附图简述
图1显示西罗莫司、Biolimus A9和相关衍生物的化学结构。
图2显示雷帕霉素衍生物的制备和本发明衍生物的纯化的方案。
图3显示对BA9批号2A观察到的X-射线粉末衍射(XRPD)图案。
图4显示对BA9批号2A观察到的示差扫描量热法(DSC)的热分析图。
图5显示对BA9批号2B观察到的XRPD图案。
图6显示对BA9批号2B观察到的DSC热分析图。
图7显示对BA9批号2B观察到的光学显微照片。
图8显示对BA9批号2B观察到的动态蒸汽吸附(DVS)动力学图。
图9显示DVS实验后对BA9批号2B观察到的XRPD图案以及BA9形式I的参比图案的覆盖。
图10显示得自溶剂浆液的XRPD图案和BA9形式I的参比图案的覆盖。
图11显示在抗溶剂结晶实验中得到的XRPD图案和BA9形式I的参比图案的覆盖。
图12显示使用KBr片中的样品得到的BA9形式I的红外光谱。
发明详述
I.一般介绍
本发明提供用于纯化雷帕霉素衍生物包括Biolimus A9(BA9)的方法。该方法包括从非极性有机溶剂中固化雷帕霉素衍生物,随后分离纯化的产物并且任选从极性有机溶剂和水的混合物中沉淀。该方法的不同步骤如本文所述。发现有效地除去各种杂质因令人惊奇的简便、经济的方法导致。这些优点如下文详细描述。
通过降温简单固化可以由此从不需要的40-O衍生物杂质和非-40-O衍生物中清洁地分离40-O衍生物的发现是令人惊奇和不可预测的。这在经济上是有利的,因为不需要的副产物具有的类似极性通常数倍于期望的产物且它们难以使用大规模色谱技术分离。这些方法可以用于制备显示优良稳定性的BA9的晶体形式。
II.定义
术语“纯化的”是指已经加工除去杂质的化合物。杂质可以包括溶剂、用于制备化合物的试剂、原料和产生所述化合物的反应副产物。在一些实施方案中,纯化的化合物基本上不含其它种类。
术语“粗化合物”是指包含期望的化合物(例如如本文所述的式I的化合物)和至少另一种类的混合物,所述另一种类选自溶剂、试剂例如碱、原料和产生期望的化合物的反应副产物。
“烷基”是指具有所示碳原子数的直链或支链饱和脂族基团。烷基可以包括任意数量的碳,例如C1-2、C1-3、C1-4、C1-5、C1-6、C1-7、C1-8、C1-9、C1-10、C2-3、C2-4、C2-5、C2-6、C3-4、C3-5、C3-6、C4-5、C4-6和C5-6。例如,C1-6烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基等。烷基还可以指具有至多20个碳原子的烷基,例如、但不限于庚基、辛基、壬基、癸基等。
“亚烷基”是指具有所示碳原子数并且连接至少两个其它基团的直链或支链饱和脂族基团,即二价烃基。连接至亚烷基的两个部分可以连接至亚烷基的同一原子或不同原子。例如,直链亚烷基可以是-(CH2)n-的二价基团,其中n是1、2、3、4、5或6。有代表性的亚烷基包括但不限于亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚异丙基、亚异丁基、亚仲丁基、亚戊基和亚己基。
“链烯基”是指具有至少2个碳原子和至少1个双键的直链或支链烃。链烯基可以包括任意数量的碳,例如C2、C2-3、C2-4、C2-5、C2-6、C2-7、C2-8、C2-9、C2-10、C3、C3-4、C3-5、C3-6、C4、C4-5、C4-6、C5、C5-6和C6。链烯基可以具有任意适合数量的双键,包括、但不限于1、2、3、4、5或5个以上。链烯基的实例包括但不限于乙烯基(vinyl)(乙烯基(ethenyl))、丙烯基、异丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、丁二烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、异戊烯基、1,3-戊二烯基、1,4-戊二烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、1,3-己二烯基、1,4-己二烯基、1,5-己二烯基、2,4-己二烯基或1,3,5-己三烯基。
“炔基”是指具有至少2个碳原子和至少1个三键的直链或支链烃。炔基可以包括任意数量的碳,例如C2、C2-3、C2-4、C2-5、C2-6、C2-7、C2-8、C2-9、C2-10、C3、C3-4、C3-5、C3-6、C4、C4-5、C4-6、C5、C5-6和C6。炔基的实例包括、但不限于乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、异丁炔基、仲丁炔基、丁二炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、异戊炔基、1,3-戊二炔基、1,4-戊二炔基、1-己炔基、2-己炔基、3-己炔基、1,3-己二炔基、1,4-己二炔基、1,5-己二炔基、2,4-己二炔基或1,3,5-己三炔基。
“芳基”是指具有任意适合的环原子数和任意适合的环数的芳族环系。芳基可以包括任意适合的环原子数,例如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个环原子以及6-10、6-12或6-14个环原子。芳基可以是单环,其稠合形成二环或三环基团或通过键连接以形成联芳基。有代表性的芳基包括苯基、萘基和联苯。其它芳基包括具有亚甲基连接基的苄基。一些芳基具有6-12个环成员,例如苯基、萘基或联苯。其它芳基具有6-10个环成员,例如苯基或萘基。一些其它芳基具有6个环成员,例如苯基。
“烷氧基”是指具有使烷基连接至连接点的氧原子的烷基:烷基-O-。作为烷基,烷氧基可以具有任意适合的碳原子数,例如C1-6。烷氧基包括,例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异-丙氧基、丁氧基、2-丁氧基、异-丁氧基、仲丁氧基、叔-丁氧基、戊氧基、己氧基等。
“羰基”是指有碳-氧双键组成的部分(即-C(O)-)。
“酰基”是指包括如本文所述的羰基的部分,其与如本文所述的烷基和链烯基或炔基结合。
“形成混合物”和“接触”是指接触至少两个不同的种类使得它们彼此混合的过程。
“非极性有机溶剂”是指基于碳的物质,其在或接近室温下为液体,基本上不含水且特征在于低介电常数(即小于约5)。适用于本文的非极性有机溶剂的实例包括、但不限于,例如己烷、庚烷、石油英、环己烷、戊烷、正-辛烷、异-辛烷、甲基环己烷、矿物油、乙醚、二异丙基醚、甲基叔丁基醚、1,4-二噁烷、氯仿、芳族烃溶剂(例如苯和甲苯)、环戊烷、正-辛烷、异-辛烷和甲基环己烷。
“烷有机溶剂”是指在或近室温下为液体且基本上不含水的饱和烃。烷有机溶剂的实例包括己烷、庚烷、石油英、环己烷、戊烷、正-辛烷、异-辛烷、甲基环己烷和矿物油。
“极性有机溶剂”是指基于碳的物质,其在或接近室温下为液体,基本上不含水且特征在于中至高介电常数(即大于约5)。极性有机溶剂的实例包括二甲基甲酰胺、二甲亚砜、碳酸丙烯酯、乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇、叔丁醇、四氢呋喃和丙酮。
“溶解”是指将物质的固体溶于溶剂形成溶液的过程。可以使固体物质的实体或其任意的部分溶解。不溶的物质可以存在于溶剂中,为混悬液形式。
“冷却”是指降低物质或物质混合物的温度的过程。
“固化”是指导致溶液中的化合物聚结成物质的固体形式的过程。可以使溶液中的化合物的实体或其任意的部分固化。固体形式可以是无定形或晶体物质。“沉淀”是指固化无定形形式的物质。
“固体”是指非气体、液体或溶液的化合物的凝聚形式。固体可以包括一个种类或两个或多个种类的混合物。固体化合物可以是晶体形式、无定形形式、玻璃、泡沫或两种或多种形式的混合物。
“晶体形式”是指化合物的固体形式,其中构成分子以规则有序的重复模式填充。晶体形式可以是三斜晶系、单斜晶系、正交晶、四边形的、三角形、六角形或立方体。晶体形式可以包含一个或多个具有不同晶体边界的区域,即晶粒。晶体固体可以包含两个或多个晶体几何形状。
“无定形形式”是指具有不确定晶体结构的化合物的固体形式,即缺乏组成分子的规则有序的重复模式。
“非固化的”是指非固体形式的化合物。非固化的化合物可以是,例如溶于溶液或混悬于胶体。
“分离”是指从包含化合物和至少另一种物质的混合物中分离至少部分该化合物的过程。分离的化合物基本上不含存在于混合物中的另外的物质的至少一种。
“回流”是指溶剂沸腾、同时使溶剂蒸汽冷凝并且使冷凝的溶剂返回至沸腾的罐的过程。回流一般在或近溶剂或溶剂混合物沸点在特定压力下进行。
“干燥”是指从化合物中除去液体种类例如溶剂。干燥一般通过加热化合物、降低储存化合物的压力或它们两者来进行。
本文所用的用于改变数值的术语“约”和“大约”表示解释数值周围的封闭范围。如果“X”是数值,则“约X”或“大约X”可以表示0.9X至1.1X的值,且更优选0.95X至1.05X的值。任意涉及的“约X”或“大约X”具体地表示至少X、0.95X、0.96X、0.97X、0.98X、0.99X、1.01X、1.02X、1.03X、1.04X和1.05X的值。“约X”和“大约X”预以教导和提供对于例如“0.98X”的权利要求限定的书面描述性支持。
III.本发明的实施方案
本发明提供用于得到具有式I的结构的纯化的固体化合物的方法:
其中R1选自H;Ra-(O)d-Rb,其中Ra是C1-5亚烷基,Rb是C1-5烷基或C1-5亚烷基-OH,且下标d是选自0-1的整数;C1-5烷基;C6-10芳基C1-5烷基;羟基C1-5烷基;
C6-10芳基C1-5烷氧基;C1-5烷氧基C1-5烷基;酰基;酰基C1-5烷基;氨基C1-5烷基;C1-5烷基氨基C1-5烷基;酰基氨基C1-5烷基;C1-5烷氧基羰基氨基C1-5烷基;和C6-10芳基。
该方法包括:a)形成包含具有式I的结构的粗化合物和非极性溶剂的混合物,该步骤在足以溶解所述化合物的条件下进行;b)使至少部分具有式I的结构的化合物固化;c)从所述混合物的溶剂中分离至少部分固化的化合物;和由此得到纯化的固体化合物。
在一些实施方案中,根据图2中所示的方法制备用于本发明方法的粗化合物。该方法包括使雷帕霉素与适合的三氟甲磺酸在受控温度下反应,随后后处理,任选分离产物。同位素标记的原料例如氘代物质可以用于制备同位素标记的雷帕霉素衍生物。本发明的方法一般包括从反应混合物中分离式I的化合物,所述反应混合物包括溶剂、试剂包括碱和式II和式III的原料(参见图2)。适合的分离技术包括、但不限于过滤固化的式I的化合物、离心固化的式I的化合物、蒸馏、液体萃取、升华和色谱技术。色谱技术的实例包括、但不限于正相柱色谱法(即硅胶柱色谱法)、反相柱色谱法和薄层色谱法。可以将两种或多种分离技术进行组合以分离式I的化合物。在一些实施方案中,色谱法是使用己烷或庚烷和乙酸乙酯的硅胶色谱法。
色谱法和其它分离技术提供具有可变水平的纯度的式I的粗化合物。这些粗化合物包含式I的化合物和至少另一种种类,其选自溶剂、试剂例如碱、式II或式III的原料和雷帕霉素衍生反应的副产物。一般地,粗化合物包含至少40%重量的式I的化合物。在一些实施方案中,粗化合物包含至少50%重量的式I的化合物。粗化合物可以包括例如约40%-约99%或约50%-约99%或约75%-约95%重量的式I的化合物。在一些实施方案中,粗化合物包含约90%-约95%重量的式I的化合物。
任意适合的溶剂可以用于本发明的方法中。一般地,适合的溶剂是非极性的。优选的溶剂包括烷有机溶剂(即饱和烃溶剂)和烯有机溶剂。烷有机溶剂的实例包括、但不限于己烷、庚烷、石油英(即石油醚)、环己烷、辛烷、戊烷和矿物油(包括石蜡族油和环烷油)。在一些实施方案中,所述非极性有机溶剂选自己烷、庚烷、石油英、环己烷、戊烷、正-辛烷、异-辛烷、甲基环己烷、矿物油、乙醚、二异丙基醚、甲基叔丁基醚、1,4-二噁烷、氯仿、苯、甲苯、环戊烷、正-辛烷、异-辛烷和甲基环己烷及其混合物。在一些实施方案中,所述非极性有机溶剂选自己烷、庚烷、石油英、辛烷、环己烷及其混合物。在一些实施方案中,所述非极性有机溶剂是己烷。在一些实施方案中,所述非极性有机溶剂是庚烷。其它非极性溶剂可以用于本发明的方法中,这取决于特定雷帕霉素衍生物的特性。
任意适量的溶剂可以用于本发明的方法中。一般地,所用的溶剂量足以溶解式I的化合物。典型地,溶剂的量在约重量1份-约500重量份/份粗化合物。溶剂:粗品之比可以约为1∶1-约500∶1或约50∶1-约250∶1重量。溶剂:粗品之比可以约为95∶1或约100∶1或约105∶1或约110∶1或约115∶1或约120∶1重量。在一些实施方案中,溶剂:粗品之比可以约为110∶1重量。溶剂:粗品之比中的粗品重量可以指粗混合物的总重量或混合物中式I的化合物的重量,正如例如通过HPLC或另一种分析技术所测定的。
包含式I的粗化合物和非极性有机溶剂的混合物在足以溶解粗化合物的条件下形成。如果必要,可以加热该混合物以溶解所述化合物。任意适合的温度可以用于溶解式I的化合物。本领域技术人员可以理解,加热温度部分取决于溶剂的极性、溶剂的量、粗化合物的纯度水平和式I的化合物的特定结构。这样的因素在一定程度上还决定溶解粗化合物所需的时间期限。可以使用任意的时间期限,从几分钟到几小时。例如,可以在加热或不加热的情况下将包含粗化合物和有机溶剂的混合物混合约10分钟或约20分钟或30分钟或约40分钟或约1小时。因此,本发明的一些实施方案提供用于得到如上所述的纯化的式I的固体化合物的方法,其中形成包含粗化合物和有机溶剂的混合物包括加热该混合物。在一些实施方案中,形成该混合物包括将所述混合物加热至约35℃-约100℃的温度。在一些实施方案中,形成所述混合物包括将该混合物加热至回流。
为了从粗物质中的其它成分中分离纯化的式I的化合物,使式I的化合物固化并且从有机溶剂混合物的母液中分离。固化式I的化合物可以包括冷却该所述混合物。将该混合物冷却至任意适合的温度。本领域技术人员可以理解,冷却温度部分取决于式I的化合物在有机溶剂中的溶解度以及用于所述方法的溶剂的量。在一些实施方案中,冷却所述混合物包括将该混合物冷却至约-78℃-约25℃的温度。在一些实施方案中,冷却所述混合物包括将该混合物冷却至约15℃的温度。冷却可以在任意适合的时间期限内进行,典型地为几分钟到几小时。例如,可以将所述混合物在3-4小时期限内缓慢地冷却至期望的温度。在该混合物达到期望的温度后,可以将其保持在该温度下或周围再经过几分钟到几小时的期限。
从有机溶剂中分离固化的化合物可以通过许多技术进行,包括使所述混合物通过滤器以便从母液中分离固体物质或离心该混合物并且除去母液上清液。可以将分离的固体物质与另一部分有机溶剂一起研磨以除去残留的杂质(如果存在)。然而,母液可以包括可变量的未固化的式I的化合物。如果母液包含这样的未固化物质,则可以例如通过真空除去有机溶剂回收未固化的物质,并且再进行溶解/固化步骤。因此,本发明的一些实施方案提供如上所述的方法,还包括分离任意未固化的具有式I结构的粗化合物。在一些实施方案中,该方法还包括使用未固化的粗化合物进行如上所述的步骤a)、b)和c)。
可以使用本发明的方法得到许多形式的纯化的固体化合物。例如,可以得到为粉末、玻璃状物或泡沫体形式的式I的化合物。可以得到为晶体形式或无定形形式的式I的化合物。可以得到为两种或多种形式的混合物的化合物。在一些实施方案中,得到晶体形式形式的纯化的固体化合物。晶体形式的特征在于组成分子以规则有序的重复模式填充并且一般以三维空间伸展。在一些实施方案中,得到无定形形式的纯化的固体化合物。无定形形式是具有确定晶体结构的固体形式,即缺乏规则有序的重复模式的组成分子。
本领域技术人员可以理解,纯化的化合物的固体形式在一定程度上取决于化合物的结构和用于溶解/固化步骤的溶解的特征。如果必要,纯化的固体化合物-以如上所述的特定形式得到-可以进一步被加工以得到更优选的固体形式。在一些实施方案中,如上所述的方法还包括:d)将固化的化合物溶于极性有机溶剂以形成溶液;e)使该溶液接触水以沉淀至少部分化合物;和f)干燥沉淀的化合物。
任意适合的有机溶剂可以用于溶解纯化的固体化合物。一般地,最适合的极性有机溶剂与水溶混。极性有机溶剂的实例包括、但不限于二甲基甲酰胺、二甲亚砜、碳酸丙烯酯、乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇、叔丁醇、四氢呋喃、丙酮及其混合物。优选的极性有机溶剂具有低于100℃的沸点。在一些实施方案中,极性有机溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、叔丁醇、四氢呋喃和丙酮。在一些实施方案中,极性有机溶剂是甲醇。一般地,极性有机溶剂与纯化的固体化合物之比约为1∶1重量-约500∶1重量。极性有机溶剂与纯化的固体化合物之比可以为,例如约2∶1重量或约3∶1重量。
将水加入到式I的纯化的化合物在极性有机溶剂中的溶液中,一般地,所述水的用量足以使I的化合物从溶液中沉淀。任意适量的水可以用于本发明的方法中。典型地,水与极性有机溶剂之比约为1∶20-约20∶1体积。水与极性有机溶剂之比可以为,例如约10∶1。沉淀后,可以通过如上所述的过滤或离心分离沉淀的化合物。或者,可以冷冻所述混合物并且可以通过升华从沉淀中除去溶剂/水混合物。在一些实施方案中,减压干燥沉淀的化合物。任意适合的压力和干燥时间可以用于从沉淀的化合物中除去痕量的水和溶剂。例如,可以进行减压干燥,直到沉淀的化合物重量保持恒定为止。
本发明的方法可以用于纯化许多大环内酯衍生物。大环内酯类包括具有图2中式II的结构的那些是以大环内酯环为特征的聚酮化合物天然产物和合成类似物。本发明的方法特别地用于制备雷帕霉素衍生物Biolimus A9(BA9)、依维莫司、佐他莫司(zotarolimus)和替西罗莫司(temsirolimus)。本发明的一些实施方案提供用于得到如上所述的式I的纯化的固体化合物的方法,其中R1选自H和Ra-(O)d-Rb。在一些实施方案中,R1选自H、CH2-CH2-OH和CH2-CH2-O-CH2-CH3。在一些实施方案中,R1是CH2-CH2-O-CH2-CH3。其它大环内酯衍生物也可以使用本发明的方法纯化。
本发明的方法提供式I的高度纯的化合物。一般地,纯化的固体化合物是至少90%纯的。在一些实施方案中,纯化的固体化合物是至少95%纯的。在一些实施方案中,纯化的固体化合物的纯度相对于粗化合物增加约1%-约20%。本发明的方法可以提供纯化的固体化合物的纯度的更大的增加,这部分取决于例如特定雷帕霉素衍生物的结构和粗物质的起始纯度这样的因素。在一些实施方案中,纯化的固体化合物的纯度相对于粗化合物增加约1%-约10%。在一些实施方案中,纯化的固体化合物的纯度相对于粗化合物增加约3%。
在一些实施方案中,本发明的方法还包括使纯化的固体化合物接触抗溶剂组合物。本发明的方法可以包括合并纯化的化合物溶液与抗溶剂组合物。一般地,抗溶剂组合物包含非极性溶剂,其中化合物在室温或低于室温不溶或难溶。抗溶剂组合物可以包含,例如乙醚、二异丙基醚、甲基叔丁基醚、石油英、环己烷、辛烷、己烷、庚烷及其混合物。在一些实施方案中,抗溶剂组合物包括乙醚、二异丙基醚、己烷、庚烷或其任意的组合。在一些实施方案中,抗溶剂组合物包括己烷、庚烷、石油英、辛烷、环己烷及其混合物。在一些实施方案中,所述方法包括使纯化的化合物接触抗溶剂组合物并且得到化合物的晶体固体形式。
在一个相关的方面,本发明提供40-O-(2-乙氧基乙基)雷帕霉素的晶体形式。该晶体形式显示优于无定形形式的稳定性。
在一些实施方案中,40-O-(2-乙氧基乙基)雷帕霉素的晶体形式使得其示差扫描量热的热分析图显示在约138℃和约192℃的一个或多个局部极小值。在一些实施方案中,所述热分析图显示在约137.9℃和191.6℃的局部极小值。在一些实施方案中,所述热分析图基本上与本文所示的图6一致。
在一些实施方案中,40-O-(2-乙氧基乙基)雷帕霉素的晶体形式使得其红外光谱显示在选自2967.1cm-1、2931.7cm-1、2863.3cm-1、1745.9cm-1、1718.8cm-1、1645.7cm-1、1619.0cm-1、1451.2cm-1、1378.2cm-1、1189.4cm-1、1073.9cm-1和988.1cm-1的波数或其周围处的一个或多个峰。在一些实施方案中,所述红外光谱显示在选自2967.1cm-1、2931.7cm-1、2863.3cm-1、1745.9cm-1、1718.8cm-1、1645.7cm-1,1619.0cm-1、1451.2cm-1,1378.2cm-1、1189.4cm-1、1073.9cm-1和988.1cm-1的波数或其周围处的5个或5个以上峰。在一些实施方案中,所述红外光谱显示在选自2967.1cm-1、2931.7cm-1、2863.3cm-1、1745.9cm-1、1718.8cm-1、1645.7cm-1、1619.0cm-1、1451.2cm-1、1378.2cm-1、1189.4cm-1、1073.9cm-1和988.1cm-1的波数或其周围处的10个或10个以上峰。在一些实施方案中,所述红外光谱基本上与本文所示的图12一致。
在一些实施方案中,40-O-(2-乙氧基乙基)雷帕霉素的晶体形式使得其X-射线粉末衍射图案显示在选自5.00°、7.06°、9.22°、10.07°、10.50°、11.94°、12.71°、13.15°、14.73°、16.33°、16.80°、17.07°、18.01°、18.57°、19.42°、19.81°、20.16°、20.44°、20.93°、21.55°、22.29°、22.58°、23.92°、24.26°、24.83°、25.17°、26.32°、27.48°、28.60°和32.28°的角度(2θ)处或其周围的一个或多个衍射峰。在这些实施方案的一些中,所述X-射线粉末衍射图案显示在选自5.00°、7.06°、9.22°、10.07°、10.50°、11.94°、12.71°、13.15°、14.73°、16.33°、16.80°、17.07°、18.01°、18.57°、19.42°、19.81°、20.16°、20.44°、20.93°、21.55°、22.29°、22.58°、23.92°、24.26°、24.83°、25.17°、26.32°、27.48°、28.60°和32.28°的角度(2θ)或其周围处的10个或10个以上衍射峰。在这些实施方案的一些中,所述X-射线粉末衍射图案显示在选自5.00°、7.06°、9.22°、10.07°、10.50°、11.94°、12.71°、13.15°、14.73°、16.33°、16.80°、17.07°、18.01°、18.57°、19.42°、19.81°、20.16°、20.44°、20.93°、21.55°、22.29°、22.58°、23.92°、24.26°、24.83°、25.17°、26.32°、27.48°、28.60°和32.28°的角度(2θ)或其周围处的25个或25个以上衍射峰。在一些实施方案中,所述X-射线粉末衍射图案显示在表4中所示的角度(2θ)或其周围处的一个或多个衍射峰。在一些实施方案中,所述X-射线粉末衍射图案显示在表4中所示的角度(2θ)或其周围处的10个或10个以上或25个或25个以上衍射峰。在一些实施方案中,所述X-射线粉末衍射图案基本上与本文所示的图5一致。
IV.实施例