KR20070107087A - 라파마이신의 정제 - Google Patents

Abstract

정제된 라파마이신 및 상기 정제된 라파마이신을 수득하기 위한 화학적 방법이 기재된다.

Description

라파마이신의 정제 {PURIFICATION OF RAPAMYCIN}

본 발명은 라파마이신의 화학적 정제 방법에 관한 것이다.

라파마이신은 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 (Streptomyces hygroscopicus) 에 의해 자연적으로 생성된 마크로시클릭 트리엔 항생물질이다. 이는 그의 항종양 및 면역억제 효과에 근거하여 여러 적용에 유용한 것으로 밝혀졌다. 그 용도에는 전신홍반루푸스, 폐의 염증, 인슐린 의존성 당뇨병, 평활근 세포 증식 및 혈관 수술 후의 내막 비후 (intimal thickening), 성인 T-세포 백혈병/림프종, 및 안구의 염증의 예방 또는 치료가 포함된다. 라파마이신 및 라파마이신 유도체는 상기 및 기타 병태의 치료에 대해 계속 연구되고 있다.

하기 구조의 라파마이신의 이성질체가 공지되어 있으며, 본원에서는 이성질체 B 및 이성질체 C 라 칭한다:

통상적인 라파마이신 제조는 발효에 의한 것이다. 발효 과정은, 순수한 백색 생성물과 반대되는 것으로서, 종종 착색된 (문제가 되는 황색 포함) 불순물을 함유하는 저등급 라파마이신 생성물을 생성한다. 현재의 정제 방법은 이소프로판올 재결정 및/또는 목탄 처리 방법을 필요로 한다. 상기 방법에 의해 수득된 생성물은 순도가 대략 94% (이성질체 B 및 C 의 각각의 순도의 합을 기준으로 함) 이고, 황색도 (yellow index) 가 약 2 이다. 라파마이신 순도를 증가시키고, 황색도를 감소시키고, 결정화 시 낮은 수율을 야기하는 저 B:C 이성질체 비율을, 최소 약 23:1 을 충족시키도록 증가시키기 위해서는 종종 반복적 재결정이 필요하다. 그 결과, 제조 비용이 여전히 높다.

충분한 순도를 갖는 라파마이신의 수율 및 전(pre)-임상적 및 상업적 용도를 위한 품질 및 규제 표준을 충족시키는 수율을 증가시키는 화학적 정제 방법이 요구된다.

발명의 개요

본 발명은 라파마이신의 대안적 정제 방법으로서의 화학적 방법을 제공한다. 이 방법은 미정제 (crude) 라파마이신 또는 이소프로판올 재결정 동안 모액으로부터 회수된 제 2 산출물에 유용하다. 이러한 물질은 일반적으로 암갈색을 띠고, 순도가 낮으며, B:C 이성질체 비율이 낮다. 상기 정제 방법은, 라파마이신을 클로로트리메틸실란으로 처리하여 31,42-비스-트리메틸실릴 에테르를 수득하고, 헵탄으로 추출하고, 31,42-비스-트리메틸실릴 에테르를 탈보호시켜 정제된 라파마이신 생성물을 수득하는 것을 포함한다.

다른 국면에서, 약물 물질 중의 C 이성질체에 대한 B 이성질체의 비율을 증가시키기 위해, 생성된 라파마이신을 완충시킨다.

또다른 구현예에서, 최종 생성물을 수득하기 위해, 정제된 라파마이신을 침전, 여과를 통한 수합, 세척, 및 이후 진공 건조한다.

본 발명의 다른 국면 및 이점은 하기 발명의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 라파마이신의 신규한 화학적 정제 방법을 제공한다.

본원에서 사용될 경우, 저등급 또는 미정제라는 용어는, 순도가 90% 미만이고, 황색도가 2 초과이고, B:C 이성질체 비율 (본원에서는 이성질체 B:C 비율이라고도 함) 이 20:1 미만인 라파마이신을 의미하도록 의도된다. 한 구현예에서, B:C 이성질체 비율은 13:1 내지 11:1 의 범위이다.

다음 페이지의 반응식 1 은 정제 방법의 개략도를 제공한다. 제 1 단계에서는, 라파마이신 31,42-비스-O-트리메틸실릴 에테르 (라파마이신 31,42-비스-O-TMS 로도 알려져 있음) 를 형성하기 위해 저등급 라파마이신을 실릴화한다. 이러한 실릴화 반응은 미국 특허 제 6,277,983 호 (Shaw 등) 에 상세히 기재되어 있다.

반응식 1

요컨대, 실릴화는 미정제 라파마이신을 약 0℃ 내지 약 5℃ 에서 적절한 염기의 존재 하에 비활성 용매 중에 클로로트리메틸실란으로 처리함으로써 수행된다. 한 구현예에서, 용매는 에틸 아세테이트 (EtOAc) 이다. 다른 구현예에서, 실릴화제는 클로로트리에틸실란이다. 한 구현예에서, 염기는 이미다졸, 예컨대 이미다졸 또는 1-메틸이미다졸이다. 그러나, 다른 구현예에서, 트리에틸아민 및 N,N-디이소프로필에틸아민이 염기로서 사용될 수 있다. 실릴화 후, 혼합물을 통상의 수단으로 여과하여 다 쓴 유기 염 및 다른 어두운색 고체들을 제거한다.

한 구현예에서, 라파마이신 31,42-비스-O-트리메틸실릴 에테르를 실온에서 헵탄으로 추출하고, 이어서, 통상의 수단을 이용하여, 여과에 의해 어두운색 불용성 불순물로부터 분리한다. 여과 후, 여과물을 목탄과 혼합한다. 한 구현예에서, Darco

KB 목탄을 사용한다. 그러나, 당업자는 Nuchar

SA 목탄 또는 Darco

G-60 목탄과 같은 다른 목탄을 선택할 수 있다. 목탄은 색의 제거에 기여한다. 또한, 이는 중탄산나트륨 세정 동안 에멀젼의 형성을 방지한다.

이어서, 용액을 여과하고, 여과물을 하나 이상의 물 및 염기성 세정제로 처리한다. 한 구현예에서, 염기성 세정제는 중탄산나트륨이다. 다른 구현예에서는, 여과물을 먼저 물로 세정하고, 이어서 중탄산나트륨 포화 용액으로 세정한 다음, 다시 물로 세정한다.

이어서, 유기층을 제거하고, 약 25℃ 내지 약 30℃ 에서 감압 하에 농축시켜 담황색 거품을 수득한다. 이어서, 거품을 적절한 용매에 용해시키고, 약 0℃ 내지 약 5℃ 로 냉각시킨다. 한 구현예에서, 용매는 아세톤이다. 다른 구현예에서, 용매는 테트라히드로푸란, 아세토니트릴, 또는 아세트산이다. 당업자는 기타 적절한 용매를 선택할 수 있다.

이어서, 라파마이신을 생성하기 위해, 적절한 산을 이용하여, 추출된 라파마이신 31,42-비스-O-TMS 의 실릴기를 제거하고, 즉, 라파마이신 31,42-비스-O-TMS 를 탈보호시킨다. 한 구현예에서, 사용된 산은 황산이다. 다른 구현예에서, 황산은 0.5 N 황산이다.

한 구현예에서, 본 발명에 따라 제조된 라파마이신은 약 95% 초과의 순도 (HPLC 면적 % 에 의함) 를 가진다. 다른 구현예에서, 라파마이신은 약 98% 초과의 순도를 가진다. 한 구현예에서, 라파마이신은 1.0 이하의 황색도 (본원에서 황색 지수 (yellow color index) 라고도 함) 를 가진다. 또다른 구현예에서, 라파마이신은 95% 초과의 순도 및 1 미만의 황색 지수를 가진다. 또다른 구현예에서, 라파마이신은 98% 초과의 순도 및 1 미만의 황색 지수를 가진다.

임의로는, 생성물의 B:C 이성질체 비율을 증가시키기 위해, 반응 혼합물의 pH 를 약 5 내지 약 6 의 pH 로 조정한다. 한 구현예에서, 수성 중탄산나트륨 및 아세트산을 라파마이신의 아세톤 용액에 첨가한다. 한 구현예에서, 이어서, 아세트산나트륨-아세트산 완충 용액을 첨가하여 아세톤과 완충제의 부피비를 조정한다. 다른 구현예에서, 아세트산칼륨 또는 아세트산아연을 사용한다. 또다른 구현예에서, 완충 용액의 pH 는 약 5 내지 약 5.5 이다. pH 를 조정하기 위한 기타 완충 시스템, 산 등은 당업자에게 공지되어 있을 것이며, 이는 본 발명에 의해 고려된다. 다음 페이지의 반응식 2 는 이러한 pH 조정을 통해 생성된 이성질체 균형의 변화에 관한 대표도를 제공한다.

반응식 2

한 구현예에서, 완충을 통해 수득된 이성질체 B:C 비율은 약 30:1 을 초과한다. 또다른 구현예에서, 이성질체 B:C 비율은 약 35:1 을 초과한다.

정제된 라파마이신 용액을 실온 (약 20℃ 내지 약 25℃) 에서 교반하여 침전된 생성물을 수득한다. 한 구현예에서, 반응 혼합물을 60 시간 동안 교반한다. 이어서, 통상의 여과 수단에 의해 생성물을 수합한다. 이어서, 수합된 생성물을 세정한다. 한 구현예에서, 생성물을 아세톤과 물의 1:1 (v/v) 혼합물로 세정한다. 또다른 구현예에서, 세정을 2 회 실시한다. 당업자는 기타 생성물 세정 수단을 알고 있을 것이며, 이는 본 발명의 방법에 의해 고려된다.

한 구현예에서, 세정된 생성물을 대략 35 내지 40℃ 에서 진공 하에 건조하지만, 건조 조건은 본 발명을 제한하지 않는다.

본 발명의 방법으로 수득된 정제된 라파마이신은 약학 조성물에 유용하다. 따라서, 수득된 라파마이신은 라파마이신에 대해 당업계에 기재된 임의의 적절한 방법에 의해 제형화될 수 있다. 한 구현예에서, 조성물은 수득된 정제된 라파마이신 및 생리적으로 적합한 담체를 함유한다. 본원에서 사용될 경우, 담체라는 용어는 생리적으로 적합한 담체를 의미하는 것으로 의도된다. 본 발명의 조성물에 사용하기에 적합한 담체는 하기에 기재된다.

본 발명의 활성 화합물을 함유하는 경구 제형물은 정제, 캡슐, 협측 형태, 트로키제 (troche), 로젠지 (lozenge) 및 경구 액체, 현탁액 또는 용액을 포함하는 통상적으로 사용되는 임의의 경구 형태를 포함할 수 있다. 캡슐은 약학적으로 허용가능한 전분 (예, 옥수수, 감자 또는 타피오카 전분), 당류, 인공 감미료, 분말화된 셀룰로오스, 예컨대 결정성 및 미세결정성 셀룰로오스, 밀가루, 젤라틴, 검 등과 같은 비활성 충전제 및/또는 희석제와 활성 화합물(들) 의 혼합물을 함유할 수 있다. 유용한 정제 제형물은 통상의 압축, 습식 과립화 또는 건식 과립화 방법에 의해 제조될 수 있으며, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 탈크, 나트륨 라우릴 술페이트, 미세결정성 셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 알긴산, 아카시아 검, 잔탄 검, 시트르산나트륨, 복합 실리케이트, 탄산칼슘, 글리신, 덱스트린, 수크로스, 소르비톨, 인산2칼슘, 황산칼슘, 락토오스, 카올린, 만니톨, 염화나트륨, 탈크, 건조 전분 및 가루 설탕을 포함하지만 이에 제한되지는 않는, 약학적으로 허용가능한 희석제, 결합제, 윤활제, 붕해제, 표면 개질제 (계면활성제 포함), 현탁제 또는 안정화제를 이용할 수 있다. 바람직한 표면 개질제에는 비이온성 및 음이온성 표면 개질제가 포함된다. 표면 개질제의 대표적 예에는, 폴록사머 188, 벤즈알코늄 클로라이드, 칼슘 스테아레이트, 세토스테아릴 알콜, 세토마크로골 유화 왁스, 소르비탄 에스테르, 콜로이드성 이산화규소, 인산염, 나트륨 도데실술페이트, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 및 트리에탄올아민이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 본원에서 경구 제형물은 활성 화합물(들) 의 흡수를 변화시키기 위해 표준 지연 또는 지속 방출 제형물을 이용할 수 있다. 경구 제형물은 또한 필요한 경우 적절한 가용화제 또는 유화제를 함유하는 물 또는 과일 주스 중 활성 성분의 투여로 이루어질 수 있다.

일부 경우, 화합물을 에어로졸 형태로 기도에 직접 투여하는 것이 바람직할 수 있다.

화합물은 또한 비경구 또는 복막내 투여될 수 있다. 유리 염기 또는 약리학적으로 허용가능한 염으로서의 이러한 활성 화합물의 용액 또는 현탁액은 히드록시-프로필셀룰로오스와 같은 계면활성제와 적절히 혼합된 물 중에서 제조될 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 오일 중 혼합물 중에서 제조될 수 있다. 통상의 저장 및 사용 조건 하에서, 이러한 제제들은 미생물 성장을 방지하는 방부제를 함유한다.

주사용으로 적합한 약학적 형태에는 멸균 수성 용액 또는 분산액 및 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제제용 멸균 분말이 포함된다. 모든 경우, 그 형태는 멸균되어야 하며, 주사가 용이한 정도로 유체이어야 한다. 이는 제조 및 저장 조건 하에서 안정해야 하며, 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 이의 적절한 혼합물, 및 식물유를 함유하는 분산 매질 또는 용매일 수 있다.

본 발명에 유용한 비경구 제형물을 사용하여, 직접 주사에 의해 또는 정맥내 주입용 멸균 주입 유체에의 첨가에 의해 투여하기에 적합한 투여 형태를 제조할 수 있다.

경피 투여는 상피 및 점막 조직을 포함하는 신체적 통로의 안쪽 면 및 신체의 표면을 거친 모든 투여를 포함한다. 이러한 투여는 본 발명 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 사용하여, 로션, 크림, 폼 (foam), 패치, 현탁액, 용액, 및 좌제 (직장내 및 질내) 로 수행될 수 있다.

경피 투여는 활성 화합물, 및 상기 활성 화합물에 대해 비활성이고 피부에 무독성이며 피부를 통한 혈액 내로의 전신적 흡수를 위한 약제의 전달을 가능하게 하는 담체를 함유하는 경피 패치를 사용하여 이루어질 수 있다. 담체는 크림 및 연고, 페이스트 (paste), 젤, 및 폐색 장치와 같은 여러 형태를 취할 수 있다. 크림 및 연고는 점성 액체 또는 수중유 (oil-in-water) 또는 유중수 (water-in-oil) 형의 반고체 (semisolid) 에멀젼일 수 있다. 활성 성분을 함유하는, 페트롤륨 또는 친수성 페트롤륨 중에 분산된 흡수성 분말로 이루어진 페이스트가 또한 적합할 수 있다. 활성 성분을 혈류 내로 방출시키기 위해, 활성 성분을 함유하는 매트릭스, 또는 담체의 유무 하에 활성 성분을 함유하는 저장소 (reservoir) 를 덮는 반투과성 막과 같은 다양한 폐색 장치를 사용할 수 있다. 기타 폐색 장치가 문헌에 공지되어 있다.

좌제 제형물은 코코아 버터 (좌제의 융점을 변화시키기 위해 왁스를 첨가하거나 첨가하지 않음) 및 글리세린을 포함하는 전통적 물질로부터 제조될 수 있다. 수용성 좌제 기제 (base), 예컨대 다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜이 또한 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명에 따라 제조되고 적절한 전달 방법으로 투여하기 위해 제형화된 정제된 라파마이신을 함유하는 키트 및 포장을 제공한다. 한 구현예에서, 정제된 라파마이신은 단위 투여 형태로 존재한다. 병, 바이알, 블리스터 팩 (blister pack) 등을 포함하는 다양한 적절한 용기가 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 포장 및 키트는 추가로 사용 설명서, 주사기, 어플리케이터 등을 포함한 기타 성분들을 함유할 수 있다.

하기 실시예는 본 발명의 예시이며, 본 발명을 제한하는 것은 아니다.

실시예 - 라파마이신 31,42-비스-O-트리메틸실릴 에테르를 통한 라파마이신의 정제

미정제 라파마이신 (20.0 g, 19.5 mmol, 황색도 = 24.23, 순도 = 89% 및 B:C 이성질체 비율 = 11:1) 의 300 ml 에틸 아세테이트 중 용액을 0 - 5 ℃ 로 냉각시켰다. 이미다졸 (6.0 g, 88.1 mmol) 을 첨가하고, 혼합물을 교반하여 용액을 형성하였다. 이러한 냉 (cold) 용액에 8.73 g (80.4 mmol) 의 클로로트리메틸실란을 30 분에 걸쳐 적가하고, 추가로 30 분간 0 - 5℃ 에서 교반하여 라파마이신 31,42-비스-O-트리메틸실릴 에테르의 형성을 완료하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 여과물을 감압 하에 어두운색 거품으로 농축시켜, 이를 400 ml 의 헵탄과 함 께 실온에서 20-30 분간 교반하였다. 혼합물을 여과하여 불용성 물질을 분리하였다. 여과물을 3.0 g 의 Darco

KB 목탄과 함게 실온에서 20-30 분간 교반한 다음 여과하고, 여과물을 추가로 물 (160 ml), 중탄산나트륨 포화 용액 (80 ml), 이어서 물 (2 x 80 ml) 로 세정하여 pH 가 6-7 이 되게 하였다. 밝은 황색 유기층을 감압 하에 25 - 30℃ 에서 농축시켜, 24.0 g 의 생성물을 담황색 거품으로 수득하였다.

상기 거품 (24.0 g) 을 100 ml 의 아세톤에 용해시키고, 교반하고, 0 - 5℃ 로 냉각시켰다. 상기 냉 용액에 20 ml 의 0.5 N 황산을 10 분에 걸쳐 적가하였다. 반응이 완료될 때까지 혼합물을 0 - 5℃ 에서 교반하였다. 중탄산나트륨의 용액 (1.68g/20 ml 물) 을 2-5 분에 걸쳐 첨가하였다. 포트 (pot) 온도를 10 - 15℃ 로 상승시켰다. 아세트산 (2 ml) 을 첨가하고, 혼합물을 15-20 분간 교반하였다. 반응 혼합물에 50 ml 의 아세트산나트륨 완충 용액 (pH 5-5.5) 을 10 분에 걸쳐 분량씩 첨가하고, 혼합물을 주변 온도에서 60 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 아세톤-물 (1:1;v/v) 혼합물 (2 x 60 ml) 로 세정하였다. 생성물을 35-40℃ 의 진공 오븐 내에서 일정 중량까지 건조시켜, 15.58 g 의 생성물을 백색 고체로서 수득하였다. 생성물의 양성자 NMR 은 참 시료 (authentic sample) 와 일치하였다.

회수율은 87.6%, 생성물의 순도는 98.7%, B:C 이성질체 비율은 35:1, 및 황색도는 0.73 이었다.

본원에서 언급된 모든 특허, 공보, 및 기타 문헌들은 참조로써 삽입된다. 당업자는 본원에 기재된 특정 구현예에 기재된 조건 및 기술에 대한 약간의 변형이 본 발명을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양할 수 있음을 인지할 것이다. 이러한 약간의 변형 및 변경은 하기 특허청구범위로 정의되는 바와 같은 본 발명의 범주 내이다.

Claims (20)

1. 순도가 98% 초과이고 황색 지수가 1 미만인 라파마이신.
2. 제 1 항에 있어서, 이성질체 B:C 비율이 30:1 초과인 라파마이신.
3. 제 1 항에 있어서, 이성질체 B:C 비율이 35:1 초과인 라파마이신.
4. 제 1 항에 따른 라파마이신 및 생리적으로 적합한 담체를 함유하는 조성물.
5. 이성질체 B:C 비율이 30:1 초과인 라파마이신을 함유하는 조성물.
6. 제 5 항에 있어서, 이성질체 비율이 35:1 초과인 조성물.
7. 하기를 포함하는, 라파마이신의 정제 방법:

   (a) 라파마이신을 적절한 염기의 존재 하에 비활성 용매 중에 클로로트리메틸실란으로 처리하여 라파마이신 31,42-비스-O-트리메틸실릴 에테르를 제공하는 단계;

   (b) 라파마이신 31,42-비스-O-트리메틸실릴 에테르를 여과하는 단계;

   (c) 라파마이신 31,42-비스-O-트리메틸실릴 에테르를 헵탄으로 추출하는 단 계;

   (d) 추출된 라파마이신 31,42-비스-O-트리메틸실릴 에테르를 세정하는 단계; 및

   (e) 추출된 라파마이신 31,42-비스-O-트리메틸실릴 에테르를 산으로 탈보호시켜 라파마이신을 생성하는 단계.
8. 제 7 항에 있어서, 단계 (d) 가 하기를 포함하는 방법:

   (i) 단계 (c) 의 용액을 여과함;

   (ii) 여과물을 목탄과 혼합함;

   (iii) 여과물을 물과 중탄산나트륨으로 세정함;

   (iv) 여과물을 농축시킴; 및

   (v) 여과물을 적절한 용매에 용해시킴.
9. 제 8 항에 있어서, 적절한 용매가 아세톤, 테트라히드로푸란, 아세토니트릴 및 아세트산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
10. 제 8 항에 있어서, 적절한 용매가 아세톤인 방법.
11. 제 7 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로 하기를 포함하는 방법:

    (f) 라파마이신 용액의 pH 를 약 5 내지 약 6 의 pH 로 조정하는 단계.
12. 제 11 항에 있어서, 그렇게 하여 제조된 라파마이신이 30:1 초과의 이성질체 B:C 비율을 갖는 방법.
13. 제 11 항에 있어서, 그렇게 하여 제조된 라파마이신이 35:1 초과의 이성질체 B:C 비율을 갖는 방법.
14. 제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 아세트산나트륨, 아세트산칼륨 또는 아세트산아연의 완충 용액으로 pH 를 조정하는 방법.
15. 제 14 항에 있어서, 완충 용액이 아세트산나트륨인 방법.
16. 제 11 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로 하기 단계를 포함하는 방법:

    (g) 라파마이신을 침전시키는 단계;

    (h) 라파마이신을 여과에 의해 수합하는 단계;

    (i) 라파마이신을 아세톤과 물의 혼합물로 세정하는 단계; 및

    (j) 라파마이신을 진공 하에 건조시키는 단계.
17. 제 7 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 중 비활성 용매가 에틸 아세테이트인 방법.
18. 제 7 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 중 적절한 염기가 이미다졸인 방법.
19. 제 7 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (e) 중 산이 황산인 방법.
20. 제 7 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 그렇게 하여 제조된 라파마이신이 98% 초과의 순도를 갖는 방법.