CN101420978B - 通过三官能双特异性抗体破坏表达低至中等水平的肿瘤相关靶抗原的肿瘤细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了三官能双特异性抗体用于制备用来预防和治疗肿瘤疾病的药物组合物的应用。已经发现所述三官能双特异性抗体结合选自下列各项的肿瘤-相关抗原：Her2/neu，CD20，EpCAM，G250，蛋白聚糖，GD3，GD2，MHC II，EGF-R和CEA，其中所述肿瘤相关抗原在只具有低到中等表达水平的所述肿瘤细胞上表达。

Description

通过三官能双特异性抗体破坏表达低至中等水平的肿瘤相关靶抗原的肿瘤细胞
本发明涉及三官能双特异性抗体用于制备预防和治疗肿瘤疾病的药物组合物的应用。
在免疫治疗过程中通过单特异性单克隆抗体治疗肿瘤中的一个迄今尚未解决的问题是对具有低至中等表达水平的肿瘤靶抗原的肿瘤细胞破坏的功效不足性。一个具体的实例是对具有低至中等表达水平的靶抗原Her2/neu的乳腺癌的治疗；另一个具体的实例是对具有低表达水平的CD20肿瘤抗原的非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴白血病的治疗。
转移性乳腺癌是几乎总是致死性的疾病。从转移的第一次表现起的平均存活时间在17到20个月范围内。许多内分泌、细胞毒性和生物学试剂已经表现出减轻的功效，但是不存在一致的护理标准，并且治疗通常引起实质上的副作用。
表皮生长因子(EGF)家族成员Her2/neu在大约25-30％的乳腺癌患者的肿瘤标本中过量表达，并且其归因于更具攻击性的肿瘤生长和更坏的预后。
EGF受体家族包括4个成员：EGFR(ERBB1)，Her2/neu(ERBB2)，ERBB3和ERBB4。EGFR和Her2/neu已被作为治疗靶点进行集中研究。靶向EGFR和Her2/neu的其余的细胞结构域的抗体以及抑制细胞内受体信号传导的小分子化合物已经用于临床应用，并且已经表现出临床功效。然而，它们的抗肿瘤作用通常不如临床前研究预测的那样强，并且优选与化学治疗结合。
是广泛用于乳腺癌治疗的公认的单克隆抗体；然而，
Figure G2007800127778D00012
只可以成功地用于在他们的肿瘤细胞上具有至少2+/FISH+(其通过所谓的
Figure G2007800127778D00013
和阳性FISH-分析验证)或3+的靶抗原Her2/neu表达水平的患者。一些研究已经表明，为了获得统计学显著的存活，具有Her2/neu的额外基因扩增(通过阳性FISH检测反映)的靶抗原Her2/neu的相对高的表达密度是必需的。临床前体外实验还表明
Figure G2007800127778D00021
对肿瘤细胞的有效破坏只在肿瘤细胞表达高水平的靶抗原Her2/neu时是明显的。
这些限制是只有大约25-30％的患有在他们的肿瘤上表达高水平的Her2/neu(用Dako HercepTest得分2+/FISH+或3+)的转移性乳腺癌的患者可以有效地使用
Figure G2007800127778D00022
进行治疗的原因。
在Perez和同事的研究中，使用免疫组织化学(IHC)评估，35％的乳腺癌患者得分为Her21+，14％为2+，和13％为3+(Perez EA等：Her2testingin patients with breast cancer：poor correlation between weak positivity byimmunohistochemistry and gene amplification by fluorescence in situhybridization(在患有乳腺癌的患者中的Her2检测：通过免疫组织化学的弱阳性和通过原位杂交荧光的基因扩增之间的弱相关性).Mayo ClinProc(Mayo临床进展)2002；77：148-154)。
Kiewe，P.等：“Phase I trial of the trifunctional anti-Her2x anti-CD3antibody ertumaxomab in metastatic breast cancer(三官能抗-Her2x抗-CD3抗体ertumaxomab在转移性乳腺癌中的I期试验)”；Journal ofClinical Oncology(临床肿瘤学杂志)，第23卷，编号16S，2005年6月1日(ASCO摘要2205-06-01)描述了靶向Her2/neu和CD3的完整双特异性单克隆抗体的应用。这种抗体用于治疗转移性乳腺癌的I期试验中。为了研究通过这种抗-Her2/neu x抗-CD3抗体引起的任何副作用，和为了加快招募必要数目的17名患者，检测了具有
Figure G2007800127778D00023
得分1+(25％)，2+(12，5％)和3+(62，5％)的患者。在这一初步的结果分析中在15名可评价的患者中有4名观察到抗肿瘤反应。然而，落入
Figure G2007800127778D00024
得分1+内的这些患者没有一名表现出抗肿瘤反应。完全没有给出关于这些反应者的Her2/neu表达状态的信息。另外，在这种I期研究的设计时，只有ertumaxomab消除表达高水平(3+得分)的Her2/neu的细胞系(例如，Sk-Br-3)的实验数据是可用的。
如同在所有典型的I期试验中，Kiewe等的I期试验设计成研究所述三官能抗体ertumaxomab的安全性和耐受性。在这一试验中的次级变量是抗肿瘤活性和不同免疫学参数的测量。为了加快对本研究的患者招募，关于在患者肿瘤细胞上的Her2/neu的表达不加以限制。这是可能的，原因在于本研究的主要目的是安全性和耐受性，而Her2/neu在肿瘤细胞上的表达水平完全不重要。
三官能抗体抗-HER2x抗-CD3ertumaxomnab似乎只在与得分2+和3+一致的过表达Her2/neu的患者中有效的发现完全不令人吃惊，也如同使用如
Figure G2007800127778D00031
的抗体进行的其它研究表现出只对以中等(2+/FISH+)到高水平(3+)表达Her2/neu的患者有效。
例如，Gatzemeier等，Anals of Oncology(肿瘤学分析)15:19-27，2004提供了如曲妥单抗的抗体的确只对在3+或2+/FISH+之内的Her2/neu表达的患者提供临床益处的证据。
类似地，Micromet公司(Micromet，Inc.)于2006年10月2日公布了关于使用adecatumumab的2次II期试验的数据，所述adecatumumab是一种针对乳腺癌和前列腺癌中的表皮细胞黏附分子EpCAM的抗体。只有在他们的肿瘤组织上表达高水平的EpCAM的患者表现出进展时间的显著延长，而具有低EpCAM表达的患者没有表现出显著的受益。强调的是adecatumumab可以为患有高度过量表达的EpCAM的乳腺癌的患者提供治疗选择。对于具有低EpCAM过量表达的患者完全没有发现有效性。
非霍奇金淋巴瘤(NHL)和慢性淋巴白血病(CLL)是最普遍的恶性病之一。在美国NHL是第五最常见的恶性病，年发病率为18-20/100,000个体。直到20世纪90年代中期，NHL的发病率每年增加5-10％1，但是从那时起保持恒定。2CLL是西方国家中最常见的白血病，年发病率为3-4/100,000个体。
除了在使用抗-CD20单克隆抗体利妥昔单抗(特别与化学治疗结合)的B-细胞淋巴瘤治疗中的有希望的结果之外，患者最终复发。9，35因此，存在对于进一步的治疗选择的需求。
目前，除了在正式批准单克隆抗体如利妥昔单抗和alemtuzumab后获得的治疗中的主要改进的事实之外，无痛性NHL和CLL都是不可治愈的疾病。3-6尽管抗体单一治疗尚未高度成功，特别在CLL中，单克隆抗体与标准化学治疗方案的结合显著改善了患者的结果。7，8然而，患者最终复发，9并且新的治疗策略经历令人失望的寻找。许多新药候选诸如完全人源化的抗-CD20抗体或靶向其它抗原(例如，CD19，CD22，CD23，CD80或HLA-DR)的抗体目前正处于集中的研究中。10，11
除了寻找新的靶点，提高抗体治疗的另一途径是开发双特异性抗体。已经开发和检测了许多双特异性形式，例如，在细胞杂交瘤(quadroma)细胞中产生的全长抗体，化学交联的F(ab)2片段，单链抗体，12和双抗体。13已经检测了这些抗体中的一些用于治疗人淋巴瘤。然而，除了有希望的体外功效之外，这些分子仅表现出有限的临床益处。14-16
针对B-细胞-特异性抗原如CD19或CD20的双特异性抗体在最近10-15年内已经处于广泛的研究中，但是迄今为止获得只表现出中等反应的有限的临床数据14，36，37。此外，复杂的和效率低的制备过程使其难以生产充足量的抗体用于临床应用。
双特异性抗体(bsAb)是通过重新定向针对肿瘤细胞的效应细胞而进行例如恶性细胞的免疫学治疗的工具。然而，bsAbs正常仅重新定向和激活单一种类的效应细胞，即，T-细胞，NK-细胞，FcγRI+，或FcαRI+细胞，因此限制了它们的功效。已经描述了所有这些现有技术抗体只在肿瘤-相关抗原以中等至高水平在所述肿瘤细胞表面上表达时有效地治疗肿瘤。
增强抗体的免疫学效应子功能反映了一种提高基于抗体的癌症治疗功效的途径。本作者已经描述了具有提高的效应子功能的三官能双特异性抗体，例如，在Zeidler，等.(18)，Riesenberg等.(22)，Ruf&Lindhofer(20)或Heiss等.(21)的公布中描述，所述三官能双特异性抗体不仅用其两个结合臂识别肿瘤细胞和T淋巴细胞，而且通过它们的Fc区域结合Fcγ-受体阳性佐细胞。然而，这些抗体到目前为止也没有已知有效用于治疗以低水平表达肿瘤-相关抗原如Her2/neu或CD20的肿瘤细胞。
上文关于Her2/neu，EpCAM和CD20解释的限制也对其它肿瘤-相关的抗原如，例如，G250，GD3，GD2，蛋白聚糖，MHC II，EGF-R和CEA有效。
总结而言，到本发明的优先权日期之前可用的所有实验数据只提供了对具有肿瘤抗原的中等至高过量表达的患者显著有益的证据。
因此，存在对于提高这样的抗体的抗肿瘤活性的需求，所述抗体还可以杀死，例如，Her2/neu低表达肿瘤细胞(使用Dako 
Figure G2007800127778D0004114452QIETU
得分例如为1+)或以至多500,000肿瘤-相关抗原/肿瘤细胞的中等水平表达Her2/neu并且使用Dako
Figure G2007800127778D00051
得分为2+但是FISH阴性，或CD20低表达肿瘤细胞，或以某种水平并且在涵盖约1,000-350,000，特别地5,000-150,000肿瘤相关抗原/肿瘤细胞的范围内表达上文详细描述的肿瘤相关抗原中的一种或多种，特别是CD20和EpCAM的这样的肿瘤细胞。
已经发现上述问题由从具有下述特征的三官能双特异性抗体选择的促进不同种类的免疫细胞的协作的抗体而解决：
(a)结合T细胞；
(b)结合在肿瘤细胞上的至少一种肿瘤-相关抗原，所述抗原选自由Her2/neu，CD20，EpCAM，G250，GD3，GD2，蛋白聚糖，MHC II，EGF-R和CEA组成的组；
(c)通过它们的Fc-部分结合Fcγ-受体I型和/或III型阳性细胞；
所述抗体用于制备用来预防和治疗肿瘤疾病的药物组合物，其中在所述肿瘤疾病中，所述肿瘤-相关抗原在所述肿瘤细胞上以下述量表达：
·对于Her2/neu，以约5,000-约150,000肿瘤-相关抗原/肿瘤细胞的量，或
·在检测为FISH阴性的肿瘤细胞中，对于Her2/neu，以约至多500,000肿瘤-相关抗原/肿瘤细胞的量，或
·对于CD20，以约1,000-约350,000肿瘤-相关抗原/肿瘤细胞的量，或
·对于EpCAM，G250，蛋白聚糖，GD2，GD3，MHC II，EGF-R和CEA，以约1,000-约350,000，优选地至多约300,000肿瘤-相关抗原/肿瘤细胞的量。
在本发明的一个实施方案中，所有所述的肿瘤抗原都以约5,000到约150,000肿瘤-相关抗原/肿瘤细胞的量在肿瘤细胞上表达。
本发明还提供关于预防和治疗肿瘤疾病而治疗人或动物的方法，其通过将包含人或动物的肿瘤细胞的机体或含有所述肿瘤细胞的这些机体的部分的与药学有效量的三官能双特异性抗体接触，所述三官能双特异性抗体具有下述特征：
(a)结合T细胞；
(b)结合在肿瘤细胞上的至少一种肿瘤-相关抗原，所述抗原选自由Her2/neu，CD20，EpCAM，G250，GD3，GD2，蛋白聚糖，MHC II，EGF-R和CEA组成的组；
(c)通过它们的Fc-部分结合Fcγ-受体I型和/或III型阳性细胞；其中所述肿瘤-相关抗原在所述肿瘤细胞上以下述量表达：
·对于Her2/neu，以约5,000-约150,000肿瘤-相关抗原/肿瘤细胞的量，或
·在检测为FISH阴性的肿瘤细胞中，对于Her2/neu，以约至多500,000肿瘤-相关抗原/肿瘤细胞的量，或
·对于CD20，以约1,000-约350,000肿瘤-相关抗原/肿瘤细胞的量，或
·对于EpCAM，G250，蛋白聚糖，GD2，GD3，MHC II，EGF-R和CEA，以约1,000-约350,000，优选地至多约300,000肿瘤-相关抗原/肿瘤细胞的量。
所述将所述三官能双特异性抗体与患者的肿瘤细胞接触是通过将所述三官能双特异性抗体以任何可接受的剂型如下文所述口服或者肠胃外施用到人或动物体内而进行。
假定要治疗包括免疫系统细胞的肿瘤疾病如白血病或淋巴瘤，所述接触还可以离体进行。参考见例如US7,018,632或US5,985,276，其通过引用完全结合于此。
将含有自体肿瘤细胞的物质用本文所述的三官能双特异性抗体温育，持续10分钟到10小时期间的短期温育，优选地达到5小时，或还如关于短期温育所述的时间期间的长期温育，以致所述自体肿瘤细胞负载它们的抗体。随后，加入患者的血细胞，优选外周血的单核细胞(PBMC)，然后将这一混合物温育长时间，诸如1到14天。备选地，将所述自体肿瘤细胞直接与所述三官能双特异性抗体和与患者的血细胞，优选外周血单核细胞接触。以这种方式，已经离体实现了针对所述肿瘤的许多免疫细胞的“激活”。后来，将这些细胞重新输注到患者中。长期的温育还导致抗体的内在化和降解。如上述，上文引用的美国专利充分描述了这些方法；然而，专家完全没有提供成功的合理预期，所述成功是指治疗包括关于上述肿瘤-相关抗原具有约5,000到约150,000肿瘤-相关抗原/肿瘤细胞的表达的肿瘤细胞的肿瘤疾病也可以是可行的。所述方法可以以同种异源或自体形式无需另外健康供体PBMCs而实施。显著地，肿瘤细胞，特别是B细胞的耗尽不依赖于用细胞因子(例如，IL-2，GM-SCF)对效应细胞的任何预先或共激活，这是本领域所述的其它双特异性或单特异性抗体的典型的缺点。
本发明的优选实施方案在从属权利要求以及在下述描述和附上的实验数据、附图和表格中描述。
本发明人可以令人吃惊地表明已经在本领域描述过的三官能双特异性抗体可以有效地用于靶向在肿瘤细胞上的特别选择的肿瘤-相关靶抗原，所述肿瘤-相关靶抗原以只是低到中等的水平在所述肿瘤细胞上表达。特别优选的是Her2/neu，EpCAM和CD20肿瘤-相关抗原作为靶抗原。
所述肿瘤-相关抗原以不同水平在肿瘤细胞上表达，其取决于在所述肿瘤细胞上表达的肿瘤-相关抗原的类型，和在Her2/neu情形中所述肿瘤抗原是否得到扩增。
已经发现，在Her2/neu的情形中，如果它们的肿瘤以约5000到约150,000肿瘤-相关抗原/肿瘤细胞的量在肿瘤细胞上表达Her2/neu，那么患者可以成功地用所述三官能双特异性抗体进行治疗。这些患者将依据DAKO
Figure G2007800127778D00071
得分为1+。将1+的上限归类为对应于约100,000或110,000也可是正确的。最重要地，得分必须归类为与“中等表达”相反的“低表达”。
还已经发现表达达到500,000分子的Her2/neu肿瘤-相关抗原/肿瘤细胞并且其依据DAKO
Figure G2007800127778D00072
归类为2+的患者可以成功地进行治疗，即使他们归类为FISH阴性。迄今为止，只有那些患者可以被成功地治疗，所述患者具有依据DAKO
Figure G2007800127778D00073
得分为2+的Her2/neu值，表达达到500,000Her2/neu肿瘤抗原/肿瘤细胞却是FISH阳性的。具有2+的Her2/neu值的FISH阴性患者不能被成功地治疗。
在患有表达CD20的肿瘤的患者中，已经吃惊地发现他们可以被成功地治疗，即使CD20的表达是以约1000到约350,000肿瘤-相关抗原/肿瘤细胞的量。另外，具有以约1000到约350,000肿瘤-相关抗原/肿瘤细胞的量表达EpCAM，G250，蛋白聚糖，GD2，GD3，MHC II，EGF-R和CEA的患者可以成功地用本文所述的三官能双特异性抗体进行治疗。
在Her2/neu的情形中，所述肿瘤-相关抗原在肿瘤细胞上表达，优选地以至少约10,000，约20,000，约50,000或约80,000肿瘤-相关抗原/肿瘤细胞的量，并且优选地以约110,000，约120,000或约130,000肿瘤-相关抗原/肿瘤细胞的最大值进行表达。
对于具有用DAKO
Figure G2007800127778D00081
得分为2+的Her2/neu值(中等表达)的患者，肿瘤-相关抗原在所述肿瘤细胞上的优选的表达是以至多500,000或至多450,000，400,000，350,000，或300,000的量，并且具有约100,000，大于约110,000，大于约150,000，约200,000，或约250,000的下限而进行。
在具有CD20肿瘤抗原表达的肿瘤细胞中，每个肿瘤细胞CD20分子的数目在约1000到约350,000范围内而不同，优选地至多约310,00或300,000，这取决于B细胞恶性的类型和在体内的位点。每个肿瘤细胞CD20分子的数目可以特别地从约5000，约10,000，约50,000，到约100,000，150,000，200,000，250,000，达到300,000而不同。这种情形对于在权利要求1中列出的所有其它肿瘤抗原EpCAM，G250，蛋白聚糖，GD2，GD3，MHC II，EGF-R和CEA是类似的。
应该注意到，在来源于单一确定的肿瘤实体的不同肿瘤细胞上，肿瘤-相关抗原的表达水平可以在下限和上限表达值之间的范围内。必须理解，所有这些附图是平均值，其取决于恶性的类型，患者的类型，肿瘤的发展等。
很重要地注意到，本发明人所选择的肿瘤-相关靶抗原仅以低到中等表达水平永久并且稳定地在所述肿瘤细胞上表达。然而，其它类型的可诱导的抗原，如热激蛋白和MIC分子MIC A和MIC B，其都在热激启动子元件的控制之下，在生命过程中在诱导之后以增加的水平进行表达，肿瘤-相关抗原如Her2/neu和CD20的表达速率通常是恒定的和稳定的。
由本发明人选择的肿瘤-相关抗原与特定的肿瘤相关或者对特定的肿瘤特异。EpCAM典型地与腺癌相关，Her2/neu与乳腺癌相关而且与结肠、肺、胃、胰腺和卵巢癌相关，CD20与B细胞淋巴瘤如非霍奇金淋巴瘤或慢性淋巴白血病相关，G250与肾癌相关，蛋白聚糖、GD3和GD2与黑素瘤相关，MHC II与B细胞淋巴瘤相关，并且EGF-R和CEA与上皮肿瘤相关。
用于本发明的三官能双特异性抗体(简写为trAb)完全是已知的。例如，参考见US-6,551,592，其内容通过引用完全结合于此。同样对于DE-A-19649223和DE-A-19710495也是真实的，其也通过引用与它们相对应的美国专利文献一起结合于此。
用于本发明的抗体可以以任何可接受的剂型如胶囊、片剂、水性混悬液、溶液等而口服施用。所述抗体及其衍生物还可以肠胃外施用。这通过下述施用途径：皮下、静脉内、腹膜内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鼻内、局部、鞘内、肝内、肿瘤内、损伤内、和颅内注射或输注技术进行。通常，所述抗体将提供为静脉内注射或输注。
本发明的抗体可以单独或与药用载体一起施用，药用载体包括可接受的佐剂、载体(vehicles)和赋形剂(excipients)。所有这些是本领域的技术人员所熟悉的。
有效剂量将取决于许多因素，并且它很好地处于熟练医师的能力范围内，以按照不同的参数如体重、治疗目的、最高耐受剂量、所用的具体制剂、施用途径、患者的反应等而调整给与给定的患者的剂量。
依据本发明所用的trAbs优选地以每次输注约5-约1000μg，更优选地约10-约300μg，约10-约100μg，或约10-约50μg的量进行施用。最佳的量可以由熟练的技术人员通过实验方法确定。更优选地，所述三官能抗体以约0.05-约15μg/kg，更优选地约0.5-5μg/kg和约0.5-2μg/kg体重的量使用。施用的次数可以由医师依据患者的需要，特别是疾病的严重性，患者的反应，所用的剂量和本领域已知的其它各种因素而选择。
优选地，选择的所述三官能抗体为抗-CD3X抗-肿瘤-相关抗原抗体和/或抗-CD4X抗-肿瘤-相关抗原抗体和/或抗-CD5X抗-肿瘤-相关抗原抗体和/或抗-CD6X抗-肿瘤-相关抗原抗体和/或抗-CD8抗-肿瘤-相关抗原抗体和/或抗-CD2X抗-肿瘤-相关抗原抗体和/或抗-CD28X抗-肿瘤-相关抗原抗体和/或抗-CD44X抗-肿瘤-相关抗原抗体，其中特别优选使用抗-CD3x抗-肿瘤-相关抗原抗体。特别优选作为所述抗-肿瘤-相关抗原的是Her2/neu，EpCAM或CD20抗原，特别优选地与所述三官能抗体的抗-CD3结合臂组合。
通过使用本发明的三官能抗体，通过所述trAb的Fc-部分与Fc-受体阳性细胞的结合而激活所述Fc-受体阳性细胞。因此，细胞因子和/或共刺激性抗原的表达得到起始或增加。然后，通过所述共刺激性抗原和/或细胞因子将T细胞生理激活所需要的至少第二次激活信号转移到所述T细胞中。这种激活通过激活标记的上调、肿瘤细胞的杀死和通过T细胞的增殖而指示。
通过trAb激活所述Fc受体-阳性细胞分别取决于抗体重链片段的亚类或亚类的组合。如体外实验所证明，例如，小鼠-IgG2a/大鼠IgG2b亚类组合的trAbs能够结合，并且同时激活，Fc受体-阳性细胞，分别导致共刺激性抗原如CD40、CD80或CD86在这些细胞表面上的上调或新形成(表达)，而小鼠IgG1/大鼠IgG2b亚类组合的双特异性抗体能够结合Fc受体阳性细胞((1)Haagen等，J.Immunology(免疫学杂志)，1995，154：1852-1860)，但是明显地不能将这些细胞激活到相当的程度((2)Gast等，Cancer Immunol.Immunother.(癌症免疫学免疫治疗)，1995，40：390)。因此，在所述trAbFc-区的小鼠IgG2a/大鼠IgG2b同种型组合是特别优选的。然而，这对于在本描述中引用的所有其它同种型组合也是如此，以致它们可以用于本发明的其它优选的实施方案中。
尽管trAb用一个结合臂(例如，抗-CD3)同时结合并且激活T细胞，来自与所述trAb的Fc部分结合的Fc受体-阳性细胞结合的共刺激性信号可以转移到T细胞，即，仅是通过trAb的一个结合臂的T细胞激活和来自Fc受体-阳性细胞的共刺激性信号同时转移到T细胞的组合导致有效的T细胞激活。
在诱导抗-肿瘤免疫性中的另一个重要方面是已经被所述trAb靶向的佐细胞(单核细胞、巨噬细胞、NK细胞或树突细胞)对肿瘤成分的可能的吞噬作用、加工和呈递。通过抗原呈递的这种经典机制，肿瘤-特异性CD4-以及CD8-阳性细胞都可以生成。此外，在T/B细胞协作的情形中，肿瘤特异的CD4细胞在体液免疫反应的诱导中起重要作用。
三官能双特异性抗体能够用一个结合臂结合T细胞的T细胞受体复合物，并且用第二结合臂结合在所述肿瘤细胞上的所述肿瘤-相关抗原。由此，它们激活T细胞，其通过释放细胞因子或通过细胞程序性死亡-介导的机制而破坏肿瘤细胞。此外，似乎存在这样的可能性，即，在通过三官能抗体激活的情形中，通过它们的受体识别肿瘤特异性抗原的T细胞可以被重新激活，由此导致长期持续的抗肿瘤免疫性。在这方面特别重要的是所述三官能双特异性抗体的完整的Fc部分调控与佐细胞如单核细胞/巨噬细胞和树突细胞的结合，并且引起它们自我发展细胞毒性和/或伴随着将重要的共刺激性信号转移到T细胞。明显地，以这种方式，可以诱导针对目前尚是未知的肿瘤特异性肽的T细胞反应。
通过以trAbs和与所述trAb的Fc部分结合的佐细胞对这样的T细胞的同时共刺激将具有可能的无反应性的肿瘤特异性T细胞重新定向于肿瘤细胞，可以消除肿瘤特异性细胞毒性T细胞(CTLs)的无反应性状态，即，在患者中存在的针对所述肿瘤的预先存在的T细胞耐受性可以通过trAbs的方式消除，并且因此，除了对肿瘤细胞的直接破坏之外，可以诱导长期持续的抗肿瘤免疫性。
优选地，依据本发明所用的抗体能够重新激活存于无反应性状态的肿瘤特异性T细胞。此外，它们能够诱导肿瘤-反应性成分-结合抗体，并且因此诱导体液免疫反应。
与T细胞的结合优选地通过CD3，CD2，CD4，CD5，CD6，CD8，CD28，和/或CD44发生。Fc受体-阳性细胞具有至少一个Fcγ受体I或III。可以依据本发明使用的抗体能够结合单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、“天然杀伤”细胞(NK细胞)和/或激活的嗜中性粒细胞，其是Fcγ受体I和/或III-阳性的细胞。
可以依据本发明使用的抗体导致作为共刺激性抗原的CD40，CD80，CD86，ICAM-1，和/或LFA-3的表达的起始或增加，或/和Fc受体-阳性细胞对细胞因子的分泌。优选地，所述细胞因子是IL-1，IL-2，IL-4，IL-6，IL-8，IL-12，IFN-γ和/或TNF-α。优选地，与T细胞的结合通过所述T细胞的T细胞受体复合物而发生。
优选地，所述三官能双特异性抗体是异源完整的大鼠/小鼠双特异性抗体。
通过可以依据本发明使用的trAbs的方式，针对所述肿瘤细胞，T细胞被激活并且重新定向。优选的有效的异源三官能双特异性抗体选自下述同种型组合中的一种或多种：
大鼠-IgG2b/小鼠-IgG2a
大鼠-IgG2b/小鼠-IgG2b，
大鼠-IgG2b/小鼠-IgG3；
大鼠-IgG2b/人-IgG1，
大鼠-IgG2b/人-IgG2，
大鼠-IgG2b/人IgG3[东方人同种异型G3m(st)＝结合蛋白质A]，
大鼠-IgG2b/人-IgG4；
大鼠-IgG2b/大鼠-IgG2c；
小鼠-IgG2a/人-IgG3[白种人同种异型G3m(b+g)＝不与蛋白质A结合，
在下文显示为*]
小鼠-IgG2a/小鼠-[VH-CH1，VL-CL]-人-IgG1-[铰合部]人IgG3*[CH2-CH3]
小鼠-IgG2a/大鼠-[VH-CH1，VL-CL]-人-IgG1-[铰合部]-人-IgG3*-[CH2-CH3]
小鼠-IgG2a/人-[VH-CH1，VL-CL]-人-IgG1-[铰合部]-人-IgG3*.[CH2-CH3]
小鼠-[VH-CH1，VL-CL]-人-IgG1/大鼠-[VH-CH1，VL-CL]人-IgG1-[铰合部]-人-IgG3*-[CH2-CH3]
小鼠-[VH-CH1，VL-CL]-人-IgG4/大鼠-[VH-CH1，VL-CL]-人-IgG4-[铰合部]-人-IgG4[CH2的N-端区域]-人-IgG3*[CH2的C-端区域：>aa位置251]-人-IgG3*[CH3]
大鼠-IgG2b/小鼠-[VH-CH1，VL-CL]-人-IgG1-[铰合部-CH2-CH3]
大鼠-IgG2b/小鼠-[VH-CH1，VL-CL]-人-IgG2-[铰合部-CH2-CH3]
大鼠-IgG2b/小鼠-[VH-CH1，VL-CL]-人-IgG3-[铰合部-CH2-CH3，东方人同种异型]
大鼠-IgG2b/小鼠-[VH-CH1，VL-CL]-人-IgG4-[铰合部-CH2-CH3]
人-IgG1/人-[VH-CH1，VL-CL]-人-IgG1-[铰合部]人-IgG3*-[CH2-CH3]
人-IgG1/大鼠-[VH-CH1，VL-CL]-人-IgG1-[铰合部]-人-IgG4[CH2的N-端区域]-人-IgG3*[CH2的C-端区域：>aa位置251]-人-IgG3*[CH3]
人-IgG1/小鼠-[VH-CH1，VL-CL]-人-IgG1-[铰合部]-人-IgG4[CH2的N-端区域]-人-IgG3*[CH2的C-端区域：>aa位置251]-人-IgG3*[CH3]
人-IgG1/大鼠-[VH-CH1，VL-CL]-人-IgG1-[铰合部]-人-IgG2[CH2的N-端区域]-人-IgG3*[CH2的C-端区域：>aa位置251]-人-IgG3＊[CH3]
人-IgG1/小鼠-[VH-CH1，VL-CL]-人-IgG1-[铰合部]-人-IgG2[CH2的N-端区域]-人-IgG3*[CH2的C-端区域：>aa位置251]-人-IgG3*[CH3]
人-IgG1/大鼠-[VH-CH1，VL-CL]-人-IgG1-[铰合部]-人-IgG3*-[CH2-CH3]
人-IgG1/小鼠-[VH-CH1，VL-CL]-人-IgG1-[铰合部]-人-IgG3*-[CH2-CH3]
人-IgG2/人-[VH-CH1，VL-CL]-人-IgG2-[铰合部]-人-IgG3*-[CH2-CH3]人-IgG4/人-[VH-CH1，VL-CL]-人-IgG4-[铰合部]-人-IgG3*-[CH2-CH3]
人-IgG4/人-[VH-CH1，VL-CL]-人-IgG4-[铰合部]-人-IgG4[CH2的N-端区域]-人-IgG3*[CH2的C-端区域：>aa位置251]-人-IgG3*[CH3]
小鼠-IgG2b/大鼠-[VH-CH1，VL-CL]-人-IgG1-[铰合部]-人-IgG3*-[CH2CH3]
小鼠-IgG2b/人-[VH-CH1，VL-CL]-人-IgG1-[铰合部]-人-IgG3*[CH2-CH3]
小鼠-IgG2b/小鼠-[VH-CH1，VL-CL]-人-IgG1-[铰合部]-人-IgG3＊-[CH2-CH3]
小鼠-[VH-CH1，VL-CL]-人-IgG4/大鼠-[VH-CH1，VL-CL]-人-IgG4-[铰合部]-人-IgG4-[CH2]-人-IgG3＊-[CH3]
人-IgG1/大鼠-[VH-CH1，VL-CL]-人-IgG1-[铰合部]-人-IgG4-[CH2]-人-IgG3*-[CH3]
人-IgG1/小鼠-[VH-CH1，VL-CL]-人-IgG1-[铰合部]-人-IgG4-[CH2]-人-IgG3*-[CH3]
人-IgG4/人-[VH-CH1，VL-CL]-人-IgG4-[铰合部]-人-IgG4-[CH2]-人-IgG3*-[CH3]
优选地，依据本发明有用的抗体是单克隆的、嵌合的、重组的、合成的、半合成的或化学修饰的完整抗体，其具有例如Fv、Fab、scFv、或F(ab)2片段。
优选地，使用人源的抗体或其衍生物或片段，或者被修饰成适用于人的那些(所谓的“人源化抗体”)(参见例如，Shalaby等，J.Exp.Med.(实验医学杂志)175(1992)，217；Mocikat等，Transplantation(移植)57(1994)，405)。
上文提及的不同类型抗体和抗体片段的制备是熟练的技术人员公知的。单克隆抗体，优选地哺乳动物来源，例如，人、大鼠、小鼠、兔或山羊的单克隆抗体的制备可以使用常规方法进行，如例如在
Figure G2007800127778D0014123100QIETU
 undMilstein(Nature(自然)256(1975)，495)，在Harlow和Lane(Antibodies，ALaboratory Manual(1988)(抗体，实验室手册(1988))，Cold Spring Harbor(冷泉港))或在Galfré(Meth.Enzymol.(酶学方法)73(1981)，3)或在DE19531346中所述的那些方法。
通过依据熟练的技术人员已知的技术的重组DNA技术的方式制备抗体也是可能的(参见，Kurucz等，J.Immunol.(免疫学杂志)154(1995)，4576；Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)90(1993)，6444)。
具有两种不同的特异性的抗体，即所谓的双特异性抗体的制备可以一方面利用重组DNA技术进行，另一方面还可以通过所谓的杂交杂交瘤融合技术进行(参见例如，Milstein等，Nature(自然)305(1983)，537)。这种技术包括将每种产生具有一种需要的特异性的抗体的杂交瘤细胞系融合，和鉴定并且分离产生具有两种特异性的抗体的重组细胞系。
使用权利要求1中定义的三官能双特异性抗体解决了本发明潜在的问题。在下文中，更详细地描述表现出两种特异性的抗体的制备。落入本发明中的三官能双特异性抗体属于现有技术，并且描述这样的制备方法的参考文献通过引用完全结合于此。
三官能双特异性抗体由两个抗体半分子组成(每个具有H和L免疫球蛋白链)，其每个抗体半分子表现出特异性，并且具有如同行使公知的效应子功能的正常抗体的Fc部分。它们优选地使用细胞杂交瘤技术制备。这种制备方法在DE-A-4419399中示例。为了完全公开，这一文献通过引用完全结合，并且结合其关于双特异性抗体的定义。应该理解，还有其它的制备方法是有用的，只要它们形成依据本发明所需要的按照上述定义的三官能双特异性抗体。
trAb与Fcγ-RI的结合表现出关于最佳抗肿瘤功效的两种实质性的优点：
(1)Fcγ-RI-阳性细胞具有通过ADCC消除肿瘤细胞的能力，并且因此能够通过所述trAbs协同地有助于细胞毒性T细胞针对所述肿瘤细胞的抗肿瘤效果。
(2)FcγRI-阳性细胞(诸如单核细胞/巨噬细胞/树突细胞)能够提供与T细胞的抗原呈递相似的重要的共刺激性信号，并且由此防止T细胞无反应性。此外，由于trAb-介导的T细胞与佐细胞和肿瘤细胞的相互作用，甚至具有识别肿瘤-特异性肽(通过在所述肿瘤细胞上的MHC抗原呈递)的T细胞受体的T细胞可以被刺激成需要的副产物。在这种情形(constellation)中，对于正确激活T细胞所必需的共-刺激将由所述佐细胞(诸如单核细胞)提供。因此，除了直接的T细胞受体-不依赖型trAb-介导的肿瘤破坏，本发明的抗体还应该能够激活并生成肿瘤-特异的T细胞，其在trAb降解后继续在患者内巡视(patrol)。这意味着，与基因-治疗方法(例如，通过将共-刺激性抗原如B-7结合到肿瘤细胞中)相似，患者的肿瘤耐受性可以被三官能双特异性抗体消除。
下述实验数据表明本文所述的trAbs可以令人吃惊地高度有效地用于破坏只具有低到中等表达水平的靶抗原，特别优选Her2/neu和CD20靶抗原的肿瘤细胞。发现关于高有效性的原因在于前述的所述三官能抗体的作用模式。所述作用模式显著不同于单特异性抗体。用于本发明的三官能抗体能够通过它们的抗-T细胞结合臂和它们的Fc部分靶向并且同时激活不同类型的免疫细胞。这些免疫细胞的典型的实例是T淋巴细胞和具有Fcγ-受体I型(CD64)和III型(CD16)的佐细胞。当所述第一结合臂结合在肿瘤细胞上的靶抗原如Her2/neu或CD20时，所述第二结合臂结合例如在T淋巴细胞上的CD3(图4)。
关于怎样定量肿瘤抗原表达水平的方法是本领域已知的。例如，免疫细胞化学方法，如例如，ELISA检测、定量流式细胞术、组织染色方法和细胞离心涂片器(cytospin)分析。关于在肿瘤细胞上的肿瘤-相关靶抗原的表达的定量确定方法的典型的实例是免疫组织化学方法，如由丹麦Glostrup DAKO开发的Hercep 
Figure G2007800127778D0016100957QIETU
，其允许定量确定Her2/neu在肿瘤组织上的表达水平。参考见由DAKO关于DAKO细胞瘤自动染色编号K5207(Cytomation Autostainer Code no.K5207)，第一版，所述的Hercep 其由通过引用完全结合于此的公布号111781-001和K5207/EFG/AOS/13.10.04鉴定。对于Her2/neu，提供了一种评估系统，其包括4个步骤，0，1+，2+，3+，是指在肿瘤细胞表面上的表达的靶抗原的近似数目。依据这一系统，将在靶细胞表面上具有低于20,000Her2/neu分子的表达的细胞分类为阴性的；将具有大于约20,000并且至多约100,000-110,000(至多最大值150,000)分子的表达的细胞分类为1+(低表达)，具有至多约500,000分子的表达的细胞分类为2+(中等表达)，并且将具有在约2.000,000到10.000,000分子的表达的细胞分类为3+(高表达)。依据本发明，已经发现针对Her2/neu的三官能双特异性抗体可以用于治疗患有依据 Hercep
Figure G2007800127778D0017101122QIETU
分类为Her2/neu1+和2+(如果后者另外检测为FISH阴性)的肿瘤细胞的患者。
所谓的FISH检测是本领域公知的。“FISH”意指“原位荧光杂交”，并且是可以用来检测和定位特异的DNA序列在染色体上的存在或不存在的细胞遗传学技术。该方法本身在本领域内是充分确定和公知的。参考见，例如，Laudadio J，Quigley DI，Tubbs R，Wolff DJ.HER2testing：a review ofdetection methodologies and their clinical performance(HER2检测：检测方法和它们的临床表现的综述)，其通过参考完全结合于此。
FISH阴性检测结果意指Her2/neu基因未得到扩增；Her2/neu基因的数目是在正常的生理范围内。然而，在15到20％的所有的乳房癌中，Her2/neu基因得到扩增。这种扩增的检测已经被确定为对于乳腺癌治疗是至关重要的。在所述Her2/neu基因得到扩增的情形中，FISH分析将是阳性的，并且例如在用曲妥单抗治疗的那些案例中可能是成功的。另一方面，过量表达Her2/neu但是FISH阴性的患者不能使用如曲妥单抗的抗体进行有效的治疗。因此，具有达到500,000的Her2/neu表达但是FISH阴性的患者也可以用本文所述的三官能双特异性抗体成功地治疗不得不被视为是乳腺癌治疗中的重要的进步。许多小组还研究CD20在B细胞恶性病上的表达。Ginaldi等，(J.Clin.Pathol.(临床病理学杂志)，51：364，1998)通过使用Quantum简单细胞微珠试剂盒(Quantum Simply Cellular rnicrobeadskit，Sigma(西格玛)，圣路易斯，密苏里州，美国)而评估CD20在不同B细胞恶性病上的表达。他们发现，例如，对于B-CLL，平均值为65,000CD20分子/白血病细胞，并且对于套细胞(mantel cell)淋巴瘤，为123,000CD20分子/细胞。在多毛细胞白血病的情形中，该研究确定平均值为312,000CD20分子/细胞。
Huh等，(Am J Clin Pathol(美国临床病理学杂志)116：437，2001)使用比较方法进一步研究了对于B细胞恶性病CD20在不同位点如外周血和骨髓的不同的表达。此处，在骨髓标本中，每个细胞的CD20分子的数目在B-CLL中(平均4,067；范围222-46,395)是最低的，在滤泡淋巴瘤中(平均22,240；范围3,689-39,643)、套细胞淋巴瘤中(平均29,770；范围2,785-97,727)较高，并且在多毛细胞白血病中(平均31,563；范围1,607-72,540)中最高。相反，在外周血中，CD20分子数目/细胞通常对于例如B-CLL更高，其中平均数是9,051，在563-31,507范围内。
综上，在B细胞恶性病的情形中，CD20分子数目/细胞从约1000到300,000而不同，取决于B细胞恶性病的类型以及在机体内的位点，并且达到约350,000的最大值。
在下述实施例中，并且参考所包含的附图和图表，更详细地描述本发明。第一个实施例关于商标为
Figure G2007800127778D00181
(INN-名为ertumaxomab)的可获得的三官能抗体和被
Figure G2007800127778D00182
靶向的肿瘤-相关抗原Her2/neu举例说明本发明。第二个实施例针对命名为Bi20的三官能双特异性抗体(也叫作FBTA05)，其通过CD3结合T细胞，并且识别CD20为肿瘤抗原。这些实施例提供了令人信服的证据证明本发明可以关于在权利要求1和贯穿本说明书中具体描述的所有其它肿瘤-相关抗原而使用。所有这些肿瘤-相关抗原可以以这样低的数量存在于肿瘤细胞的表面上，以致它们几乎不能通过常规所用的基于抗体的免疫治疗而进行治疗。
本发明的附图和图表联系实施例1和2解释如下。
图1：A-F，细胞系Lox，HCT-8和SKBR3的Her2/neu表达模式谱，其通过流式细胞术测量具有不同的抗Her2抗体。
图2a：Her2+3SKBR-3细胞的杀伤：使用微小转移检测系统进行的绘图分析；*与表3相对应的数目
图2b：Her2+1HCT-8细胞的杀伤：使用微小转移检测系统进行的绘图分析；*与表3相对应的数目
图2c：阴性Her2Lox细胞的杀伤：使用微小转移检测系统进行的绘图分析；*与表3相对应的数目
图2d：Her2+1HCT-8细胞的杀伤；供体2作为MDS工作流程的实例的绘图结果；*与表3相对应的数目
图3：使用细胞因子珠点阵系统(CBA)测量24小时后在产克隆测定上清液中的细胞因子分泌。
图4：假定的三细胞复合物。三官能抗体能够通过不同的免疫学机制加速对肿瘤细胞的识别和破坏。Bei der Auflistung der Zytokine im Bildsollte man noch IFN-γaufnehmen
注释：ADCC，抗体依赖性细胞的细胞毒性；DC，树突细胞；NK，天然杀伤细胞；DC-CK1，树突细胞细胞因子1；IL，白介素；LFA，白细胞功能相关抗原；TNF-α，肿瘤坏死因子α；CD，分化簇(摘自Ruf和Lindhofer，2001)
图5.Bi20的纯化。(A)阳离子交换层析(CIEX)。将母体小鼠抗体(峰1)在HR10/10高效SP-琼脂糖柱上与三官能抗体(峰2)分开。(B)Bi20三官能抗体纯化的等电聚焦(IEF)。母体大鼠抗体(26II6)在蛋白质A亲和层析(AC Bi20)后去除，并且母体小鼠抗体(TPA10)通过CIEX(CIEX P1Bi20)与三官能抗体分开。纯化的Bi20在阳离子交换层析的峰2(CIEX P2Bi20)中发现。
图6.Bi20特异性结合效应细胞。将190ng Bi20与5x105个靶细胞温育，并且通过FACS分析测量结合。Ramos细胞(A)用作CD20臂的靶细胞，并且THP-1细胞(B)用于Fc部分。对于竞争测定，将细胞与利妥昔单抗(Rit)在指定抗体过量的情况下预先温育30分钟。
图7.在效应细胞存在下，Bi20调控有效的B细胞消耗。(A)将1x106/ml PBMCs和2x105/ml肿瘤细胞(Raji，Mec1)用50ng/ml的Bi20，catumaxomab(Catum)，利妥昔单抗，或母体抗体TPA10和26II6温育。在第3天通过单核细胞、B细胞和T细胞的锥虫蓝排除计数和FACS分析而确定B细胞的清除。将在没有抗体的测定(阴性)中的绝对的B细胞数目设定为100％。(B)1x106/ml PBMCs和2x105/ml Raji细胞用增加量(0.5-250ng/ml)的Bi20温育。在第1、2和3天，通过锥虫蓝排除和FACS分析确定绝对的B细胞计数，并且计算B细胞消耗的百分数。
图8.Bi20调控T细胞的激活。(A)1x106/ml PBMCs和2x105/ml Raji肿瘤细胞用50ng/ml的Bi20，catumaxomab(Catum)，利妥昔单抗，或母体抗体TPA10和26II6温育3天。CD25在CD4+和CD8+细胞上表达的MFI通过FACS分析确定。(B)PBMC和Raji细胞用增加量(0.5-250ng/ml)的Bi20温育。在第1、2和3天测量CD25在CD4+T细胞上表达的MFI。
图9.Bi20诱导T细胞的增殖。1x106/mlPBMCs和2x105/ml Raji细胞用浓度为50ng/ml的Bi20，catumaxomab(Catum)，利妥昔单抗，或母体抗体TPA10和26II6温育3天。T细胞数目通过锥虫蓝排除计数和使用抗-CD5/4和抗-CD5/8抗体的FACS分析确定。
图10.Bi20-介导的单核细胞的激活。(A)1x106/ml PBMCs和2x105/ml Raji肿瘤细胞用50ng/ml的Bi20，catumaxomab(Catum)，或利妥昔单抗温育1天。CD14+单核细胞表达CD25的MFI通过FACS分析确定。(B)1x106/ml PBMCs和1x105/ml THP-1细胞用50ng/ml的Bi20，catumaxomab(Catum)，利妥昔单抗(Rit)，TPA10，或26II6温育1天。CD33+THP-1细胞的激活通过CD25或CD40的表达而确定。
图11.在健康的供体效应细胞的存在下，Bi20诱导CLL B细胞的消耗。(A)1x106/ml PBMCs和2x105/ml CLL肿瘤细胞用5，50，或250ng/mlBi20，250ng/ml catumaxomab(Catum)，或250ng/ml利妥昔单抗(Rit)温育3天。在第3天通过单核细胞、B细胞和T细胞的锥虫蓝排除计数和FACS分析而确定B细胞的清除。将在没有抗体的测定(阴性)中的绝对B细胞的数量设定为100％。MV：CLL-l到CLL-9的平均值。(B)CD20在CLL患者样品(1-14)，细胞系(Raji，Mec-l)，和一名健康供体(PBMC)中的表达的纵览。MFI＝平均荧光密度。
表1：所用抗体及它们相对应的检测抗体的特征
＊TRION Pharma，慕尼黑，$Roche，#Micromet，慕尼黑
表2：所用细胞系及它们的Her2/neu得分
＊：依据Ross等，分子和细胞蛋白质组学(Molecular and CellularProteomics)3:379-398，2004
表3：产克隆测定样品
Ab＝抗体，μg＝微克，ng＝纳克
表4：Bi20调控的细胞因子分泌。1x106/ml PBMCs和2x105/ml肿瘤细胞(Raji，Ramos，Mec1，Granta，DOHH-2)用50ng/ml Bi20，catumaxomab(Catum)，利妥昔单抗，或母体抗体TPA10和26II6温育3天。收集上清液，并且用CBA测定和FACS分析测量细胞因子的分泌。
表5：Bi20在体外以自体形式调控的CLL B细胞的消除。B和T细胞的百分数、CD20在B细胞上的表达(MFI)、和E：T比例在CLL PBMC制备后和温育之前立即确定。在第0、3、6和9天，将CLL细胞用指定量的Bi20或利妥昔单抗温育。取决于患者样品，如显示在第3天和第10天之间确定B细胞的清除。B细胞的清除表示为消耗的％B细胞。T细胞激活：CD25在CD4+和CD8+T细胞上的表达上调至少5倍(++)。效应器/靶点比例(E：T)定义为单核细胞、NK细胞和T细胞的数目相对于B细胞的数目。≤10％的B细胞清除标定为阴性(neg)。
实施例1
实施例1涉及Her2/neu结合三官能双特异性抗体关于其用于治疗在
Figure G2007800127778D00211
中具有得分1+的患者的能力的特征。
方法
细胞系和抗体
Figure G2007800127778D00212
(由Trion Pharma，慕尼黑生产)是一种三官能抗体，其用一个结合臂靶向肿瘤-相关抗原Her2/neu，并且用另一个臂结合T细胞上的CD3分子。此外，以其有效的Fc区域结合FcγRI和FcγRIII阳性细胞(例如，巨噬细胞、NK细胞、树突细胞)，所述Fc区域由小鼠IgG2a和大鼠IgG2b同种型组成。单克隆抗体2502A(Trion Pharma，慕尼黑)对Her2/neu特异，并且是包含在
Figure G2007800127778D00214
中的一种母体抗体。26II6(Trion Pharma，慕尼黑)对CD3特异，并且是包含在
Figure G2007800127778D00215
中的另一种母体抗体。520C9(ATCC HB-8696)是识别Her2/neu受体的另一种单克隆抗体。曲妥单抗是从鼠源抗Her2/neu抗体Mab4D5开发的一种人源化抗Her2单克隆抗体(58)。表1显示所用的抗体及它们相对应的检测抗体的特征。
SKBR3(ATCC H TB-30)是通过IHC检测具有强Her2/neu过表达(
Figure G2007800127778D00216
得分+3)的乳腺癌细胞系(58.HCT-8(ATCC CCL-244)是结肠癌细胞系，和Lox是黑素瘤细胞系(表2)。
Her2/neu得分
HCT-8细胞的Her2/neu状态使用
Figure G2007800127778D00217
试剂盒(DAKO，Glostrup，丹麦)通过IHC评估，并且由慕尼黑LMU的病理学研究所按照供应商的手册进行。
FACS分析
FACS分析用5x105靶细胞(SKBR3，HCT-8或Lox)进行。将细胞用100ng单克隆抗体或100ng三官能抗体
Figure G2007800127778D00221
在4℃温育45分钟。然后，将样品用不含Mg2+和Ca2+的磷酸缓冲盐(PBS)(PAN Biotec，Aidenbach)洗涤，并且用相对应的检测抗体(Dianova，汉堡)(表1)在4℃温育45分钟。在用PBS的另一次洗涤步骤后，将细胞重悬在含有0.01μg/ml溴化乙锭(西格玛，慕尼黑)的PBS中。抗体结合的量通过在叠加柱状图中的平均荧光强度进行分析。只具有抗人检测抗体的样品或用26II6(抗CD3)及其相对应的检测抗体(同种型对照)温育的样品作为阴性对照。所有的FACS分析都在FACSCalibur(Becton Dickinson，海德尔堡)上进行，并且用CellQuest Pro或WinMDI2.8分析。
产克隆测定
抗体介导的肿瘤清除用关于未刺激的效应细胞的长期产克隆测定进行研究。因此，将106PBMC掺加入5％的靶细胞(SKBR3，HCT-8或Lox)，并且接种在24孔平板(Greiner)中。将抗体以在表3所示的不同浓度和组合加入。单独的靶细胞的样品和由靶细胞和效应细胞的混合物组成而没有添加任何抗体的样品作为对照。将样品在37℃/5％CO2中温育，并且每3天用RPMI1640，L-谷氨酰胺和10％FCS培养。在温育8天后，将细胞从24孔平板中收集起来，用PBS w/o Mg2+/Ca2+洗涤，并且通过锥虫蓝用死细胞排除在Neubauer细胞室中计数。然后将活细胞离心在细胞离心涂片器载玻片(Menzel)上，浓度为每载玻片2，5x105个细胞。将细胞离心涂片器样品干燥过夜，然后进行免疫细胞化学。实验使用来自3名不同供体的PBMC重复3次。
免疫细胞化学
将在细胞离心涂片器载玻片上的非特异性结合特征用10％的人血清饱和。将SKBR3和HCT-8细胞用1.5μg/载玻片的抗细胞角蛋白(Cytokeratine)8，18，19抗体(A45B-B3，小鼠IgG1，Micromet，慕尼黑)染色，Lox细胞用1.5μg/载玻片的抗EGFR抗体(小鼠IgG2a，由慕尼黑的Htun博士馈赠)染色。用于细胞角蛋白染色的抗-小鼠IgG1Alexa Fluor477(FITC)抗体(Molecular probes(分子探针)，Eugene)或用于EGFR染色的抗-小鼠IgG2aAlexa Fluor477(FITC)抗体(Molecular probes(分子探针)，Eugene)以1.5μg/载玻片用作检测抗体。将细胞离心涂片器载玻片在微小转移检测系统(MDS，Applied Imaging(应用成像))中使用计数FITC标记细胞的计算机化成像分析进行分析。
结肠癌细胞系HCT-8表现出+1Her2/neu表达
为了找到具有+1的Her2/neu表达的细胞系，在不同细胞系上研究Her2/neu的表达水平。
因此，使用单克隆Her2/neu抗体2502A，520C9，曲妥单抗和三官能抗体
Figure G2007800127778D00231
进行FACS分析。单克隆抗CD3抗体26II6作为模拟对照。图1A-F显示所用的抗体在SKBR3，HCT-8或Lox细胞上的结合模式。由于对照作为仅具有不同检测抗体的流式细胞术样品(图1A)，同种型对照是具有其相对应的检测抗体的26II6(抗CD3)(图1B)。
黑素瘤细胞系Lox----如预计----没有表现出Her2/neu受体的表达(图1C-F)，而SKBR3细胞用单克隆抗体520C9(图1C)，2502A(图1D)和曲妥单抗(图1E)针对Her2/neu浓重染色。
Figure G2007800127778D00232
染色SKBR3细胞至较低的程度，可能是由于其一个结合臂的性质(图1F)。与SKBR3细胞相比，使用所有所用的Her2抗体，HCT-8细胞具有显著更弱的Her2/neu受体表达(图1C-F)，进一步证明这些细胞的评估。HCT-8细胞的Her2/neu表达另外使用DAKO
Figure G2007800127778D00233
进行分析。该检测由病理学研究所(慕尼黑TU)进行。在进行的DAKO检测中，结肠癌细胞系HCT-8表现出+1的Her2/neu表达，这证实了FACS分析的结果。表2显示所用的细胞系、它们的Her2/neu得分以及用于确定Her2/neu表达的方法的总结。
Figure G2007800127778D00234
能够在体外杀死Her2/neu+3和Her2/neu+1细胞系
Figure G2007800127778D00235
同时召集并且激活不同类型的免疫细胞到肿瘤位点的能力导致这样的假说，即，
Figure G2007800127778D00241
还可能能够清除Her2/neu(1+)低表达的肿瘤细胞。
因此，建立了长期的细胞毒性测定(产克隆测定)。将3名健康供体的PBMC与表达Her2/neu+3的细胞系SKBR-3、Her2/neu-阴性Lox细胞系或表达Her2/neu+1的HCT-8细胞系共温育8天。如在表3所示加入不同抗体浓度的曲妥单抗(100μg/ml-1μg/ml)或
Figure G2007800127778D00242
(100ng/ml-1ng/ml)。在8天后通过收集所述细胞，将它们转移到细胞离心涂片器载玻片上，并且用抗CK8，18，19抗体(SKBR-3和HCT-8)或抗EGFR-抗体(Lox)和相对应的Alexa-Fluor FITC抗体进行细胞染色，而评价肿瘤细胞的杀伤。然后将染色的细胞离心涂片器载玻片在微小转移检测系统(MDS，AppliedImaging(应用成像)，英国)上使用载玻片扫描程序通过计算机化的图像分析进行评估。
在本研究中，将三官能抗体
Figure G2007800127778D00243
(抗Her2/neu x抗CD3)与人源化抗Her2/neu单克隆抗体曲妥单
Figure G2007800127778D00244
在其抑制表达低Her2/neu的肿瘤细胞系HCT-8的肿瘤细胞(HercepTest得分：+1)生长的能力上进行比较。
在细胞系SKBR3(+3Hercep得分)，HCT-8(+1Hercep得分)和Lox(Her2/neu阴性)上的Her2/neu表达通过FACS分析测量，而HCT-8细胞还通过
Figure G2007800127778D00245
检测。使用针对Her2/neu的不同抗体的FACS分析表明在SKBR3细胞上的强Her2表达，在HCT-8细胞上的较弱表达，和在Lox细胞上没有Her2/neu表达。这些结果对应HCT-8细胞的+1的
Figure G2007800127778D00246
得分。与所述单克隆抗体的二价结合相比，由于的单价结合(图1，A-F)，所述三官能抗体
Figure G2007800127778D00248
的平均荧光值比所述单克隆抗体的值略低。
为了检测
Figure G2007800127778D00249
和
Figure G2007800127778D0024124004QIETU
抑制表达低的Her2/neu的细胞系HCT-8的生长的能力，进行了产克隆测定。在培养8天后，将细胞从培养皿中收集起来，离心到细胞离心涂片器载玻片上，并且对于肿瘤细胞进行染色。在MDS中细胞离心涂片器染色后，所有不添加抗体的对照样品(12,500肿瘤细胞/24孔平板)(图2a-c，样品A1，B1，C1)对于细胞系SKBR3，HCT-8和Lox都表现出肿瘤细胞生长。具有250000PBMC无掺加的肿瘤细胞或加入的抗体的载玻片完全没有表现出----如预计----肿瘤细胞(图2a-c，样品A2，B2，C2)。肿瘤生长在同种异型对照中也是明显可见的，其中PBMC与5％的SKBR3，HCT-8或Lox细胞混合而不添加任何抗体(图2a-c，样品A3，B3，C3)。
Her2+3细胞系SKBR-3的肿瘤细胞生长如预计通过加入100μg，50μg，10μg和1μg
Figure G2007800127778D00251
而被抑制(图2a，样品A4-A8)。此外，
Figure G2007800127778D00252
还能够通过只加入100ng，50ng，10ng或1ng而抑制肿瘤生长。如在样品A9-A12(图2a)中所示，肿瘤细胞的生长比使用得到更有效地抑制。
Her2/neu阴性细胞系Lox的肿瘤细胞生长既没有通过加入不同量的
Figure G2007800127778D00254
也没有被
Figure G2007800127778D00255
抑制，这表明肿瘤细胞清除的特异性是由Her2/neu受体的存在而推动的(图2c，样品C4-C12)。
显著地，结肠癌细胞系HCT-8(Her2/neu得分+1)的生长没有被不同量的(100μg-1μg)
Figure G2007800127778D00256
(图2b，样品B4-B8)所抑制，其与使用Her2/neu+1乳房癌细胞系MCF-7的先前的发现相对应(5)。由于MCF-7细胞(ATCC HTB-22)表现出对TNF-α的生长抑制，所以这些细胞不能用于产克隆测定，因为
Figure G2007800127778D00257
如三官能抗体(抗EpCAM x抗CD3)由于其激活特性促进TNF-α的分泌(59)。然而，
Figure G2007800127778D00259
能够以低至100ng，50ng和10ng/孔的浓度破坏+1Her2/neu细胞系HCT-8(图2b，样品B9-B11)。1ng的
Figure G2007800127778D002510
没有成功地抑制HCT-8细胞的肿瘤细胞生长(图2b，样品B12)。图2d显示使用HCT-8细胞作为靶点的供体2的产克隆测定的原始MDS数据图。
总之
Figure G2007800127778D002511
不仅是用于具有+3或+2过量表达/基因扩增的乳房癌患者，而且是用于具有低Her2/neu表达水平的患者的治疗选择。
实施例2
这里我们描述Bi20的生产和功能特征，特别是其用于治疗仅以低水平表达肿瘤抗原CD20的患者的治疗的能力，所述Bi20是一种针对人CD3和人CD20的新三官能双特异性抗体。
CD20是一种35-kDa的非糖基化的磷蛋白，其已被提议作用为钙通道，在B细胞分化中起作用。24然而，它的准确的功能仍然未知，原因在于CD20-缺陷型小鼠表现出正常的B细胞发育并且还是表型正常的。25出于下述原因选择CD20作为定向免疫治疗的靶点：(i)它专门在正常和恶性B细胞上表达，而不在血液前体细胞或在其它人组织中的细胞上表达，26(ii)它在大部分B细胞淋巴瘤细胞上表达，27和(iii)当抗体结合时它没有被排出(shed)或分泌。28，29此外，CD20作为肿瘤治疗靶点的适合性已经得到了利妥昔单抗的成功应用，特别与常规化学治疗结合的成功应用的临床验证。
在我们目前的研究中，我们详细分析了Bi20的体外特征，表明这种trAb有效杀伤人B细胞肿瘤细胞以及来源自仅表达低水平的CD20的CLL患者的细胞。对于肿瘤细胞的清除，不需要效应细胞的预先激活，其伴随着典型的Th1细胞因子模式和T细胞与单核细胞的强激活。作为临床应用重要的先决条件，Bi20可以以有效量容易地纯化和生产。因此，这种trAb可以为目前为止难以治愈的NHL和CLL患者提供新的治疗选择。
材料和方法
抗体和试剂
将产生CD20-特异性的单克隆IgG2a抗体的小鼠细胞系TPA10与26II6融合，这导致产生Bi20(FBTA05)的细胞杂交瘤细胞系TPBs05，所述26II6为一种大鼠细胞系，其分泌CD3-特异性的IgG2b抗体。Catumaxomab
Figure G2007800127778D00261
用作三官能对照抗体，由26II6-来源的CD3-特异性臂和抗EpCAM特异性组成。利妥昔单抗
Figure G2007800127778D00262
，嵌合抗-CD20抗体，获自罗氏(Roche)(巴塞尔，瑞士)。抗-CD20抗体及相对应的同种型获自Beckman Coulter Immunotech(Krefeld，德国)。用于FACS分析的所有其它抗体购自BD生物科学(BD Biosciences)(海德尔堡，德国)。碘化丙锭获自西格玛化学(Sigma Chemicals)(Deisenhofen，德国)。
细胞系和PBMC制备
CLL细胞系Mec1由Michael Hallek博士馈赠(GSF，慕尼黑，德国)。Burkitt’s淋巴瘤(BL)细胞系Ramos获自ATCC(美国)。BL细胞系Raji，NHL细胞系DOHH-2和Granta，以及AML细胞系THP-1购自DSMZ(Braunschweig，德国)。细胞生长在补充了10％热灭活的FCS、非必需氨基酸、丙酮酸钠和L-谷氨酸(PAN-Biotech)的RPMI-1640培养基(PAN-Biotech，Aidenbach，德国)中。人外周血单核细胞(PBMCs)通过使用PANCOLL(PAN-Biotech)进行密度梯度离心而分离自健康供体的肝素化的血液。在告知同意后获得来自CLL患者的外周血样品。CLL的诊断是基于标准的临床和实验室标准。在纯化后，CLL细胞立即使用或者冰冻保存备用。将CLL细胞在补充了10％FCS的IMDM(PAN Biotech)中培育。对于以自体形式的测定，只使用新鲜制备的CLL细胞。
Bi20的生成和纯化
Bi20应用细胞杂交瘤技术产生。30对于与靶细胞结合的trAb，通过FACS分析检测细胞杂交瘤细胞的上清液。将产生trAb的细胞亚克隆几次，以增加抗体生产的稳定性，并且建立主细胞库。TrAbs通过使用
Figure G2007800127778D0027124222QIETU
纯化器100(Amersham Biosciences(安玛西亚生物科学)，乌普萨拉，瑞典)如所述31用蛋白质A亲和和离子交换层析从所述细胞杂交瘤细胞培养物上清液中纯化。
等电聚焦
将抗体样品点样到pH7-11IsoGel-琼脂糖-IEF(Cambrex生物科学(Cambrex Bio Science)，Rockland，美国)上，并且在1500V，50mA，和25W分离75分钟。抗体同种型通过用考马斯亮蓝(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich Inc.)，密苏里州，美国)染色而显现，并且对凝胶进行扫描用于分析。
FACS分析
抗体与靶细胞的结合，效应细胞的激活，相对CD20表达和细胞亚型组成使用装配有488-nm氩气激光的FACScalibur(BD生物科学(BDBiosciences)，海德尔堡，德国)通过流式细胞术而进行分析。数据使用Cellquest软件(BD生物科学)分析。
为了分析抗体结合，将5x105细胞(Ramos，Jurkat，或THP-1)用指定浓度的Bi20在4℃温育30分钟，用补充了2％热灭活FCS的PBS洗涤，并且用FITC-标记的小鼠抗-大鼠IgG检测抗体(Ramos)或FITC-标记的大鼠抗-小鼠抗体(Jurkat，THP-1)在4℃温育30分钟。
为了表征Bi20的激活特性，将1x106/ml PBMCs和2x105/ml人肿瘤细胞用指定浓度的抗体在RPMI培养基中在37℃温育1、2和3天。对细胞进行收集、洗涤并且用针对CD25和CD69的FITC-或PE-标记的检测抗体在4℃温育30分钟。
细胞亚型组成通过将3x106PBMCs用下述抗-CD抗体混合物(FITC/PE/APC)：14/19/5，4/8/5，4/8/25，45/3/5，和16/56/5进行染色而确定。
B细胞消耗测定
Bi20-介导的B细胞消耗使用生物测定进行确定。将获自健康供体的PBMCs(1x106/ml)补充2x105/ml的指定的肿瘤细胞(Raji，Ramos，Mec1，DOHH-2，或Granta)或CLL患者细胞(效应器-与-靶点比例5：1)，并且在指定浓度的不同抗体的存在下在1ml的总体积中进行温育。在第1、2和3天，对细胞进行收集和洗涤，并且使用PE-缀合的抗-CD19检测抗体通过FACS分析而分析存活的B细胞的百分数。存活细胞的总数通过锥虫蓝排除计数而确定。为了检验在自体CLL样品中抗体-介导的B细胞消耗，将从CLL患者分离的PBMCs以2x106细胞/ml的密度接种，并且在第0、3和6天以指定的浓度加入抗体。在指定的时间点进行FACS测量和锥虫蓝排除计数。
细胞因子的测量
Bi20-诱导的细胞因子释放在与用于所述B细胞消耗实验相同的条件下确定。将来自健康供体的肿瘤B细胞系和PBMCS用50ng/ml的指定抗体温育。3天后，收集上清液。细胞因子用人Th1/Th2细胞计数珠点阵(CBA，BD生物科学，海德尔堡，德国)测量，其允许同时分析IFN-γ，TNF-α，IL-2，IL-4，IL-6，和IL-10。数据获得和分析按照供应商的流程进行。
结果
Bi20的产生和纯化
trAb Bi20在细胞杂交瘤细胞中产生，并且通过蛋白质A亲和层析捕获。母体大鼠抗体不与蛋白质A结合，并且因此不存在于洗脱物中。然后，杂质如母体小鼠抗体通过阳离子交换层析(CIEX)去除(图5A)。小鼠抗体在148mM NaCl处洗脱下来(图5A，峰1)，而trAbs在320mM NaCl处洗脱。纯化的trAbs的等电聚焦表现出具有～8.65-8.15pI范围的不同的条带模式。TrAbs只在CIEX分离的峰2发现。没有检测到污染的母体抗体。
Bi20的结合特异性
为了证明Bi20的三官能性质，我们检验了其与特异的靶细胞的结合。我们使用CD20+Burkitt’s淋巴瘤细胞系Ramos来证实CD20-结合臂的官能性，CD3+T-细胞系Jurkat用于CD3-结合臂，并且单核细胞系THP-1用来验证Fcγ-RI结合(图6)。为了证实Bi20与CD20的结合，用利妥昔单抗进行竞争性结合测定。Bi20在Ramos细胞上的结合可以通过将所述细胞与21倍过量的利妥昔单抗预先温育而完全封闭(图6A)。类似地，Bi20与THP-1细胞的结合可以被利妥昔单抗竞争掉(图6B)。Bi20与Jurkat细胞上的CD3的结合与Bi20与Ramos细胞上的CD20的结合相当(数据未显示)。由于Bi20的CD3-结合臂与在充分表征的trAbs catumaxomab和ertumaxomab中相对应的臂相同，所以没有进行关于CD3-结合臂的特异性的进一步分析。概言之，这些数据证实Bi20的三价结合模式和结合的特异性。
Bi20调控B细胞消除
为了研究Bi20对B细胞杀伤的作用，我们开发了基于FACS的生物测定。将不含任何预刺激或共刺激的新鲜制备的PBMCs与肿瘤B细胞以5：1的比例和50ng/ml的指定的抗体混合，并且温育3天。收集细胞，并且亚群的组成通过FACS分析确定。进行锥虫蓝排除计数以获得绝对细胞数。
使用CD20+Burkitt’s淋巴瘤细胞系Raji作为靶细胞，用50ng/ml的Bi20观察有效的B细胞清除(图7)。作为对照，我们使用不结合B细胞(数据未显示)的trAb catumaxomab(抗-EpCAM x抗-CD3)，和母体抗体26II6(抗-CD3)和TPA10(抗-CD20)。Catumaxomab(Catum)以及母体抗体的组合诱导一些B细胞的清除，可能是由于细胞因子诸如IFN-γ和TNF-α的释放(表4)，表明Bi20的抗肿瘤活性确实由其三官能形式引起。在这些实验条件下(低抗体浓度和E：T比例)，利妥昔单抗只调控B细胞数目的较少的减少。使用CLL细胞系Mecl获得了相当的数据，其具有比Raji细胞低2.5倍的CD20表达(MFI179相对428，数据未显示)。
这些结果鼓励我们更详细地分析Bi20-调控的B细胞消耗。时间动力学分析表明Raji细胞只在24小时后消耗(图7B)，此时在低至0.5ng/ml的抗体浓度消除了至少35％的B细胞。在250ng/ml和50ng/ml的Bi20浓度，分别在第2天和第3天观察到完全的B细胞消除。使用Mec1细胞发现相当的结果(数据未显示)。此外，我们研究了代表其它淋巴瘤实体的B细胞系是否可以被有效地杀伤。当将DOHH-2(滤泡淋巴瘤)，Granta(套细胞淋巴瘤)，或Ramos(Burkitt’s淋巴瘤)用作靶细胞时，检测到有效的B细胞消耗(数据未显示)。
Bi20不依赖于同时发生的B细胞结合调控T细胞的激活
与先前描述的双特异性抗-淋巴瘤抗体相反，其只在用例如抗-CD28抗体预先刺激后表现出B细胞毒性，32对于Bi20诱导的有效的B细胞裂解，T细胞或单核细胞的预先激活不是必需的。因此，我们询问在Bi20结合时效应细胞是否可以被激活。将PBMCs和Raji细胞用指定的抗体温育，并且通过流式细胞术测量在CD4+和CD8+T细胞上的激活标记CD25的上调(图8A)。Bi20和catumaxomab诱导在CD4+和CD8+T细胞上的CD25的显著的上调，表明所述trAb与CD3和CD20的同时结合对于T细胞激活不是必需的。使用母体抗体26II6(抗-CD3)和TPA10(抗-CD20)的组合也观察到CD25的上调。如预测，利妥昔单抗没有诱导任何T细胞激活(图8A)。
如在图8B中所示，T细胞激活依赖于温育时间和抗体浓度，对于最高的Bi20浓度(250ng/ml)在第2天观察到最大的CD25表达。其它激活标记如CD69也被上调，尽管只上调更低的程度和持续更短的时间阶段(数据未显示)。
Bi20诱导T细胞增殖
除了T细胞激活外，我们确定由不同抗体诱导的CD4+和CD8+T细胞数目的增加(图9)。与CD4+亚型相比较，用Bi20温育导致CD8+亚型的T细胞的优先增殖(145％相对85％的T细胞扩增)，将CD4+：CD8+比例由1.8：1改变到1.3：1。Catumaxomab和母体抗体也诱导T细胞增殖，但是到比Bi20更低的程度。如预测，利妥昔单抗不刺激T细胞增殖。显著地，除了所述抗体外不需要任何刺激剂来诱导增殖。
单核细胞的激活依赖于同时的T细胞结合但不依赖于同时的B细胞结合
然后，我们阐释Fcγ-RI/III+细胞诸如单核细胞/巨噬细胞是否也可以被Bi20激活的问题。将PBMCs和Raji细胞在不同抗体的存在下温育，并且测量CD14+细胞的激活。如在图6A中所示，trAbs Bi20和catumaxomab诱导在CD14+单核细胞/巨噬细胞上的CD25的上调，表明同时的B细胞结合对于单核细胞的激活不是必需的。相反，利妥昔单抗，其通过它的Fc区域结合B细胞和单核细胞/巨噬细胞而不是T细胞，不诱导CD14+佐细胞的激活。从这些结果我们推论对于佐细胞的激活T细胞的结合(engagement)是必需的。
我们在不存在恶性B细胞时使用略微不同的系统证实了这一结果。将PBMCs和THP-1细胞在不同抗体的存在下温育，并且通过CD25和CD40表达监测CD33+THP-1细胞的激活(图10B)。所有同时结合THP-1细胞和T细胞的抗体(Bi20，TPBs01，26II6)激活THP-1细胞。相反，当使用结合THP-1和B细胞而不结合T细胞的抗体(TPA10，利妥昔单抗)时，没有观察到激活。不存在PBMCs时，THP-1细胞不被任何抗体激活(数据未显示)，表明在我们的实验设计中，T细胞和单核细胞的同时结合对于单核细胞的激活是绝对的先决条件。
Bi20诱导Th-1样细胞因子模式
由于细胞因子释放是在治疗使用单克隆抗体之后发生的一种免疫反应，33我们研究了由Bi20诱导的细胞因子模式。将PBMCs与不同的肿瘤细胞(Raji，Ramos，DOHH-2，Granta，或Mec1)和50ng/ml的抗体温育。在3天后，收集上清液，并且分析IFN-γ，TNF-α，IL-2，IL-4，IL-6，和IL-10的量(表4)。
Bi20诱导高水平的IL-6，其也在用其它抗体温育后以显著的更低水平检测到。在Bi20或catumaxomab处理后检测到TNF-α，但是在用利妥昔单抗或母体抗体温育后没有检测到TNF-α。IL-2表达的强增加可以仅在用Bi20温育后检测到，这证实使用trAbs的更早的研究，其表明IL-2仅在所有三种结合配偶体(肿瘤细胞、T细胞和佐细胞)都存在时才释放。18IL-4，Th2世代的标记，只是被微量地分泌，而IFN-γ，一种Th1-特异性细胞因子被强烈产生。有趣的是，IL-10，其可以作用为抑制性的细胞因子，也被释放，表明免疫学的逆反应。使用所有细胞系(Raji，Ramos，Mec1，DOHH-2，Granta；表4)获得相似的结果。
Bi20调控来源于CLL患者的B细胞的清除
然后我们研究了Bi20-介导的B细胞消耗是否可以通过使用来源于CLL患者的细胞而证实。将来自9名不同供体的细胞与来自健康供体的PBMCs和Bi20(5，50，或250ng/ml)或对照抗体温育，如在图11中所示。增加浓度的Bi20导致CLL B细胞的提高的清除(至多99％)。利妥昔单抗还诱导显著的B细胞消耗，但是即使在250ng/ml的浓度，几乎一半的B细胞是存活的。这表明，至少在我们的实验设计中，对于来自CLL患者的原代肿瘤细胞的清除，trAb Bi20比利妥昔单抗更加有效得多。在这种情形中，与先前使用B细胞系的实验相比较，由catumaxomab介导的非特异性B细胞消耗基本上是减少的(图7和11)。
显著地，甚至在检测表达很低水平的CD20的CLL B细胞(CLL2，3，和4；图11A和B)时，几乎所有的B细胞都被Bi20清除(分别为99％，93％，和98％)。相反，使用来自相同患者组的细胞，利妥昔单抗表现出更低的功效或没有功效(分别为76％，79％，和1％)。
然后，我们阐释Bi20能否在不添加来自健康供体的效应细胞的自体模式中诱导CLL B细胞的杀伤的关键问题。因此，我们将来源于CLL患者的PBMCs用Bi20和对照抗体温育。由于不利的E：T比例和已知的CLL中的T细胞无反应性，将细胞温育至少6天(除了患者CLL10之外)，并且每三天加入抗体。B细胞消耗和T细胞激活的分析在第6天和第10天之间进行，在患者CLL10的情形中例外(在第3天)。
如在表2中所总结，在分析的7份患者样品中的3份中检测到有效的B细胞消耗(>85％)。在一份样品(患者CLL13)中，观察到65％的肿瘤B细胞消耗。有趣地，甚至在很低的CD20表达水平也观察到B细胞消耗(患者CLL11，12和13，图11B)，证实在同种异型形式中获得的结果(图11A和B)。使用相同浓度的利妥昔单抗的对照实验没有表现出或者表现出很低的CLL B细胞的减少。
有效的B细胞消耗似乎取决于效应器-与-靶点的比例(E:T)。具有最佳反应的患者样品(CLL10，11，和12)也具有最高的效应细胞百分数。特别地，具有最有利的E：T比例的样品(3.5：1，来源于患者CLL10)只在3天后表现出有效的B细胞消除。
CLL T细胞已知是无反应性的，特别是CD4亚型。34令人吃惊地，当我们在温育阶段结束时通过CD25的上调而分析CD4+和CD8+T细胞亚型的激活时，我们发现在6份患者样品中有5份已经发生了CD4+和CD8+亚型的有效激活(表2)。当将样品用利妥昔单抗处理时没有观察到激活(数据未显示)。这些结果表明，至少在体外，Bi20可以克服CLL样品中的T细胞无反应性，甚至在肿瘤细胞的存在下。
尽管在用抗-CD20单克隆抗体利妥昔单抗治疗B细胞淋巴瘤(特别与化学治疗结合)中取得有希望的结果，患者最终复发。9，35因此，存在对于进一步的治疗选择的需求。一种改进可以是使用双特异性抗体，其将效应细胞诸如T细胞重新定向至肿瘤细胞。
在最近的10-15年内，针对B细胞-特异性抗原诸如CD19或CD20的双特异性抗体一直处在广泛的研究中，但是迄今为止只有表现出中等反应的有限的临床数据14，36，37是可用的。此外，复杂和效率低的制备过程使得很难生产充足量的抗体用于临床应用。这里我们描述了Bi20的产生和生产，Bi20是一种针对CD20和CD3的新的三官能双特异性抗体。特别地，由于物种-限制的重链/轻链配对，小鼠IgG2a和大鼠IgG2b的同种型组合以及本文所述的其它三官能双特异性抗体的应用能够产生正确配对的双特异性抗体的高产量生产。30这些trAbs特征在于同时结合肿瘤细胞、T细胞和FcγRI/III+-佐细胞，因此增强肿瘤细胞的清除。17，18
表明Bi20在体外B细胞清除中非常有效，不需要任何共同刺激。B细胞消耗测定证明，甚至在低如0.5ng/ml的抗体浓度，在24小时后可以清除几乎70％的Raji肿瘤B细胞，在3天后具有完全的肿瘤细胞清除。使用代表其它NHL实体的B细胞系(Mec1，Granta，或DOHH-2)，获得了相似的结果，表明肿瘤细胞的清除不限于这种恶性病的特定的亚组。
此外，尽管存在增加的细胞程序性死亡抗性和低CD20表达水平，其是CLL B细胞的特征，27，38，39来源于CLL患者的B细胞也被有效地杀死(图11A和B，表5)。同样地，对于有效的CLL B细胞清除，T细胞的预先激活或共同激活不是必需的，这与已经描述的其它双特异性抗体相反。例如，双特异性小鼠抗体Bis20(小鼠IgG1CD20x小鼠IgG2b CD3)以在我们的实验中所用的相同E：T比例诱导几乎60％的B细胞消耗，但是具有10倍更高的抗体浓度，预先激活的T细胞和更短的温育时间。40在使用抗-CD20x抗-CD3抗体的另一研究中，仅在将PBLs用IL-2预先刺激时，可以获得肿瘤细胞(Raji)的裂解。甚至在1000ng/ml的双抗体浓度和20：1的E：T比例，只有约35％的细胞被裂解。41此外，关于抗-CD3x抗-CD19双抗体，Cochlovius与同事表明，在1-2.5μg/ml的抗体浓度，对于有效的B细胞裂解，预先激活的PBLs和通过CD28对T细胞的共同刺激是必需的。
在7份患者样品中的4份中，Bi20诱导有效的肿瘤细胞杀伤，甚至在不添加健康供体PBMCs的自体形式中也是如此。显著地，与利妥昔单抗相反，Bi20-介导的B细胞消耗甚至在CLL肿瘤细胞的非常低的CD20表达水平的存在下也是有效的，其对于自体以及同种异型形式也是真实的(表5和图11)。这一发现与CLL研究的临床数据一致，其中利妥昔单抗只表现出作为单一治疗的有限的功效，这可能是由于CLL肿瘤细胞的低CD20表达。3，43
与一些其它的双特异性抗体相反，44，45Bi20有效地激活CD4+和CD8+T-细胞亚型，甚至在不存在任何共同刺激性分子如抗-CD28抗体或IL-2时。结果，我们检测到高的INF-γ水平，其已知是由被刺激的T细胞释放的，并且其是Th1-型应答的指征。46T细胞的激活还伴随着两种T细胞亚型的增殖。
不仅使用健康供体的T细胞，而且使用来自B-CLL患者的T细胞，观察到T细胞的激活(表5)。这些T细胞通常特征在于无反应性，可能是由于低的CD28和T细胞受体表达造成的。47，48在我们的实验中，甚至在没有观察到基本的CLL B细胞消耗的那些样品中检测到CD4+和CD8+T-细胞亚型的激活。在一些样品(CLL-2，-4，-14)中的有限的B细胞消耗可能是由于短的温育时间，其受到B-CLL细胞在体外的有限的存活能力的限制。最近使用单链CD19x CD3双特异性抗体描述了基于不依赖于共激活剂的T细胞激活的可比较的B细胞消耗，进一步证实所述双特异性抗体形式的功效。49，50因此，我们的结果表明Bi20可能不仅在体外而且在体内克服CLL T细胞无反应性的潜力。
除了T细胞之外，Bi20还结合并且激活Fcγ-RI+细胞。激活取决于Bi20与T细胞的同时结合，这是因为肿瘤靶细胞和Fcγ-RI+细胞的结合对于激活是不充分的，如使用母体抗体TPA10所示(图10A和B)。trAbs的Fc区域的重要性得到我们最近的观察的支持，即，在免疫活性小鼠B细胞淋巴瘤模型中，长期持续的抗肿瘤免疫性的诱导取决于所述trAb的功能Fc部分。在这些实验中，trAb的F(ab)2片段的使用显著减少了这些小鼠的存活。20这一结果与最近的公布一致51，其表明，在体外和在小鼠模型中，与单一的双抗体相比较，抗-CD19x抗-FcγRIII和抗-CD19x抗-CD3的双抗体组合表现出更高的抗肿瘤活性，尽管在这两种情形中，通过抗-CD28抗体对T细胞的另外的共同刺激是必需的。这些结果表明，由Bi20介导的T细胞和Fcγ-R+效应细胞的同时结合和激活比与肿瘤细胞和T细胞单独的结合允许更有效的肿瘤细胞杀伤。
综上所述，我们的结果表明，trAb Bi20是肿瘤B细胞消耗的有效的诱导剂，其不依赖于任何预先激活或共同激活，甚至在肿瘤细胞的CD20表达非常低时有效。T细胞和辅助免疫细胞的同时激活以及它们重新定向于肿瘤细胞不仅在体外而且在体内克服了关于CLL所述的T细胞无反应性。因此，本文所述的三官能双特异性抗体提供了新的治疗选择，以治疗先前难以治愈的患者中的非霍奇金淋巴瘤和CLL，其中CD20的表达如本发明所述那样低。
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抗体名称 抗体类型 特异性 同种型 检测抗体(FITC)
Rexomun* 三官能 Her2/neuxCD3 小鼠IgG2ax大鼠IgG2b 抗大鼠IgGH+LFITC
曲妥单抗$ 单克隆 Her2/neu 人IgG1 抗人IgG1FITC
520C9 单克隆 Her2/neu 小鼠IgG1 抗小鼠IgG1FITC
EGFR-1 单克隆 EGFRI 小鼠IgG2a Alexa Fluor477抗小鼠IgG2a
A45-B-B3# 单克隆 CK8，18，19 小鼠IgG1 Alexa Fluor477抗小鼠IgG1
表1：所用抗体及它们相对应的检测抗体的特征
*TRION Pharma，慕尼黑，$Roche，#Micromet，慕尼黑
 
细胞系 来源 在细胞表面上的分子数* Her2/neu得分 方法
SKBR3 乳腺 1.000.000-20.000.000 +3 HercepTest，FACS
HCT-8 结肠 80.000-110.000 +1 HercepTest，FACS
Lox 黑素瘤 <20.000 阴性 FACS，细胞离心涂片器
表2：所用的细胞系及它们的Her2/neu得分
*：依据Ross等，Molecular and Cellular Proteomics(分子和细胞蛋白质组学)3：379-398，2004
Figure G2007800127778D00461
表4：Bi20调控的细胞因子分泌
Figure G2007800127778D00471
Figure G2007800127778D00481

Claims (13)

1.三官能双特异性抗体用于制备用来预防和治疗肿瘤疾病的药物组合物的应用，所述三官能双特异性抗体具有下述特征：
(a)通过CD3结合T细胞；
(b)结合在肿瘤细胞上的至少一种肿瘤相关抗原，所述抗原选自由Her2/neu和CD20组成的组；
(c)通过它们的Fc-部分结合Fcγ-受体I型或III型阳性细胞，或它们的组合；
所述肿瘤疾病的特征在于肿瘤相关抗原Her2/neu或CD20的表达，在所述肿瘤疾病中，所述肿瘤-相关抗原在所述肿瘤细胞上以下述量表达：
·对于Her2/neu，以5,000-150,000肿瘤-相关抗原/肿瘤细胞的量，或
·在检测为FISH阴性的肿瘤细胞中，对于Her2/neu，以至多500,000肿瘤-相关抗原/肿瘤细胞的量，或
·对于CD20，以1,000-350,000，或至多300,000肿瘤-相关抗原/肿瘤细胞的量，
其中所述三官能抗体为抗CD3X抗-肿瘤-相关抗原抗体，
其中所述抗体导致细胞因子和/或共刺激性抗原的表达的起始或增加，
其中所述三官能抗体的Fc-区域选自下述同种型组合的组的至少一个成员：
大鼠-IgG2b/小鼠-IgG2a，
大鼠-IgG2b/小鼠-IgG2b，
大鼠-IgG2b/人-IgG1，
大鼠-IgG2b/人-IgG2。
2.按照权利要求1的应用，其中所述肿瘤抗原以下述量在所述肿瘤细胞上表达：以至少5,000，20,000，50,000或80,000肿瘤抗原/肿瘤细胞的量，和以150,000，110,000或100,000肿瘤抗原/肿瘤细胞的最大值。
3.按照权利要求1的应用，其中所述三官能抗体选自异源双特异性抗体。
4.权利要求3的应用，其中所述抗体是异源大鼠/小鼠双特异性抗体。
5.按照权利要求1的应用，其中所述三官能抗体以0.05-15μg/kg体重的量施用。
6.按照权利要求1的应用，其中所述三官能双特异性抗体是抗-Her2/neu x抗-CD3抗体，其与Fcγ-I型/III型-受体结合。
7.权利要求6的应用，其中所述抗体具有大鼠-IgG2b/小鼠-IgG2a的同种型组合。
8.按照权利要求1的应用，其中所述Her2/neu抗原以5,000-150,000的量表达。
9.权利要求8的应用，其中所述Her-2/neu抗原以20,000-100,000的量在乳腺肿瘤细胞上表达。
10.按照权利要求1的应用，其中所述肿瘤疾病是下列癌症：依据Dako
Figure FDA00003214791700021
具有1+的Her2/neu值的种类，或在依据Dako具有2+的Her2/neu值的情形中为FISH阴性的种类，其中所述Dako
Figure FDA00003214791700023
是如DAKO关于出版号为111781-001和K5207/EFG/AOS/13.10.04的第一版DAKO Cytomation Autostainer Code No.K520所述。
11.按照权利要求10的应用，其中所述癌症是乳腺癌。
12.按照权利要求1的应用，其中所述三官能双特异性抗体是抗-CD20x抗-CD3抗体，其与Fcγ-I型/III型-受体结合。
13.按照权利要求12的应用，其中所述抗体具有大鼠-IgG2b/小鼠-IgG2a的同种型组合。
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