CN100497632C

CN100497632C - 转谷氨酰胺酶的制备方法

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Publication number: CN100497632C
Application number: CNB008137331A
Authority: CN
Inventors: 菊池庆实; 伊达雅代; 梅泽有希子; 横山敬一; 松井裕
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1999-09-30
Filing date: 2000-09-29
Publication date: 2009-06-10
Anticipated expiration: 2020-09-29
Also published as: US7723067B2; KR100565030B1; BR0014059A; EP1219713B1; WO2001023591A1; US7972829B2; ES2372806T3; EP1219713A1; KR20020038787A; JP4320769B2; CA2391961A1; AU7449400A; EP1219713A4; US20030082746A1; US20100297729A1; CN1377413A; CA2391961C; DK1219713T3; ATE532870T1; BR0014059B1

Abstract

本发明涉及在棒杆菌中分泌生产外源蛋白，特别是转谷氨酰胺酶的方法。本发明提供通过使工业生产上有用的外源蛋白，特别是转谷氨酰胺酶在棒杆菌中生成，并有效地释放到菌体外(分泌生产)来制备外源蛋白，特别是转谷氨酰胺酶的方法。使用编码源自棒杆菌的信号肽区的序列下游结合含有前体结构部分的目的外源蛋白质基因序列，特别是转谷氨酰胺酶原基因序列的表达重组体，将该表达型基因重组体导入棒杆菌，培养转化的棒杆菌，释放到菌体外的蛋白质通过用蛋白酶等进行处理切去前体结构部分，制备目的外源蛋白质，特别是转谷氨酰胺酶。

Description

转谷氨酰胺酶的制备方法

发明的背景

本发明涉及在棒杆菌中分泌生产外源蛋白，特别是转谷氨酰胺酶的方法。用该方法分泌生产的外源蛋白质是产业上有用的酶或有生理活性的蛋白质等，转谷氨酰胺酶被广泛地应用于食品加工和制药领域等中。

到目前为止，对于外源蛋白质的分泌生产已有很多报道，如有关利用杆菌属细菌分泌生产外源蛋白质的综述[Microbiol.rev.，57，109-137(1993)]，利用甲基营养酵母Pichia pastoris分泌生产外源蛋白的综述[Biotechnol.，11，905-910(1993)]，以及利用曲霉菌属霉菌进行工业生产的报道[Biotechnol.，6，1419-1422(1988)；Biotechnol.，9，976-981(1991)]等。

根据本发明的一个实施方式，分泌生产的转谷氨酰胺酶是催化位于蛋白质肽链内的γ-羧酰胺基的酰基转移反应的酶。该酶作用于蛋白质时，可以通过形成ε-(γ-Glu)-Lys桥及Gln脱酰胺化，产生Gln置换为Glu的反应。该转谷氨酰胺酶可用于果冻等胶状食品、酸奶酪、干酪、或胶状化妆品等的制造或改善肉类食品的肉质等(特开平1-50382)。另外该酶也可用于制备热稳定微胶囊的材料、固定化酶的载体等，是工业上利用性高的酶。

到目前为止，已知有源于动物和源于微生物(微生物转谷氨酰胺酶，以下略作“MTG”)的转谷氨酰胺酶。源自动物的转谷氨酰胺酶是依赖于钙离子的酶，分布在动物的脏器、皮肤、血液等。例如，有豚鼠肝脏转谷氨酰胺酶(K.Ikura et al.Biochemistry 27，2898(1988))，人表皮角质细胞转谷氨酰胺酶(M。A.Phillips et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，9333(1990))、人凝血因子XIII(A.Ichinose et al.Biochemistry 25，6900(1990))。

源自微生物的转谷氨酰胺酶有在链轮丝菌(Streptoverticillium)属细菌中发现的钙非依赖性转谷氨酰胺酶。这样的细菌，例如灰肉色链轮丝菌(Streptoverticilliumgriseocarneum)IFO 12776、肉桂链轮丝菌肉桂亚种(Streptoverticillium cinnamoneum sub sp.cinnamoneum)(以下略作S.cinnamoneum)IFO 12852、茂原链轮丝菌(Streptoverticilliummobaraense)(以下略作S.mobaraense)IFO 13819(特开昭64-27471)等。这些微生物产生的转谷氨酰胺酶的一级结构经肽谱以及基因结构解析，结果表明与源自动物的转谷氨酰胺酶完全没有同源性(欧洲专利公开公报0481 504 A1)。

源自微生物的转谷氨酰胺酶(MTG)由于是从上述菌类等的培养物经纯化操作制备的，所以在供给量、效率等方面存在问题。因此也正在尝试通过基因工程技术来制备转谷氨酰胺酶。转谷氨酰胺酶及其基因，例如在Biosci.Biotechnol.Biochem.，58，82-87(1994)、Biosci.Biotechnol.Biochem.，58，88-92(1994)、Biochimie，80，313-319(1998)、Eur.J.Biochem.，257，570-576(1998)、WO96/06931、WO 96/22366等中已有报道，其中有关于利用浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)、oryzae曲霉菌(Aspergillusoryzae)、大肠杆菌(Escherichia coli)等宿主载体系统表达生产的报道。除此之外，还有通过E.coli、酵母等微生物分泌表达(特开平5-199883)的方法，以及通过大肠杆菌将MTG以非活性融合蛋白质包涵体表达后，再用蛋白质变性剂溶解，经去除变性剂使其复性来生成有活性的MTG的方法的报道(特开平6-30771)。然而，在E.coli、酵母等微生物的分泌表达中存在着其表达量非常少的问题。

而为了利用棒杆菌有效分泌生产外源蛋白质的研究到目前为止已有一些报道，如利用谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)(以下略作C.Glutamicum)分泌核酸酶(nuclease)或脂肪酶[US4965197，J.Bacteriol.，174，1854-1861(1992)]以及枯草杆菌蛋白酶等蛋白酶[Appl.Environ.Microbiol.，61，1610-1613(1995)]的研究，有关棒杆菌的细胞表面蛋白质的分泌的研究[特表平6-502548]，在以上研究基础上展开的纤连蛋白结合蛋白分泌的研究[Appl.Environ.Microbiol.，63，4392-4400(1997)]和利用变异型分泌手段提高蛋白质分泌的研究报道[特开平11-169182]等，但只是有关极其有限的蛋白质的极少数的报道。从蛋白蓄积量来看，虽然有在Appl.Environ.Microbiol.，61，1610-1613(1995)文献中报道的利用源自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的枯草杆菌蛋白酶基因(aprE)的启动子、核糖体结合位点以及信号肽的序列使源自节瘤偶蹄形菌(Dichelobacter nodosus)的碱性蛋白酶的基因在谷氨酸棒杆菌中表达，确认蓄积了大约2.5mg/ml的该蛋白的例子，但在US4965197、特表平6-502548、特开平11-169182的描述中都没有记载具体的分泌蓄积的蛋白量，而在分泌纤连蛋白结合蛋白[Appl.Environ.Microbiol.，63，4392-4400(1997)]的报道中被确认的分泌蓄积量最大不过是约为2.5μg/L的非常少的量。所以使外源蛋白以实用水平有效地蓄积在培养基中的报道还未看到。

棒杆菌的基因操作技术是通过原生质体转染法的建立[J.Bacteriol，159，306-311(1984)；J.Bacteriol，161，463-467(1985)]、各种载体的开发[Agric.Biol.Chem.，48，2901-2903(1984)；J.Bacteriol，159，306-311(1984)；J.Gen.Microbiol。，130，2237-246(1984)；Gene，47，301-306(1986)；Appl.Microbiol.Biotechnol.，31，65-69(1989)]、基因表达调控法的开发[Bio/Technology，6，428-430(1988)]、粘粒的开发[Gene.39，281-286(1985)]等、以及利用质粒和嗜菌体系统发展起来的。另外有关源自棒杆菌的基因克隆也有报道[Nucleic AcidsRes.，14，10113-1011(1986)；J.Bacteriol，167，695-702(1986)；Nucleic Acids Res.，15，10587(1987)；Nucleic Acids Res.，15，3922(1987)；Nucleic Acids Res.，16，9859(1988)；Agric.Biol.Chem.，52，525-531(1988)；Mol.Microbiol.，2，63-72(1988)；Mol.Gen.Genet.，218，330-339(1989)；Gene，77，237-251(1989)]。

另外，有关源自棒杆菌的转移因子也有报道[WO93/18151；EP0445385；特开平6-46867；Mol.Microbiol.，11，739-764(1994)；Mol.Microbiol.，14，571-581(1994)；Mol.Gen.Genet.，245，397-405(1994)；FEMS Microbiol.Lett.，126，1-6(1995)；特开平7-107976]。

所谓转移因子是在染色体上可转移的DNA片段，存在于从原核生物到真核生物范围很广的生物中。开发利用转移因子的转座子[WO93/18151；特开平7-107976；Mol.Gen.Genet.，245，397-405(1994)、特开平9-70291]、以及通过转座子使外源基因表达已成为可能。

发明内容

本发明的目的在于，提供通过使棒杆菌生成产业上有用的外源蛋白、特别是转谷氨酰胺酶，并使之有效地分泌到菌体外(分泌生产)，制备外源蛋白质、特别是转谷氨酰胺酶的方法。

本发明人着眼于无论是信号肽还是前体部分在放线菌等的分泌蛋白质分泌过程中都起着重要作用的事实，直至发明了有效分泌生产工业上有用的外源蛋白质，特别是转谷氨酰胺酶的方法。

就是说，本发明是有关外源分泌型蛋白质的制备方法的发明，其特征是使在源自棒杆菌的信号肽的下游连接含有前体结构部分的外源分泌型蛋白质的融合蛋白质在棒杆菌中生成和分泌，然后将前体结构部分切除来获得外源蛋白质。

更具体地说，本发明提供的方法是，将在编码源自棒杆菌的信号肽区，特别是细胞表面蛋白质的信号肽区的序列的下游结合了含有前体结构部分的目的蛋白质基因序列，特别是转谷氨酰胺酶原基因序列的表达重组体导入棒杆菌，对得到的转化棒杆菌进行培养，使生成的蛋白质有效地分泌到菌体外，用蛋白酶对释放到菌体外的蛋白质进行处理，切去前体结构部分，进而制备大量的目的外源蛋白质，特别是转谷氨酰胺酶。

另外，本发明还提供获得转谷氨酰胺酶的一种方法，即，对蛋白酶等也象转谷氨酰胺酶基因重组体那样构建这些蛋白酶等的表达型基因重组体，然后与含有转谷氨酰胺酶原基因的表达重组体都导入棒杆菌，对得到的转化棒杆菌进行培养，或导入到别的棒杆菌，对得到的转化棒杆菌与导入转谷氨酰胺酶原基因的细菌共同培养，通过使转谷氨酰胺酶原和这些蛋白酶分泌表达，可以得到切除了转谷氨酰胺酶原的前体结构部分的转谷氨酰胺酶。

另外在本说明书中，所谓蛋白质或肽被“分泌”是指蛋白质或肽分子被转移到菌体外(细胞外)，最终这些蛋白质或肽分子完全游离在培养基中，当然也包括只有一部分存在于菌体外的情况以及存在于菌体表面的情况。

实施发明的最佳方式

依照本发明的方法，用棒杆菌作为宿主载体系统，构建在棒杆菌细胞表面蛋白质的信号肽的下游结合了含有分泌型的前体结构部分的转谷氨酰胺酶基因的表达重组体，然后将该重组体导入棒杆菌内，对被表达、分泌到菌体外的转谷氨酰胺酶原用蛋白酶等进行处理，切除前体结构部分，就可得到大量的切除了前体结构部分的转谷氨酰胺酶。

另外依照本发明的方法，对蛋白酶等也象转谷氨酰胺酶基因重组体那样构建这些蛋白酶等的表达型基因重组体，然后与转谷氨酰胺酶原基因重组体都导入棒杆菌，对得到的转化棒杆菌进行培养，或导入到别的棒杆菌，对得到的转化棒杆菌与导入转谷氨酰胺酶原基因的细菌共同培养，通过分泌表达，可以直接在菌体外得到切除了转谷氨酰胺酶原的前体结构部分的转谷氨酰胺酶。

分泌型蛋白质一般以前导肽或前导肽原形式被翻译，然后变成成熟型蛋白质。即一般以前导肽或前导肽原形式被翻译后，切除信号肽(“前导部分”)使之变成成熟肽或肽原，肽原再经蛋白酶处理，切除前体部分使之成为成熟肽。在本说明书中，所谓“信号序列”是指存在于分泌型蛋白质前体的N末端，且不存在于天然成熟蛋白质中的序列，所谓“信号肽”是指从该蛋白质前体中切除的肽。一般来说，信号序列随着蛋白质分泌到菌体外的同时，就被蛋白酶(通常称之为信号肽酶)切除了。这样的信号肽虽然在所有生物中都有某些共同的序列上的特征，但在某种生物中表现出分泌功能的信号肽在其他生物中未必发挥能分泌功能。

在本说明书中，有时将信号肽和前体部分都含有的蛋白质，即初次翻译产物称之为“前蛋白质原”，将不含信号肽而含有前体部分的蛋白质称之为“蛋白质原”。蛋白质原的前体部分有时也称之为“前体结构部分”或“前体结构”，在本说明书中蛋白质的“前体结构部分/前体结构”与蛋白质的“前体部分”之间可互换使用。在前蛋白原或前蛋白质中，其信号肽可以来自于不同的蛋白质，也可以是天然存在于目的蛋白质的信号肽，但最好是使用源自所用宿主的分泌型蛋白质。或者按照所用宿主的密码子使用频率将信号肽改造成具有最适密码子的信号肽。而可用于本发明的信号肽也可以含有信号肽来源的天然的成熟蛋白质的N末端氨基酸序列的一部分。信号肽源自不同的蛋白质时，有时也将前蛋白原特别称之为“外源融合前蛋白原”。例如，蛋白质为转谷氨酰胺酶时，可分别称之为“前转谷氨酰胺酶原”、“转谷氨酰胺酶原”和“外源融合前转谷氨酰胺酶原”。所谓“切除前体部分的”蛋白质是指通过切断肽键，除去至少一个以上构成前体部分的氨基酸的蛋白质，包括该N末端区与天然成熟蛋白质的N末端区完全一致的蛋白质，以及只要具有该蛋白质活性，与天然蛋白质相比其N末端多出一个以上源自前体部分的氨基酸的蛋白质以及与天然成熟蛋白质相比氨基酸序列短的蛋白质也都包括在内。

到目前为止，利用棒杆菌将外源蛋白分泌到菌体外的例子如在阐述以往的的技术时所描述的那样非常少，而且从技术上也没有完善。另外也没有棒杆菌通过自身将蛋白酶等蛋白质分泌到菌体外的例子，但内源性DNase的分泌[US4965197]和本发明使用的细胞表面蛋白[特表平6-502548]从细胞表面剥落并出现在菌体外的事实是已经知道的例子。但是，就棒杆菌来说，对参与分泌的信号肽除了细胞表面蛋白质以外到现在还不清楚。到目前为止所了解的棒杆菌的细胞表面蛋白只是谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)的细胞表面蛋白PS1和PS2的基因[特表平6-502548]以及产氨棒杆菌(以下略作C.ammoniagenes)的细胞表面蛋白质S1pA的基因[特开平10-108675]。在这些蛋白质内，虽然PS1和S1pA之间能看到有许多同源性(30％)，但在其他蛋白质之间几乎看不到同源性，另外关于信号序列区域也看不到它们之间的同源性。作为信号序列的例子，如序列号29和1给出的谷氨酸棒杆菌的PS1和PS2的信号序列，以及序列号2给出的产氨棒杆菌的S1pA的信号序列。

本发明人从谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)(旧名称为乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum))ATCC13869菌株克隆PS2蛋白质基因，测定其序列时，虽然没有看出在信号序列区与源自谷氨酸棒杆菌的已知蛋白质基因序列有什么差别，但在成熟型细胞表面蛋白质的N末端氨基酸的38位残基前的序列中确认有2个不同之处(序列号7给出的氨基酸序列中第40位氨基酸残基的Thr是Asn，第55位的Gly是Glu)。序列号6给出了含有编码其信号序列号30个氨基酸残基和成熟细胞表面蛋白质的N末端38个氨基酸残基的共68个残基的碱基序列以及启动子区的其5’-上游区序列，序列号7给出了其氨基酸序列。

然后，为了在棒杆菌中尝试使外源蛋白质大量分泌到菌体外是否可行，本发明人利用含有细胞表面蛋白质的启动子区和信号肽区的序列进行了外源蛋白质的分泌研究。

已知源自放线菌的转谷氨酰胺酶基因GC含量高，但棒杆菌与它相近，另外密码子利用性也近似，所以可直接利用放线菌基因。因此，本发明人就能否可以直接利用放线菌转谷氨酰胺酶基因进行了研究，结果表明源自放线菌的转谷氨酰胺酶的信号肽在棒杆菌中不起作用。但是，编码与源自棒杆菌的细胞表面蛋白的信号肽融合的包含源自放线菌的前体结构部分的成熟蛋白的转谷氨酰胺酶基因可直接有效地发挥其功能，并可作为含有前体结构部分的蛋白原有效地分泌到菌体外。另外，使用多出了细胞表面蛋白质的信号肽30个氨基酸残基与成熟细胞表面蛋白质的N末端部分的38个氨基酸残基，即，使用融合了成熟细胞表面蛋白质的N末端部分的带有前体结构部分的转谷氨酰胺酶基因时，转谷氨酰胺酶原向菌体外分泌的效率将进一步增大。

本发明中所说的棒杆菌是需氧的革兰式阳性杆菌，包括以前属于短杆菌属，现在都合并到棒杆菌属的细菌(Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255(1981))，以及包括与棒杆菌属亲缘关系近的短杆菌属细菌。作为使用棒杆菌的优点，与到目前为止适用于外源蛋白分泌的霉菌、酵母或枯草杆菌属细菌相比，它本来分泌到菌体外的蛋白质就非常少，所以分泌生产外源蛋白质时的纯化过程可以简化和省略，另外在糖、氨和无机盐等简单培养基中能很好生长，在培养基花费和培养方法、培养生产效率方面也都有优势。

本发明中作为宿主菌使用的棒杆菌有，以L-谷氨酸生成菌为代表的解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)ATCC14066、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum，又称为谷氨酸棒杆菌)ATCC13869、玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)ATCC13825、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum，又称为谷氨酸棒杆菌)ATCC14067、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)ATCC13870、谷氨酸棒杆菌ATCC13032，百合花棒杆菌(Corynebacterium lilium)ATCC15990、产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes，又称为产氨棒杆菌)ATCC6871等野生株，以及由这些野生株诱变的变异株，例如失去谷氨酸生成能力的变异株，还包括生成赖氨酸的氨基酸生成变异株，生成如肌苷等核酸那样的其他物质的变异株。

本发明使用的基因重组体，一般都在适当位置中含有启动子、编码合适的信号肽的序列和编码目的蛋白的核酸片段、以及为了使目的蛋白基因在棒杆菌表达所必需的调控序列(起始因子和终止因子)，并能使它们发挥作用的基因重组体。目的蛋白也可以在N末端含有前体结构部分。用于该重组体的载体没有特别限制，只要是在棒杆菌中能够发挥功能的就可以，象质粒那样在染色体外自我增殖的，还是插入细菌染色体的载体都可以，最好是源自棒杆菌的质粒。其中包括诸如pHM1519(Agric，Biol.Chem.，48，2901-2903(1984))、pAM330(Agric，Biol.Chem.，48，2901-2903(1984))以及将它们进行改造使之含有抗药性基因的质粒。另外人工转座子等也可以利用。使用转座子时，通过同源重组或它们自身转移能力将目的基因导入染色体中。

本发明中使用的启动子没有特别限定，只要是在棒杆菌中发挥功能的启动子一般都可以使用，甚至源自外源的，例如优选tac启动子等源自E.coli的启动子。其中更优选tac启动子等强力启动子。源自棒杆菌的启动子有，细胞表面蛋白质的PS1、PS2、S1pA基因的启动子，各种氨基酸合成系统，例如谷氨酸合成系统的谷氨酸脱氢酶基因、谷氨酰胺合成系统的谷氨酰胺合成酶基因、赖氨酸生物合成系统的天冬氨酸激酶基因、苏氨酸生物合成系统的同型丝氨酸脱氢酶基因、异亮氨酸和缬氨酸生物合成系统的乙酰羟酸合成酶基因、亮氨酸生物合成系统的2-异丙基苹果酸合成酶基因、脯氨酸和精氨酸生物合成系统的谷氨酸激酶基因、组氨酸生物合成系统的磷酸核糖-ATP焦磷酸化酶基因、色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸生物合成系统的脱氧阿拉伯庚糖醛磷酸(DAHP)合成酶基因、肌苷酸和鸟苷酸那样的核酸生物合成系统中的磷酸核糖焦磷酸(PRPP)氨基转移酶基因、肌苷酸脱氢酶基因和鸟苷酸合成酶基因的启动子。

本发明使用的信号肽是作为宿主的棒杆菌的分泌型蛋白质的信号肽，最好是棒杆菌细胞表面蛋白质的信号肽。作为棒杆菌的细胞表面蛋白质有源自谷氨酸棒杆菌的PS1和PS2[特表平6-502548]、以及产氨棒杆菌的S1pA[特开平10-108675]。序列号29给出了PS1的氨基酸序列，序列号1给出了PS2的氨基酸序列，序列号2给出了S1pA的氨基酸序列。另外按照美国专利4965197的描述，在源自棒杆菌的DNase中也包含有信号肽，那样的信号肽也可以用于本发明。

在信号肽中也可以加上信号肽来源的分泌型蛋白质的N末端氨基酸序列的一部分。信号序列在翻译产物分泌到菌体外时就被信号肽酶切去了。编码信号肽的基因可以直接使用天然型的基因，也可以根据使用宿主的密码子使用频率进行改变，使之具有最适密码子。

使用这些信号肽时，编码目的蛋白的基因接在编码信号肽的基因的3’-末端一侧，并使它受到源自上述启动子的表达调控。

通过本发明分泌生产的有用的蛋白质实质上包括源自动植物或微生物的所有分泌型蛋白质，但并没有被特别限定。例如蛋白酶、氨肽酶、羧肽酶、胶原酶和几丁质酶等蛋白质都可以通过本发明进行分泌生产。通过本发明分泌生产的蛋白质优选天然且为分泌型蛋白质，更优选带有前体结构部分的蛋白质，特别优选将转谷氨酰胺酶作为通过本发明分泌生产的有用的蛋白质。作为本发明可利用的转谷氨酰胺酶基因可以是放线菌，例如茂原链轮丝菌IF013819、肉桂链轮丝菌IF012852、灰色肉链轮丝菌IF012776、利迪链霉菌(Streptomyceslydicus)[W09606931]等和Oomycetes[W09622366]等霉菌的分泌型转谷氨酰胺酶基因。编码这些蛋白质的基因按照使用的宿主以及为了获得所希望的活性可以进行改变，其中包括添加、缺失、置换一个以上的氨基酸等改变，可以根据需要变换成响应宿主密码子使用频率的最适密码子。

通过本发明分泌生产以天然的前肽原形式表达的蛋白质时，最好使用编码含有前体结构部分(前体部分)的蛋白原的基因片段。作为前体结构部分的例子有，序列号3(源自茂原链轮丝菌)和序列号4(源自肉桂链轮丝菌)给出的源自放线菌的转谷氨酰胺酶的前体结构部分的序列。蛋白质的前体结构部分可以通过适当的手段，例如利用蛋白酶切除，也可以用氨肽酶、在适当位置进行切割的内肽酶、或使用更特异的蛋白酶，但最好是使用能在特定位置切断，并能使生成的蛋白质具有与天然蛋白质同样的或更高的活性的蛋白酶。或者是改变编码目的蛋白质或目的蛋白质的前体结构部分的基因序列，设计成能表达在所希望的位置含有特异的蛋白酶识别位点的蛋白质。包括上述那样的诱变技术、基因克隆技术、生成蛋白质的检测技术在内的常规分子生物学手法业内人士都很清楚。例如可以参照下列文献：Sambrook etal.，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，SecondEdition(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York、DNA cloning：A Practical Approach，Volumes Iand II(D.N.Glover ed.1985)、F.M.A usubel et al.(eds)，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc，(1994)、PCR Technology：Principles and Application for DNAAmplification，H.Erlich，ed.，Stockton Press等。

作为改变了序列号3和4所示的前体结构部分的前体结构部分的例子，如具有序列号30～38所示的氨基酸序列的修饰前体结构部分。

<序列表说明>

序列号30～37：茂原链轮丝菌的转谷氨酰胺酶的修饰前体结构部分

序列号38：茂原链轮丝菌和肉桂链轮丝菌的转谷氨酰胺酶前体结构部分的嵌合

这些修饰前体结构部分具有以下特征：

序列号30＝缺失了源自茂原链轮丝菌的前体结构部分(45个氨基酸残基)的C末端的AP。

序列号31＝缺失了源自茂原链轮丝菌的前体结构部分(45个氨基酸残基)的C末端的FRAP。

序列号32＝缺失了源自茂原链轮丝菌的前体结构部分(45个氨基酸残基)的N末端的D。

序列号33＝缺失了源自茂原链轮丝菌的前体结构部分(45个氨基酸残基)的N末端的DNGAGE。

序列号34＝将源自茂原链轮丝菌的前体结构部分(45个氨基酸残基)的C末端的RAP改变成了GPK。

序列号35＝将源自茂原链轮丝菌的前体结构部分(45个氨基酸残基)的C末端的RAP改变成了GPR。

序列号36＝将源自茂原链轮丝菌的前体结构部分(45个氨基酸残基)的C末端的GPSFRAP改变成了GPK(FRAP缺失，C末端的S改变成R)。

序列号37＝将源自茂原链轮丝菌的前体结构部分(45个氨基酸残基)的C末端的GPSFRAP改变成了GPR(FRAP缺失，C末端的S改变成R)。

序列号38＝由源自茂原链轮丝菌的前体结构部分一部分(15个氨基酸残基)和源自肉桂链轮丝菌的前体结构部分(41个氨基酸残基)的一部分构成的嵌合前体结构部分(56个氨基酸残基)。

这样，只要在特定位置有了蛋白酶的特异识别位点，就可以在前体结构部分置换、缺失、插入或添加一个以上的氨基酸。

蛋白酶分解获得的蛋白质的N末端区未必与天然的蛋白质一样，即使是多添加了1～数个氨基酸，或缺失了1～数个氨基酸都可以。一般来说，从蛋白质活性观点出发，优选在与天然蛋白质几乎相同的位置切断，更优选与天然产物一样的成熟肽。例如，有关茂原链轮丝菌和肉桂链轮丝菌的成熟型转谷氨酰胺酶的序列分别是序列号5和43给出的序列。因此，一般来说最优选能在生成与天然成熟蛋白质一样的蛋白质的位置切断肽原的特异性蛋白酶。然而，为了特定目的，与天然蛋白质相比，N末端或多或少1～数个氨基酸的肽有时具有更适合的活性。这样的蛋白酶中除了包括象分散酶(Dispase)(BoeringerManheim公司制)那样可购买的酶以外，也包括从微生物培养液、例如从放线菌的培养液中获得的酶。这样的蛋白酶未经纯化就可使用，也可根据需要纯化至适当的纯度后再使用。

其他适用的蛋白酶的例子有白灰浅链霉菌(Streptomycesalbogriseolus，以下略作S.albogriseolus)生成的丝氨酸蛋白酶SAMP45。而源自茂原链轮丝菌的转谷氨酰胺酶原由于SAMP45优先切断序列号3的前体结构部分的第41位的Ser和42位的Phe之间肽键，可生成在序列号5给出的天然型成熟转谷氨酰胺酶的N末端附加了前体结构部分的C末端的Phe-Arg-Ala-Pro4个氨基酸结构的蛋白质。本发明人确认这样的蛋白质也具有转谷氨酰胺酶活性。另外SAMP45基因序列已经确定，序列号39给出了附加了前体结构的蛋白质(SAMP45原)的氨基酸序列(J.Bacteriol，179，430-438(1997))。SAMP45以白灰浅链霉菌的培养液或白灰浅链霉菌菌体的形式作用于转谷氨酰胺酶原时，可以切除前体结构的一部分，结果可以得到除去大部分前体结构的转谷氨酰胺酶。或者是将导入了前SAMP45原基因的棒杆菌与使转谷氨酰胺酶原分泌到菌体外的棒杆菌一起培养，同样可以得到除去大部分前体结构的转谷氨酰胺酶。另外，用同样的方法将SAMP45基因导入携有前转谷氨酰胺酶原基因的棒杆菌中，使SAMP45与前转谷氨酰胺酶原基因同时分泌到菌体表面或菌体外，可以更有效地通过切去前体结构部分使转谷氨酰胺酶活化。

另外，通过将本发明人发现的茂原链轮丝菌生成的脯氨酸特异性肽酶(svPEP)与SAMP45配合使用，也可以除去附加在N末端的Phe-Arg-Ala-Pro 4个氨基酸，得到与天然型一样的成熟的转谷氨酰胺酶。

该svPEP是能够在下述式(1)中↓处特异切断式(1)表示的肽或肽的类似物，即特异切断从N末端开始的第3或第4位脯氨酸羧基侧的肽键的酶。

Y-Pro-↓-Z (1)

(式中，Y是由2个或3个氨基酸残基构成的寡肽，Z代表氨基酸、肽、酰胺、或酯)。

更具体地说，该脯氨酸特异性肽酶是具有以下(1)～(8)性质的脯氨酸特异性肽酶。

(1)可以在↓所示位置、即在脯氨酸的羧基侧切断以下至少一种含有脯氨酸的肽(pNA代表对硝基酰替苯胺)。

Ala-Ala-Pro-↓-pNA、Ala-Phe-Pro-↓-pNA、Phe-Arg-Ala-Pro-↓-pNA(与Phe-Arg-Ala-Xaa(序列号68)相同(式中Xaa代表Pro-pNA，pNA表示对硝基酰替苯胺))

(2)最适pH为6.0～6.5。

(3)pH4～9时稳定。

(4)最适温度为25～30℃。

(5)20℃以下时稳定。

(6)活性可被苯基甲基磺酰氟化物、氨基乙基苯磺酰氟盐酸盐抑制。

(7)等电点为10.2。

(8)分子量大约为50000。

该svPEP可以按以下步骤制备。按照放线菌培养中通常用的方法培养生成具有svPEP活性的肽酶的放线菌，例如放线菌茂原链轮丝菌IF013819。培养放线菌IF013819的培养基用含有通常的碳源、氮源、无机离子等常用的培养基就可以。作为碳源可以使用葡萄糖、淀粉、蔗糖以及其他碳源。作为氮源根据需要可以适当选用蛋白胨、酵母提取液、肉汤、麦芽提取液、铵盐和其他的氮源。培养是在好氧条件下进行的，例如可以将条件控制在pH5.0到8.5、温度从15℃到37℃的合适的范围内。培养时间虽然因温度、pH、培养基不同而不同，但通常为1～10天左右，一般来说，在svPEP的产率达到最大时停止培养最好。

经上述时间培养后，从培养物回收菌体，轻轻洗涤后，从菌体表面洗脱出含有svPEP的组分，通过配合使用HPLC、FPLC等通常蛋白质纯化中使用的业内人士熟悉的各种纯化手段进行纯化，可以获得纯化的svPEP标准品。从菌体表面洗脱svPEP组分，可以通过将菌体在例如0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.0)等缓冲液中，振荡一定时间、如1～5小时左右来洗脱。为了防止酶失活，此时的温度最好控制在0℃～5℃范围内。也可以从培养上清液分离纯化出svPEP，但此时杂蛋白质较多，因此还是从洗涤的菌体洗脱纯化为好。

另外，确认各个纯化阶段的活性组分可以通过测定各个组分中的酶活性来进行。酶活性的测定可以配合使用适当的底物和反应生成物的检测方法，例如以Ala-Ala-Pro-pNA、Ala-Phe-Pro-pNA、Phe-Arg-Ala-Pro-pNA为底物进行酶反应，通过算出游离的pNA(对硝基酰替苯胺)量，对活性进行定量测定。

根据需要，可以使用反相色谱等将上述纯化的svPEP进一步纯化，测定其部分氨基酸序列，通过设计合适的探针可以得到编码svPEP的基因。这样的操作过程业内人士是很熟悉的，例如可参照MolecularCloning 2nd edtion[J.Sambrook E.F.Fritsch and T.Maniatis，Cold Spring Harbor Laboratory Press，p9.31(1989)]。序列号41和42分别给出了上述得到的svPEP的基因的碱基序列和它所编码的整个氨基酸序列，序列号40给出了svPEP成熟蛋白质的氨基酸序列。

使SvPEP以茂原链轮丝菌的培养液或茂原链轮丝菌菌体的形式与蛋白酶一起作用于转谷氨酰胺酶原时，可以完全除去前体结构部分，结果可以得到前体结构部分完全切除的成熟型的转谷氨酰胺酶。或者是通过将导入了前svPEP原基因和蛋白酶基因的棒杆菌与将转谷氨酰胺酶原分泌到菌体外的棒杆菌共同培养，同样可以得到前体结构部分完全切除的成熟型的转谷氨酰胺酶。另外，通过在导入了前转谷氨酰胺酶原基因的棒杆菌中按照同样方法再导入SAMP45基因和svPEP基因两者，使得svPEP和转谷氨酰胺酶原以及SAMP45同时分泌到菌体表面或菌体外，可以有效地生成具有与天然结构一样的成熟型的转谷氨酰胺酶。

将本发明使用的基因重组体导入棒杆菌的方法没有特别限定，可以利用通常使用的方法，例如原生质体法(Gene，39，281-286(1985))、电穿孔法(Bio/Technology，7，1067-1070(1989))等方法。得到的导入了基因的转化体按照通常使用的方法和条件进行培养。例如，转化体可以用含有碳源、氮源和无机离子的常用的培养基进行培养。为了要获得高增殖，也可以根据需要添加维生素、氨基酸等有机微量营养素。

作为碳源可以使用象葡萄糖和蔗糖那样的碳水化合物，醋酸那样的有机酸、醇类以及其他碳源。作为氮源可以使用氨气、氨水、铵盐和其他氮源。作为无机离子根据需要可以适当使用钙离子、镁离子、磷酸根离子、钾离子、铁离子等。培养在pH5.0～8.5、15℃～37℃等合适的范围内通氧条件下进行。培养1～7天左右。通过在这样的条件下培养转化体，目的蛋白质在菌体内大量生成并被有效地分泌到菌体外。就转谷氨酰胺酶来说，已知如果在微生物菌体内大量蓄积一般都会导致菌体死亡，但如果利用本发明，由于生成的转谷氨酰胺酶都释放到菌体外，菌体不会受到致死的影响，所以可以连续地生产转谷氨酰胺酶。

利用本发明分泌到培养基的蛋白质按照同行都熟悉的方法可以从培养后的培养基中分离纯化。例如，通过离心分离除去菌体后，再通过盐析、乙醇沉淀、超滤、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、中高压液相层析，反相层析、疏水层析等已知的合适的方法、或配合使用进行分离纯化。利用本发明分泌到菌体表面的蛋白质也可使用同行都熟悉的方法，例如提高盐浓度、使用表面活性剂等使其溶解后，象分泌到培养基中的蛋白质那样进行分离纯化。有时分泌到菌体表面的蛋白质不进行可溶化，例如作为固定化酶使用。

结合以下实施例，对本发明进一步进行具体说明，但本发明并不限定于这些实施例。

实施例1：源自茂原链轮丝菌IF013819的前转谷氨酰胺酶原在谷氨酸棒杆菌ATCC13869中的表达

(1)源自茂原链轮丝菌IF013819的前转谷氨酰胺酶原基因的获得源自茂原链轮丝菌DSMZ菌株的转谷氨酰胺酶基因的序列已经被确定[Eur.J.Biochem.，257，570-576(1998)]。参考该序列，合成如序列号8和9所示的引物，利用PCR法从按照常规方法(斋藤、三浦的方法[Biochim.Biophys.Acta，72，619(1963)])制备的茂原链轮丝菌IF013819的染色体DNA中扩增编码成熟转谷氨酰胺酶序列的区域。在PCR反应中使用Pyrobest DNA polymerase(宝酒造公司制)，反应条件参照厂家推荐的方案。

(序列号8)5’-GACTCCGACGACAGGGTCACCCCTCCCGCC-3’

(序列号9)5’-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3’

<序列表说明>

序列号8、9：PCR引物

然后对扩增的大约1.0kb的DNA片段用Random Primer DNALabeling Kit Ver.2(宝酒造公司制)和[α-³²P]dCTP，按照说明书附带的方案进行反应，制备DNA探针。使用制备的探针和茂原链轮丝菌IF013819染色体DNA，按照Molecular Cloning 2nd edtion[J.Sambrook，E.F.Fritsch and T.Maniatis，Cold Spring HarborLaboratory Press，p9.31(1989)]所述的方法进行Southern blot杂交，便可确认在用限制酶Sac I酶切出的大约4kb的片段中存在着转谷氨酰胺酶基因。使用EASYTRAP Ver.2(宝酒造公司制)通过琼脂糖凝胶电泳回收用Sac I切茂原链轮丝菌IF013819的染色体DNA得到的大约4kb的片段，并插入pUC18(宝酒造公司制)的Sac I位点后，导入大肠杆菌JM109(宝酒造公司制)的感受态细胞，构建文库。

使用先前制备的转谷氨酰胺酶的DNA探针按照MolecularCloning 2nd edtion[J.Sambrook，E.F.Fritsch and T.Maniatis，Cold Spring Harbor Laboratory Press，p1.90(1989)]所述的菌落杂交方法进行文库的筛选，获得含有转谷氨酰胺酶基因片段被克隆的质粒的菌株，从该菌株回收质粒，取名为pUITG。测定克隆于pUITG的片段的碱基序列，可以确认茂原链轮丝菌IF013819转谷氨酰胺酶基因与茂原链轮丝菌DSMZ株的转谷氨酰胺酶基因具有同样的碱基序列。

碱基序列测定的结果表明，该Sac I的大约4kb的片段是缺了一部分信号序列(前导部分)的不完全的DNA片段。于是进行了启动子区和完整的信号序列区的克隆的尝试。克隆是利用TAKARA LA PCR invitro Cloning Kit(宝酒造公司制)和序列号10和11所示的引物，按照说明书附带的方案实施的。

(序列号10)5’-GTGACCCTGTCGTCGGAGTC-3’

(序列号11)5’-GGCATCCTGTCGAGCGGCTC-3’

<序列表说明>

序列号10、11：用于克隆茂原链轮丝菌的启动子区和信号序列的PCR引物。

结果表明，使用Sa1 I的试剂盒引物时得到大约800bp的PCR扩增片段，测定该片段的碱基序列，可确认该片段是含有转谷氨酰胺酶基因的启动子区和信号序列区的片段。通过将这个大约800bp的PCR扩增片段插入到特开平9-070291所述的pVC7的SmaI位点，得到pVITGS5。然后通过用Sa1 I消化pUITG，通过琼脂糖凝胶电泳回收含有转谷氨酰胺酶基因的约4kb片段，再将该片段插入pVITGS5的Sac I位点，构建含有全长的转谷氨酰胺酶基因的质粒pVITGC。另外碱基序列的测定使用Dye Terminator Cycle Sequencing kit(PE AppliedBiosystems公司制)和DNA测序仪(PE Applied Biosystems公司制)。序列号12给出了前转谷氨酰胺酶原基因的序列，而N末端的31个氨基酸序列被认为是信号序列(前导部分)。前转谷氨酰胺酶原的氨基酸序列如序列号13所示。

(2)转谷氨酰胺酶基因启动子区的转换

谷氨酸棒杆菌的细胞表面蛋白PS2基因序列已经确定[Mol.Microbiol.，9，97-109(1993)]。参考该序列合成序列号14和序列号15所示的引物，通过PCR法从常规方法制备的谷氨酸棒杆菌ATCC13869染色体DNA中扩增含有PS2蛋白质基因的起始密码5’-上游区的启动子的区域。

(序列号14)5’-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3’

(序列号15)5’-GAGCTCTCCGGCGTATGCGCATAGAGGCGAAGGCTCCTTGAATA-3’

<序列表说明>

序列号14、15：PCR引物

以实施例1(1)中测定的转谷氨酰胺酶基因序列为基础，合成序列号16和9所示的引物，利用PCR法从实施例1(1)中得到的pUITG扩增前转谷氨酰胺酶原基因区。

(序列号16)5’-ATGCGCATACGCCGGAGAGCTCTCGTCTTC-3’

<序列表说明>

序列号16：PCR引物

接下来，将扩增的含有谷氨酸棒杆菌ATCC13869 PS2基因的启动子的区域与已扩增的转谷氨酰胺酶基因区的PCR反应液1μl混合作为模板，使用序列号14和序列号9进行交叉(cross over)PCR，扩增与含有谷氨酸棒杆菌ATCC13869的细胞表面蛋白基因启动子的区域相连的带有前体结构部分的转谷氨酰胺酶的融合基因。通过琼脂糖凝胶电泳检测出大约1.8kb的扩增片段。使用EASYTRAP Ver.(宝酒造公司制)从琼脂糖凝胶中回收该片段，插入到特开平9-070291所述的pVC7的SmaI位点，得到pVKPTGO。按照上述方法测定插入片段的碱基序列，确认构建了象预想那样的融合基因。

(3)前转谷氨酰胺酶原基因在谷氨酸棒杆菌ATCC13869中的表达

用实施例1(1)构建的pVITGC(启动子和前转谷氨酰胺酶原基因都源自茂原链轮丝菌)或实施例1(2)构建的pVKPTGO(启动子源自谷氨酸棒杆菌ATCC13869的PS2基因，前转谷氨酰胺酶原基因源自茂原链轮丝菌)转化谷氨酸棒杆菌ATCC13869，筛选在含有5mg/l的氯霉素的CM2S琼脂培养基(将10g酵母提取物、10g蛋白胨、5g蔗糖、5g NaCl、15g琼脂用水配成1升溶液)中生长的菌株。然后将筛选出的携有pVITGC或pVKPTGO的谷氨酸棒杆菌ATCC13869用含有5mg/l的氯霉素的MM液体培养基(将葡萄糖30g、硫酸镁7水合物0.4g、硫酸铵30g、磷酸二氢钾1g、硫酸铁7水合物0.01g、硫酸锰5水合物0.01g、硫胺素盐酸盐200μg、生物素500μg、DL-蛋氨酸0.15g、碳酸钙50g用水配成1L溶液，pH调节为7.5)分别于30℃条件下培养48小时。培养结束后，取上清液10μl进行SDS-PAGE，然后用Biosci.Biotechnol.Biochem.，58，82-87(1994)所述的抗转谷氨酰胺酶抗体，按照常规方法(例如，J.Sambrook等人(1989)所述的通常步骤)进行Western blot。

结果没有检测出转谷氨酰胺酶的分泌。从以上结果可以确认茂原链轮丝菌的转谷氨酰胺酶的信号序列在谷氨酸棒杆菌ATCC13869中没有起作用。

实施例2：利用编码谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum ATCC13869)的细胞表面蛋白质的信号肽和源自茂原链轮丝菌IF013819的成熟转谷氨酰胺酶的融合基因进行转谷氨酰胺酶的分泌生产

(1)具有谷氨酸棒杆菌ATCC13869的细胞表面蛋白质信号序列的转谷氨酰胺酶基因的构建

谷氨酸棒杆菌的细胞表面蛋白PS2的基因序列已经确定了[Mol.Microbiol.，9，97-109(1993)]。参考该序列合成序列号14和序列号17所示的引物，利用PCR法从实施例1(2)方法制备的谷氨酸棒杆菌ATCC13869的染色体DNA中扩增含有编码相当于PS2蛋白质基因的N末端一侧的44氨基酸残基(信号肽30个氨基酸残基和成熟细胞表面蛋白质的14个氨基酸残基)区和启动子区的5’-上游区。为了构建与转谷氨酰胺酶融合基因，序列号17给出的引物含有编码成熟转谷氨酰胺酶的N末端一侧的氨基酸序列的碱基序列。

(序列号14)5’-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3’

(序列号17)5’-GGGGTGACCCTGTCGTCGGAGTCGTTGAAGCCGTTGTTGATGTTGAA-3’

<序列表说明>

序列号17：PCR引物

以实施例1(1)中测定的转谷氨酰胺酶基因序列为基础，合成序列号8和9所示的引物，利用PCR法从实施例1(1)中得到的pUITG扩增成熟的转谷氨酰胺酶基因区。

接下来，将扩增的含有编码相当于谷氨酸棒杆菌ATCC13869的PS2蛋白质N末端一侧的44个氨基酸残基的区域和启动子区的5’-上游区的PCR反应液1μl与已扩增的成熟的转谷氨酰胺酶基因区的PCR反应液1μl混合作为模板，使用序列号14和序列号9进行交叉PCR，扩增含有谷氨酸棒杆菌ATCC13869的细胞表面蛋白基因的启动子区的5’-上游区和编码N末端一侧44个氨基酸残基的区域相连的成熟转谷氨酰胺酶的融合基因。

通过琼脂糖凝胶电泳检测出大约1.7kb的扩增片段。使用EASYTRAP Ver.2(宝酒造公司制)从琼脂糖凝胶中回收该片段，插入到特开平9-070291所述的pVC7的SmaI位点，得到pVKTG3。按照上述方法测定插入片段的碱基序列，确认构建了象预想那样的融合基因。

通过用KpnI和XbaI消化pVKTG3，切出大约1.7kb的含有谷氨酸棒杆菌ATCC13869的细胞表面蛋白基因的启动子区的5’-上游区和编码N末端一侧44氨基酸残基的区相连的成熟转谷氨酰胺酶的融合基因，通过琼脂糖凝胶电泳回收，然后将该片段插入到特开平9-322774所述的pPK4的KpnI-XbaI位点，构建pPKTG3。

(2)利用谷氨酸棒杆菌ATCC13869的细胞表面蛋白质的信号序列进行成熟转谷氨酰胺酶的分泌

用构建的质粒pVKTG3或pPKTG3(两者中由启动子和信号肽以及N末端14个氨基酸残基构成的基因都源自谷氨酸棒杆菌ATCC13869，成熟转谷氨酰胺酶基因源自茂原链轮丝菌)转化谷氨酸棒杆菌ATCC13869，筛选在含有5mg/l的氯霉素或25mg/l的卡那霉素的上述CM2S琼脂培养基中生长的菌株。然后将筛选出的携有pVKTG3或pPKTG3的谷氨酸棒杆菌ATCC13869用含有5mg/l的氯霉素或25mg/l的卡那霉素的上述MM液体培养基于30℃培养48小时。培养结束后，取上清液10μl进行SDS-PAGE，然后用Biosci.Biotechnol.Biochem.，58，82-87(1994)所述的抗转谷氨酰胺酶抗体，按照常规方法进行Western blot。结果在两种菌株的培养上清中能够检测出少量的具有与成熟转谷氨酰胺酶大致相同分子量的分泌的转谷氨酰胺酶。

实施例3：利用与谷氨酸棒杆菌ATCC13869的细胞表面蛋白质的信号肽相连的源自茂原链轮丝菌IF013819的转谷氨酰胺酶原的融合基因 (外源融合前转谷氨酰胺酶原基因)进行转谷氨酰胺酶的分泌生产

(1)具有谷氨酸棒杆菌ATCC13869的细胞表面蛋白质信号序列的带有前体结构部分的转谷氨酰胺酶基因(外源融合前转谷氨酰胺酶原基因)的构建

参考谷氨酸棒杆菌的细胞表面蛋白PS2的基因序列[Mol.Microbiol.，9，97-109(1993)]，合成序列号18、序列号19、序列号20以及序列号21所示的引物。使用序列号14和序列号18、或序列号14和序列号19、或序列号14与序列号20、或者序列号14与序列号21的组合通过PCR法从实施例1(2)方法制备的谷氨酸棒杆菌ATCC13869的染色体DNA中扩增出分别编码相当于PS2蛋白质的N末端一侧的30个、31个、44个以及68个氨基酸残基的编码区域(含有信号肽30个氨基酸残基)和含有启动子的5’-上游区。

为了构建与带有前体结构部分的转谷氨酰胺酶的融合基因，序列号18、19、20和21给出的引物含有编码转谷氨酰胺酶的N末端一侧的氨基酸序列的碱基序列。

(序列号18)5’-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCAGCGAATGCTGGGATAGCAACGCC-3

(序列号19)5’-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCCTGAGCGAATGCTGGGATAGCTAC-3

(序列号20)5’-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCGTTGAAGCCGTTGTTGATGTTGAA-3

(序列号21)5’-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCAGTCAGGTCGCGGAGGGTTTCCTC-3

<序列表说明>

序列号18～21：PCR引物

以实施例1(1)中测定的转谷氨酰胺酶基因序列为基础，合成序列号22和9所示的引物，利用PCR法从实施例1(1)中得到的pUITG中扩增转谷氨酰胺酶原基因区。

(序列号22)5’-GACAATGGCGCGGGGGAAGAGACGAAGTCC-3’

<序列表说明>

序列号22：PCR引物

接下来，将扩增的含有相当于谷氨酸棒杆菌ATCC13869的PS2蛋白质基因的启动子区的5’-上游区和编码N末端一侧的30个、31个、44个以及68个氨基酸残基的碱基序列的PCR反应液各1μl，与已扩增的带有前体结构部分的转谷氨酰胺酶基因区的PCR反应液1μl混合作为模板，使用序列号14和序列号9进行交叉PCR，分别扩增含有相当于谷氨酸棒杆菌ATCC13869的PS2蛋白基因的启动子区的5’-上游区和编码N末端一侧的30个、31个、44个以及68个氨基酸残基的各个碱基序列区相连的转谷氨酰胺酶原的融合基因，即与谷氨酸棒杆菌ATCC13869表面蛋白质基因的启动子结合的外源融合前转谷氨酰胺酶原基因片段。

通过琼脂糖凝胶电泳分别检测出从大约1.8kb到1.9kb的扩增片段。使用EASYTRAP Ver.2(宝酒造公司制)从琼脂糖凝胶中回收这些片段，插入到特开平9-070291所述的pVC7的SmaI位点，分别得到pVKPTG1、pVKPTG2、pVKPTG3和pVKPTG4。按照上述方法测定插入片段的碱基序列，确认构建了象预想那样的融合基因。

通过用KpnI和XbaI消化pVKPTG1、pVKPTG2、pVKPTG3和pVKPTG4，切出从大约1.8kb到1.9kb的含有相当于谷氨酸棒杆菌ATCC13869的细胞表面蛋白基因的启动子区的5’-上游区和编码N末端一侧的30个、31个、44个以及68个氨基酸残基的各个序列区相连的带有前体结构部分的转谷氨酰胺酶的融合基因，通过琼脂糖凝胶电泳回收，然后将该片段插入到特开平9-322774所述的pPK4的KpnI-XbaI位点，构建pPKPTG1、pPKPTG2、pPKPTG3和pPKPTG4。

(2)利用谷氨酸棒杆菌ATCC13869的细胞表面蛋白质的信号序列分泌转谷氨酰胺酶原

用构建的质粒pVKPTG1、pVKPTG2、pVKPTG3、pVKPTG4、pPKPTG1、pPKPTG2、pPKPTG3或pPKPTG4转化谷氨酸棒杆菌ATCC13869，筛选在含有5mg/l的氯霉素或25mg/l的卡那霉素的上述CM2S琼脂培养基中生长的菌株。然后将筛选出的携有pVKPTG1、pVKPTG2、pVKPTG3、pVKPTG4、pPKPTG1、pPKPTG2、pPKPTG3和pPKPTG4的谷氨酸棒杆菌ATCC13869用含有5mg/l的氯霉素或25mg/l的卡那霉素的上述MM液体培养基于30℃分别培养48小时。培养结束后，取上清液10μl进行SDS-PAGE，然后用Biosci.Biotechnol.Biochem.，58，82-87(1994)所述的抗转谷氨酰胺酶抗体，按照常规方法进行Westernblot。结果可以确认无论pVC7，还是pPK4载体都有大致等量的带有前体结构部分的转谷氨酰胺酶的分泌，但相当于PS2蛋白质的成熟蛋白质的N末端一侧氨基酸残基的长度不同，可看出相应的分泌量存在明显的差别。表1给出了有代表性的分泌量。

表1.利用谷氨酸棒杆菌ATCC13869的细胞表面蛋白质的信号序列获得的转谷氨酰胺酶原的分泌生产量

质粒	转谷氨酰胺酶原(mg/L)
质粒	转谷氨酰胺酶原(mg/L)	pPKPTG1	78
pPKPTG4	210	pPKPTG1	78

(3)通过分散酶消化来切断转谷氨酰胺酶原和检测活性

向携有pVKPTG1、pVKPTG2、pVKPTG3和pVKPTG4、pPKPTG1、pPKPTG2、pPKPTG3或pPKPTG4的谷氨酸棒杆菌ATCC13869培养上清加入作为蛋白酶的分散酶(Boeringer Manheim公司制)，添加的比例为底物:酶＝1:1，于pH7.5、37℃下反应1小时。分散酶消化反应后，通过SDS-PAGE确认转谷氨酰胺酶原被切情况，再经氧肟酸酯(hydroxamate)法[J.Biol.chem.，241，5518-5525(1966)]确认转谷氨酰胺酶活性，可确认具有大致与天然型一样的比活性(约20U/mg)。

实施例4：利用具有产氨棒杆菌(C.ammoniagenes)的细胞表面蛋白质的信号肽编码序列和源自茂原链轮丝菌IF013819的转谷氨酰胺酶编码序列的融合基因进行转谷氨酰胺酶原的分泌生产

(1)具有产氨棒杆菌的细胞表面蛋白质的信号序列的带有前体结构部分的转谷氨酰胺酶基因(外源融合前转谷氨酰胺酶原)的构建

参考产氨棒杆菌的细胞表面蛋白(S1pA)的基因序列[特开平10-108675]，合成序列号23和序列号24所示的引物，利用PCR法从常规方法制备的产氨棒杆菌的染色体DNA中扩增含有相当于细胞表面蛋白(S1pA)基因的启动子区的5’-上游区和编码N末端一侧的25个氨基酸残基(信号肽)的区域。为了构建与转谷氨酰胺酶的融合基因，序列号24给出的引物含有编码转谷氨酰胺酶原的N末端一侧的氨基酸序列的碱基序列。

(序列号23)5’-GCCCAGAAGCCCAAAATTGAGATTT-3’

(序列号24)5’-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCTGCCGTTGCCACAGGTGCGGCCAGC-3

<序列表说明>

序列号23、24：PCR引物

接下来，将扩增的含有相当于产氨棒杆菌细胞表面蛋白(S1pA)基因的启动子区的5’-上游区与编码N末端一侧的25个氨基酸残基的区域的PCR反应液1μl，与在实施例3(1)中扩增的带有前体结构部分的转谷氨酰胺酶基因区的PCR反应液1μl混合作为模板，使用序列号23和序列号9进行交叉PCR，扩增含有产氨棒杆菌的细胞表面蛋白(S1pA)基因的启动子区的5’-上游区和编码N末端一侧25氨基酸残基的区域相连的带有前体结构部分的转谷氨酰胺酶的融合基因(外源融合前转谷氨酰胺酶原)。

通过琼脂糖凝胶电泳检测出大约1.7kb的扩增片段。使用EASYTRAP Ver.2(宝酒造公司制)从琼脂糖凝胶中回收该片段，插入到pVC7的Sma I位点，得到pVSPTG1。

(2)启动子区域的转换；与谷氨酸棒杆菌ATCC13869的细胞表面蛋白质基因的启动子的结合

参考谷氨酸棒杆菌的细胞表面蛋白PS2的基因序列[Mol.Microbiol.，9，97-109(1993)]，合成序列号14、序列号25所示的引物。通过PCR法从实施例1(2)制备的谷氨酸棒杆菌ATCC13869的染色体DNA中扩增含有相当于PS2蛋白质基因的启动子区的5’-上游区。为了构建与具有产氨棒杆菌细胞表面蛋白(S1pA)基因的信号序列的带有前体结构部分的转谷氨酰胺酶基因的融合基因(外源融合前转谷氨酰胺酶原基因)，序列号25给出的引物含有编码产氨棒杆菌细胞表面蛋白(S1pA)的信号序列的N末端一侧的氨基酸序列的碱基序列。

(序列号25)5’-CGCAGCCAGCGATTTCATGCGTTTCATAGAGGCGAAGGCTCCTTGAATAGGT-3

<序列表说明>

序列号25：PCR引物

另外，以具有产氨棒杆菌细胞表面蛋白(S1pA)的信号序列的带有前体结构部分的转谷氨酰胺酶基因的融合基因序列为基础，合成序列号26和9所示的引物，利用PCR法从实施例4(1)中得到的pVSPTG1中扩增具有产氨棒杆菌细胞表面蛋白(S1pA)的信号序列的带有前体结构部分的转谷氨酰胺酶的基因区。

(序列号26)5’-ATGAAACGCATGAAATCGCTGGCTGCGGCG-3’

<序列表说明>

序列号26：PCR引物

接下来，将扩增的含有相当于谷氨酸棒杆菌ATCC13869的PS2蛋白质基因的启动子区的5’-上游区的PCR反应液1μl，与已扩增的具有产氨棒杆菌细胞表面蛋白(S1pA)的信号序列的带有前体结构部分的转谷氨酰胺酶的基因(外源融合前转谷氨酰胺酶原基因)区的PCR反应液1μl混合作为模板，使用序列号14和序列号9进行交叉PCR，扩增具有含有相当于谷氨酸棒杆菌ATCC13869的PS2蛋白基因的启动子区的5’-上游区的、带有与编码产氨棒杆菌细胞表面蛋白(S1pA)N末端一侧25个氨基酸残基的区域相连的前体结构部分的转谷氨酰胺酶的融合基因。

通过琼脂糖凝胶电泳检测出大约1.8kb的扩增片段。使用EASYTRAP Ver.2(宝酒造公司制)从琼脂糖凝胶中回收该片段，插入到特开平9-070291所述的pVC7的SmaI位点，得到pVKSPTG1。按照上述方法测定插入片段的碱基序列，确认构建了象预想那样的融合基因。

另外，通过用KpnI和XbaI消化pVKSPTG1，切出大约1.8kb的具有含有相当于谷氨酸棒杆菌ATCC13869的PS2细胞表面蛋白基因的启动子区的5’-上游区的、带有与编码产氨棒杆菌细胞表面蛋白(S1pA)N末端一侧25个氨基酸残基(信号肽)区域相连的前体结构部分的转谷氨酰胺酶的融合基因(外源融合前转谷氨酰胺酶原基因)，通过琼脂糖凝胶电泳回收。然后通过将该片段插入到特开平9-322774所述的pPK4的KpnI-XbaI位点，构建pPKSPTG1。质粒pVKSPTG1和pPKSPTG1都是由源自谷氨酸棒杆菌ATCC13869的PS2基因的启动子、源自产氨棒杆菌的S1pA的信号肽和源自茂原链轮丝菌的转谷氨酰胺酶原基因构成的。

(3)转换为E.coli的tac启动子

参考E.coli的tac启动子被克隆的质粒pKK223-3(AmershamPharmacia公司制)的序列，合成序列号27和28所示的引物。通过PCR法从pKK223-3的DNA扩增相当于tac启动子的区域。为了构建具有产氨棒杆菌细胞表面蛋白(S1pA)的信号序列的带有前体结构部分的转谷氨酰胺酶基因的融合基因(外源融合前转谷氨酰胺酶原基因)，序列号28给出的引物含有编码产氨棒杆菌细胞表面蛋白(S1pA)的信号序列的N末端一侧的氨基酸序列的碱基序列。

(序列号27)5’-GGATCCGGAGCTTATCGACTGCACG-3’

(序列号28)5’-CGCAGCCAGCGATTTCATGCGTTTCATAATTCTGTTTCCTGTGTGAAATTGT-3

<序列表说明>

序列号27、28：PCR引物

接下来，将扩增的相当于tac启动子区的PCR反应液1μl，和在实施例4(2)扩增的具有产氨棒杆菌细胞表面蛋白(S1pA)的信号序列的带有前体结构部分的转谷氨酰胺酶的基因区的PCR反应液1μl混合作为模板，使用序列号27和序列号9进行交叉PCR，扩增具有tac启动子的、带有与编码产氨棒杆菌细胞表面蛋白(S1pA)N末端一侧的25个氨基酸残基的区域相连的前体结构部分的转谷氨酰胺酶的融合基因(外源融合前转谷氨酰胺酶原基因)。通过琼脂糖凝胶电泳分别检测出大约1.5kb的扩增片段。使用EASYTRAP Ver.2(宝酒造公司制)从琼脂糖凝胶中回收该片段，插入到特开平9-070291所述的pVC7的SmaI位点，得到pVTSPTG1。按照上述方法测定插入片段的碱基序列，确认构建了象预想那样的融合基因。

另外，通过用Kpn I和XbaI消化pVTSPTG1，切出大约1.5kb的具有tac启动子的、带有与编码产氨棒杆菌细胞表面蛋白(S1pA)N末端一侧25个氨基酸残基的区域相连的前体结构部分的转谷氨酰胺酶的融合基因，通过琼脂糖凝胶电泳回收。然后将该片段插入到特开平9-322774所述的pPK4的KpnI-XbaI位点，构建pPTSPTG1。质粒pVTSPTG1和pPTSPTG1都是由源自于E.coli的tac启动子，源自于产氨棒杆菌的S1pA的信号肽，源自茂原链轮丝菌的转谷氨酰胺酶原基因构成的。

(4)利用产氨棒杆菌的细胞表面蛋白质的信号序列分泌转谷氨酰胺酶原

用构建的质粒pVKSPTG1、pVTSPTG1、pPKSPTG1和pPTSPTG1转化谷氨酸棒杆菌ATCC13869，筛选在含有5mg/l的氯霉素或25mg/l的卡那霉素的上述CM2S琼脂培养基中生长的菌株。然后将筛选出的携有pVKSPTG1、pVTSPTG1、pPKSPTG1和pPTSPTG1的谷氨酸棒杆菌ATCC13869用含有5mg/l的氯霉素或25mg/l的卡那霉素的上述MM液体培养基于30℃下分别培养48小时。培养结束后，取上清液10μl进行SDS-PAGE，然后用Biosci.Biotechnol.Biochem.，58，82-87(1994)所述的抗转谷氨酰胺酶抗体，按照常规方法进行Westernblot。结果无论pVC7，还是pPK4载体都可以确认有大致等量的转谷氨酰胺酶的分泌。表2给出了有代表性的分泌量。

表2.利用产氨棒杆菌的细胞表面蛋白质的信号序列获得的转谷氨酰胺酶原的分泌生产量

质粒	转谷氨酰胺酶原(mg/L)
质粒	转谷氨酰胺酶原(mg/L)	pPKSPTG1	102
pPTSPTG1	74	pPKSPTG1	102

(5)通过分散酶消化来切断转谷氨酰胺酶原和检测活性

向携有pVKSPTG1、pVTSPTG1、pPKSPTG1和pPTSPTG1的谷氨酸棒杆菌ATCC13869培养上清加入作为蛋白酶的分散酶(BoeringerManheim公司制)，添加的比例为底物:酶＝1:1，于pH7.5、37℃下反应1小时。分散酶消化反应后，通过SDS-PAGE确认转谷氨酰胺酶原被切情况，再经氧肟酸酯(hydroxamate)法确认转谷氨酰胺酶活性，可确认具有大致与天然型一样的比活性(约20U/mg)。

实施例5：通过茂原链轮丝菌的培养液和菌体切断转谷氨酰胺酶原和检测活性

(1)通过茂原链轮丝菌IF013819株的培养液切断转谷氨酰胺酶原和检测活性

茂原链轮丝菌IF013819菌株用ISP2液体培养基(将酵母提取物4g、麦芽提取物10g、葡萄糖4g用水配成1L溶液，pH调节为7.3)于30℃下培养24小时。向10ml该培养液中添加在实施例4(5)中也应用过的蓄积了转谷氨酰胺酶原的携有pVKSPTG1、pVTSPTG1、pPKSPTG1或pPTSPTG1的谷氨酸棒杆菌ATCC13869的经膜过滤器过滤的培养上清10ml，于30℃下保持6小时。然后进行SDS-PAGE，确认带有前体结构部分的转谷氨酰胺酶被切情况，再经氧肟酸酯法确认具有与天然型大致一样的比活性(约20U/mg)的转谷氨酰胺酶活性。另外，在SDS-PAGE后，经半干转移将蛋白从胶上转移到聚偏(二)氟乙烯(Polyvinylidene-defluoride，PVDF)膜上(用于基因克隆的蛋白质结构解析，东京化学同人(1993))。蛋白转移后，可以用考马斯亮蓝对膜进行染色、脱色、风干。将成熟转谷氨酰胺酶的部分切下来，使用蛋白质序列仪(Model 476A，Perkin Elmer Co.Ltd制)解析N末端氨基酸序列。解析结果可以确认具有与序列号5所示的天然型成熟转谷氨酰胺酶一样的N末端氨基酸序列。

(2)通过茂原链轮丝菌IF013819株的菌体切断带有前体结构部分的转谷氨酰胺酶和检测活性

茂原链轮丝菌IF013819菌株用ISP2液体培养基于30℃下培养24小时。将10ml该培养液经离心分离收集菌体，用生理盐水洗2次。将最后收集的菌体悬浮于10ml的生理盐水中，然后添加在实施例4(5)中也应用过的蓄积了转谷氨酰胺酶原的携有pVKSPTG1、pVTSPTG1、pPKSPTG1或pPTSPTG1的谷氨酸棒杆菌ATCC13869的经膜过滤器过滤的培养上清10ml，于30℃下保持6小时。然后进行SDS-PAGE，确认带有前体结构部分的转谷氨酰胺酶被切情况，再经氧肟酸酯法确认具有与天然型大致一样比活性(约20U/mg)的转谷氨酰胺酶活性。另外，在SDS-PAGE后，经半干转移将蛋白从胶上转移到PVDF膜上(用于基因克隆的蛋白质结构解析，东京化学同人(1993))。蛋白转移后，可以用考马斯亮蓝对PVDF膜进行染色、脱色、风干。将成熟转谷氨酰胺酶的部分切下来，使用蛋白质序列仪解析N末端氨基酸序列。解析结果可以确认具有与序列号5所示的天然型成熟转谷氨酰胺酶一样的N末端氨基酸序列。

实施例6：利用具有产氨棒杆菌的细胞表面蛋白质的信号序列、以及源自肉桂链轮丝菌IF012852的转谷氨酰胺酶的编码序列的融合基因进行转谷氨酰胺酶原的分泌生产

(1)具有产氨棒杆菌的细胞表面蛋白质的信号序列、以及源自肉桂链轮丝菌IF012852的转谷氨酰胺酶的编码序列的融合基因的构建

肉桂链轮丝菌IF012852的转谷氨酰胺酶基因序列已经确定(特原平11-295649)。人们推定第1位到第32位的氨基酸序列为酶的前导(pre)部分的序列，而33到86位的氨基酸序列为前体(pro)部分的序列，而87到416位的氨基酸序列为成熟型转谷氨酰胺酶的序列。推定的前体结构和成熟蛋白质的氨基酸序列分别如序列号4和43所示。而用含有该基因的质粒pUJ-MTG转化的大肠杆菌AJ13669于1999年10月14日以FERM P-17602寄存于通商产业省工业技术院生命工程工业技术研究所(305-8566茨城县筑波市东1丁目1-3)，根据布达佩斯条约于2000年8月28日进行移交，寄存号为FERM BP-7287。

首先用限制酶BamHI从pUJ-MTG中切出覆盖前转谷氨酰胺酶原基因的全长的约3.5kb片段的区域，然后将它插入pUC19的BamHI位点，制作pUCSCTG。

以pUCSCTG为模板，合成序列号44和序列号45所示的引物，通过同样的PCR法使含有源自肉桂链轮丝菌IF012852的转谷氨酰胺酶原的基因区域扩增。

(序列号44)5’-GGC GAT GGG GAA GAG AAG GGG-3’

(序列号45)5’-GGC GGA TCC TCG CGT CGA GAG GCG TGG ACT GA-3’

<序列表说明>

序列号44、45：PCR引物

接下来，以实施例4(2)构建的pPKSPTG1为模板，通过序列号46和序列号47组合，利用PCR法使含有谷氨酸棒杆菌的细胞表面蛋白质PS2基因的启动子区域的5’-上游区和含有产氨棒杆菌的细胞表面蛋白质S1pA的信号序列的区域扩增。

为了构建与源自肉桂链轮丝菌IF012852的转谷氨酰胺酶的融合基因，序列号47给出的引物含有编码源自肉桂链轮丝菌IF012852的转谷氨酰胺酶原的N末端一侧的氨基酸的碱基序列。

(序列号46)5’-TAC GAA TTC GAG CTC GGT ACC-3’

(序列号47)5’-CCC CTT CTC TTC CCC ATC GCC TGC CGT TGC CAC AGG TGC GG C C-3’

<序列表说明>

序列号46、47：PCR引物

接下来，将扩增的编码含有源自肉桂链轮丝菌IF012852的转谷氨酰胺酶原的基因区域的PCR反应液1μl，与扩增的含有PS2基因的启动子区的5’-上游区和含有产氨棒杆菌细胞表面蛋白S1pA的信号序列的区域的PCR反应液1μl混合作为模板，使用序列号46和序列号45进行交叉PCR，使含有PS2基因的启动子区的5’-上游区和产氨棒杆菌细胞表面蛋白S1pA的信号序列相连的外源融合前转谷氨酰胺酶原基因片段扩增。

通过琼脂糖凝胶电泳检测出大约1.8kb的扩增片段。该片段用EcoRI和BamHI消化后，从琼脂糖凝胶中回收该片段，插入到pUC19的EcoRI-BamHI位点，得到pUKSPTG2’。按照上述方法测定插入片段的碱基序列，确认构建了象预想那样的融合基因。用EcoRI消化该pUKSPTG2’，使用Blunting kit(宝酒造公司制)进行平端化，插入带有5’-末端磷酸化的5’-CTCTAGAG-3’序列的XbaI接头(宝酒造公司制)，再环化构建pUKSPTG2。通过用XbaI消化pUKSPTG2，切出大约1.8kb的融合前转谷氨酰胺酶原基因(转谷氨酰胺酶原基因源自肉桂链轮丝菌IF012852)，通过琼脂糖凝胶电泳回收。然后通过将该片段插入到上述pPK4的XbaI位点，构建pPKSPTG2。

然后构建带有前体结构部分的N末端的一部分被茂原链轮丝菌的前体结构部分替换的嵌合前体结构部分的前转谷氨酰胺酶原基因(成熟型转谷氨酰胺酶基因和前体结构部分的一部分源自肉桂链轮丝菌IF012852)。

首先从实施例4(2)构建的质粒pPKSPTG1(用于表达茂原链轮丝菌IF013819的转谷氨酰胺酶原)切出EcoRI-BamHI的含有大约1.8kb的前转谷氨酰胺酶原基因的片段，然后插入到pUC19的EcoRI-BamHI位点(pUKSPTG1)。pUKSPTG1用AatII消化，切出大约1.2kb的片段，同时pUKSPTG2’也用AatII消化，制备除去大约1.2kb片段后的约3.3kb片段。将该约3.3kb片段与源自pUKSPTG1的约1.2kb片段连接，按照常规的基因操作法筛选插入了AatII片段的克隆。为了了解其中AatII片段插入的方向，依次进行测序，筛选按目的方向(编码前转谷氨酰胺酶原)插入的克隆(pUKSPTG3’)。而对pUKSPTG3’也要象对pUKSPTG2’操作那样使其EcoRI位点平端化，插入XbaI接头，构建pUKSPTG3。通过从pUKSPTG3切出XbaI的大约1.8kb片段，插入到pPK4的XbaI位点，构建pPKSPTG3。

(2)利用产氨棒杆菌的细胞表面蛋白质的信号序列分泌源自肉桂链轮丝菌IF012852的转谷氨酰胺酶原

用构建的质粒pPKSPTG2和pPKSPTG3转化谷氨酸棒杆菌ATCC13869，筛选在上述含有25mg/l的卡那霉素的CM2S琼脂培养基中生长的菌株。然后将筛选出的携有pPKSPTG2和pPKSPTG3的谷氨酸棒杆菌ATCC13869分别用含有25mg/l的卡那霉素的MMTG液体培养基(将葡萄糖60g、硫酸镁7水合物0.4g、硫酸铵30g、磷酸二氢钾1g、硫酸铁7水合物0.01g、硫酸锰5水合物0.01g、硫胺素盐酸盐450μg、生物素450μg、DL-蛋氨酸0.15g、碳酸钙50g用水配成1L溶液，pH调节为7.5)分别于30℃条件下培养3天。培养结束后，取上清液10μl进行SDS-PAGE，然后用上述抗转谷氨酰胺酶抗体，按照常规方法进行Western blot解析。该抗体虽然是抗源自茂原链轮丝菌的转谷氨酰胺酶的抗体，但对源自肉桂链轮丝菌的转谷氨酰胺酶也有反应性。结果可以确认，分泌了约30～50mg/L的带有前体结构部分的源自肉桂链轮丝菌IF012852的转谷氨酰胺酶。

实施例7：通过将源自茂原链轮丝菌的转谷氨酰胺酶原的前体结构部分替换为源自肉桂链轮丝菌IF012852的前体结构部分(制作杂化体)进行转谷氨酰胺酶原的分泌生产

合成序列号14和序列号48所示的引物，利用PCR法分别从pPKSPTG2或pPKSPTG3扩增含有谷氨酸棒杆菌ATCC13869的PS2基因的启动子区的5’-上游区和编码产氨棒杆菌的细胞表面蛋白(S1pA)的信号序列以及源自肉桂链轮丝菌IF012852的转谷氨酰胺酶的前体结构部分序列的区域的碱基序列。

为了构建含有谷氨酸棒杆菌ATCC13869的PS2基因的启动子区的5’-上游区和具有产氨棒杆菌的细胞表面蛋白(S1pA)的信号序列、以及源自肉桂链轮丝菌IF012852的转谷氨酰胺酶的前体结构部分的成熟转谷氨酰胺酶基因(源自茂原链轮丝菌IF013819)的融合基因(外源融合前转谷氨酰胺酶原)，序列号48给出的引物含有编码源自茂原链轮丝菌IF013819的成熟转谷氨酰胺酶的N末端一侧氨基酸的碱基序列。

(序列号14)5’-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3’

(序列号48)5’-GGG GTG ACC CTGTCG TCG GAG TCG GGG GCC CGG GAG GGC GCG CTG G-3’

<序列表说明>

序列号48：PCR引物

另外，以实施例1(1)测定的源自茂原链轮丝菌的转谷氨酰胺酶基因序列为基础，合成序列号8和序列号9所示的引物，利用PCR法从实施例1(1)中得到的pUITG扩增源自茂原链轮丝菌的成熟转谷氨酰胺酶基因区域。

(序列号8)5’-GACTCCGACGACAGGGTCACCCCTCCCGCC-3’

(序列号9)5’-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3’

<序列表说明>

序列号8、9：PCR引物

接下来，将分别扩增的含有谷氨酸棒杆菌ATCC13869的PS2基因的启动子区的5’-上游区和编码产氨棒杆菌的细胞表面蛋白(S1pA)的信号序列以及源自肉桂链轮丝菌IF012852的转谷氨酰胺酶的前体结构部分序列的区域的PCR反应液1μl，与已扩增的源自茂原链轮丝菌的成熟转谷氨酰胺酶基因编码区域的PCR反应液1μl混合作为模板，使用序列号14和序列号9进行交叉PCR，使含有谷氨酸棒杆菌ATCC13869的PS2基因的启动子区的5’-上游区和具有产氨棒杆菌的细胞表面蛋白(S1pA)的信号序列以及源自肉桂链轮丝菌IF012852的转谷氨酰胺酶原的前体结构部分的成熟转谷氨酰胺酶基因(源自茂原链轮丝菌IF013819)的融合基因片段扩增。通过琼脂糖凝胶电泳检测出大约1.8kb的扩增片段。使用ScaI和Eco065I消化该扩增片段，从琼脂糖凝胶中回收生成的约800bp的片段，通过与从实施例4(2)构建的pPKSPTG1用ScaI和Eco065I切出的片段替换来构建pPKSPTG4和pPKSPTG5。

(序列号14)5’-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3’

(序列号9)5’-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3’

(2)利用产氨棒杆菌的细胞表面蛋白质的信号序列和源自肉桂链轮丝菌IF012852的前体结构部分分泌源自茂原链轮丝菌IF013819的转谷氨酰胺酶

用构建的质粒pPKSPTG4和pPKSPTG5转化谷氨酸棒杆菌ATCC13869，筛选在上述含有25mg/l的卡那霉素的CM2S琼脂培养基中生长的菌株。然后将筛选出的携有pPKSPTG4和pPKSPTG5的谷氨酸棒杆菌ATCC13869分别用含有25mg/l的卡那霉素的MMTG液体培养基于30℃条件下培养3天。培养结束后，取上清液10μl进行SDS-PAGE，然后用上述抗转谷氨酰胺酶抗体，按照常规方法进行Westernblot解析。结果可以确认带有源自肉桂链轮丝菌IF012852前体结构部分的源自茂原链轮丝菌IF013819的转谷氨酰胺酶的分泌。表3给出了转谷氨酰胺酶原的产量。用pPKSPTG1作对照，其基因构成上的特点是前体结构部分源自茂原链轮丝菌。pPKSPTG4具有其前体结构部分源自肉桂链轮丝菌的基因结构上的特点。pPKSPTG5具有其前体结构部分的N末端开始的16个氨基酸源自茂原链轮丝菌，而C末端的40个氨基酸源自肉桂链轮丝菌的嵌合前体结构的基因结构上的特点。除此之外，其他方面三者是共同的。结果可以看出由于前体结构的氨基酸序列的不同其分泌量存在着明显的差异。具有嵌合前体结构的分泌量最高。

表3.由于前体结构部分的不同对转谷氨酰胺酶原分泌产量的影响

质粒	转谷氨酰胺酶原(mg/L)
质粒	转谷氨酰胺酶原(mg/L)	pPKSPTG1	235
pPKSPTG4	130	pPKSPTG1	235
pPKSPTG4	130	pPKSPTG5	270

实施例8：丝氨酸蛋白酶(SAMP45)基因的克隆和表达质粒的构建评价

(1)具有产氨棒杆菌的细胞表面蛋白质的信号序列的带有前体结构部分的丝氨酸蛋白酶(SAMP45)基因(外源融合丝氨酸蛋白酶(SAMP45)基因)的构建

作为白灰浅链霉菌产生的丝氨酸蛋白酶SAMP45的基因序列已经确定[J.Baceriol.，179，430-438(1997)]。参考该序列，合成序列号49和序列号50所示的引物，按照先前叙述的方法利用PCR法扩增含有SAMP45的N末端前体结构、成熟SAMP45以及C末端前体结构的基因区。

(序列号49)5’-AACGGGGAGAACAGCACGGCCGCCGG-3’

(序列号50)5’-GGCGAATTCTCCGGCGGGCCGTCACCGGT-3’

<序列表说明>

序列号49、50：PCR引物

接下来，以实施例4(2)构建的pPKSPTG1为模板，通过序列号51和序列号52组合，利用相同PCR法扩增含有谷氨酸棒杆菌的细胞表面蛋白质PS2基因的启动子区域的5’-上游区和含有产氨棒杆菌的细胞表面蛋白质S1pA基因的信号序列的区域。

为了构建带有前体结构部分的丝氨酸蛋白酶的融合基因，序列号52含有编码丝氨酸蛋白酶原的N末端一侧的氨基酸的碱基序列。

(序列号51)5’-GGCAAGCTTAAATTCCTGTGAATTAGCTGA-3’

(序列号52)5’-CGGCCGTGCTGTTCTCCCCGTTTGCCGTTGCCACAGGTGCGGCC-3’

<序列表说明>

序列号51、52：用于构建融合前丝氨酸蛋白酶原基因的PCR引物

接下来，将分别扩增的编码SAMP45的N末端前体结构、成熟SAMP45以及含有C末端前体结构的基因区域的PCR反应液各1μl，与已扩增的含有PS2基因的启动子区的5’-上游区与含有产氨棒杆菌的细胞表面蛋白S1pA基因的信号序列的PCR反应液1μl混合作为模板，用序列号51和50进行交叉PCR，使含有PS2基因的启动子区的5’-上游区和产氨棒杆菌的细胞表面蛋白S1pA的信号序列相连的外源融合前丝氨酸蛋白酶原基因片段扩增。

通过琼脂糖凝胶电泳检测出大约3.9kb的扩增片段。使用HindIII和EcoRI消化PCR产物，进行琼脂糖凝胶电泳，从琼脂糖凝胶中回收约3.9kb的片段，通过插入到上述的pVC7的HindIII-EcoRI位点，分别得到pVSS1。按照先前叙述的方法测定插入片段的碱基序列，可确认构建了预想那样的融合基因。

(2)利用产氨棒杆菌的细胞表面蛋白的信号序列分泌丝氨酸蛋白酶

用构建的质粒pVSS1转化谷氨酸棒杆菌ATCC13869，筛选在含有5mg/l的氯霉素的上述CM2S琼脂培养基中生长的菌株。然后将筛选出的携有pVSS1的谷氨酸棒杆菌ATCC13869用含有5mg/l的氯霉素的上述MMTG液体培养基于30℃下培养70小时。该培养液1ml经离心分离，将培养上清与菌体分离。菌体悬浮于0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.0)中。丝氨酸蛋白酶活性测定按如下步骤进行。向含有0.25mM的Bz-Phe-Val-Arg-pNA(Bachem Co.Ltd.制)的20mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)中加入培养上清或菌体悬浮液50μl，总溶液量为0.6ml，于30℃下反应20分钟后，加0.4ml的50％醋酸终止反应。测定410nm的吸光度，通过算出游离的pNA(对硝基酰替苯胺)的量确定活性。而一个酶单位为在一分钟内使1μm的pNA游离所需的酶量。测定结果表明，在培养上清中没有检测出丝氨酸蛋白酶的活性，而在菌体悬浮液中可以检测到活性。通过从检测出的活性值和文献[J.Bacteriol.，179，430-438(1997)]中记载的比活值计算的结果，可以确认有约相当于9mg/l的丝氨酸蛋白酶分泌在菌体表面。

(3)通过在谷氨酸棒杆菌ATCC13869中分泌表达的丝氨酸蛋白酶切去带有前体结构部分的转谷氨酰胺酶的前体结构部分

用构建的质粒pVSS1转化携有实施例4(2)所述的带有前体结构部分的转谷氨酰胺酶的分泌表达质粒pPKSPTG1的谷氨酸棒杆菌ATCC13869，筛选在含有5mg/l的氯霉素和25mg/l的卡那霉素的上述CM2S琼脂培养基中生长的菌株。然后将筛选出的携有pVSS1、pPKSPTG1的谷氨酸棒杆菌ATCC13869用含有5mg/l的氯霉素和25mg/l的卡那霉素的上述MMTG液体培养基于30℃下培养70小时。取培养结束后的上清液10μl进行SDS-PAGE，然后用上述的抗转谷氨酰胺酶抗体，按照常规方法进行Western blot解析。结果表明SAMP正常分泌表达，而且分泌的带有前体结构部分的转谷氨酰胺酶的前体结构部分被切去，并可确认分泌具有与天然的成熟转谷氨酰胺酶大致相同分子量的转谷氨酰胺酶。

对该培养上清用上述的氧肟酸酯法确认转谷氨酰胺酶活性时，确认具有大致与天然型一样的比活性(约20U/mg)。

另外，在SDS-PAGE后，按照先前叙述的方法经半干转移将蛋白从胶上转移到PVDF膜上。蛋白转移后，用考马斯亮蓝对膜进行染色、脱色、风干。将成熟转谷氨酰胺酶的部分切下来，使用蛋白质序列仪解析N末端氨基酸序列。解析结果可以确认，序列号5所示的源自茂原链轮丝菌的天然型的成熟转谷氨酰胺酶带有前体结构部分的C末端一侧氨基酸的Phe-Arg-Ala-Pro 4个氨基酸的结构。

实施例9：脯氨酸特异性肽酶(svPEP)基因的克隆和表达质粒构建评价

(1)茂原链轮丝菌生成的脯氨酸特异性肽酶(svPEP)的纯化

将800ml的ISP2液体培养基(将酵母提取物4g、麦芽提取物10g、葡萄糖4g用水配成1L溶液，pH调节为7.3)加到5L坂口烧瓶中，将茂原链轮丝菌IF013819株从板上移植到培养基中，于30℃下，以120rpm速度振荡培养48小时。

对培养液进行离心分离，去除培养上清回收菌体。用含有25mg/l的卡那霉素的20mM Tris-HCl缓冲液洗净后，将得到的菌体悬浮于含有25mg/l的卡那霉素的0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.0)。于冰上振荡4小时后，通过离心分离回收上清。用硝酸纤维素膜(孔径0.22μm，Satrius公司制)过滤灭菌后，用FPLC(Amarsham Pharmacia公司制)通过用1.5M硫酸铵/50mM磷酸缓冲液(pH7.0)平衡的丁基-琼脂糖4FF(Amarsham Pharmacia公司制)柱(1.6φ×10cm)，用同一缓冲液中硫酸铵1.5-0M的线性浓度梯度进行洗脱。回收含有活性成分的组分，再于相同的条件通过苯基-琼脂糖HP柱(1ml，AmarshamPharmacia公司制)，回收活性组分，然后对50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)于4℃下透析过夜。通过以上操作可获得部分纯化的酶液。

表4给出了上述各个阶段的总蛋白量、总活性、比活性、收率以及纯化程度。而各个阶段的酶活性的测定按照芳本等人的方法(鹤·船津编；生物化学实验法31蛋白质分解酶II，学会出版中心(1993)，p187)按如下步骤进行。

向含有0.25mM的Ala-Ala-Pro-pNA(Bachem公司制)的20mM磷酸钠缓冲液中加入酶溶液，总溶液量为0.6ml，于30℃下反应5分钟后，加0.4ml的50％醋酸终止反应。测定410nm的吸光度，通过算出游离的pNA的量确定活性。一个酶活性单位为在1分钟内使1μmol的pNA游离所需的酶量。

表4.茂原链轮丝菌生成的脯氨酸特异性肽酶(svPEP)的纯化

(2)茂原链轮丝菌IF013819生成的脯氨酸特异性肽酶(svPEP)的N末端氨基酸序列的解析

部分纯化的酶液用反相柱色谱进一步纯化。反相柱色谱的条件如下。

HPLC装置：泵：HITACHI L-6300，检测器：L-4000H

柱子：PROTEIN C4 214TP5410(VYDAC公司制)

洗脱条件：24-40％乙腈线性梯度/0.1％三氟乙酸(20分钟)，于室温下进行洗脱

流速：1.0ml/min

检测波长：280nm

将上述条件下纯化的酶样品用Membrane Cartridge(PerkinElmer公司制)转移到聚偏(二)氟乙烯(Polyvinylidene-defluoride，PVDF)膜上，利用气相蛋白测序仪PPSQ-10(岛津制作所制)解析N末端氨基酸序列。结果可得到序列号53所示的N末端的20个氨基酸残基序列。

(序列号53)Gln Ala Asp Ile Lys Asp Arg Ile leu Lys Ile Pro

1 5 10

Gly Met Lys Phe Val Glu Glu Lys

15 20

(3)茂原链轮丝菌IF013819生成的脯氨酸特异性肽酶(svPEP)的特性评价

就以下特性对茂原链轮丝菌IF013819生成的脯氨酸特异性肽酶进行了评价

(i)底物特异性

(a)以带有发色基团pNA的肽为底物时：向含有附加了pNA的各种肽(浓度都是0.25mM)的20mM磷酸钠缓冲液(pH6.5)加入纯化的酶溶液，总溶液量为0.6ml，于37℃下反应5分钟后，加0.4ml的50％醋酸终止反应。测定410nm的吸光度，求出酶切活性。

(b)以带有发色基团βNA(β-萘甲酰胺)的肽为底物时：向含有各种肽(浓度都是0.3mM)的20mM磷酸钠缓冲液(pH6.5)加入纯化的酶溶液，总溶液量为1.0ml，于37℃下反应5分钟后，加0.4ml的Fastgarnet GBC溶液(用10％Triton X-100/1M乙酸钠(pH4.0)溶解，使浓度为0.1％)终止反应。测定550nm的吸光度，求出酶切活性。

(c)以肽为底物时：以配成1mg/ml的肽溶液为底物，加酶液，于30℃下反应1小时。通过以下条件的HPLC确认酶切活性。

柱子：YMC-PACK ODS-A 4.6×150mm(YMC)

洗脱液：0.1％三氟乙酸(TFA)-乙腈

流速：1ml/min

检测波长：UV220nm

结果表明，该酶是特异切断脯氨酸的羧基侧肽键的酶，能很好地依次识别Ala-Ala-Pro-pNA、Pro-Arg-Ala-Xaa(序列号68)(式中Xaa代表Pro-pNA，pNA代表对硝基酰替苯胺)、Ala-Phe-Pro-pNA，对含有从N末端开始的第3位或第4位脯氨酸的肽有很高的反应性。但对含有从N末端开始的第2位或第5位脯氨酸的肽没有作用(表5)。

表5.svPEP的特异性P52

肽底物	相对活性(％)
肽底物	相对活性(％)	P-pNA	0.04
DP-pNA	0.00	P-pNA	0.04
DP-pNA	0.00	Z-GP-βNA	0.04
GP-βNA	0.40	Z-GP-βNA	0.04
GP-βNA	0.40	AP-pNA	0.53
RP-pNA	0.94	AP-pNA	0.53
RP-pNA	0.94	Z-AGP-βNA	0.78
Z-GAP-βNA	1.2	Z-AGP-βNA	0.78
Z-GAP-βNA	1.2	Bz-FVR-pNA	0.002
AAF-pNA	4.1	Bz-FVR-pNA	0.002
AAF-pNA	4.1	AAA-pNA	8.5
AFP-pNA	26.3	AAA-pNA	8.5
AFP-pNA	26.3	AAP-pNA	100
AAPL-pNA	0.3	AAP-pNA	100
AAPL-pNA	0.3	FRAP-pNA	49.0
Suc-AAPF-pNA	0.01	FRAP-pNA	49.0
Suc-AAPF-pNA	0.01	SFRAP-pNA	1.23
PSFRAP-pNA	0.2	SFRAP-pNA	1.23

PNA：对硝基酰替苯胺，βNA：β-萘甲酰胺

<序列表说明>

序列号68：svPEP用底物

(ii)最适pH

pH4～6：20mM乙酸钠缓冲液

pH5.5～8：20mM磷酸钠缓冲液

pH6.5～9.5：20mM Tris-HCl缓冲液

分别使用以上3种缓冲液，以Ala-Ala-Pro-pNA为底物，于30℃下反应5分钟。以20mM磷酸钠缓冲液pH6.5时的活性为100％，算出使用各种缓冲液时的相对活性。结果表明，最适pH为6～6.5。

(iii)pH稳定性

使用pH3至10的0.15M GTA缓冲液(由3，3-二甲基戊二酸、三(羟甲基)氨基甲烷、2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇配成的缓冲液)，向20μl纯化的酶液中加入各种pH的缓冲液40μl，于4℃下放置过夜后，将pH调到7.0，溶液量调到120μl。取出其中的50μl加入Ala-Ala-Pro-pNA，于30℃下反应5分钟。以pH为7.0、以及在与上述相同条件下保存时的活性为100％，各个pH下的相对底物分解量为残余活性。结果表明在pH4～9范围内稳定。

(iv)最适温度

向50μl纯化的酶液中加入0.5ml的20mM磷酸钠缓冲液(pH6.5)，然后加入Ala-Ala-Pro-pNA，使其终浓度为0.25mM，从20℃到60℃进行5分钟的分解反应。以25℃下的底物分解量为100％时的各个温度的相对分解量作为相对活性。结果表明最适温度为25～30℃。

(v)温度稳定性

向50μl纯化的酶液中加入0.5ml的20mM磷酸钠缓冲液(pH6.5)，于4℃或20℃到60℃处理15分钟，冰冷后加入Ala-Ala-Pro-pNA，使其终浓度为0.25mM，于30℃下反应5分钟。以上述4℃下处理时的活性为100％算出残余活性。结果表明20℃以下时稳定。

(vi)抑制剂

向含有如表6所示浓度的各种化合物的20mM磷酸钠缓冲液(pH6.5)中加入纯化的酶溶液，于室温下放置10分钟。然后加入Ala-Ala-Pro-pNA，于30℃下反应5分钟。以对没有添加化合物时的Ala-Ala-Pro-pNA的活性为100％，以添加各种化合物时的相对底物分解量为相对活性。结果表明，虽然也受到作为SH酶抑制剂的对氯汞苯甲酸等的一些抑制，但受到作为丝氨酸蛋白酶抑制剂的苯基甲基磺酰氟(Nakaraitesk公司制)和氨基乙基苯磺酰氟盐酸盐(BoeringerManheim公司制)的抑制作用比较强。

表6.抑制剂对茂原链轮丝菌IF013819生成的脯氨酸特异性肽酶活性的影响

化合物	浓度(mM)	相对活性(％)
化合物	浓度(mM)	相对活性(％)	不加抑制剂	0	100
丝氨酸酶抑制剂苯基甲基磺酰氟氨基乙基苯磺酰氟盐酸盐胰凝乳蛋白酶抑制剂	141	39.759.984.9	不加抑制剂	0	100
丝氨酸酶抑制剂苯基甲基磺酰氟氨基乙基苯磺酰氟盐酸盐胰凝乳蛋白酶抑制剂	141	39.759.984.9	SH-酶抑制剂对氯汞苯甲酸N-乙基马来酰亚胺碘乙酰胺亮抑酶肽	1110.5	87.198.38779.6
天冬酰胺酶抑制剂胃蛋白酶抑制剂	1	165.7	SH-酶抑制剂对氯汞苯甲酸N-乙基马来酰亚胺碘乙酰胺亮抑酶肽	1110.5	87.198.38779.6
天冬酰胺酶抑制剂胃蛋白酶抑制剂	1	165.7	金属蛋白酶抑制剂EDTA1，10-菲咯啉	101	105.292.5
氨肽酶抑制剂苯丁抑制素	1	97.6	金属蛋白酶抑制剂EDTA1，10-菲咯啉	101	105.292.5
氨肽酶抑制剂苯丁抑制素	1	97.6	还原剂二硫苏糖醇	10	102.5
脯氨酰内肽酶抑制剂Z-(S)Pro-(S)ProlinalZ-Pro-(S)ProlinalZ-Pro-Prolinal	11	111.2105.899.7	还原剂二硫苏糖醇	10	102.5

(3)源自茂原链轮丝菌IF013819的脯氨酸特异性肽酶(svPEP)基因的获得

在从测定的svPEP的N末端20个氨基酸序列中推定的碱基序列中选出简并少的部位Lys-Ile-Pro-Gly-Met-Lys-Phe-Val-Glu-Glu-Lys，制备序列号54所示的合成寡核苷酸。以该合成寡核苷酸为探针，用识别6碱基序列的各种限制酶消化按照常规方法制备的茂原链轮丝菌IF013819的染色体DNA，通过Southern blot杂交进行解析，可检测出经SacI剪切的约6kb的单一带。于是再用SacI消化按照前面方法制备的茂原链轮丝菌IF013819的染色体DNA，利用EASYTRAPVer.2(宝酒造公司制)通过琼脂糖凝胶电泳回收约6kb片段。将回收的片段插入到pUC18的SacI位点后，导入大肠杆菌JM109(宝酒造公司制)的感受态细胞，制备文库。通过用³²P标记的序列号54所示的合成寡核苷酸作为探针，对制备的文库用菌落杂交来进行文库的筛选，筛选携有svPEP基因片段被克隆的质粒的菌株，获得目的基因。从该菌株回收的质粒命名为pUMP1。

(序列号54)5’-AAGATCCCCGGGATGAAGTTCGTCGAGGAGAAG-3’

<序列表说明>

序列号54：用于筛选svPEP的探针

测定pUMP1克隆的片段的碱基序列。序列号41给出了对应于svPEP的svPEP基因序列。推定该基因编码的氨基酸序列时，发现了由先前纯化的酶蛋白测定的N末端部分氨基酸序列(20个残基)，进而确定了序列号40所示的成熟型svPEP的氨基酸一级序列。另外也确定了含有序列号42所示的svPEP的信号序列以及估计为前体结构的区域的整个氨基酸一级序列。

用pUMP1转化的大肠杆菌AJ13691以FERM BP-7160编号于2000年5月15日按照布达佩斯条约寄存于通商产业省工业技术院生命工程工业技术研究所(日本国

茨城县筑波市东1丁目1-3)。

(4)具有产氨棒杆菌的细胞表面蛋白的信号序列的带有前体构部分的脯氨酸特异性肽酶(svPEP)基因(外源融合前脯氨酸特异性肽酶(svPEP)原基因)的构建

以实施例9(3)测定的svPEP的序列为参考，以实施例9(3)构建的pUMP1为模板，合成序列号55和序列号56所示的引物，按照前面同样的方法利用PCR法扩增含有svPEP的前体结构以及成熟svPEP的基因区域。

(序列号55)5’-GAGGCGGCGTCGATCACCGCCCC-3’

(序列号56)5’-GCCAAGCTTGAAGCACCGGCGGCGGCACCCGG-3’

<序列表说明>

序列号55、56：PCR引物

接下来，用实施例4(2)中构建的pPKSPTG1为模板，通过序列号51和序列号57的组合，利用PCR法扩增含有谷氨酸棒杆菌的细胞表面蛋白质PS2基因的启动子区域的5’-上游区和含有产氨棒杆菌的细胞表面蛋白质S1pA基因的信号序列的区域。

为了构建与带有前体结构部分的svPEP的融合基因，序列号57所示的引物含有编码svPEP的N末端一侧的氨基酸的序列。

(序列号51)5’-GGCAAGCTTAAATTCCTGTGAATTAGCTGA-3’

(序列号57)5’-GGGGCGGTGATCGACGCCGCCTCTGCCGTTGCCACAGGTGCGGCCA-3’

<序列表说明>

序列号57：PCR引物

接下来，将分别扩增的含有svPEP的前体结构以及成熟svPEP的基因区域的PCR反应液各1μl，与已扩增的含有PS2基因的启动子区的5’-上游区和含有产氨棒杆菌的细胞表面蛋白S1pA的信号序列的区域的PCR反应液1μl混合作为模板，使用序列号51和序列号56进行交叉PCR，使含有PS2基因的启动子区的5’-上游区和产氨棒杆菌的细胞表面蛋白S1pA的信号序列相连的外源融合前svPEP原基因片段扩增。

(序列号51)5’-GGCAAGCTTAAATTCCTGTGAATTAGCTGA-3’

(序列号56)5’-GCCAAGCTTGAAGCACCGGCGGCGGCACCCGG-3’

通过琼脂糖凝胶电泳检测出大约2.1kb的扩增片段。使用HindIII消化PCR产物，进行琼脂糖凝胶电泳，从琼脂糖凝胶中回收约2.1kb的片段，通过插入到实施例8(1)所述的pVSS1的HindIII位点，分别得到pVSSSP1。按照常规方法测定插入片段的碱基序列，可确认构建了预想那样的融合基因。

(5)利用产氨棒杆菌的细胞表面蛋白的信号序列分泌脯氨酸特异性肽酶

用构建的质粒pVSSSP1转化谷氨酸棒杆菌ATCC13869，筛选在含有5mg/l的氯霉素的上述CM2S琼脂培养基中生长的菌株。然后将筛选出的携有pVSSSP1的谷氨酸棒杆菌ATCC13869用含有5mg/l的氯霉素的上述MMTG液体培养基于30℃下培养70小时。该培养液1ml经离心分离，将培养上清与菌体分离。菌体悬浮于0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.0)。svPEP的活性按下述步骤测定。向含有0.25mM的Ala-Ala-Prp-pNA(Bachem Co.Ltd.制)的20mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)中加入培养上清或菌体悬浮液50μl，总溶液量为0.6ml，于30℃下反应20分钟后，加0.4ml的50％醋酸终止反应。测定410nm的吸光度，通过算出游离的pNA的量确定活性。而一个酶单位为在一分钟内使1μm的pNA游离所需的酶量。测定结果表明，在培养上清中没有检测出svPEP的活性，而在菌体悬浮液中可以检测到活性。通过从检测出的活性值和实施例9(1)的比活性值计算的结果可以确认有约相当于50mg/l的svPEP分泌在菌体表面。

(6)利用在谷氨酸棒杆菌ATCC13869中分泌表达的丝氨酸蛋白酶和脯氨酸特异性肽酶切去带有前体结构部分的转谷氨酰胺酶的前体结构部分

用构建的质粒pVSSSP1转化携有实施例4(2)所述的带有前体结构部分的转谷氨酰胺酶的分泌表达质粒pPKSPTG1的谷氨酸棒杆菌ATCC13869，筛选在含有5mg/l的氯霉素和25mg/l的卡那霉素的上述CM2S琼脂培养基中生长的菌株。然后将筛选出的携有pVSSSP1、pPKSPTG1的谷氨酸棒杆菌ATCC13869用含有5mg/l的氯霉素和25mg/l的卡那霉素的上述MMTG液体培养基于30℃下培养70小时。取培养结束后的上清液10μl进行SDS-PAGE，然后用上述的抗转谷氨酰胺酶抗体，按照常规方法进行Western blot解析。结果表明SAMP45和svPEP正常分泌表达，而且分泌的带有前体结构部分的转谷氨酰胺酶的前体结构部分被切去，能够确认与天然的成熟转谷氨酰胺酶具有大致相同分子量的转谷氨酰胺酶的分泌。

另外，在SDS-PAGE后，按照先前叙述的方法经半干转移将蛋白从胶上转移到PVDF膜上。蛋白转移后，用考马斯亮蓝对膜进行染色、脱色、风干。将成熟转谷氨酰胺酶的部分切下来，使用蛋白质序列仪解析N末端氨基酸序列。解析结果可以确认获得了与序列号5所示的源自茂原链轮丝菌的天然型成熟转谷氨酰胺酶一样的，N末端的氨基酸为Asp的序列。

实施例10：源自茂原链轮丝菌IF013819的转谷氨酰胺酶原的前体结构部分的部分缺失体构建和转谷氨酰胺酶的分泌生产

(1)前体结构部分的部分缺失型转谷氨酰胺酶基因的构建

首先为了构建前体结构部分的C末端一侧的氨基酸残基的部分缺失型，以实施例1(1)测定的转谷氨酰胺酶的基因序列为基础，合成如序列号8和9所示的引物，利用与前面相同的PCR法从实施例1(1)中得到的pUITG中扩增成熟转谷氨酰胺酶的基因区域。

接下来，用实施例4(2)中构建的pPKSPTG1为模板，通过序列号14和序列号58的组合，或者序列号14与序列号59的组合，利用PCR法使含有谷氨酸棒杆菌的细胞表面蛋白质PS2的启动子区域的5’-上游区和含有产氨棒杆菌的细胞表面蛋白质S1pA的信号序列以及转谷氨酰胺酶的前体结构部分的基因区域扩增。

为了构建与成熟转谷氨酰胺酶的融合基因，序列号58所示的引物含有缺失了转谷氨酰胺酶的前体结构部分的C末端2个氨基酸残基序列Ala-Pro的基因序列，序列号59所示的引物具有缺失了转谷氨酰胺酶的前体结构部分的C末端4个氨基酸残基序列Phe-Arg-Ala-Pro的基因序列，同时还都含有编码成熟转谷氨酰胺酶的N末端一侧的氨基酸的序列。

(序列号14)5’-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3’

(序列号58)5’-GTG ACC CTG TCG TCG GAG TCC CGG AAC GAC GGG CCG GCG C-3’

(序列号59)5’-GTG ACC CTG TCG TCG GAG TCC GAC GGG CCG GCG CTC GAA G-3’

<序列表的说明>

序列号58、59：PCR引物

接下来，将分别扩增的含有谷氨酸棒杆菌的细胞表面蛋白质PS2基因的启动子区的5’-上游区和编码含有产氨棒杆菌的细胞表面蛋白S1pA的信号序列以及各个变异前体结构部分的区域的基因区域的PCR反应液各1μl，与已扩增的编码成熟转谷氨酰胺酶的区域的PCR反应液1μl混合作为模板，使用序列号14和序列号9进行交叉PCR，使含有谷氨酸棒杆菌的细胞表面蛋白质PS2基因的启动子区的5’-上游区和产氨棒杆菌的细胞表面蛋白S1pA的信号序列以及转谷氨酰胺酶的部分缺失型前体结构部分相连的成熟转谷氨酰胺酶基因片段分别扩增。

(序列号14)5’-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3’

(序列号9)5’-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3’

通过琼脂糖凝胶电泳检测出大约1.8kb的各个扩增片段。从琼脂糖凝胶中回收使用ScaI和Eco065I消化这些片段生成的约800bp的片段，通过与从实施例4(2)构建的pPKSPTG1用ScaI和Eco065I切出的片段替换来构建pPKSPTG1ΔAP(Ala-Pro缺失型)和pPKSPTG1ΔFRAP(Phe-Arg-Ala-Pro缺失型)。

为了构建前体结构部分的N末端一侧的氨基酸残基的部分缺失型，以实施例1(1)测定的转谷氨酰胺酶的基因序列为基础，合成如序列号60和61所示的引物，通过序列号60和序列号9的组合，或者序列号61和序列号9的组合，利用PCR法从实施例1(1)中得到的pUITG中扩增转谷氨酰胺酶原的基因区域。

(序列号60)5’-AAT GGC GCG GGG GAA GAG ACG AAG TCC TAC GCC GAA ACC T-3’

(序列号61)5’-GAG ACG AAG TCC TAC GCC GAA ACC TAC CGC CTC ACG GCG G-3’

(序列号9)5’-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3’

<序列表说明>

序列号60、61：PCR引物

接下来，用实施例4(2)中构建的pPKSPTG1为模板，通过序列号14和序列号62的组合，或者序列号14与序列号63的组合，利用PCR法使含有谷氨酸棒杆菌的细胞表面蛋白质PS2基因的启动子区域的5’-上游区和含有产氨棒杆菌的细胞表面蛋白质S1pA的信号序列的区域扩增。

为了构建与产氨棒杆菌的细胞表面蛋白质S1pA的信号序列的融合基因，序列号62所示的引物具有缺失了转谷氨酰胺酶的前体结构部分的N末端1个氨基酸残基Asp的基因序列，序列号63所示的引物具有缺失了转谷氨酰胺酶的前体结构部分的N末端6个氨基酸残基的序列Asp-Asn-Gly-Ala-Gly-Glu的基因序列，同时还都含有编码产氨棒杆菌的细胞表面蛋白质S1pA的信号序列的C末端一侧的氨基酸的序列。

(序列号14)：5’-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3’

(序列号62)：5’-GTC TCT TCC CCC GCG CCA TTT GCC GTT GCC ACA GGT GCG G-3’

(序列号63)：5’-TCG GCG TAG GAC TTC GTC TCT GCC GTT GCC ACA GGT GCG G-3’

<序列表说明>

序列号62、63：PCR引物

接下来，将分别扩增的含有谷氨酸棒杆菌的细胞表面蛋白质PS2基因的启动子区的5’-上游区和编码含有产氨棒杆菌的细胞表面蛋白S1pA的信号序列的区域的基因区域的PCR反应液各1μl，与已扩增的编码前体结构部分的N末端部分缺失的转谷氨酰胺酶原的区域的PCR反应液1μl混合作为模板，使用序列号14和序列号9进行交叉PCR，使含有谷氨酸棒杆菌的细胞表面蛋白质PS2基因的启动子区的5’-上游区和产氨棒杆菌的细胞表面蛋白S1pA的信号序列以及转谷氨酰胺酶的部分缺失型前体结构部分相连的成熟转谷氨酰胺酶基因片段扩增。

(序列号14)5’-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3’

(序列号9)5’-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3’

通过琼脂糖凝胶电泳分别检测出大约1.8kb的各个扩增片段。从琼脂糖凝胶中回收用ScaI和Eco065I消化这些片段生成的约800bp的片段，通过与从实施例4(2)构建的pPKSPTG1用ScaI和Eco065I切出的片段替换来构建pPKSPTG1ΔD(Asp缺失型)以及pPKSPTG1ΔDNGAGE(Asp-Asn-Gly-Ala-Gly-Glu缺失型)。

(2)前体结构部分缺失型转谷氨酰胺酶的分泌

用构建的质粒pPKSPTG1ΔAP、pPKSPTG1ΔFRAP、pPKSPTG1ΔD或pPKSPTG1ΔDNGAGE转化的谷氨酸棒杆菌ATCC13869，筛选在含有25mg/l的卡那霉素的上述CM2S琼脂培养基中生长的菌株。然后将筛选出的携有pPKSPTG1ΔAP、pPKSPTG1ΔFRAP、pPKSPTG1ΔD或pPKSPTG1ΔDNGAGE的谷氨酸棒杆菌ATCC13869用含有25mg/l的卡那霉素的上述MMTG液体培养基于30℃下分别培养48小时。取培养结束后的上清液10μl进行SDS-PAGE，然后用上述的抗转谷氨酰胺酶抗体，按照常规方法进行Western blot解析。结果可以确认前体结构部分部分缺失的转谷氨酰胺酶的分泌。虽然带有pPKSPTG1ΔAP、pPKSPTG1ΔFRAP、pPKSPTG1ΔD的重组体分别都表现出与天然型(pPKSPTG1)同等的分泌性，但带有pPKSPTG1ΔDNGAGE的重组体的分泌量只是天然型(pPKSPTG1)分泌量的一半。

(3)利用在谷氨酸棒杆菌ATCC13869中分泌表达的丝氨酸蛋白酶切去前体结构部分缺失型转谷氨酰胺酶原的前体结构部分

用实施例8(1)构建的质粒pVSSSP1转化携有实施例10(2)所述的前体结构部分缺失型转谷氨酰胺酶原的分泌表达质粒pPKSPTG1ΔAP、pPKSPTG1ΔFRAP、pPKSPTG1ΔD或pPKSPTG1ΔDNGAGE的谷氨酸棒杆菌ATCC13869，筛选在含有5mg/l的氯霉素和25mg/l的卡那霉素的上述CM2S琼脂培养基中生长的菌株。然后将筛选出的携有pVSS1和pPKSPTG1ΔAP、pPKSPTG1ΔFRAP、pPKSPTG1ΔD或pPKSPTG1ΔDNGAGE的谷氨酸棒杆菌ATCC13869用含有5mg/l的氯霉素和25mg/l的卡那霉素的上述MMTG液体培养基于30℃下分别培养70小时。取培养结束后的上清液10μl进行SDS-PAGE，然后用上述的抗转谷氨酰胺酶抗体，按照常规方法进行Western blot解析。

结果表明SAMP45正常分泌表达，而且分泌的前体结构部分缺失型转谷氨酰胺酶原的前体结构部分被切去，能够确认与天然的成熟转谷氨酰胺酶具有大致相同的分子量的转谷氨酰胺酶的分泌。

另外，在SDS-PAGE后，按照先前叙述的方法经半干转移将蛋白从胶上转移到PVDF膜上。蛋白转移后，用考马斯亮蓝对膜进行染色、脱色、风干。将成熟转谷氨酰胺酶的部分切下来，使用蛋白质序列仪解析N末端氨基酸序列。解析结果可以确认，携有pPKSPTG1ΔAP的重组体在序列号5所示的天然成熟型转谷氨酰胺酶的N末端附加了Phe-Arg；携有pPKSPTG1ΔFRAP的重组体在成熟型转谷氨酰胺酶的N末端附加了Ser-Ala-Gly-Pro-Ser；携有pPKSPTG1ΔD及pPKSPTG1Δ

DNGAGE重组体在成熟转谷氨酰胺酶中附加了Phe-Arg-Ala-Pro。

实施例11：源自茂原链轮丝菌IF013819的转谷氨酰胺酶原的前体结构部分的变异体构建和转谷氨酰胺酶的分泌生产

(1)前体结构部分变异型转谷氨酰胺酶原基因的构建

以实施例1(1)测定的转谷氨酰胺酶的基因序列为基础，合成如序列号8和9所示的引物，利用PCR法从实施例1(1)中得到的pUITG中扩增成熟转谷氨酰胺酶的基因区域。

接下来，用实施例4(2)中构建的pPKSPTG1为模板，通过序列号14和序列号64的组合，或者序列号14与序列号65的组合，或者序列号14与序列号66的组合，序列号14与序列号67的组合，利用PCR法使含有谷氨酸棒杆菌的细胞表面蛋白质PS2基因的启动子区域的5’-上游区和含有产氨棒杆菌的细胞表面蛋白质S1pA的信号序列以及转谷氨酰胺酶的前体结构部分的区域扩增。

序列号64所示的引物含有将转谷氨酰胺酶的前体结构部分的C末端3个氨基酸残基序列Arg-Ala-Pro转换为Gly-Pro-Lys的基因序列，而序列号65所示的引物含有将转谷氨酰胺酶的前体结构部分的C末端3个氨基酸残基序列Arg-Ala-Pro转换为Gly-Pro-Arg的基因序列。序列号66所示的引物含有将前体结构部分的C末端5个氨基酸残基序列Ser-Phe-Arg-Ala-Pro仅转换为Lys的基因序列，而序列号67所示的引物具有将Ser-Phe-Arg-Ala-Pro仅转换为Arg的基因序列。

为了构建与成熟转谷氨酰胺酶的融合基因，还都含有编码成熟转谷氨酰胺酶的N末端一侧的氨基酸序列的序列。

(序列号14)5’-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3’

(序列号64)5’-GTG ACC CTG TCG TCG GAG TCC TTG GGG CCG AAC GAC GGG C-3’

(序列号65)5’-GTG ACC CTG TCG TCG GAG TCG CGG GGG CCG AAC GAC GGG C-3’

(序列号66)5’-GTG ACC CTG TCG TCG GAG TCC TTC GGG CCG GCG CTC GAA G-3’

(序列号67)5’-GTG ACC CTG TCG TCG GAG TCG CGC GGG CCG GCG CTC GAA G-3’

<序列表说明>

序列号64～67：PCR引物

接下来，将分别扩增的含有谷氨酸棒杆菌的细胞表面蛋白质PS2基因的启动子区的5’-上游区和编码含有产氨棒杆菌的细胞表面蛋白S1pA的信号序列以及变异型前体结构部分的区域的基因区域的PCR反应液各1μl，与已扩增的编码成熟转谷氨酰胺酶的区域的PCR反应液1μl混合作为模板，使用序列号14和序列号9进行交叉PCR，使含有谷氨酸棒杆菌的细胞表面蛋白质PS2基因的启动子区的5’-上游区和产氨棒杆菌的细胞表面蛋白S1pA的信号序列以及变异型转谷氨酰胺酶的前体结构部分相连的成熟转谷氨酰胺酶基因片段扩增。

(序列号14)5’-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3’

(序列号9)5’-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3’

通过琼脂糖凝胶电泳检测出大约1.8kb的0000扩增片段。从琼脂糖凝胶中回收用ScaI和Eco065I消化该片段后生成的约800bp的片段，通过与从实施例4(2)构建的pPKSPTG1用ScaI和Eco065I切出的片段替换来构建pPKSPTG11(Gly-Pro-Lys变异型)和pPKSPTG12(Gly-Pro-Arg变异型)，pPKSPTG13(缺失Phe-Arg-Ala-Pro，Lys插入变异型)和pPKSPTG14(缺失Phe-Arg-Ala-Pro，Arg插入变异型)。

(2)前体结构部分变异型转谷氨酰胺酶的分泌

用构建的质粒pPKSPTG11、pPKSPTG12、pPKSPTG13或pPKSPTG14转化谷氨酸棒杆菌ATCC13869，筛选在含有25mg/l的卡那霉素的上述CM2S琼脂培养基中生长的菌株。然后将筛选出的携有pPKSPTG11、pPKSPTG12、pPKSPTG13或pPKSPTG14的谷氨酸棒杆菌ATCC13869用含有25mg/l的卡那霉素的上述MMTG液体培养基于30℃下分别培养48小时。取培养结束后的上清液10μl进行SDS-PAGE，然后用上述的抗转谷氨酰胺酶抗体，按照常规方法进行Western blot解析。结果可以确认带有前体结构部分的转谷氨酰胺酶的分泌。

(3)利用在谷氨酸棒杆菌ATCC13869中分泌表达的丝氨酸蛋白酶切去带有变异型前体结构部分的转谷氨酰胺酶的前体结构部分

用实施例8(1)构建的质粒pVSS1转化携有实施例11(2)所述的带有改造的前体结构部分转谷氨酰胺酶的分泌表达质粒pPKSPTG11、pPKSPTG12、pPKSPTG13或pPKSPTG14的谷氨酸棒杆菌ATCC13869，筛选在含有5mg/l的氯霉素和25mg/l的卡那霉素的上述CM2S琼脂培养基中生长的菌株。然后将筛选出的携有pVSS1和pPKSPTG11、pPKSPTG12、pPKSPTG13或pPKSPTG14的谷氨酸棒杆菌ATCC13869用含有5mg/ml的氯霉素和25mg/l的卡那霉素的上述MMTG液体培养基于30℃下分别培养70小时。取培养结束后的上清液10μl进行SDS-PAGE，然后用上述的抗转谷氨酰胺酶抗体，按照常规方法进行Western blot解析。结果表明SAMP45正常分泌表达，而且分泌的带有变异型前体结构部分的转谷氨酰胺酶的变异型前体结构部分被切去，能够确认与天然的成熟转谷氨酰胺酶具有大致相同分子量的转谷氨酰胺酶的分泌。

另外，在SDS-PAGE后，按照常规方法经半干转移将蛋白从胶上转移到PVDF膜上。蛋白转移后，用考马斯亮蓝对膜进行染色、脱色、风干。将成熟转谷氨酰胺酶的部分切下来，使用蛋白质序列仪解析N末端氨基酸序列。解析结果可以确认携有pVSS1和pPKSPTG11、或者pVSS1和pPKSPTG12的谷氨酸棒杆菌ATCC13869分泌的转谷氨酰胺酶的序列是与序列号5所示的天然型成熟转谷氨酰胺酶一样的，N末端为Asp的序列。另外携有pVSS1和pPKSPTG13、或者pVSS1和pPKSPTG14的谷氨酸棒杆菌ATCC13869分泌的转谷氨酰胺酶序列是在天然型成熟转谷氨酰胺酶附加了Ser-Ala-Gly-Pro-Lys(序列号69)，或者Ser-Ala-Gly-Pro-Arg(序列号70)的序列。

前者具有与天然型转谷氨酰胺酶一样氨基酸序列的培养上清用氧肟酸酯法确认有转谷氨酰胺酶活性，而且具有大致与天然型一样的比活性(约20U/mg)。

<序列表说明>

序列号69、70：附加在天然的转谷氨酰胺酶的序列

利用本发明可以通过棒杆菌属细菌使有用的外源蛋白、特别是转谷氨酰胺酶大量生成，并有效地分泌到菌体外。由于通过本发明生成的蛋白质可释放到培养基中，所以利用已知的适当的方法可以简便而且大规模地从培养基中直接回收蛋白质。

序列表

<110>味之素株式会社(Ajinomoto Co.，Inc.)

<120>转谷氨酰胺酶的制备方法

<130>Y1H0862

<140>

<141>

<150>JP 11-280098

<151>1999-09-30

<150>JP 2000-194043

<151>2000-06-28

<160>70

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>30

<212>PRT

<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<400>1

<210>2

<211>25

<212>PRT

<213>产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)

<400>2

<210>3

<211>45

<212>PRT

<213>茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)

<400>3

<210>4

<211>54

<212>PRT

<213>肉桂链轮丝菌(Streptoverticillium cinnamoneum)

<400>4

<210>5

<211>331

<212>PRT

<213>茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)

<400>5

<210>6

<211>782

<212>DNA

<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<220>

<221>CDS

<222>(579)..(782)

<400>6

<210>7

<211>68

<212>PRT

<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<400>7

<210>8

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>8

<210>9

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>9

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>10

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>11

<210>12

<211>1809

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<220>

<221>CDS

<222>(578)..(1798)

<400>12

<210>13

<211>407

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>13

<210>14

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>14

<210>15

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>15

<210>16

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>16

<210>17

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>17

<210>18

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>18

<210>19

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>19

<210>20

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>20

<210>21

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>21

<210>22

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>22

<210>23

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>23

<210>24

<211>52

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>24

<210>25

<211>52

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>25

<210>26

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>26

<210>27

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>27

<210>28

<211>52

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>28

<210>29

<211>43

<212>PRT

<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<400>29

<210>30

<211>43

<212>PRT

<213>茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)

<400>30

<210>31

<211>41

<212>PRT

<213>茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)

<400>31

<210>32

<211>44

<212>PRT

<213>茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)

<400>32

<210>33

<211>39

<212>PRT

<213>茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)

<400>33

<210>34

<211>45

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：源自茂原链轮丝菌的转谷氨酰胺酶的修饰前体结构部分

<400>34

<210>35

<211>45

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<400>35

<210>36

<211>41

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<400>36

<210>37

<211>41

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<400>37

<210>38

<211>56

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：源自茂原链轮丝菌和肉桂链轮丝菌的转谷氨酰胺酶的嵌合前体结构部分

<400>38

<210>39

<211>1079

<212>PRT

<213>白灰浅链霉菌(Streptomyces albogriseolus)

<400>39

<210>40

<211>444

<212>PRT

<213>茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)

<400>40

<210>41

<211>1751

<212>DNA

<213>茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)

<220>

<221>CDS

<222>(229)..(1659)

<400>41

<210>42

<211>477

<212>PRT

<213>茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)

<400>42

<210>43

<211>330

<212>PRT

<213>肉桂链轮丝菌(Streptoverticillium cinnamoneum)

<400>43

<210>44

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>44

<210>45

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>45

<210>46

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>46

<210>47

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>47

<210>48

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>48

<210>49

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>49

<210>50

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>50

<210>51

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>51

<210>52

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>52

<210>53

<211>20

<212>PRT

<213>茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)

<400>53

<210>54

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：svPEP的探针

<400>54

<210>55

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>55

<210>56

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>56

<210>57

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>57

<210>58

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>58

<210>59

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>59

<210>60

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>60

<210>61

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>61

<210>62

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>62

<210>63

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>63

<210>64

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>64

<210>65

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>65

<210>66

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>66

<210>67

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>67

<210>68

<211>4

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>MOD_RES

<222>(4)

<223>Xaa为Pro-pNA，pNA为对硝基酰替苯胺

<220>

<223>人工序列的描述：svPEP的底物

<400>68

<210>69

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：天然型转谷氨酰胺酶的附加序列

<400>69

<210>70

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：天然型转谷氨酰胺酶的附加序列

<400>70

Claims

1.一种转谷氨酰胺酶的制备方法，其包括，对携有基因表达重组体的棒杆菌进行培养，使上述转谷氨酰胺酶在上述棒杆菌中生成并分泌、然后从上述转谷氨酰胺酶中切除前体结构部分，其中在所述基因表达重组体中，在棒杆菌中发挥功能的启动子的下游连接编码源自棒杆菌的信号肽区的核酸序列，再在编码上述信号肽区的核酸序列的下游连接编码含有前体结构部分的转谷氨酰胺酶的核酸序列。

2.权利要求1所述的方法，其中，信号肽是源自棒杆菌的细胞表面蛋白质的信号肽。

3.权利要求1所述的方法，其中，信号肽是源自谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的细胞表面蛋白质的信号肽。

4.权利要求3所述的方法，其中，信号肽由序列号1或29所示的氨基酸序列组成。

5.权利要求1所述的方法，其中，信号肽是源自产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)的细胞表面蛋白质的信号肽。

6.权利要求5所述的方法，其中，信号肽由序列号2所示的氨基酸序列组成。

7.权利要求1～6任一项所述的方法，其中，前体结构部分为源自放线菌的转谷氨酰胺酶的前体结构部分。

8.权利要求7所述的方法，其中，前体结构部分由序列号3或4所示的序列组成。

9.权利要求7所述的方法，其中，前体结构部分的氨基酸序列为序列号30～38所示的氨基酸序列中任意一种。

10.权利要求1所述的方法，其中，前体结构部分的切除是通过蛋白酶实施的。

11.权利要求10所述的方法，其中，生成和分泌转谷氨酰胺酶的棒杆菌还生成所述蛋白酶。

12.权利要求11所述的方法，其中，前体结构部分的切除是通过所述蛋白酶和肽酶实施的。

13.权利要求12所述的方法，其中，生成和分泌转谷氨酰胺酶的棒杆菌还生成所述蛋白酶和所述肽酶。

14.权利要求10或12所述的方法，其中，蛋白酶源自放线菌。

15.权利要求10或12所述的方法，其中，蛋白酶源自白灰浅链霉菌(Streptomyces albogriseolus)。

16.权利要求12所述的方法，其中，肽酶源自放线菌。

17.权利要求12所述的方法，其中，肽酶源自茂原链霉菌(Streptomyces mobaraense)。

18.权利要求1～9任一项所述的方法，其中，转谷氨酰胺酶是源自放线菌的转谷氨酰胺酶。

19.权利要求18所述的方法，其中，转谷氨酰胺酶是源自茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)的转谷氨酰胺酶。

20.权利要求19所述的方法，其中，转谷氨酰胺酶由序列号5所示的氨基酸序列组成。

21.权利要求18所述的方法，其中，转谷氨酰胺酶是源自肉桂链轮丝菌(Streptoverticillium cinnamoneum)的转谷氨酰胺酶。

22.权利要求21所述的方法，其中，转谷氨酰胺酶由序列号43所示的氨基酸序列组成。