CN101133065A - 雷帕霉素的纯化 - Google Patents

Abstract

描述了纯化的雷帕霉素和用于获得纯化雷帕霉素的方法。

Description

雷帕霉素的纯化

发明背景

本发明涉及用于雷帕霉素纯化的化学方法。

雷帕霉素是一种由吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)自然产生的大环三烯抗生素。已经有基于其抗肿瘤和免疫抑制作用的一系列申请。用途包括预防或治疗系统性红斑狼疮、肺炎、胰岛素依赖性糖尿病、平滑稽细胞增殖和血管手术后的内膜增厚、成人T-细胞白血病/淋巴瘤、和眼炎。人们仍在继续研究雷帕霉素和雷帕霉素衍生物将其用于这些和其它病症的治疗。

雷帕霉素的异构体是已知的，其具有下列结构，此处称作异构体B和异构体C：

雷帕霉素的常规生产是通过发酵。发酵方法产生含有杂质的低级雷帕霉素，与纯的白色产物相反，低级雷帕霉素常常带有颜色(包括令人讨厌的黄色)。目前的纯化方法需要异丙醇重结晶和/或炭处理方法。通过这些方法获得的产物具有约94％的纯度(基于异构体B和C各纯度的总和)，和约2的黄色指数。常常需要反复重结晶来增加雷帕霉素的纯度，减少黄色指数并增加较低的B∶C异构比(isomeric ratio)，从而满足约23∶1的最小值，结晶后导致产率较低。结果，生产成本仍然较高。

我们需要一种化学纯化方法来增加雷帕霉素的产率，所述雷帕霉素具有足够的纯度且满足临床前和商业使用的质量和管理标准。

发明概述

本发明提供一种作为雷帕霉素纯化的可选择性方法的化学方法。该方法可用于粗雷帕霉素或在异丙醇重结晶过程中从母液回收的次要产物。这些物质通常是深棕色的，具有较低的纯度和较低的B∶C异构比。纯化方法包括用三甲基氯硅烷处理雷帕霉素得到31，42-双-三甲基甲硅烷基醚，庚烷萃取，并使31，42-双-三甲基甲硅烷基醚脱保护从而产生纯化的雷帕霉素产物。

另一方面，使所产生的雷帕霉素缓冲，以便提高药物中B异构体与C异构体之比。

在另一实施方案中，使纯化的雷帕霉素沉淀，过滤收集，洗涤，然后真空干燥得到终产物。

根据下面本发明的详细描述，本发明的其它方面和优点是显而易见的。

发明详述

本发明提供一种用于雷帕霉素纯化的新的化学方法。

此处所用术语“低级”或“粗的”是指雷帕霉素的纯度低于90％，黄色指数大于2，且B∶C异构比(此处也称作异构B∶C比(isomeric ratio))低于20∶1。在其中一个实施方案中，B∶C异构比为13∶1-11∶1。

下一页上的流程1提供纯化方法的概述。在第一步中，将低级雷帕霉素硅烷化，从而形成雷帕霉素31，42-双-O-三甲基甲硅烷基醚(也称作雷帕霉素31，42-双-O-TMS)。该硅烷化反应在US Patent No.6,277,983(Shaw等人)中详细描述。

简单地说，硅烷化是通过在约0℃-约5℃时，在有适宜碱存在的条件下，于惰性溶剂中用三甲基氯硅烷处理粗雷帕霉素而完成的。在其中一个实施方案中，所述溶剂是乙酸乙酯(EtOAc)。在另一实施方案中，硅烷化试剂是三乙基氯硅烷。在其中一个实施方案中，所述碱是咪唑，如咪唑或1-甲基咪唑。然而，在其它实施方案中，三乙胺和N，N-二异丙基乙胺可用作碱。硅烷化之后，通过常规方法过滤该混合物，从而除去废的有机盐和其它深色固体。

在其中一个实施方案中，室温下在庚烷中萃取雷帕霉素31，42-双-O-三甲基甲硅烷基醚，然后使用常规方法，过滤分离深色不溶性杂质。过滤之后，将滤液与炭混合。在其中一个实施方案中，使用DarcoKB炭。然而，可由本领域技术人员选择其它炭，如NucharSA炭或DarcoG-60炭。炭可除去颜色。此外，它可防止在碳酸氢钠洗涤过程中形成乳液。

然后过滤溶液，并使滤液经过一次或多次水和碱性洗涤。在其中一个实施方案中，碱性洗涤是碳酸氢钠。在另一实施方案中，首先用水，然后用饱和碳酸氢钠溶液，然后再用水洗涤滤液。

然后除去有机层并在约25℃-约30℃下减压浓缩，得到浅黄色泡沫。将该泡沫溶于适宜溶剂中并冷却至约0℃-约5℃。在其中一个实施方案中，溶剂是丙酮。在其它实施方案中，溶剂是四氢呋喃、乙腈或乙酸。其它适宜溶剂可由本领域普通技术人员选择。

然后使用适宜的酸除去萃取过的雷帕霉素31，42-双-O-TMS的甲硅烷基，即使雷帕霉素31，42-双-O-TMS脱保护，从而产生雷帕霉素。在其中一个实施方案中，所用酸是硫酸。在另一实施方案中，硫酸为0.5N硫酸。

在其中一个实施方案中，按照本发明生产的雷帕霉素具有大于约95％的纯度(HPLC面积％)。在另一实施方案中，雷帕霉素具有大于约98％的纯度。在其中一个实施方案中，雷帕霉素具有1.0或更低的黄色指数(此处也称作黄色指数)。在另一实施方案中，雷帕霉素具有大于95％的纯度和低于1的黄色指数。在另一实施方案中，雷帕霉素具有大于98％的纯度和低于1的黄色指数。

任选地，为了增加产物的B∶C异构比，将反应混合物的pH调节至约5-约6的pH。在其中一个实施方案中，将碳酸氢钠水溶液和乙酸加入到雷帕霉素的丙酮溶液中。在其中一个实施方案中，通过加入乙酸钠-乙酸缓冲溶液而调节丙酮与缓冲液的体积比。在另一实施方案中，使用乙酸钾或乙酸锌。在另一实施方案中，缓冲溶液具有约5-约5.5的pH。调节pH的其它缓冲液系统，酸等是本领域技术人员已知的，且由本发明的方法预期。下一页上的流程2提供通过这种pH调节所产生的异构体平衡变化的表现。

流程2

在其中一个实施方案中，通过缓冲所得的异构B∶C比大于约30∶1。在另一实施方案中，异构B∶C比大于约35∶1。

室温(约20℃-约25℃)搅拌纯化的雷帕霉素溶液，得到沉淀的产物。在其中一个实施方案中，搅拌反应混合物60小时。通过常规过滤方法收集产物。然后洗涤收集的产物。在其中一个实施方案中，用丙酮和水的1∶1(v/v)混合物洗涤产物。在另一实施方案中，所述洗涤进行两次。本领域的技术人员知晓洗涤产物的其它方法，其由本发明的方法预期。

在其中一个实施方案中，在约35-40℃的下真空干燥洗涤过的产物，虽然干燥条件不作为对本发明的限制。

通过本发明方法获得的纯化雷帕霉素可用于药物组合物中。因此，所得雷帕霉素可通过在雷帕霉素领域中描述的任意适合方法配制。在其中一个实施方案中，组合物包含所得纯化的雷帕霉素和生理相容载体。此处所用术语“载体”是指生理相容的载体。用于本发明组合物中的适宜载体在下面描述。

含有本发明活性化合物的口服制剂可包括任何常规使用的口服形式，包括片剂、胶囊剂、口颊形式、锭剂、糖锭和口服液、混悬液或溶液。胶囊剂可含有活性化合物与惰性填充剂和/或稀释剂如药学可接受的淀粉(例如，玉米、马铃薯或木薯淀粉)、糖、人工甜味剂、粉末状纤维素，如结晶和微晶纤维素、面粉、明胶、树胶等的混合物。有效的片剂可通过常规的压片、湿法制粒或干法制粒方法制备，并利用药学可接受的稀释剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、表面改性剂(包括表面活性剂)、悬浮剂或稳定剂，包括，但不限于，硬脂酸镁、硬脂酸、滑石粉、十二烷基硫酸钠、微晶纤维素、羧甲基纤维素钙、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、海藻酸、阿拉伯树胶、黄原胶、柠檬酸钠、络合硅酸盐、碳酸钙、甘氨酸、糊精、蔗糖、山梨糖醇、磷酸二钙、硫酸钙、乳糖、高岭土、甘露糖醇、氯化钠、滑石粉、干淀粉和粉末状的糖。优选的表面改性剂包括非离子和阴离子表面改性剂。表面改性剂的代表性例子包括，但不限于，泊洛沙姆188、苯扎氯铵、硬脂酸钙、十六醇十八醇混合物、聚西托醇乳化蜡、脱水山梨糖醇酯、胶态二氧化硅、磷酸盐、十二烷基硫酸钠、硅酸铝镁、和三乙醇胺。此处的口服制剂可利用标准的延迟或定时释放制剂，从而改变活性化合物的吸收。所述口服制剂还可包括以水或果汁形式给予活性成分，需要时可含有适宜的加溶剂或乳化剂。

在某些情况下，可能需要以气溶胶形式将化合物制剂给予至导气管。

还可非肠道或腹膜内给予所述化合物。游离碱或药学可接受盐形式的这些活性化合物的溶液或混悬液可在与表面活性剂如羟丙基纤维素适当混合的水中制备。还可在甘油、液体聚乙二醇及其溶于油的混合物中制备分散液。在贮藏和使用的普通条件下，这些制剂含有防止微生物生长的防腐剂。

适于注射用的药物形式包括无菌水溶液或分散液和用于无菌可注射溶液或分散液的临时制备的无菌粉末。在所有情况下，该形式均必须是无菌的且必须是容易注射程度的流体。它在制造和贮藏条件下必须是稳定的且必须保持不被微生物如细菌和真菌所污染。载体可以是溶剂或分散介质，其中含有，例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、其适宜的混合物、和植物油。

用于本发明的非肠道制剂可用于生产适于通过直接注射或通过加入用于静脉内输注的无菌输注液而给药的剂型。

据了解，透皮给药包括通过肌体表面和身体通道的内层，包括上皮和粘膜组织的所有给药。这种给药可以洗剂、霜剂、泡沫、贴剂、混悬液、溶液、和栓剂(直肠和阴道)的形式，使用本发明的化合物或其药学可接受的盐进行。

透皮给药可通过使用透皮贴剂实现，其含有活性化合物和对活性化合物而言是惰性的、对皮肤是无毒的、且可递送药剂，从而经由皮肤全身吸收到血流中的载体。所述载体可以采用任何形式如霜剂和软膏剂、糊剂、凝胶剂和闭合装置。霜剂和软膏剂可以是粘性液体或水包油或油包水型的半固体乳液。糊剂也是适宜的，它包括分散在含有活性成分的石油或亲水石油中的吸收粉末。各种闭合装置可用于将活性成分释放到血流中，如覆盖在贮器上的半-渗透膜，或含有活性成分的基质，其中所述贮器含有活性成分，有或没有载体。其它闭合装置是文献中已知的。

栓剂可由传统材料，包括椰子油，其中加入或不加改变栓剂熔点的蜡，和甘油制成。还可使用水溶性栓剂基质，如各种分子量的聚乙二醇。

本发明还提供含有按照本发明生产且被配制用于通过适宜递送方法给药的纯化雷帕霉素的包装和试剂盒。在其中一个实施方案中，纯化的雷帕霉素以单位剂量形式存在。各种适宜的容器，包括瓶子、小瓶、硬质泡沫塑料衬垫包装等是本领域技术人员已知的。这种包装和试剂盒可进一步含有其它组件，包括，例如，使用说明、注射器、涂药器等。

下列实施例是本发明的举例说明，而不是其限制。

实施例-经由雷帕霉素31，42-双-O-三甲基甲硅烷基醚纯化雷帕霉素

将粗雷帕霉素(20.0g，19.5mmol，黄色指数＝24.23，纯度＝89％andB∶C异构比＝11∶1)溶于300ml乙酸乙酯的溶液冷却至0-5℃。加入咪唑(6.0g，88.1mmol)并搅拌混合物形成溶液。30分钟内，向该冷的溶液中滴加8.73g(80.4mmol)三甲基氯硅烷，并在0-5℃下再搅拌30分钟，从而形成雷帕霉素31，42-双-O-三甲基甲硅烷基醚。过滤反应混合物并减压浓缩滤液至深色泡沫，室温下与400ml庚烷搅拌20-30分钟。过滤该混合物从而分离不溶性物质。室温下用3.0g DarcoKB炭搅拌滤液20-30分钟，然后过滤，用水(160ml)、饱和碳酸氢钠溶液(80ml)、然后用水(2×80ml)进一步洗涤滤液至pH6-7。25-30℃下，减压浓缩亮黄色的有机层，得到24.0g浅黄色泡沫状的产物。

将泡沫(24.0g)溶于100ml丙酮中，搅拌并冷却至0-5℃。10分钟内，向该冷的溶液中滴加20ml 0.5N硫酸。0-5℃下搅拌该混合物，直到反应完成。2-5分钟内，加入碳酸氢钠溶液(1.68g/20ml水)。使罐温升至10-15℃。加入乙酸(2ml)并搅拌该混合物15-20分钟。10分钟内，向反应混合物中逐渐加入50ml乙酸钠缓冲溶液(pH5-5.5)并室温下搅拌混合物60小时。过滤反应混合物并用丙酮-水(1∶1；v/v)混合物(2×60ml)洗涤。在35-40℃的真空烘箱中干燥产物至恒定重量，得到15.58g白色固体产物。产物的质子NMR与真实样品相同。

回收率为87.6％，产物纯度为98.7％，B∶C异构比为35∶1，黄色指数为0.73。

本说明书中涉及的所有专利、公开出版物和其它文献均引入作为参考。本领域技术人员应认识到可在不背离本发明的情况下，可以对此处所述特定实施方案中描述的条件和技术作微小改变。这种微小改变和变型落在由下列权利要求所限定的本发明范围之内。

Claims (20)

1.具有大于98％的纯度和小于1的黄色指数的雷帕霉素。

2.如权利要求1所述的雷帕霉素，其异构B∶C比大于30∶1。

3.如权利要求1所述的雷帕霉素，其异构B∶C比大于35∶1。

4.一种组合物，其包含权利要求1所述的雷帕霉素和与之生理相容的载体。

5.一种组合物，其包含异构B∶C比大于30∶1的雷帕霉素。

6.如权利要求5所述的组合物，其中所述异构比大于35∶1。

7.一种纯化雷帕霉素的方法，其包括：

(a)在有适宜碱存在的条件下，于惰性溶剂中用三甲基氯硅烷处理雷帕霉素，从而提供雷帕霉素31，42-双-O-三甲基甲硅烷基醚；

(b)过滤雷帕霉素31，42-双-O-三甲基甲硅烷基醚；

(c)在庚烷中萃取雷帕霉素31，42-双-O-三甲基甲硅烷基醚；

(d)洗涤萃取过的雷帕霉素31，42-双-O-三甲基甲硅烷基醚；并

(e)用酸使萃取过的雷帕霉素31，42-双-O-三甲基甲硅烷基醚脱保护，从而产生雷帕霉素。

8.如权利要求7所述的方法，其中步骤(d)包括：

(i)过滤步骤(c)的溶液；

(ii)将滤液与炭混合；

(iii)用水和碳酸氢钠洗涤滤液；

(iv)浓缩滤液；并

(v)将滤液溶于适宜溶剂中。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述适宜溶剂选自丙酮、四氢呋喃、乙腈和乙酸。

10.如权利要求8所述的方法，其中所述适宜溶剂是丙酮。

11.如权利要求7-10任一项所述的方法，进一步包括：

(f)调节雷帕霉素溶液的pH至约5-约6的pH。

12.如权利要求11所述的方法，其中所产生的雷帕霉素具有大于30∶1的异构B∶C比。

13.如权利要求11所述的方法，其中所产生的雷帕霉素具有大于35∶1的异构B∶C比。

14.如权利要求11-13任一项所述的方法，其中用乙酸钠、乙酸钾或乙酸锌的缓冲溶液调节pH。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述缓冲溶液是乙酸钠。

16.如权利要求11-15任一项所述的方法，进一步包括下列步骤：

(g)使雷帕霉素沉淀；

(h)过滤收集雷帕霉素；

(i)用丙酮和水的混合物洗涤雷帕霉素；并

(j)真空干燥雷帕霉素。

17.如权利要求7-16任一项所述的方法，其中步骤(a)中的惰性溶剂是乙酸乙酯。

18.如权利要求7-17任一项所述的方法，其中步骤(a)中的适宜碱是咪唑。

19.如权利要求7-18任一项所述的方法，其中步骤(e)中的酸是硫酸。

20.如权利要求7-19任一项所述的方法，其中由此产生的雷帕霉素具有大于98％的纯度。