcgca    480 
agcctcggtg gcatgaaggc catgcacgag cagggcgacg gcccgatccc cggcatcgag    540 
catatcgacc agccctactg gttcggcgag ggtggcgaca tgagcccgga agagttcggc    600 
gtgcgcatcg ccgaccagct ggagcagaag atccttgagg tcggcgagga caaggtcgcc    660 
gccttcatcg ccgaacctat ccagggcgcc ggcggcgtga tcatcccgcc cgagagctac    720 
tggccgcggg tcaaggaaat cctcgcgcgc tacgacattc tcttcatcgc cgacgaggtc    780 
atctgcggct tcggccgtac cggtgagtgg ttcggcagcg actactacgg cctcgagccg    840 
gacctgatgc cgatcgccaa gggcctgacc tctggctaca tccccatggg cggcgtagtg    900 
gtgcgcgacg aagtggtgca cacgctcaac gagggcggcg agttctacca cggcttcacc    960 
tactcggggc accccgtggc cgccgcggtg gcgctggaga acatccgcat cctgcgcgag   1020 
gagaagatcg tcgagcgggt gaagacgaag acggcaccct atttgcagtc ccgttggcag   1080 
gaactgctcg agcatccgct ggtaggcgag gcgcgcggcg tcggcctgct tggtgcgctg   1140 
gagttggtga agaacaagaa gacccgcgaa cgctttgccg atcccggtgt gggcatgctc   1200 
tgtcgcgagc actgcttccg caacggcctg gtgatgcgtg cggttggcga caccatgatc   1260 
atttcgccgc cgctggtgat cagcgaagag cagatcgacg agctggttgg caaggtgcgg  1320 
ttgtgcctcg acgccacggc caaggatgtg ctgggctga                         1359 
<210>42 
<211>1380 
<212>DNA 
<213>人工 
<220> 
<223>在大肠杆菌中用于表达的密码子优化基因 
<400>42 
atgcagaaac agcgtaccac ctctcagtgg cgtgaactgg atgcggcgca tcatctgcat    60 
ccgtttaccg ataccgcgag cctgaatcag gcgggtgcgc gtgtgatgac ccgtggcgaa   120 
ggcgtgtatc tgtgggatag cgaaggcaac aaaattattg atggcatggc gggcctgtgg   180 
tgcgtgaacg tgggctatgg ccgtaaagat tttgcggaag cggcgcgtcg tcagatggaa   240 
gaactgccgt tttataacac cttctttaaa accacccatc cggcggtggt ggaactgagc   300 
agcctgctgg ccgaagttac cccggcaggt tttgatcgtg tgttttatac caacagcggc   360 
agcgaaagcg tggataccat gattcgtatg gtgcgtcgtt attgggatgt gcagggcaaa   420 
ccggaaaaaa aaaccctgat tggccgttgg aacggctatc acggcagcac cattggcggt   480 
gcgagcctgg gcggcatgaa atatatgcat gaacagggcg atctgccgat tccgggcatg   540 
gcgcatattg aacagccgtg gtggtataaa catggcaaag atatgacccc ggatgaattt   600 
ggcgtggttg cggcgcgttg gctggaagaa aaaattctgg aaatcggcgc ggataaagtg   660 
gcggcgtttg tgggcgaacc gattcagggt gcgggcggtg tgattgttcc gccggcaacc   720 
tattggccgg aaattgaacg tatttgccgc aaatatgatg tgctgctggt tgcggatgaa   780 
gtgatttgcg gctttggccg taccggcgaa tggtttggcc atcagcattt tggctttcag   840 
ccggacctgt ttaccgcggc gaaaggcctg agcagcggct atctgccgat tggcgcggtg   900 
tttgtgggca aacgtgttgc ggaaggtctg attgcgggcg gtgattttaa ccatggcttt   960 
acctatagcg gccatccggt gtgtgcggcg gtggcgcatg cgaatgttgc ggcgctgcgt  1020 
gatgaaggca ttgtgcagcg tgtgaaagat gatattggcc cgtatatgca gaaacgttgg  1080 
cgtgaaacct ttagccgttt tgaacatgtg gatgatgtgc gtggcgtggg catggtgcag  1140 
gcgtttaccc tggtgaaaaa caaagcgaaa cgtgaactgt ttccggattt tggcgaaatt  1200 
ggcaccctgt gccgcgatat tttttttcgc aacaacctga ttatgcgtgc gtgcggcgat  1260 
cacattgtgt ctgcaccgcc gctggttatg acccgtgcgg aagtggatga aatgctggcc  1320 
gtggcggaac gttgcctgga agaatttgaa cagaccctga aagcgcgtgg cctggcctaa  1380 
<210>43 
<211>5143 
<212>DNA 
<213>人工 
<220> 
<223>载体 
<400>43 
tttaagaagg agatataccc atgacacaga gggcccacca tcaccatcac cattccatgg     60 
cctcctccga ggacgtcatc aaggagttca tgcgcttcaa ggtgcgcatg gagggctccg    120 
tgaacggcca cgagttcgag atcgagggcg agggcgaggg ccgcccctac gagggcaccc    180 
agaccgccaa gctgaaggtg accaagggcg gccccctgcc cttcgcctgg gacatcctgt    240 
cccctcagtt ccagtacggc tccaaggcct acgtgaagca ccccgccgac atccccgact    300 
acttgaagct gtccttcccc gagggcttca agtgggagcg cgtgatgaac ttcgaggacg    360 
gcggcgtggt gaccgtgacc caggactcct ccctgcagga cggcgagttc atctacaagg    420 
tgaagctgcg cggcaccaac ttcccctccg acggccccgt aatgcagaag aagactatgg    480 
gttgggaggc ctccaccgag cggatgtacc ccgaggacgg cgccctgaag ggcgagatca    540 
agatgaggct gaagctgaag gacggcggcc actacgacgc cgaggtcaag accacctaca    600 
tggccaagaa gcccgtgcag ctgcccggcg cctacaagac cgacatcaag ctggacatca    660 
cctcccacaa cgaggactac accatcgtgg aacagtacga gcgcgccgag ggccgccact    720 
ccaccggcgc cggcgagaac ctgtactttc agatggcaag taagtatgcc acttgcatgt    780 
ctgggaactc cacttccagg aggattttca ctactgaggc agcacctgag aagaaaaaca    840 
ctgttgggtc taaagggcat gatatgcttg caccttttac tgctggatgg cagagtgctg    900 
atttagatcc cttggtcatt gcaaagtctg agggaagtta tgtgtatgat gatactggga    960 
aaaaatatct tgactctctc gctggtttat ggtgtactgc cttaggagga aatgagccaa   1020 
ggcttgtttc tgccgctgtt gaacagttga acaccttgcc gttttatcac tccttttgga   1080 
accgtactac taaaccttct ctggatcttg ctaaggttct tttagagatg ttcacggcca    1140 
acaaaatggc caaagcattt tttacaagcg gtggatcaga tgccaacgat acccaggtca    1200 
agctggtttg gtattacaat aacgcacttg gaaggcccga gaagaaaaag tttatcgcga    1260 
gaaagaaatc gtaccatggc tccactctaa tatcagcaag tttgtccggc cttcccccgc    1320 
tacaccaaaa ttttgattta cctgcaccat ttgtgttgca cacagattgc cctcattatt    1380 
ggcgttttca tcttccaggc gaaacggaag aggagttctc aaccagatta gccaagaatt    1440 
tagaggatct aatcatcaaa gaaggaccag aaactattgg tgcttttata gctgaaccag    1500 
tcatgggtgc tgggggtgtg atacctccac ctgctaccta ctttgaaaag gttcaagctg    1560 
ttgttaagaa atatgatatc ttgttcattg ctgatgaggt gatatgtgca tttggaaggc    1620 
tcgggacaat gtttggctgt gacaaataca acattaagcc agatcttgtg accttagcta    1680 
aggcactgtc ttcagcatat atgccgattg gagccattct tatgagccaa gaagtggcag    1740 
atgtcataaa ttctcatagc agcaagctag gcgttttctc ccatggattt acttattctg    1800 
gtcatccagt ttcgtgtgct gtagcaattg aagcgttaaa gatatacaag gagaggaaca    1860 
taccagagta tgtcgccaaa gttgccccaa ggtttcaaga tggagttaaa gcgtttgcct    1920 
ctggtagtcc tattattgga gagacaagag gaacaggttt gattcttggg actgagtttg    1980 
tagacaataa atctccgaac gaaccatttc caccagaatg gggtgttggc gcattctttg    2040 
gagccgagtg ccagaagcac gggatgttag tccgtgttgc aggtgatggc attttgatgt    2100 
ctccaccgct cattatctca cctgaagaga ttgatgagtt gatttctatc tatgggaaag    2160 
cattgaaggc aacggaagag aaggtaaaag aactcaaggc tcagcacaag aagtgaggat    2220 
ccggctgcta acaaagcccg aaaggaagct gagttggctg ctgccaccgc tgagcaataa    2280 
ctagcataac cccttggggc ctctaaacgg gtcttgaggg gttttttgct gaaaggagga    2340 
actatatccg gccggatatc cacaggacgg gtgtggtcgc catgatcgcg tagtcgatag    2400 
tggctccaag tagcgaagcg agcaggactg ggcggcggcc aaagcggtcg gacagtgctc    2460 
cgagaacggg tgcgcataga aattgcatca acgcatatag cgctagcagc acgccatagt    2520 
gactggcgat gctgtcggaa tggacgatat cccgcaagag gcccggcagt accggcataa    2580 
ccaagcctat gcctacagca tccagggtga cggtgccgag gatgacgatg agcgcattgt    2640 
tagatttcat acacggtgcc tgactgcgtt agcaatttaa ctgtgataaa ctaccgcatt    2700 
aaagcttatc gatgataagc tgtcaaacat gagaattctt gaagacgaaa gggcctcgtg    2760 
atacgcctat ttttataggt taatgtcatg catgagacaa taaccctgat aaatgcttca    2820 
ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt    2880 
ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga    2940 
tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa    3000 
gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct    3060 
gctatgtggc gcggtattat cccgtgttga cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat    3120 
acactattct cagaatgact tggttgacgc gtcaccagtc acagaaaagc atcttacgga    3180 
tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata acactgcggc    3240 
caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat    3300 
gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa    3360 
cgacgagcgt gacaccacga tgcctgcagc aatggcaaca acgttgcgca aactattaac    3420 
tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg aggcggataa    3480 
agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg ctgataaatc    3540 
tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag atggtaagcc    3600 
ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag    3660 
acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag accaagttta    3720 
ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa    3780 
gatccttttt gataatctca tgcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact    3840 
gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg    3900 
taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc    3960 
aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata    4020 
ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta    4080 
catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc    4140 
ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg    4200 
ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac    4260 
agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg    4320 
taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt    4380 
atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct    4440 
cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg    4500 
ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata    4560 
accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca    4620 
gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc    4680 
tgtgcggtat ttcacaccgc atatatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc    4740 
atagttaagc cagtatacac tccgctatcg ctacgtgact gggtcatggc tgcgccccga    4800 
cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac    4860 
agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg    4920 
aaacgcgcga ggcagctggc acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa    4980 
cgcaattaat gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc    5040 
ggctcgtatg ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga    5100 
ccatgattac gccaagctct agctagaaat aattttgttt aac                      5143 
<210>44 
<211>36 
<212>DNA 
<213>人工 
<220> 
<223>引物 
<400>44 
ggaattccat atgagcgtca acaacccgca aacccg                    36 
<210>45 
<211>37 
<212>DNA 
<213>人工 
<220> 
<223>引物 
<400>45 
ccgctcgagt tatcgaatcg cctcaagggt caggtcc                   37 
<210>46 
<211>38 
<212>DNA 
<213>人工 
<220> 
<223>引物 
<400>46 
ggaattccat atgagcgatt cgcaaaccct gcactggc                  38 
<210>47 
<211>35 
<212>DNA 
<213>人工 
<220> 
<223>引物 
<400>47 
cgcggatcct cagcccagca catccttggc tgtcg    35 

Claims (1)

1.一种微生物，该微生物相对于其野生型以如下方式进行基因工程修饰：使得其能够比其野生型由羧酸或羧酸酯生产更多的ω-氨基羧酸、更多的ω-氨基羧酸酯或者更多的从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺，
其中，该微生物与其野生型相比具有下列酶EI和酶EIII或者酶EI，酶 EII和酶EIII的增强活性：
i)         酶 EI，其将羧酸或者羧酸酯催化转换成相应的ω-羟基羧酸或者ω-羟基羧酸酯，该酶 EI 选自下列烷烃单加氧酶：alkBGT 编码的来自恶臭假单胞菌GPo1的烷烃单加氧酶和源于热带假丝酵母的细胞色素-P450-单加氧酶；
ii)        酶 EII，其将ω-羟基羧酸或者ω-羟基羧酸酯催化转换成相应的ω-氧代羧酸或者ω-氧代羧酸酯，该酶 EII 选自alkJ 基因编码的醇脱氢酶； 
iii)      酶 EIII，其将ω-氧代羧酸或者ω-氧代羧酸酯催化转换成相应的ω-氨基羧酸或者ω-氨基羧酸酯，该酶 EIII 选自ω-转氨酶。
2. 根据权利要求 1 所述的微生物，该微生物具有所有酶 EI、EII 和 EIII 的增强活性。
3. 根据权利要求 1～2 中任一项所述的微生物，其中酶 EI 是经过 alkBGT 编码的来自恶臭假单胞菌 GPo1 的烷烃单加氧酶。
4. 根据权利要求 1～3 中任一项所述的微生物，其中酶EII经来自恶臭假单胞菌 GPo1 的 alkJ 基因编码。
5. 根据权利要求1～4 中任一项所述的微生物，其中酶 EIII 是来自紫色色杆菌 DSM30191 的ω-转氨酶 CV2025。
6. 根据上述权利要求中任一项所述的微生物，在微生物中增强了酶 EIV 的表达，该酶将ω-氨基羧酸酯催化转化成相应的ω-氨基羧酸。
7. 根据权利要求 6 所述的微生物，其中酶 EIV 是来自荧光假单胞菌的脂肪酶 LipA（Q76D26），所述脂肪酶 LipA（Q76D26）是由所述微生物分泌的。
8. 根据上述权利要求中任一项所述的微生物，在微生物中增强了酶 EV 的表达，该酶将ω-氨基羧酸催化转化成相应的内酰胺。
9. 根据权利要求 8 所述的微生物，其中酶 EV是由所述微生物分泌的。
10. 根据上述权利要求中任一项所述的微生物，该微生物是转基因大肠杆菌微生物、转基因谷氨酸棒状杆菌微生物或者转基因恶臭假单胞菌微生物。
11. 一种转基因微生物的制备方法，包括在微生物中增强下列酶EI和酶EIII或者酶EI，酶 EII和酶EIII的活性的方法步骤：
i) 酶 EI，其将羧酸或者羧酸酯催化转换成相应的ω-羟基羧酸或者ω-羟基羧酸酯，该酶 EI 选自下列烷烃单加氧酶：alkBGT 编码的来自恶臭假单胞菌GPo1的烷烃单加氧酶和源于热带假丝酵母的细胞色素-P450-单加氧酶；
ii) 酶 EII，其将ω-羟基羧酸或者ω-羟基羧酸酯催化转换成相应的ω-氧代羧酸或者ω-氧代羧酸酯，该酶 EII 选自alkJ 基因编码的醇脱氢酶； 
iv) 酶 EIII，其将ω-氧代羧酸或者ω-氧代羧酸酯催化转换成相应的ω-氨基羧酸或者ω-氨基羧酸酯，该酶 EIII 选自ω-转氨酶。
12. 根据权利要求 11 所述的方法，除了增强酶 EI、EII 或 EIII 的活性之外，也增强酶 EIV 的活性，该酶EIV将ω-氨基羧酸酯催化转化成相应的ω-氨基羧酸；和/或增强酶 EV 的活性，该酶EV将ω-氨基羧酸催化转化成相应的内酰胺，这通过增强这些酶的表达来增强，和酶 EIV 和/或者 EV是由所述微生物分泌的。
13. 一种可通过权利要求 11 或 12 获得的转基因微生物。
14. 一种用于制备ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺的方法，包括下列方法步骤：
I)      在使得微生物能够从羧酸或者从羧酸酯形成ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺的条件下，使权利要求1至 10 或 13之一的微生物与含有羧酸或者羧酸酯的培养基接触，或者与邻接含有羧酸或羧酸酯的有机相的培养基接触；
II)     视需要分离出所形成的ω-氨基羧酸、所形成的ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺。
15. 根据权利要求 14 所述的方法，在额外的方法步骤中使用常规化学方法将方法步骤 I）中形成的ω-氨基羧酸酯转化成ω-氨基羧酸。
16. 根据权利要求 14 或 15 所述的方法，所述微生物是转基因大肠杆菌微生物、转基因谷氨酸棒状杆菌微生物或者转基因恶臭假单胞菌微生物。
17. 根据权利要求 14～16 中任一项所述的方法，在方法步骤 I）中使用的培养基含有氨基酸，这些氨基酸在通过转氨酶将ω-氧代羧酸或者ω-氧代羧酸酯催化转化成相应ω-氨基羧酸或ω-氨基羧酸酯的过程中起到氨基供体的作用。
18. 根据权利要求 14～17 中任一项所述的方法，所述方法在两相系统中进行，包括
A)     水相，以及
B)     有机相，
在方法步骤 I）中在水相中通过微生物形成ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺，并在有机相中使得所形成的ω-氨基羧酸、所形成的ω-氨基羧酸酯或者所形成的从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺富集。
19. 根据权利要求 14～18 中任一项所述的方法，通过至少两个步骤的提纯方法来分离所形成的ω-氨基羧酸、所形成的ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺，包括
a)    提取步骤：其中从培养基中提取ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺，以及 
b)    提纯步骤：采用蒸馏法或者其它提取方法，对方法步骤 a）中获得的提取物进行进一步提纯，获得纯度至少为 99.8％ 的ω-氨基羧酸相、ω-氨基羧酸酯相或者内酰胺相。
20. 根据权利要求 19 所述的方法，方法步骤 a) 中的提取是反应萃取。
21. 根据权利要求 14～20 中任一项所述的方法，所述羧酸是月桂酸，或者所述羧酸酯是月桂酸酯，且在方法步骤 II）中将月桂酸或月桂酸酯转化成月桂内酰胺。
22. 一种基于ω-氨基羧酸制备聚酰胺的方法，包括下列方法步骤：
（α1）   通过权利要求 14～21 中任一项所述的方法制备 ω-氨基羧酸，
（α2）   聚合该ω-氨基羧酸而获得聚酰胺。
23.一种基于内酰胺制备聚酰胺的方法，包括下列方法步骤： 
（β1）   通过权利要求 14～21 中任一项所述的方法制备内酰胺； 
（β2）   开环聚合或者缩聚月桂内酰胺而获得聚酰胺。
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