CN101102746A - 包含笃斯越桔提取物的用于改善皮肤状况的组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含笃斯越桔提取物的用于改善皮肤状况的组合物及其制备方法，其中所述笃斯越桔提取物作为活性组分。所述笃斯越桔提取物可抑制和清除因皮肤受到紫外线照射而在皮肤组织中生成的活性氧物质，有效地抑制酪氨酸酶活性以抑制黑色素在黑素细胞中的生成，抑制细胞因子在角质细胞中的分泌，促进原胶原的生成并抑制胶原的分解。因此，所述提取物可用于防止由紫外线照射造成的皮肤光老化，促进皮肤增白和除皱。另外，笃斯越桔提取物适合在化妆品、食品和药物中用作去除皮肤皱纹的组分，因为甚至是涂敷在皮肤上或者内用时，笃斯越桔提取物也可以获得改善皮肤状况的效果。

Description

包含笃斯越桔提取物的用于改善皮肤状况的组合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及用于改善皮肤状况的组合物，该组合物含有笃斯越桔(Vaccinium uliginosum L.)提取物，更具体地说，本发明涉及用于改善皮肤状况(皮肤老化)的组合物，该组合物可以预防和改善皮肤变色、雀斑、色素沉着等，以促进皮肤变白，可以预防和去除皮肤皱纹，还可以提高皮肤的弹性。用于改善皮肤状况的本发明组合物可以容易地以提取物或干燥的提取物粉末的形式制备，并且可以用作用于改善皮肤状况的化妆品、功能性保健食品、药物等的一个组分。
背景技术
近来，随着平均寿命的延长，老年人口增加，在医学、生物学和食品领域对衰老的研究也在逐步增加。所有活的生物体都会因为年龄增长而衰老，其中，衰老意味着随着时间的推移，生物体适应环境变化的能力逐渐减弱。
同样，皮肤也会衰老。由于皮肤的衰老，皮肤状况会恶化，主要表现为皮肤皱纹和色素沉着的出现，以及皮肤弹性的下降等。皮肤内外环境中出现的各种因素造成各种结构变化，从而使皮肤经历老化过程。然而，现代人都希望让皮肤变得更加清洁和漂亮，因此，人们正在积极地对用于改善皮肤状况(防止皮肤衰老)的方法和材料进行各种研究和实验。
皮肤老化(主要表现为造成皮肤状况恶化)的原因可以粗略地划分为内在老化和外在老化。内在老化随着年龄的增大而出现，而外在老化是由于外部因素(例如紫外线照射)造成的。具体地说，外在老化也称为“光老化”，这是因为，光老化主要因紫外线照射而进展。在内在的皮肤老化过程中，皮肤的特征性临床表现包括细纹、真皮萎缩和皮下脂肪层的减少。在由于阳光紫外线照射(这是外在老化的最主要原因)造成的光老化过程中，由于紫外线的照射，皮肤表皮中产生了大量的活性氧物质(ROS)，其中，所述活性氧物质导致黑色素增加，从而引起色素沉着，抑制了皮肤中胶原蛋白和弹性蛋白的生物合成，并且引发对胶原蛋白和弹性蛋白分解的刺激，因而形成皱纹。本发明具体涉及对经历了光老化过程的皮肤状况进行改善(皮肤增白、除皱等)。
尽管光老化的作用机制尚不明确，但是通过各种研究已经知道，紫外线照射造成核酸和蛋白变异以及脂质氧化，从而造成细胞染色体变异和细胞膜损伤，或者介导活性氧物质而造成细胞变异。另外，来自太阳的紫外线照射造成炎症反应(例如红斑和水肿)和各种临床变化(例如皮肤发黑和真皮细胞之间的物质变异)。此外，目前正在进行一些研究，以便判断在如此之多的反应中，是否有的反应与皮肤皱纹、皮肤弹性等有密切关系。
由于紫外线照射所造成的光老化和自然老化等，皮肤状况恶化，由此而可能出现的典型现象包括皮肤颜色变黑和变暗。与皮肤颜色有关的色素包括黑色素、类黑素、胡萝卜素、氧化的血色素和还原的血色素，最重要的是黑色素。黑色素具有用于自我保护的掩蔽功能，它可吸收或散射紫外线，以防止细胞或细胞中的组织受到紫外线照射引起损伤。黑色素没有特征峰吸收波长，其吸收全波长范围内的光，而且还具有从皮肤除去活性氧物质(例如过氧化物阴离子、过氧化氢、羟基自由基和单线态氧)的优良性能。
然而，当皮肤中存在过量的黑色素时，黑色素本身会产生活性氧，并且在某些情况中，会利用黑色素结构中的儿茶酚或苯醌还原或氧化其他物质。另外，已知黑色素本身显示出自由基性能，使得它在人体上形成变色、雀斑等，从而使皮肤变黑变暗，加速皮肤老化，并且会诱发皮肤癌。
已知的黑色素的生成途径包括化学途径，其中，利用酪氨酸酶由酪氨酸经DOPA和DOPA-醌生成黑色素，或者包括通过黑素细胞向角质细胞转移而生成黑色素的途径。
通过抑制黑色素的生成而使皮肤增白的已知方法包括：屏蔽紫外线的方法；抑制对于酪氨酸酶活性所必需的核碳水化合物合成的方法；抑制酪氨酸酶(它是与黑色素形成有关的酶)的活性的方法；使用对黑素细胞具有特异性的毒性物质干扰黑素细胞的清除的方法；以及使用维生素C衍生物和胎盘提取物的方法。
日本特开平6-192062披露了作为增白物质的氢醌。所披露的氢醌显示出优异的增白效果，但问题是，它属于致癌物质而不适合用作化妆品等的原料。日本特开昭56-7710披露了作为增白物质的曲酸。曲酸显示出抑制酪氨酸酶的良好性能，从而产生良好的增白效果，但问题是，由于它有毒性而不适合用作化妆品、食品等的原料。日本特开平4-9315披露了作为增白物质的熊果苷，熊果苷从分布于高山地区的天然植物熊果提取或合成得到。然而，熊果苷存在造成皮肤刺激的问题。另外，诸如薏苡和黄瓜等天然物质很早就已经使用，但是这些物质对于黑色素的过量生成没有作用。
随着皮肤状况因光老化等而恶化，出现的典型现象有皮肤颜色变黑变暗，皮肤上皮受损并且出现皱纹。已知由于光老化在真皮变化中非常突出，所以皱纹的出现也归因于真皮的变化。具体地说，皮肤的真皮层的明显变化是，无定形弹性组织在外部真皮中过度累积和真皮胶原纤维减少。
尽管目前难以清楚地理解变皱的过程，但是已经有很多与变皱有关的结果，包括真皮胶原合成的下降、真皮胶原的分解活性增加、表皮基膜的损伤和表皮代谢活性的降低。另外，据信皱纹的出现是由紫外线诱导的各种生物化学和临床变化的综合作用造成的。
在先前为解决皮肤皱纹问题而进行的尝试中，有使化妆品中含有胶原的例子。然而，如果将胶原以化妆品的形式涂在皮肤表面，则存在的问题是，难以透皮吸收聚合物胶原，使得不能充分预期其功能。此外，有的方法直接将胶原注入皮肤真皮中，但是该方法具有副作用，因而认为不能作为去除皮肤皱纹的方案。
已知刺激胶原合成的物质包括视黄酸和来自动物胎盘的蛋白(日本特开平8-231370)。视黄酸需要复杂的配制技术，并且由于其导致例如皮肤刺激而具有使用安全方面的局限。来自动物胎盘的蛋白存在致命的问题，即，可能使用来自患有疯牛病(牛海绵状脑病)的牛的提取物。另外，α-羟基酸(ABA)已证实对人体有效，各种维生素A衍生物(类视黄醇)已经被开发用于化妆品。然而，目前证明具有可靠临床效果的只有这些物质和紫外线掩蔽剂。在欧洲，从20世纪90年代开始，化妆品就标明并宣称具有除皱效果，大约在1993年，用于改善皮肤状况的组分，诸如神经酰胺、AHA和视黄醇被引入化妆品中，并起了新的名称“功能性化妆品”。
几乎所有的化妆品公司都已经开发了用于皮肤增白或除皱的化妆品，但是这些产品仅限于化妆品，不能通过摄取来获得去除皮肤皱纹的效果。另外，考虑到“食用化妆品”比“涂敷用化妆品”具有更快的效果，所以迫切需要研究和开发用于改善皮肤状况的“食用化妆品”以及用于改善皮肤状况的“功能性食品”。
现有技术中报道了一些具有通过摄取来改善皮肤状况的效果的物质，这些物质包括很少数几种皮肤增白物质，例如维生素C、维生素E和番石榴提取物。即使在涂敷用化妆品的情况中，这类物质也仅限于氢醌和熊果苷的稳定化衍生物、曲酸和维生素C(据认为它们是氢醌的前体)以及天然物质(与黑色素合成有关的细胞因子调节剂)。在涂敷用化妆品的情况中，这些化合物的效果已经得到各种体外测试的验证，但是，由于这些化妆品不很令人满意，例如其手感不及其他的除皱和增湿产品，所以人们又合成了很多衍生物，并且检验了一些新的天然物质对皮肤状况的改善效果。然而，距离例如供口服施用的新型产品的成功开发仍然十分遥远。
同时，在本发明中首次用作去除皮肤皱纹的组分的笃斯越桔是属于杜鹃花(Rhododendron)科的落叶灌木，该植物自然生长在朝鲜半岛的汉拿山(Halla)、金刚山(Geumgang)和白头山(Baekdu)等地，在6～7月开花，在8月结果。笃斯越桔所含成分包括糖类(8％～11.8％)、果酸(2％～2.25％)、鞣酸(0.15％～0.25％)和纤维素。笃斯越桔目前已知的药理学作用包括脉管保护、痢疾治疗、抗溃疡、抗癌、糖尿病视网膜症的治疗、老年病的预防、产后恢复、血液净化、排尿和类风湿性关节炎的治疗。然而，笃斯越桔对皮肤除皱和皮肤增白的效果尚不为人所知。
发明内容
本发明的一个目的是提供用于改善皮肤状况的组合物及其制备方法，所述组合物含有作为活性组分的笃斯越桔提取物，并用于皮肤增白和除皱。
本发明的另一个目的是提供含有笃斯越桔提取物的化妆品组合物、食品组合物和药物组合物，及其作为试剂在改善皮肤状况中的应用。
本发明基于如下发现，即，笃斯越桔提取物具有抑制活性氧物质的生成或清除活性氧物质的抗氧化作用，所述活性氧物质是导致光老化的重要因素。当皮肤暴露于紫外线时，在角质细胞中将生成高浓度的诸如过氧化物自由基、羟基自由基、过氧化氢和单线态氧自由基等活性氧物质。已经发现，当将本发明的笃斯越桔提取物施用于受到紫外线照射的皮肤组织时，将显著降低活性氧物质的生成。
另外，本发明人新近发现，笃斯越桔提取物显示出通过抑制介导黑色素合成的酪氨酸酶的活性来抑制黑色素生成的效果，而且还显示出增强皮肤成纤维细胞中胶原的合成、抑制胶原的分解和抑制角质细胞中细胞因子分泌的效果。在所述发现的基础上，本发明人提出了笃斯越桔提取物在皮肤增白和除皱中的新用途。
笃斯越桔提取物是一种在本发明中用作皮肤改善剂的天然物质，它没有特别的副作用，因此非常适合于预防和去除皮肤皱纹以及增强皮肤弹性。另外，笃斯越桔提取物甚至在涂敷于皮肤上或者内服时，也能够充分地获得增白皮肤和改善皮肤状况(例如皱纹)的效果。
以下，本发明将就改善皮肤状况的组合物及其制备方法和具体应用实施方式进行详细描述。
用于改善皮肤状况的本发明组合物含有作为活性组分的笃斯越桔提取物。除了笃斯越桔提取物之外，根据所需制剂的不同，本发明组合物还可以进一步包含例如各种添加剂和稳定剂。笃斯越桔提取物从笃斯越桔的果实、叶子或茎皮提取获得，其中优选使用诸如水或醇等提取溶剂。
尽管对用作本发明主要组分的笃斯越桔提取物的制备方法没有具体限制，但是根据本发明，制备所述笃斯越桔提取物的一个优选方法如下。
首先，洗涤笃斯越桔的果实和/或叶子，并用水作为溶剂对其进行提取，获得未稀释的提取物(第一步骤)。更具体地说，相对于100g的笃斯越桔果实，优选使用800ml～1200ml的水溶剂，优选通过在40℃～100℃温度的水浴中加热所述植物10～15小时来进行提取。
然后，对在第一步骤中获得的笃斯越桔提取物进行过滤并收集上清液(第二步骤)。例如，优选通过多层纱布过滤所述笃斯越桔提取物，从而获得已经从中除去异物的上清液。
尽管仅使用第一步骤或第二步骤获得的笃斯越桔提取物也可以充分地获得本发明的改善皮肤状况的效果，但是优选进行如下的额外步骤。
在下一个步骤中，蒸发出第二步骤中获得的上清液所含有的溶剂，以浓缩所述笃斯越桔提取物，由此获得高度浓缩的笃斯越桔提取物(第三步骤)。优选将通过重复所述第一步骤和第二步骤3次而获得的上清液合并在一起，通过旋转蒸发仪完全蒸发出经合并的上清液所含有的水，以便浓缩所述笃斯越桔提取物。
另外，在第三步骤之后，将所述经浓缩的笃斯越桔提取物溶解在少量蒸馏水中，然后对其进行冻干或喷雾干燥，如此可以以粉末的形式使用所述笃斯越桔提取物。
作为在第一步骤中用于提取笃斯越桔的溶剂，除了水以外，还可以使用诸如甲醇、乙醇、异丙醇或丁醇等醇。在这种情况中，将笃斯越桔的果实或叶子在20℃～90℃温度的醇中进行提取，或者进行超声处理。另外，也可以通过在室温或4℃通过渗滤法进行提取。
本发明的笃斯越桔提取物的具体应用实施方式包括用于改善皮肤状况的化妆品组合物、食品或功能性保健食品以及药物组合物，下文将对其进行详细描述。
本发明的笃斯越桔提取物可以在现有化妆品中用作改善皮肤状况(例如增白和除皱)的试剂，并且对所述化妆品制剂没有具体限制。当使用笃斯越桔提取物来制备化妆品时，除了笃斯越桔提取物之外，还可以使用常用于化妆品的组分，例如常规的佐剂和载体组分，如抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、色素和芳香剂等。化妆品制剂的实例包括溶液、悬浮液、乳液、糊状物、凝胶、乳膏、洗液、粉末、皂、含有表面活性剂的清洁油、粉底、乳液型粉底(emulsion foundation)和喷雾剂，并且任何本领域技术人员均可根据制剂类型选择使用适当的载体。
就增白效果而言优选的是，所述化妆品组合物应包含选自由熊果苷、曲酸、构树(Broussonetia)提取物、3-乙氧基抗坏血酸、甘草提取物以及它们的混合物组成的组中的至少一种组分。此外，所述化妆品组合物可以另外包含选自由视黄醇、棕榈酸视黄醇、聚乙氧基化视黄酰胺、腺苷、激动素、蚕茧提取物、异黄酮以及它们的混合物组成的组中的至少一种添加剂。
基于所述化妆品组合物的总重量，笃斯越桔提取物的干含量优选为0.0001重量％～10重量％。如果笃斯越桔提取物的含量小于0.0001重量％，除皱效果会不足，而如果该含量大于10重量％，笃斯越桔提取物会不易溶解。另外，增加笃斯越桔提取物含量时，预计并不能由此而使抑制酪氨酸酶活性和提高胶原合成的效果得到增强，而且还会造成原料成本的增加。
在笃斯越桔提取物的另一个应用实施方式中，本发明提供了用于改善皮肤状况(例如，增白和除皱)的食品，该食品含有笃斯越桔提取物和食品添加剂。
在此使用的短语“用于改善皮肤状况的食品”不仅包括普通食品，而且还包括“增补性保健食品”或“功能性保健食品”。术语“功能性保健食品”是指这样的食品，该食品能够符合食品的要求，采用例如片剂、胶囊、粉末、颗粒、液体和丸剂等形式，由具有对人体有用的功能的原料或组分加工制备(韩国法律编号为No.7428的功能性保健食品法第3条第(1)款)。在此使用的术语“功能性”是指获得对保健用途有用的效果，例如控制与人体的结构和机能有关的营养，或生理活动。即，该术语是指食品对健康的人或亚健康的人的保健有用。
甚至在摄取含有笃斯越桔提取物的食品或将其涂敷在皮肤上时，都可以充分地获得改善皮肤状况的效果。然而，就方便施用而言，本发明的提取物优选以功能性食品形式使用，这些食品的剂型为诸如片剂、糖衣片剂、胶囊和饮品等。
用于改善皮肤状况的所述食品的其他形式包括饮料、含酒精的饮品、泡菜、酸奶、乳品、冰淇淋、面包、米糕和面条。在此使用的术语“食品添加剂”是指在制备、加工和保存食品时通过例如添加、混合和渗透等用于所述食品的添加剂。
在另一个实施方式中，本发明提供了用于改善皮肤状况的药物组合物，该药物组合物包含笃斯越桔提取物和药用载体。所述笃斯越桔提取物具有抗氧化剂的功能，并显示出以下效果，它不仅能够消除由紫外线引起的皮肤皱纹(例如通过刺激胶原的合成和抑制胶原的分解)，而且还能够抑制酪氨酸酶活性。根据下述实施例，将会清楚地理解这一点。
所述药物组合物的适当制剂包括但不限于片剂、糖衣片剂、硬胶囊或软胶囊、溶液、悬浮液、乳液、注射液和栓剂。所述载体的类型可以由本领域技术人员根据该药物组合物制剂的不同而容易地加以选择，并且可以含有能够用作稀释剂、芳香剂、增溶剂、润滑剂、悬浮剂、粘合剂和崩解剂的至少一种组分。
用于刺激胶原合成的所述提取物(含有笃斯越桔提取物)的剂量可以根据患者的需要、待处理的状况以及使用的化合物类型而改变，并且本发明的提取物即使在施用过量时也不会导致副作用的问题。通常优选的是，基于干粉，笃斯越桔提取物的剂量为0.001～0.10g/kg患者体重。
下文将首先结合本发明采用的笃斯越桔提取物的皮肤状况改善效果来说明皮肤增白过程和皱纹形成过程，然后将通过以下实施例和测试例来说明在使用笃斯越桔提取物时会出现的与皮肤皱纹有关的因子的任何变化。
当来自阳光的紫外光(这是皮肤老化的主要原因)照射到皮肤上时，在皮肤的表皮组织中将会生成活性氧物质。所生成的活性氧物质造成表皮组织的损伤并刺激表皮组织中的角质细胞，从而不仅分泌白介素(例如IL-1α、IL-1β和IL-6)，而且还分泌细胞因子(例如集落刺激因子和肿瘤坏死因子(TNF)-α)，其中所分泌的白介素或细胞因子影响皮肤细胞，从而诱导复杂的炎性反应和免疫反应。另外，活性氧物质还促进黑素体从黑素细胞向角质细胞的转移，并提高黑色素在黑素细胞中的生成，而且还抑制胶原在真皮成纤维细胞中的合成。这些现象对于光老化过程是非常重要的。
当角质细胞受到外部紫外线刺激时，它们会分泌炎性细胞因子等来促进黑素细胞的增殖和黑色素的生物合成，从而调节黑素细胞的生长和形成以及黑色素的分泌和分化中的各种因子。另外，照射到皮肤组织中的紫外线刺激皮肤中的黑素细胞分泌IL-1α，而所分泌的IL-1α又刺激黑素细胞分泌ET(内皮素)-1。所分泌的ET-1激活蛋白激酶C和腺苷环化酶系统，从而诱导黑素细胞的增殖，并促进酪氨酸酶的活性，从而导致色素沉着。
此外，上述在角质细胞中生成并分泌的白介素刺激诸如基质金属蛋白酶(MMP)-1(胶原酶)、MMP-3(基质溶素-1)和MMP-9(92-kd明胶酶)等基质降解酶的基因表达从而促进MMP的生成，而且它们还抑制原胶原的表达从而降低原胶原的生物合成。所述MMP-1(胶原酶)起到促进转化自I型原胶原的胶原分解的作用。即，当紫外线照射到皮肤时，所述MMP-1将降低I型原胶原的生成，并引起所生成的胶原的分解，从而减少皮肤上胶原的量。由于这一过程，皮肤上会形成皱纹。
通过以下测试例，并结合与皮肤增白和皱纹有关的上述因素，由此来对施用笃斯越桔提取物所产生的效果进行说明。
包含笃斯越桔提取物的用于改善皮肤状况的本发明组合物抑制并清除活性氧物质，该活性氧物质在皮肤受到紫外线照射时在皮肤组织中生成。另外，本发明的组合物能够有效地抑制酪氨酸酶的活性，从而抑制黑素细胞中黑色素的生成，并抑制角质细胞中的细胞因子的分泌，促进原胶原的生成，并抑制胶原的分解。因此，本发明组合物可用于防止由紫外线引起的皮肤光老化，并促进皮肤增白和改善皱纹状况。
附图说明
图1是显示笃斯越桔提取物的DPPH自由基清除活性的图表。
图2是显示笃斯越桔提取物在黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶系统中的过氧化物自由基清除活性的图表。
图3是显示笃斯越桔提取物在NADH/PMS系统中的过氧化物自由基清除活性的图表。
图4是显示笃斯越桔提取物的羟基自由基清除活性的图表。
图5是显示笃斯越桔提取物的单线态氧自由基清除活性的图表。
图6是显示在紫外线B照射之后来自经笃斯越桔提取物处理的角质细胞的过氧化物自由基的图表。
图7是显示在紫外线B照射之后来自经笃斯越桔提取物处理的角质细胞的羟基自由基的图表。
图8是显示在紫外线B照射之后来自经笃斯越桔提取物处理的角质细胞的过氧化氢自由基的图表。
图9是显示在紫外线B照射之后来自经笃斯越桔提取物处理的角质细胞的单线态氧自由基的图表。
图10是显示在紫外线B照射之后来自经笃斯越桔提取物处理的角质细胞的IL-1β释放的图表。
图11是显示在紫外线B照射之后来自经笃斯越桔提取物处理的角质细胞的IL-6释放的图表。
图12显示了经IL-1β和笃斯越桔提取物处理的人真皮成纤维细胞的I型原胶原浓度。
图13显示了经IL-1β和笃斯越桔提取物处理的人真皮成纤维细胞的MMP-1浓度。
图14是显示经过用紫外线照射皮肤并施用笃斯越桔提取物的无毛小鼠的皮肤复制品的照片。
图15(a)～15(d)显示由经过用紫外线照射皮肤并施用笃斯越桔提取物的无毛小鼠测得的H_R值。
图16显示当对皮肤分别施用笃斯越桔提取物和曲酸后，皮肤组织的B16黑素瘤细胞中的黑色素浓度。
图17显示在紫外线B照射后，对皮肤分别施用笃斯越桔提取物和曲酸后的皮肤组织的黑素瘤细胞中的黑色素浓度。
具体实施方式
制备例1：笃斯越桔提取物的制备
在50℃水浴中，将100g从韩国北汉山(Bukhan)采集到的笃斯越桔果实和500ml的80％的水一起加热12小时，获得笃斯越桔提取物。用多层纱布过滤所述笃斯越桔提取物并收集上清液。将通过重复所述提取和过滤过程3次获得的上清液合并在一起，用旋转蒸发仪在减压下完全蒸发掉所合并的上清液中含有的水，获得经浓缩的热水提取物。
制备例2：笃斯越桔提取物粉末的制备
将经浓缩的所述笃斯越桔提取物溶解在蒸馏水中，然后对其进行喷雾干燥，从而制得粉末形式的最终的笃斯越桔提取物。
制备例3：笃斯越桔提取物的制备
将100g笃斯越桔果实加入到500ml的80％的甲醇(甲醇∶水＝4∶1)中，并在室温进行4次超声处理，获得提取物。将用纱布过滤该提取物，然后收集上清液。将通过重复所述提取和过滤过程3次获得的上清液合并在一起，用旋转蒸发仪在减压下蒸发出所合并的上清液中含有的甲醇。将残留的提取物溶解在少量的蒸馏水中，获得笃斯越桔的醇提取物。
实施例1：用于改善皮肤状况的皮肤洗液的制备
使用制备例1中制得的笃斯越桔提取物(液相)，以常规方法制备皮肤洗液。该皮肤洗液的组分和含量如下表1所示。
(表1)
    组分     含量(重量％)
    笃斯越桔提取物     0.5
    丙三醇     5
    1，3-丁二醇     3
    乙醇     10
    透明质酸钠     5
    PEG 1500     1
    Alantoin     0.1
    二苯甲酮     0.04
    Octyldodeces-16     0.2
    聚山梨醇酯     0.2
    蒸馏水     余量
    合计     100
实施例2：用于改善皮肤状况的洗液的制备
使用制备例1中制得的笃斯越桔提取物(液相)，以常规方法制备洗液。该洗液的组分和含量如下表2所示。
(表2)
    组分     含量(重量％)
    笃斯越桔提取物     1
    丙三醇     5
    1，3-丁二醇     3
    透明质酸钠     5
    角鲨烷     5
    硬脂酸甘油酯     1.5
    硬脂醇     1.5
    聚山梨酸酯60硬脂酸酯     1.5
    羊毛脂     1
    失水山梨醇硬脂酸酯     0.7
    三辛酸甘油酯(Trioctanoin)     1.5
    二甲聚硅氧烷     1
    芳香剂     0.01
    蒸馏水     余量
    合计     100
实施例3：用于改善皮肤状况的功能性食品(片剂)的制备
将5mg在制备例2中制得的笃斯越桔提取物(粉末)与150mg乳糖BP、30mg淀粉和15mg预凝胶化的玉米淀粉BP混合。然后，向其中加入适当量的纯净水，并将该混合物粒化成粉末。干燥该颗粒，并将其与1mg的硬脂酸镁混合，经压缩获得片剂。
实施例4：用于改善皮肤状况的功能性食品(饮料)的制备
向包含功能性饮料基料的组合物中加入纯净水，从而制得饮料，所述功能性饮料基料含有2mg在制备例1中制得的笃斯越桔提取物、5mg食品着色剂、5mg橙精、700mg果糖、10mg柠檬酸和5mg维生素。
实施例5：用于改善皮肤状况的功能性食品(糖浆)的制备
将637.5g白糖溶解在500ml的纯净水中。在另外的容器中，将2.0g羧甲基纤维素钠溶解在400ml纯净溶液中，然后将其与白糖溶液混合。向该混合溶液中加入0.28g对羟基苯甲酸甲酯和0.12g对羟基苯甲酸丙二醇酯并溶解，向其中加入20ml乙醇，并向其中加入纯净水使得溶液总体积为1000ml。将过筛的制备例1中制得的笃斯越桔提取物悬浮在该溶液中而获得糖浆。
实施例6：软膏的制备
将5g制备例1中制得的笃斯越桔提取物与20g棕榈酸十六烷基酯、40g的十六烷醇、40g硬脂醇、80g肉豆蔻酸异丙酯、20g失水山梨醇单硬脂酸酯、60g聚山梨醇酯、1g对羟基苯甲酸丙酯、1g对羟基苯甲酸酯和适量的纯净水混合，从而制得软膏。
实施例7：含酒精的功能性饮品的制备
以40重量％的浓度将经去臭并纯化的酒精稀释在蒸馏水中，然后，基于100重量份经稀释的酒精溶液，以0.05重量份的量向其中加入在制备例3中制得的笃斯越桔提取物。向该溶液中加入适量的甜菊苷、高果糖、氨基酸、柠檬酸和盐，从而制得含有笃斯越桔提取物的含酒精的功能性饮品。
测试例1：活性氧物质(ROS)清除活性
1.DPPH自由基清除活性的测定
将0.8ml在乙醇中的1mM DPPH(2，2-二苯基-1-苦基偕腙肼)与0.2ml在制备例1中制得的笃斯越桔提取物混合，并将该混合物在37℃静置30分钟，然后测定517nm处的吸光率。使用抗坏血酸(维生素C)作为对照药物。结果以相对于未处理样品组的百分比来表示。
在测试结果中，笃斯越桔提取物在10mg/mL浓度时的DPPH自由基清除活性比100μM的维生素C的高3倍，在1mg/mL浓度时比100μM的维生素C的高约2倍(见图1)。图1显示制备例1中制得的笃斯越桔提取物的DPPH自由基清除活性。图1上部所示的按照字母次序示出的字母显示通过邓氏多重范围检验(Duncan′s multiple range test)，各组中在p＜0.05时显著不同的值。
2.过氧化物自由基清除活性的测定
2-1.黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶系统
在24孔板中，将600μl的0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.5)、各50μl的具有不同提取物浓度的笃斯越桔提取物溶液和50μl黄嘌呤氧化酶(0.068μg/mL)相互混合，并在25℃静置30分钟。向该混合物中加入100μl的1M HCl以终止反应，然后测定295nm处的吸光率。作为对照药物，使用已知具有抑制黄嘌呤氧化酶的药物别嘌呤醇。结果以相对于未处理样品组的百分比来表示。如图2所示，笃斯越桔提取物在0.01mg/mL浓度时清除黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶系统(其为酶促过氧化物自由基生成系统)中的过氧化物自由基的活性与10μM维生素A的相同，并对应于1μM别嘌呤醇和10μM别嘌呤醇之间的清除活性。
2-2.NADH-PMS系统
在24孔板中，分别按73μM、15μM和50μM的浓度将NADH、吩嗪硫酸二甲酯和NBT加入到20mM的磷酸钾缓冲液(pH7.4)中，制得1.8mL的溶液。按不同浓度，向该溶液中加入0.2ml在制备例1中制得的笃斯越桔提取物。将该混合物在37℃静置20分钟，然后测定560nm处的吸光率。使用抗坏血酸(维生素C)作为对照药物。结果以相对于未处理样品组的百分比来表示。如图3所示，笃斯越桔提取物在0.1mg/mL的提取物浓度时清除NADH/PMS系统(其为非酶促过氧化物自由基生成系统)中的过氧化物自由基的活性与100μM维生素C的相等。
3.羟基自由基清除活性的测定
在24孔板中，将0.8ml的5.94mM H2O2和0.8ml的含有26.4mMFeSO4的乙醇溶液加入到0.2ml的β-胡萝卜素乙醇溶液中，向其中加入0.2ml在制备例1制得的笃斯越桔提取物。测定该混合物在436nm处的吸光率。使用抗坏血酸(维生素C)作为对照药物。结果以相对于未处理样品组的百分比来表示。测试结果显示，笃斯越桔提取物在0.05mg/mL的提取物浓度时的羟基自由基清除活性与100μM维生素C的近似(见图4)。
4.单线态氧清除活性的测定
向1.9ml在45mM的磷酸钠缓冲液(pH7.1)中的10mM精氨酸、10mMNaOCl、10mM H2O2和50mM N，N-二甲基-对硝基苯胺的混合溶液中，按不同浓度加入0.1ml的笃斯越桔提取物。将所得溶液在30℃静置40分钟，然后测定440nm处的吸光率。使用α-生育酚(维生素E)作为对照药物。结果以相对于未处理样品组的百分比来表示。测试结果显示，笃斯越桔提取物浓度在0.1mg/mL和0.01mg/mL之间时的单线态氧清除活性没有差异，并与100μM维生素E的相等(见图5)。
测试例2：抑制角质细胞中ROS生成的能力
-人角质细胞的培养
通过活检从13岁男性的皮肤组织中收集人角质细胞，并在37℃和5.0％的CO2的条件下在CO2培养箱中，将该人角质细胞培养在角质细胞基础培养基(改进的MCDB 153培养基)中，该培养基含有100ng/mL的人重组表皮生长因子、70mg/mL的牛垂体提取物、0.5mg/mL的氢化可的松、5mg/mL的胰岛素、0.3mg/mL的庆大霉素和2.5mg/mL的两性霉素-B。为了在测试中使用，对角质细胞进行3次继代培养。
-抑制角质细胞中自由基生成的能力的测定
为了测定当皮肤受到紫外线照射时角质细胞中生成的ROS，将角质细胞按105个细胞/孔的细胞浓度接种在24孔板的各个孔中并静置17小时，并且确认细胞贴壁。然后，去掉培养基，并将笃斯越桔提取物溶液各2ml分加到培养板的各个孔中并静置24小时，所述笃斯越桔提取物溶液通过将该提取物按不同浓度溶解在培养基中而制得。静置结束后，去掉培养基，并将400μl的PBS(磷酸缓冲盐溶液)分加到培养板的各个孔中。接着，以45mJ/cm2的剂量用紫外线B照射培养板各个孔中的溶液，然后在60分钟内以10分钟的间隔测定ROS的生成量。
1.抑制过氧化物自由基生成的能力的测定
在24孔板中，将73μM的NADH、15μM的吩嗪硫酸二甲酯和50μM的NBT相互混合在20mM的磷酸钾缓冲液(pH7.4)中，制得1.8mL的溶液，然后向其中加入0.2ml在制备例1中制得的笃斯越桔提取物。在不同时间点收集0.2ml的上清液，并在37℃静置20分钟，然后测定560nm处的吸光率。
测定结果显示，在10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟和60分钟，在用2mg/ml的笃斯越桔提取物处理的组的情况中，相对于对照组，紫外线照射后角质细胞中的过氧化物自由基的生成量分别为31％、55％、42％、37％、45％和65％，而在用0.2mg/ml的笃斯越桔提取物处理的组的情况中，相对于对照组，过氧化物自由基的生成量分别为79％、86％、87％、89％、94％和94％。在10分钟～40分钟的时间段内，过氧化物自由基的生成量随浓度呈统计显著性下降，然后，该生成量在用2mg/ml的笃斯越桔提取物处理的组的情况中显著下降(见图6)。
2.抑制羟基自由基生成的能力的测定
在24孔板中，将0.8ml的5.94mMH2O2和0.8ml含有26.4mM FeSO4的乙醇溶液和0.2ml从各个时间点收集到的上清液相互混合在0.2ml的2.5mM β-角蛋白乙醇溶液中。测定所得溶液在436 nm处的吸光率。
测定结果显示，在用2mg/ml的笃斯越桔提取物处理的组的情况中，紫外线B照射后角质细胞中的羟基自由基的生成量在10分钟～50分钟的时段内下降，并且相对于对照组，羟基自由基的生成量百分比在10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟和60分钟时分别为46％、46％、42％、24％和37％(见图7)。
3.抑制过氧化氢生成的能力的测定
将1ml的3×10-6M东莨菪苷、400μl的10-2M叠氮化钠和0.5mL在各个时间点收集到的上清液相互混合并静置5分钟。向该混合物中加入100μl的150U/mL HPO(辣根过氧化物酶)和600μl的KRP(KrepsRinger磷酸盐缓冲液)，使用分光荧光计在360nm激发且在450nm发射的条件下测量所得溶液的吸光率。结果显示在图8中。如图8所示，在用2mg/ml的笃斯越桔提取物处理的组的情况中，相对于未用笃斯越桔提取物处理的对照组，紫外线照射后角质细胞中的过氧化氢生成量显著下降，其中相对于对照组，过氧化氢的生成量百分比在20分钟、30分钟、40分钟和50分钟时分别为61％、61％、39％和62％。
4.抑制单线态氧生成的能力的测定
将0.2ml在各个时间点收集到的上清液与在45 mM的磷酸钠缓冲液(pH7.1)中的10mM精氨酸、10mM NaOCl、10mMH2O2和50mM N，N-二甲基-对硝基苯胺的溶液混合，并在30℃静置40分钟，然后测定440nm处的吸光率。结果如图9所示。在笃斯越桔提取物处理的组的情况中，紫外线B照射后角质细胞中的单线态氧自由基的生成量从20分钟开始随浓度下降。相对于对照组(UV-C)，用2mg/mL的笃斯越桔提取物(V 2)处理的组的生成量在20分钟时显示为98％、在30分钟时显示为96％、在40分钟～60分钟时显示为93％，而用0.2mg/mL的笃斯越桔提取物(V 0.2)处理的组显示为99％的生成量。
测试例3：抑制角质细胞中细胞因子分泌的能力
为了测量在皮肤受到紫外线照射时角质细胞中生成的细胞因子的量，将角质细胞按105个细胞/孔的细胞浓度接种在24孔板上并静置17小时，并且确认细胞贴壁。然后，去掉培养基，并将笃斯越桔提取物溶液各2ml分加到培养板的各个孔中并静置24小时，所述笃斯越桔提取物溶液通过将该提取物按不同浓度溶解在培养基中而制得。静置结束后，去掉培养基，并将400μl的PBS(磷酸缓冲盐溶液)分加到培养板的各个孔中。接着，以40mJ/cm2的剂量用紫外线B照射培养板各个孔中的溶液。然后，计算在24小时内的不同时间点各溶液中生成的细胞因子的量。
1.抑制IL-1β分泌的能力的测定
用40mJ/cm2的紫外线B照射角质细胞，并在0小时、30分钟、1小时、3小时、6小时和24小时之后收集上清液，使用ELISA(酶联免疫吸附测定)分析试剂盒测定IL-1β的量。测定结果显示，在用2 mg/mL的笃斯越桔提取物处理的角质细胞中的IL-1β生成量与对照组相比有显著的降低，其中，相对于对照组，IL-1β的生成量在1小时、3小时、6小时和24小时时的生成量百分比分别为约37％、28％、29％和26％。另外，相对于对照组，用0.2mg/mL的笃斯越桔提取物处理的角质细胞中的IL-1β的生成量为约85％、88％、89％和73％(见图10)。
2.抑制IL-6分泌的能力的测定
用40mJ/cm2的紫外线B照射角质细胞，并在0小时、1小时、3小时、6小时和24小时之后收集上清液，使用ELISA分析试剂盒测定IL-6的量。测试结果显示，在用2mg/mL的笃斯越桔提取物处理的角质细胞中的IL-6生成量从3小时开始有显著下降，并且相对于对照组，IL-6的生成量百分比在3小时、6小时和24小时时分别为43％、61％和33％。另外，用0.2mg/mL的笃斯越桔提取物处理的组在6小时时的IL-6生成量显示出显著的下降，其中相对于对照组，该生成量百分比为约81％(见图11)。
测试例4：除皱效果的测试
-人的成纤维细胞的培养
通过活检从13岁男性的皮肤组织中收集人的成纤维细胞，并在37℃和5.0％的CO2的条件下在培养箱中，将该成纤维细胞培养在DMEM(Dulbecco改进的Eagle培养基)中，该培养基含有10％的胎牛血清、100 IU/mL的青霉素和50μg/mL的链霉素。
-除皱效果的测试
将人的成纤维细胞按105个细胞/孔的细胞浓度接种在24孔板中并静置17小时，并且确认细胞贴壁。然后，去掉培养基，并将笃斯越桔提取物溶液各2ml分加到培养板的各个孔中，所述笃斯越桔提取物溶液通过将制备例1中制得的提取物按不同浓度溶解在培养基中而制备。将孔板在CO2培养箱中培养48小时，然后去掉培养基并测定人的成纤维细胞中的I型原胶原(MMP-1)。
1.对人的成纤维细胞中的I型原胶原的促进作用
用不同浓度的笃斯越桔提取物溶液处理人的成纤维细胞，并在48小时之后收集上清液，然后使用I型原胶原C-肽(PIP)EIA(酶免疫测定)试剂盒测定人的成纤维细胞中生成的I型原胶原的量。
(表3)
    样品浓度(mg/ml)     原胶原浓度(ng/ml)
    对照     149.6±25.41)
    0.001     144.9±21.8
    0.005     155.1±20.1
    0.01     179.2±31.3
1)平均值±标准偏差
测试结果显示，与未用本发明提取物处理的对照组的149.6ng/mL相比，用笃斯越桔提取物处理的人的成纤维细胞中的I型原胶原生成量在0.005mg/mL浓度时为155.1ng/mL(103％)，而在0.01mg/mL时为179.2ng/mL(119％)。这表明，用本发明提取物处理的人的成纤维细胞中的I型原胶原生成量随浓度上升。胶原纤维的形成过程是，原胶原在成纤维细胞中合成，并分泌至细胞外，然后经历酶促作用、纤维形成和交联。因此，发现笃斯越桔提取物可以增加原胶原(胶原前体)的量，从而增强皮肤弹性并除皱。
2.抑制基质金属蛋白酶-1(MMP-1)的生成
按下表4所示，用不同提取物浓度的笃斯越桔提取物溶液处理人的成纤维细胞。在48小时之后，收集上清液，并使用MMP-1 EIA试剂盒测定成纤维细胞中生成的基质金属蛋白酶-1(MMP-1)的量。
(表4)
    样品浓度(mg/ml)     MMP-1浓度(ng/ml)
    对照     37.2±4.71)
    0.001     32.8±3.1
    0.005     27.1±5.5
    0.01     25.5±1.3
1)平均值±标准偏差
在测试结果中，未用本发明提取物处理的对照组中的MMP-1的生物合成量为37.2mg/mL，而用笃斯越桔提取物处理的组中的MMP-1的生成量在0.01mg/mL时为25.5ng/mL(68％)，并随浓度下降。已知MMP-1通过重复暴露于紫外线而在角质细胞和成纤维细胞中表达，并且是分解胶原的酶。因此，发现笃斯越桔提取物可以抑制MMP-1的活性以抑制皮肤胶原的分解，从而提高皮肤弹性并除皱。
3.将IL-1β加入到人的成纤维细胞中后I型原胶原生成量的变化
可以看出，将白介素(IL)-1β加入到人的成纤维细胞中后I型原胶原生成量低于不加IL-1β时的生成量，特别是I型原胶原的生成量随IL-1β的浓度而下降。然而，可以看出，当加入笃斯越桔提取物时，I型原胶原的生成量随笃斯越桔提取物的浓度而上升。图12显示了作为IL-1β浓度(10ng/mL和20ng/mL)和笃斯越桔提取物浓度(0.2mg/mL和2mg/mL)的函数的人的成纤维细胞中I型原胶原的生成量。
4.将IL-1β加入到人的成纤维细胞中后MMP-1生成量的变化
由图13可以看出，向人的成纤维细胞中加入白介素(IL)-1β后生成的MMP-1的量高于没有加入IL-1β时所生成的量，并且MMP-1的生成量随IL-1β的浓度而上升。然而，即使在这种情况中也可以看出，当加入笃斯越桔提取物时，MMP-1的浓度将随笃斯越桔提取物的浓度而下降。
测试例5：抑制皱纹形成的能力的体内测试
-无毛小鼠、紫外线照射和样品施用
购买6周龄的无毛雌性小鼠(Skh-1)，并在到达实验室后进行3天的适应，然后用于测试。让动物任意进食和饮水并在24±2℃的温度、50±10％的湿度和12小时/12小时的光暗周期的条件下饲养。将动物分为受到紫外线照射组、不受紫外线照射组和受到紫外线照射并施用样品组。对受到紫外线照射并施用样品的组施用剂量各为10mg/kg、20mg/kg和40mg/kg的笃斯越桔提取物。
在18周内，按每周3次用紫外线照射每只小鼠的背部，其中紫外线剂量如下：第1周为1MED(最小红斑剂量；60mJ/cm2)，第2和3周为2 MED(120mJ/cm2)，第4～6周为3 MED(180mJ/cm2)，第7～18周为4 MED(240mJ/cm2)。将作为样品的笃斯越桔提取物溶解在蒸馏水中并分别以10mg/kg/天、20mg/kg/天和40mg/kg/天的剂量施用于动物。
-皮肤复制品的制作
为了测量由将所述样品施用于小鼠而引起的除皱作用，每隔3周用50mg/kg的戊巴比妥溶液进行腹膜内注射来麻醉小鼠，将具有孔径为8mm的复制品模型贴在每只小鼠的背部。然后，将Silflo的各组分(即，硅橡胶、冲淡剂和催化剂)适当混合并涂在所述模型的内侧，让其自然干燥。然后，揭下所述模型，从而制得复制品。通过计算机成像系统以恒定的角度照射所述复制品，使用所得反射面积来量化皱纹的深度或数量，由此来测定皱纹的程度。
-皮肤复制品分析的结果
紫外线照射后，经肉眼观察可以清楚地看到，与正常组(N)相比，UV对照组(C)中皮肤皱纹增加。然而，在施用笃斯越桔提取物的皮肤的情况中，施用9周后可以清楚地看到深皱纹减少(见图14)。
在施用后3周，与UV对照组(C)相比，以20mg/kg(V 20)和40mg/kg(V 40)的量施用笃斯越桔提取物的组显示出H_R1、H_R4和H_R5值的显著下降。在施用后6周，与UV对照组相比，除了施用20mg/kg的笃斯越桔提取物的组显示出H_R2和H_R3值的下降以外，所有施用本发明提取物的组的所有值都显著地下降。在施用后9周，施用笃斯越桔提取物的各组的H_R值全都显著下降。
图15(a)～15(d)显示了在紫外线照射后第0、3、6、9周时的H_R值。此处的“H”是指基线，“R1”代表最高峰与最低值之间的距离，“R2”代表所述5个最大距离的最大值，“R3”代表5个最大距离R1的平均值，“R4”代表平滑深度，而“R5”代表算术平均粗糙度。图15的标在上边的不同文字(字母)表示在邓氏多重范围检验(Duncan′s multiple range test)中p＜0.05时是显著差异的。
测试例6：对酪氨酸酶活性的抑制效果
向96孔板(Coming，USA)依次加入220μl的0.1M PBS(pH 6.5)、20μl各具有不同提取物浓度的笃斯越桔提取物溶液和20μl的2,000U/mL酪氨酸酶溶液。向该溶液中加入40μl的1.5mM酪氨酸溶液，然后在37℃静置10分钟。然后，使用酶联免疫吸附测定(ELISA)判读仪(Bio-Tek，USA)测量该溶液在490nm处的吸光率。在测试中，使用20μl的0.1M PBS(pH6.5)作为空白样品。使用以曲酸处理的组作为对照组。根据下式计算酪氨酸酶活性的抑制比率。
酪氨酸酶活性的抑制比率(％)＝100-{(b-b′)/(a-a′)}×100
其中a：空白样品反应后的吸光率；b：样品反应后的吸光率；a′和b′：在各样品反应中使用缓冲液代替酪氨酸酶测得的吸光率。
在测试结果中，针对酪氨酸酶活性，笃斯越桔提取物显示出约0.41mg/mL的IC50，而曲酸显示出约10μM的高IC50。针对酪氨酸酶活性，笃斯越桔提取物在1mg/mL时显示出72.8％的抑制比率，这样的抑制比率处于10μM曲酸的50.8％到100μM曲酸的84.8％之间。另外，笃斯越桔提取物在0.1mg/mL的低浓度显示出11.4％的抑制比率，而这一抑制比率近似于1μM曲酸的14.4％的抑制比率(见表5)。
(表5)
    样品浓度     抑制比率(％)
曲酸(μM)     100     84.4±8.11)2)
    10     50.8±9.6
    1     14.4±4.5
    0.1     9.7±3.7
笃斯越桔提取物(mg/ml)     1     72.8±5.7
    0.5     58.4±3.4
    0.25     33.2±4.8
    0.1     11.4±2.4
1)平均值±标准偏差；2)抑制比率(％)
尽管由于浓度的差异而无法对所述两种物质进行直接比较，但是由测试结果可以看出，0.5mg/mL的笃斯越桔提取物对酪氨酸酶活性的抑制比率高于用10μM曲酸处理的组的抑制比率，这表明笃斯越桔提取物显著地抑制了酪氨酸酶的活性。酪氨酸酶起到使酪氨酸(一种氨基酸)氧化而生成黑色素的作用，上述测试结果显示，笃斯越桔提取物抑制了酪氨酸酶的活性，可以看出笃斯越桔提取物能够促进皮肤增白。
测试例7：使用B 16黑素瘤F10细胞来测试对黑色素生成的抑制效果
-B16黑素瘤F10的培养
在培养箱中，在37℃和5.0％的CO2的条件下，将B16黑素瘤F10细胞培养在DMEM(Dulbecco改进的Eagle培养基)中，该培养基含有10％的胎牛血清、100IU/mL的青霉素和50μg/mL的链霉素。
-对黑色素生成的抑制效果的测试
将B16黑素瘤F10细胞按104个细胞/孔的细胞浓度接种在24孔板的每个孔中。17小时后，确认细胞贴壁并去掉培养基。然后，以不同浓度，将2ml在制备例1中制得的笃斯越桔提取物溶液分加到培养板的各个孔中。将孔板在CO2培养箱中培养72小时，然后去掉培养基。接着，将2ml的NaOH加入到培养板的各个孔中，然后在60℃静置30分钟。之后，测定该细胞溶液在450nm处的吸光率。比较黑色素标准曲线，计算黑色素的浓度。
在测试结果中，在以浓度范围为0.01mg/mL～0.5mg/mL的笃斯越桔提取物处理的B16黑素瘤F10细胞中，黑色素总生成量随浓度显著下降。当笃斯越桔提取物的浓度为0.05mg/mL时，黑色素的生成量为16.66μg/mL，而当曲酸为10μM时，黑色素生成量为16.54μg/mL，表明0.05 mg/mL的笃斯越桔提取物对黑色素生成的抑制效果与10μM的曲酸的抑制效果相同。另外，笃斯越桔提取物的浓度为0.5mg/mL时黑色素的生成量低于曲酸为100μM时黑色素的生成量(见图16)。在图16中，“V”代表用笃斯越桔提取物处理的测试组，而“K”代表用曲酸处理的测试组。
-紫外线照射后对黑色素生成总量的抑制效果的测试
用提取物浓度为0.2mg/mL和2mg/mL的笃斯越桔提取物溶液处理的B16黑素瘤F10细胞的组中的黑色素生成量为20.80μg/mL和17.47μg/mL，这低于对照组的生成量(27.96μg/mL)，并且黑色素生成量随笃斯越桔提取物的浓度而下降。另外，笃斯越桔提取物为0.2mg/mL时黑色素生成量低于0.2μM曲酸时的生成量(22.72μg/mL)，而笃斯越桔提取物为2mg/mL时黑色素生成量低于2μM曲酸时的生成量(19.22μg/mL)(见图17)。在图17中，“C”代表未经紫外线照射的测试组，“UV-C”代表用紫外线照射的对照组，而“V”和“K”分别代表用笃斯越桔提取物和曲酸处理的测试组。
在测试结果中，与未用样品进行处理的对照组相比，用笃斯越桔提取物处理的组和用曲酸处理的组均显示出黑色素生成量的下降。皮肤上的色素沉着(例如变色和雀斑)归因于表皮中黑色素色素的异常增高。尽管笃斯越桔提取物和曲酸均显示出黑色素生成量的显著下降，但是曲酸存在毒性问题。考虑到这一问题，发现笃斯越桔提取物可用作曲酸的替代物。
尽管为说明目的，已经对本发明的优选实施方式进行了说明，但是本领域的技术人员应当理解，在未脱离如所附权利要求披露的本发明的范围和精神的情况下，各种改变、增加和替代方式都是可能的。
工业实用性
如上所述，用于改善皮肤状况的本发明组合物能够容易地以提取物或干燥的提取物粉末的形式制备，并且能够用于促进皮肤增白、消除皱纹、防止皱纹产生和增强皮肤弹性。另外，本发明组合物基于天然提取物，因此对本发明组合物的工业应用范围没有特别限制。而且，笃斯越桔提取物适合在化妆品、食品和药物中用作去除皮肤皱纹的组分，因为甚至是涂敷在皮肤上或者内用时，笃斯越桔提取物也可以获得改善皮肤状况的效果。

Claims (11)

1.一种用于改善皮肤状况的组合物，该组合物包含作为活性组分的笃斯越桔提取物，并具有使皮肤增白和除皱的效果。
2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述笃斯越桔提取物通过向笃斯越桔的果实或叶子中添加水或醇作为提取溶剂进行提取而获得。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述笃斯越桔提取物通过以下方法获得：在40℃～100℃温度的水浴中加热笃斯越桔的果实或叶子以获得热水提取物，对该热水提取物进行过滤，从经过滤的热水提取物中分离出上清液，并在减压下浓缩经分离的上清液。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述笃斯越桔提取物通过以下方法获得：在20℃～90℃温度的醇中对笃斯越桔的果实或叶子进行提取，对该提取物进行过滤，从经过滤的提取物中分离出上清液，并在减压下浓缩经分离的上清液。
5.一种用于改善皮肤状况的化妆品组合物，该化妆品组合物包含权利要求1～4中任一项所述的组合物和化妆品添加剂，并具有使皮肤增白和除皱的效果。
6.如权利要求5所述的化妆品组合物，其中，基于所述化妆品组合物的总重量，所述笃斯越桔提取物的含量为0.0001干重％～10干重％。
7.如权利要求5所述的化妆品组合物，其中，所述化妆品组合物还另外包含选自由熊果苷、曲酸、构树提取物、3-乙氧基抗坏血酸、甘草提取物以及它们的混合物组成的组中的至少一种组分。
8.一种食品组合物，该食品组合物包含权利要求1～4中任一项所述的组合物和可食用的食品添加剂。
9.一种药物组合物，该药物组合物包含权利要求1～4中任一项所述的组合物和药用载体，并具有促进胶原合成和抑制酪氨酸酶活性的效果。
10.一种制备用于改善皮肤状况的笃斯越桔提取物的方法，该方法包括：
第一步骤，将水或醇作为溶剂加入到笃斯越桔的果实或叶子中以获得笃斯越桔提取物；
第二步骤，对所述第一步骤中获得的所述笃斯越桔提取物进行过滤并从滤液中分离出上清液；和
第三步骤，浓缩所述第二步骤中所分离的所述上清液。
11.如权利要求10所述的方法，该方法在所述第三步骤之后进一步包括第四步骤：将经浓缩的所述笃斯越桔提取物溶解在少量的蒸馏水中，冻干或干燥该溶液，以获得粉状的笃斯越桔提取物。
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