CH707252B1

CH707252B1 - Erythropoietinrezeptor-modifizierte Elektrode und deren Herstellungsverfahren und Anwendung.

Info

Publication number: CH707252B1
Application number: CH00900/13A
Authority: CH
Inventors: Zhang Liqun; Fu Weiling; Wang Yunxia
Original assignee: First Affiliated Hospital Third Military Medical University Chinese People's Liberation Army P R Of
Priority date: 2012-09-07
Filing date: 2012-10-09
Publication date: 2016-12-15
Also published as: CN102854231A; US8986535B2; CN102854231B; US20140216950A1; WO2014036772A1

Abstract

Die Erfindung offenbart eine Erythropoietinrezeptor-modifizierte Elektrode, gebildet aus einer Glaskohlenstoffelektrode mit einem auf der Elektrodenoberfläche über ein ZnO-Sol-Gel fixierten Erythropoietinrezeptor als Erkennungselement. Die modifizierte Elektrode kann einfach hergestellt werden und ihre Leistungsfähigkeit ist stabil. Nach Lagerung über 50 Tage in der Dunkelheit bei 4 °C bleibt ihr Antwortstrom bei ungefähr 77% des ursprünglichen Wertes. Ein elektrochemischer Biosensor unter Verwendung dieser modifizierten Elektrode als Arbeitselektrode, einer Platinelektrode als Gegenelektrode, einer gesättigten Kalomelelektrode als Referenzelektrode und eines 2 mMol/L K 3 [Fe(CN) 6 ]-K 4 [Fe(CN) 6 ] enthaltenden Phosphatpuffers als Testbasislösung kann Erythropoietin (EPO) und/oder rekombinantes humanes Erythropoietin (rhEPO) auf schnelle, spezifische und sensitive Weise mit einem linearen Bereich von 5 pg/L–500 ng/L und einer Nachweisgrenze von 0.5 pg/L nachweisen. Insbesondere erlaubt der Biosensor aufgrund der unterschiedlichen Potenzialmaxima eine genaue Unterscheidung von EPO und rhEPO. Er kann nicht nur für den Nachweis von tiefen Konzentrationen von EPO oder rhEPO, sondern auch für den Nachweis des Stimulans rhEPO bei Sportwettkämpfen verwendet werden.

Description

Gebiet der Erfindung

[0001] Die Erfindung gehört zum technischen Gebiet des elektrochemischen Nachweises. Sie betrifft eine modifizierte Elektrode und deren Herstellungsverfahren, und sie betrifft zudem einen die modifizierte Elektrode als Arbeitselektrode umfassenden elektrochemischen Biosensor, sowie zugehörige Nachweisverfahren.

Hintergrund

[0002] Erythropoietin (EPO) ist ein Glycoproteinhormon und ein hämatopoetischer Faktor, welcher hauptsächlich in den menschlichen Nieren gebildet wird. EPO begünstigt die Bildung und Freisetzung von roten Blutkörperchen im Knochenmark. Im Jahr 1985 wurde rekombinantes humanes Erythropoietin (rhEPO) mittels Gentechnik synthetisiert. Aufgrund seiner mitogenen und differenzierungsbegünstigenden Wirkungen kann rhEPO die Wirkung einer Bluttransfusion hervorrufen, ohne den Patienten dem Risiko einer viralen Infektion oder einer übermässigen Transfusion auszusetzen. Dementsprechend spielt es eine wichtige Rolle bei der Behandlung der renalen Anämie. Mittlerweile ist rhEPO wegen seiner Wirkung der Erhöhung der Sauerstoffspeicherungskapazität und Belastungstoleranz ein neues Stimulans bei Sportwettkämpfen. Im Jahr 2005 wurde rhEPO vom Internationalen Olympischen Komitee (IOC) und der Welt-Antidoping-Agentur (WADA) als die erste bei Sportwettkämpfen verbotene Peptidsubstanz aufgelistet.

[0003] EPO und rhEPO haben dieselben biologischen Aktivitäten und eine sehr ähnliche Molekülstruktur, und deren einziger Unterschied liegt beim isoelektrischen Punkt. EPO hat einen isoelektrischen Punkt von 3.7–4.7, und rhEPO hat einen isoelektrischen Punkt von 4.4–5.1. Dementsprechend ist es schwierig, EPO von rhEPO zu unterscheiden. Die Unterscheidung von EPO und rhEPO war lange auf die Kombination von Massenspektrometrie, isoelektrischer Fokussierung und Gelelektrophorese angewiesen. Allerdings haben diese Nachweisverfahren einige Nachteile wie lange Auftrennungszeit, niedrige Nachweiseffizienz und geringe Spezifität. Dementsprechend sind sie nicht für eine schnelle, genaue Unterscheidung von EPO und rhEPO geeignet. Es ist zwingend erforderlich, ein hochspezifisches, sensitives, schnelles und genaues Verfahren zur Unterscheidung von EPO und rhEPO zu entwickeln.

Zusammenfssung

[0004] Eine durch die hier offenbarte Erfindung zu lösende Aufgabe besteht darin, eine modifizierte Elektrode bereitzustellen. Eine weitere zu lösende Aufgabe besteht darin, ein Herstellungsverfahren für die besagte modifizierte Elektrode bereitzustellen. Noch eine weitere zu lösende Aufgabe besteht darin, einen elektrochemischen Biosensor unter Verwendung der modifizierten Elektrode als Arbeitselektrode bereitzustellen. Noch eine weitere zu lösende Aufgabe besteht darin, ein EPO- und/oder rhEPO-Nachweisverfahren unter Verwendung des besagten elektrochemischen Biosensors bereitzustellen. Die besagte modifizierte Elektrode kann einfach hergestellt werden, und ihre Leistungsfähigkeit ist stabil. Der elektrochemische Biosensor unter Verwendung der modifizierte Elektrode als Arbeitselektrode ist fähig, EPO und/oder rhEPO auf schnelle, spezifische und sensitive Weise nachzuweisen. Insbesondere erlaubt er eine schnelle, genaue Unterscheidung von EPO und rhEPO.

[0005] Die Aufgaben werden gelöst durch Bereitstellung der folgenden technischen Protokolle:

[0006] 1. Erythropoietinrezeptor-(EPOR)-modifizierte Elektrode. Die besagte modifizierte Elektrode ist eine Glaskohlenstoffelektrode mit einem an der Elektrodenoberfläche über ein ZnO-Sol-Gel fixierten EPOR als Erkennungselement.

[0007] 2. Herstellungsverfahren für die EPOR-modifizierte Elektrode, umfassend die folgenden Schritte: <tb>a.<SEP>Vorbehandeln der Glaskohlenstoffelektrode: Die Oberfläche der Glaskohlenstoffelektrode wird poliert, gereinigt und für die spätere Verwendung getrocknet; <tb>b.<SEP>Herstellen eines ZnO-Sol-Gels: Zinkacetat wird in absolutem Alkohol gelöst; während das Gemisch einem Ultraschall-Rühren unterzogen wird, wird Lithiumhydroxid zugegeben, woraus eine ZnO-Sol-Gel-Lösung zur späteren Verwendung erhalten wird; <tb>c.<SEP>EPOR-Fixierung: Die im Schritt b hergestellte ZnO-Sol-Gel-Lösung und eine EPOR-Lösung werden gründlich vermischt, und die erhaltene Lösung wird auf die Oberfläche einer wie in Schritt a beschriebenen vorbehandelten Glaskohlenstoffelektrode aufgeträufelt, gefolgt von Trocknen und Waschen; damit ist die Erythropoietinrezeptor-modifizierte Elektrode hergestellt.

[0008] Vorzugsweise wird die Glaskohlenstoffelektrode im besagten Schritt a zunächst mit 0.3 µm und dann mit 0.05 µm Aluminiumoxid-Pulver poliert. Zwischen den Polierschritten wird die Elektrode zunächst mit Wasser und dann in einem Ultraschallbad mit Salpetersäure, Aceton und Wasser gewaschen. Nach jedem Waschschritt wird die Elektrode luftgetrocknet.

[0009] Vorzugsweise wird das Zinkacetat im besagten Schritt b in absolutem Alkohol gelöst, woraus sich eine 0.1 Mol/L-Lösung ergibt. Während das Gemisch einem Ultraschall-Rühren unterzogen wird, wird Lithiumhydroxid zugegeben, woraus sich eine ZnO-Sol-Gel-Stammlösung mit einer Endkonzentration von 0.067 Mol/L ergibt. Unmittelbar vor der Verwendung wird ZnO-Sol-Gel-Lösung durch Verdünnen der Stammlösung mit absolutem Alkohol in einem Vol/Vol-Verhältnis von 2:1~1:3 hergestellt.

[0010] Noch bevorzugter wird das Zinkacetat im besagten Schritt b in absolutem Alkohol gelöst, woraus sich eine 0.1 Mol/L-Lösung ergibt. Während das Gemisch einem Ultraschall-Rühren unterzogen wird, wird Lithiumhydroxid zugegeben, woraus sich eine ZnO-Sol-Gel-Stammlösung mit einer Endkonzentration von 0.067 Mol/L ergibt. Unmittelbar vor der Verwendung wird ZnO-Sol-Gel-Lösung durch Verdünnen der Stammlösung mit absolutem Alkohol in einem Vol/Vol-Verhältnis von 1:2 hergestellt.

[0011] Vorzugsweise werden die im Schritt b hergestellte ZnO-Sol-Gel-Lösung und 10 ng/L~100 µg/L Erythropoietinrezeptor-Lösung im besagten Schritt c in einem Vol/Vol-Verhältnis von 4:1~1:1.15 gründlich vermischt, und die erhaltene Lösung wird auf die Oberfläche einer wie in Schritt a beschriebenen vorbehandelten Glaskohlenstoffelektrode aufgeträufelt, gefolgt von Lufttrocknung und gründlichem Waschen in einem Phosphatpuffer. Damit ist die Erythropoietinrezeptor-modifizierte Elektrode hergestellt.

[0012] Noch bevorzugter werden die im Schritt b hergestellte ZnO-Sol-Gel-Lösung und 1 µg/L Erythropoietinrezeptor-Lösung im besagten Schritt c in einem Vol/Vol-Verhältnis von 1:1 gründlich vermischt, und die erhaltene Lösung wird auf die Oberfläche einer wie in Schritt a beschriebenen vorbehandelten Glaskohlenstoffelektrode aufgeträufelt, gefolgt von Lufttrocknung und gründlichem Waschen in einem Phosphatpuffer. Damit ist die Erythropoietinrezeptor-modifizierte Elektrode hergestellt.

[0013] 3. Der elektrochemische Biosensor für EPO und rhEPO umfasst eine Arbeitselektrode, eine Gegenelektrode, eine Referenzelektrode und die Testbasislösung. Die besagte Arbeitselektrode ist die besagte Erythropoietinrezeptor-modifizierte Elektrode nach Anspruch 1, die Gegenelektrode ist eine Platinelektrode, und die Referenzelektrode ist eine gesättigte Kalomelelektrode. Die besagte Testbasislösung ist ein 2 mMol/L K3[Fe(CN)6] und 2 mMol/L K4[Fe(CN)6] enthaltender Phosphatpuffer (pH = 6.2~9.0).

[0014] Vorzugsweise ist die besagte Testbasislösung ein 2 mMol/L K3[Fe(CN)6] und 2 mMol/L K4[Fe(CN)6] enthaltender Phosphatpuffer (pH = 7.4).

[0015] 4. EPO und/oder rhEPO wird unter Verwendung des besagten elektrochemischen Biosensors für EPO und rhEPO wie folgt nachgewiesen: Die Erythropoietinrezeptor-modifizierte Elektrode und Probelösung werden während mehr als 20 Minuten ko-inkubiert, anschliessend wird unter Verwendung des elektrochemischen Biosensors, welcher die Erythropoietinrezeptor-modifizierte Elektrode als Arbeitselektrode, eine Platinelektrode als Gegenelektrode, eine gesättigte Kalomelelektrode als Referenzelektrode und ein 2 mMol/L K3[Fe(CN)6] und 2 mMol/L K4[Fe(CN)6] enthaltender Phosphatpuffer (pH = 6.2~9.0) als Testbasislösung umfasst, ein zyklischer Voltammetrie-Scan mit einem Potenzial-Scanbereich von –0.3V~0.7V und mit einer Potenzial-Scangeschwindigkeit von 10 mV/s~100 mV/s durchgeführt. Die Erythropoietinkonzentration der Probelösung wird aufgrund des Spitzenstroms beim Potenzial von 0.14 V~0.17 V und der Erythropoietin-Standardkurve berechnet, und/oder die Konzentration der Probelösung an rekombinantem humanem Erythropoietin wird aufgrund des Spitzenstroms beim Potenzial von 0.06 V~0.09 V und der Standardkurve des rekombinanten humanen Erythropoietins berechnet.

[0016] Vorzugsweise werden die besagte EPOR-modifizierte Elektrode und Probelösung während 20 Minuten ko-inkubiert, und die besagte Potenzial-Scangeschwindigkeit ist 50 mV/s.

[0017] Die Vorteile der Erfindung liegen in Folgendem: Die erfindungsgemässe EPOR-modifizierte Elektrode kann einfach hergestellt werden und ihre Leistungsfähigkeit ist stabil. Nach Lagerung über 50 Tage in der Dunkelheit bei 4 °C blieb ihr Antwortstrom bei ungefähr 77% des ursprünglichen Wertes. Ein elektrochemischer Biosensor unter Verwendung dieser modifizierten Elektrode als Arbeitselektrode kann Erythropoietin (EPO) und/oder rekombinantes humanes Erythropoietin (rhEPO) auf schnelle, spezifische und sensitive Weise mit einem linearen Bereich von 5 pg/L–500 ng/L und einer Nachweisgrenze von 0.5 pg/L nachweisen. Insbesondere erlaubt der Biosensor aufgrund der unterschiedlichen Potenzialmaxima eine genaue Unterscheidung zwischen EPO und rhEPO. Er kann nicht nur für den Nachweis von niedrigen Konzentrationen von EPO oder rhEPO, sondern auch für den Nachweis des Stimulans rhEPO bei Sportwettkämpfen verwendet werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

[0018] <tb>Fig. 1<SEP>zeigt die Auswirkung des Verdünnungsverhältnisses der ZnO-Sol-Gel-Stammlösung und absolutem Alkohol auf die Stromantwort der EPOR-modifizierten Elektrode. <tb>Fig. 2<SEP>zeigt die Auswirkung des Vol/Vol-Verhältnises von ZnO-Sol-Gel-Lösung und EPOR-Lösung auf die Stromantwort der EPOR-modifizierten Elektrode. <tb>Fig. 3<SEP>zeigt die Auswirkung der Konzentration der EPOR-Lösung auf die Stromantwort der EPOR-modifizierten Elektrode. <tb>Fig. 4<SEP>zeigt die Auswirkung des pH-Wertes der Testbasislösung auf die Stromantwort des elektrochemischen Biosensors für EPO und rhEPO. <tb>Fig. 5<SEP>zeigt die Auswirkung der Inkubationszeit der Arbeitselektrode in der Probelösung auf die Stromantwort des elektrochemischen Biosensors für EPO und rhEPO. <tb>Fig. 6<SEP>zeigt die Auswirkung des Potenzials des zyklischen Voltammetrie-Scans auf die Stromantwort des elektrochemischen Biosensors für EPO und rhEPO. <tb>Fig. 7<SEP>zeigt die Ergebnisse der elektrochemischen Antwort und Spezifität des elektrochemischen Biosensors unter Verwendung der EPOR-modifizierten Elektrode als Arbeitselektrode. a: zyklisches Voltammogramm einer einfachen ZnO-Sol-Gel-modifizierten Elektrode in einer PBS-Lösung; b: zyklisches Voltammogramm einer nicht-modifizierten Glaskohlenstoffelektrode in einer 2 mMol/L K3[Fe(CN)6]-K4[Fe(CN)6] enthaltenden PBS-Lösung; c: zyklisches Voltammogramm einer einfachen ZnO-Sol-Gel-modifizierten Elektrode in einer 2 mMol/L K3[Fe(CN)6]-K4[Fe(CN)6] enthaltenden PBS-Lösung; d: zyklisches Voltammogramm einer EPOR-modifizierten Elektrode in einer 2 mMol/L K3[Fe(CN)6]-K4[Fe(CN)6] enthaltenden PBS-Lösung; e: zyklisches Voltammogramm einer EPOR-modifizierten Elektrode nach 20-minütiger Inkubation in einer interferierende Substanzen enthaltenden Lösung (500 ng/L IgA, 500ng/L IgG und 500 ng/L IgM); f: zyklisches Voltammogramm einer EPOR-modifizierten Elektrode nach 20-minütiger Inkubation in einer 500 ng/L EPO-Standardzubereitung enthaltenden Lösung; g: zyklisches Voltammogramm einer EPOR-modifizierten Elektrode nach 20-minütiger Inkubation in einer 500 ng/L rhEPO-Standardzubereitung enthaltenden Lösung. <tb>Fig. 8<SEP>Zeigt EPO- und rhEPO-Standardkurven, die unter Verwendung eines elektronischen Biosensors für EPO und rhEPO unter optimalen Bedingungen erhalten wurden. <tb>Fig. 9<SEP>zeigt die Veränderung der Stromantwort eines elektrochemischen Biosensors für EPO und rhEPO nach verschiedener Zeitdauer der Lagerung.

Ausführliche Beschreibung

[0019] Um die Aufgaben, technischen Protokolle und Vorteile der Erfindung zu verdeutlichen, werden nachfolgend die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung unter Bezugnahme auf die Zeichnungen ausführlich beschrieben.

[0020] Die in den Ausführungsformen verwendeten Reagenzien und Instrumente sind nachfolgend aufgeführt: Lithiumhydroxid (LiOH⋅H2O), Zinkacetat [Zn(Ac)2⋅2H2O] von Shanghai Sangon Bioengineering Co., Ltd (Shanghai, China); K3[Fe(CN)6], K4[Fe(CN)6] von Chongqing Dongfang Reagents Factory (Chongqing, China); Glaskohlenstoffelektrode, gesättigte Kalomelektrode, Platinelektrode, 0.3 µm und 0.05 µm Al2O3-Pulver von Tianjin Aidahengsheng Tech Co., Ltd (Tianjin, China); PBS-Pulver von Beijing Zhong Shan Golden Bridge Biotech Co., Ltd (Beijing, China); EPOR von Novus Biologicals (USA); EPO und rhEPO-Standardzubereitung von Abnova (USA); elektronische Arbeitsstation Modell CHI660C von Shanghai Chenhua Instruments Co., Ltd, China; Ultraschallbad Modell KQ-5200B von Kunshan Ultrasound Instruments Co., Ltd (Jiangsu, China), und automatisches elektrisches Potenzialtitrimeter Modell ZD-2 von Shanghai Jingke Leici Co., Ltd (Shanghai, China).

I. Herstellen der EPOR-modifizieren Elektrode und Parameteroptimierung

[0021] Das Herstellungsverfahren für eine EPOR-modifizierte Elektrode umfasst die folgenden Schritte: <tb>a.<SEP>Vorbehandeln der Glaskohlenstoffelektrode: Glaskohlenstoffelektroden (3 mm im Durchmesser) werden zunächst mit 0.3 µm und dann mit 0.05 µm Al2O3-Pulver poliert. Zwischen den Polierschritten werden die Elektroden zunächst mit ultrareinem Wasser und dann während jeweils 5 Min. in einem Ultraschallbad mit Salpetersäure, Aceton und ultrareinem Wasser gewaschen. Nach dem Waschen werden die Elektroden luftgetrocknet. <tb>b.<SEP>Herstellen einer ZnO-Sol-Gel-Lösung: 2.20 g (0.01 Mol) Zn(Ac)2⋅2H2O werden in 100 mL absolutem Alkohol gelöst. Anschliessend werden 0.28 g (6.7 mMol) LiOH⋅H2O langsam unter Ultraschallbehandlung zugegeben, um ZnO-Sol-Gel-Stammlösung herzustellen, welche für die spätere Verwendung bei 4 °C gelagert wird. Unmittelbar vor der Verwendung wird ZnO-Sol-Gel-Lösung durch Verdünnen der Stammlösung mit absolutem Alkohol in einem Vol/Vol-Verhältnis von 1:2 hergestellt. <tb>c.<SEP>EPOR-Fixierung: Die im Schritt b hergestellte ZnO-Sol-Gel-Lösung und 1 µg/L EPOR-Lösung werden im Vol/Vol-Verhältnis 1:1 gründlich vermischt, und 10 µl der erhaltenen Lösung werden auf die Oberfläche einer wie in Schritt a beschriebenen vorbehandelten Glaskohlenstoffelektrode aufgeträufelt, gefolgt von Trocknen bei Raumtemperatur während 16 Stunden, was die Bildung von Gel auf der Elektrodenoberfläche erlaubt. Schliesslich wird die Elektrode gründlich in PBS-Lösung (pH 7.4, 0.05 Mol/L) gewaschen. Die hergestellte EPOR-modifizierte Elektrode wird bis zur Verwendung bei 4 °C in der Dunkelheit gelagert.

[0022] Die Erfindung umfasst die Optimierung von wichtigen Parametern, welche die Stromantwort von EPOR-modifizierten Elektroden beeinflussen. Ein elektrochemischer Biosensor, welcher eine EPOR-modifizierte Elektrode, die mit verschiedenen Parametern als Arbeitselektrode, gesättigte Kalomelelektrode als Referenzelektrode, Platinelektrode als Gegenelektrode und 2 mMol/L K3[Fe(CN)6]-K4[Fe(CN)6] (pH 7.4, 0.05 Mol/L) enthaltende PBS-Lösung als Testbasislösung hergestellt ist, umfasst, wird für einen zyklischen Voltammetrie-Scan bei Raumtemperatur innerhalb des Potenzial-Scanbereichs von –0.3V~0.7V und mit der Potenzial-Scangeschwindigkeit von 50 mV/s eingesetzt. Die Ergebnisse zeigen, dass das Verdünnungsverhältnis von ZnO-Sol-Gel-Stammlösung und absolutem Alkohol, das Vol/Vol-Verhältnis von ZnO-Sol-Gel-Lösung und EPOR-Lösung und die EPOR-Konzentration die Stromantwort der EPOR-modifizierten Elektrode beeinflussen und dass das bevorzugte Verdünnungsverhältnis im Bereich von 2:1~1:3 liegt und das am meisten bevorzugte Verhältnis 1:2 für ZnO-Sol-Gel-Stammlösung und absolutem Alkohol beträgt (Fig. 1 ). Das bevorzugte Vol/Vol-Verhältnis von ZnO-Sol-Gel-Lösung und EPOR-Lösung liegt im Bereich von 4:1~1:1.15, und das am meisten bevorzugte Verhältnis beträgt 1:1 (Fig. 2 ). Die bevorzugte EPOR-Konzentration liegt im Bereich von 10 ng/L~100 µg/L, und die am meisten bevorzugte Konzentration beträgt 1 µg/L (Fig. 3 ).

II. Herstellung eines elektrochemischen Biosensors für EPO und rhEPO und Parameteroptimierung

[0023] Die EPOR-modifizierte Elektrode und die Probelösung werden während 20 Minuten ko-inkubiert, und der elektrochemische Biosensor für EPO und rhEPO, welcher eine EPOR-modifizierte Elektrode als Arbeitselektrode, eine gesättigte Kalomelelektrode als Referenzelektrode, eine Platinelektrode als Gegenelektrode, und 2 mMol/L K3[Fe(CN)6]-K4[Fe(CN)6] (pH 7.4, 0.05 Mol/L) enthaltende PBS-Lösung als Testbasislösung umfasst, wird für einen zyklischen Voltammetrie-Scan bei Raumtemperatur innerhalb des Potenzial-Scanbereichs von –0.3V~0.7V und mit der Potenzial-Scangeschwindigkeit von 50 mV/s eingesetzt.

[0024] Die Erfindung umfasst die Optimierung von wichtigen Parametern, welche die Stromantwort des elektrochemischen Biosensors für EPO und rhEPO beeinflussen. Die Ergebnisse zeigen, dass der Spitzenstrom des Sensors bei einem pH der Testbasislösung innerhalb von 6.2~9.0 hoch ist und bei einem pH von 7.4 am höchsten ist. Dementsprechend liegt der bevorzugte pH der Testbasislösung im Bereich von 6.2~9.0, und der am meisten bevorzugte pH beträgt 7.4 (Fig. 4 ). Wird die Inkubationszeit der EPOR-modifizierten Elektrode und der 500 ng/L EPO- oder rhEPO-Standardzubereitungslösung von 5 Minuten auf 20 Minuten erhöht, so nimmt der Spitzenstrom des Sensors graduell auf ein Minimum ab, während bei weiterer Erhöhung der Inkubationszeit auf 40 Minuten der Spitzenstrom unverändert bleibt. Daraus wird geschlossen, dass nach 20-minütiger Inkubation die EPO- oder rhEPO-Bindung an die EPOR-modifizierte Elektrode gesättigt ist. Dementsprechend beträgt die bevorzugte Inkubationszeit der EPOR-modifizierten Elektrode und der Probelösung 20 Minuten oder mehr, und die am meisten bevorzugte Inkubationszeit beträgt 20 Minuten (Fig. 5 ). Ausserdem beeinflusst die Veränderung des Scanpotenzials das K3[Fe(CN)6]-K4[Fe(CN)6]-Redoxspitzenpotenzial nur geringfügig, aber sie beeinflusst die Stromantwort des Sensors, insbesondere innerhalb von –0.3V~0.7V, in ausgeprägter Weise (Fig. 6 ). Die Potenzial-Scangeschwindigkeit beeinflusst die Form des zyklischen Voltammogrammes. Im Rahmen der Erfindung wurde festgestellt, dass die zulässige Potenzial-Scangeschwindigkeit im Bereich von 10 mV/s~100 mV/s liegt, wobei jedoch bei 50 mV/s das zyklische Voltammogramm am glattesten ist.

III. Leistungsfähigkeit des elektrochemischen Biosensors für den EPO- und rhEPO-Nachweis

1. Spezifität

[0025] Die EPOR-modifizierte Elektrode und die Probelösung werden während 20 Minuten ko-inkubiert, und der elektrochemische Biosensor, welcher eine EPOR-modifizierte Elektrode als Arbeitselektrode, eine gesättigte Kalomelelektrode als Referenzelektrode, eine Platinelektrode als Gegenelektrode, und eine 2 mMol/L K3[Fe(CN)6]-K4[Fe(CN)6] (pH 7.4, 0.05 Mol/L) enthaltende PBS-Lösung als Testbasislösung umfasst, wird für einen zyklischen Voltammetrie-Scan bei Raumtemperatur innerhalb des Potenzial-Scanbereichs von –0.3V~0.7V und mit der Potenzial-Scangeschwindigkeit von 50 mV/s eingesetzt.

[0026] Die experimentellen Resultate zur Spezifität des Sensors sind in Fig. 7 dargestellt. Kurve a ist das zyklische Voltammogramm einer einfachen ZnO-Sol-Gel-modifizierten Elektrode in PBS-Lösung, welches nur den Hintergrundstrom zeigt; Kurve b ist das zyklische Voltammogramm einer nicht-modifizierten Glaskohlenstoffelektrode in einer 2 mMol/L K3[Fe(CN)6]-K4[Fe(CN)6] enthaltenden PBS-Lösung. Da die PBS-Lösung mit der Redox-Probe K3[Fe(CN)6]-K4[Fe(CN)6] zugegeben wird, verändert sich das zyklische Voltammogramm deutlich und zeigt ein Paar von quasi-reversiblen Redoxspitzen; Kurve c ist das zyklische Voltammogramm einer einfachen ZnO-Sol-Gel-modifizierten Elektrode in einer 2 mMol/L K3[Fe(CN)6]-K4[Fe(CN)6] enthaltenden PBS-Lösung. Da der ZnO-Sol-Gel-Film den Elektronentransfer von elektrisch leitenden Ionen von der Lösung auf die Elektrode verhindert, nehmen die Redox-Spitzenströme ab. Kurve d, welche das zyklische Voltammogramm der EPOR-modifizierten Elektrode in einer 2 mMol/L K3[Fe(CN)6] / K4[Fe(CN)6] enthaltenden PBS-Lösung darstellt, unterscheidet sich signifikant von der Kurve c, was darauf hinweist, dass EPOR die Elektrodenoberfläche erfolgreich modifiziert. Als biologisches Makromolekül verhindert EPOR den Elektronentransfer, sobald es auf der Elektrodenoberfläche absorbiert worden ist, was im Vergleich zur Kurve c zu einer weiteren Abnahme des Redox-Spitzenstroms führt. Kurve e stellt das zyklische Voltammogramm der EPOR-modifizierten Elektrode nach 20-minütiger Inkubation in einer interferierende Substanzen enthaltenden Lösung (500 ng/L IgA, 500 ng/L IgG und 500 ng/L IgM) dar, und Kurve d bleibt weitgehend unverändert, was darauf hinweist, dass interferierende Substanzen, z.B. IgA, IgG, IgM den Nachweis von EPO und rhEPO nicht beeinflussen. Kurve f ist das zyklische Voltammogramm der EPOR-modifizierten Elektrode nach 20-minütiger Inkubation in 500 ng/L EPO-Standardzubereitungslösung, wobei sich der Antwortstrom zwischen vor und nach der Inkubation (ΔI) um 8.2 µA verändert, und wobei der Spitzenstrom beim Potenzial von 0.16 V erscheint. EPO-EPOR Komplexe, welche sich aus der spezifischen Bindung von EPO in der Lösung an EPOR auf der Elektrodenoberfläche ergeben, bedecken eine grössere Fläche der Elektrodenoberfläche, was den Elektronentransfer weiter erschwert. Im Ergebnis nimmt der Redox-Spitzenstrom im Vergleich zur Kurve d deutlich ab. Kurve g ist das zyklische Voltammogramm der EPOR-modifizierten Elektrode nach 20-minütiger Inkubation in 500 ng/L rhEPO-Standardzubereitungslösung. Die Antwortströme verändern sich um 9.7 µA (ΔI) vor beziehungsweise nach der Inkubation. Da die rhEPO-EPOR-Komplexe, welche sich aus der spezifischen Bindung von rhEPO und EPOR ergeben, den Elektronentransfer erschweren, nimmt in ähnlicher Weise der Redox-Spitzenstrom im Vergleich zur Kurve d deutlich ab. Dennoch weisen die rhEPO-EPOR-Komplexe und EPO-EPOR-Komplexe unterschiedliche Arbeitspotenziale auf, da rhEPO und EPO unterschiedliche isoelektrische Punkte haben. Im Vergleich zur Kurve f verschiebt sich die Redoxspitze gegen das negative Potenzial in Kurve g, in welcher der Spitzenstrom beim Potenzial von 0.08 V erscheint. EPO und rhEPO können aufgrund des Redoxspitzenpotenzials genau unterschieden werden. Diese experimentellen Resultate zeigen, dass die EPOR-modifizierte Elektrode der vorliegenden Erfindung eine starke Resistenz gegenüber Interferenzen und eine hohe Selektivität für EPO und rhEPO aufweist, und dass sie den Nachweis von EPO und rhEPO mit guter Unterscheidbarkeit erlaubt.

2. Linearer Bereich und Nachweisgrenzen

[0027] Die EPOR-modifizierte Elektrode und die Probelösung werden während 20 Minuten ko-inkubiert, und der elektrochemische Biosensor für EPO und rhEPO, welcher eine EPOR-modifizierte Elektrode als Arbeitselektrode, eine gesättigte Kalomelelektrode als Referenzelektrode, eine Platinelektrode als Gegenelektrode, und eine 2 mMol/L K3[Fe(CN)6]-K4[Fe(CN)6] (pH 7.4, 0.05 Mol/L) enthaltende PBS-Lösung als Testbasislösung umfasst, wird für einen zyklischen Voltammetrie-Scan bei Raumtemperatur innerhalb des Potenzial-Scanbereichs von –0.3V~0.7V und mit der Potenzial-Scangeschwindigkeit von 50 mV/s eingesetzt. Die Ergebnisse sind in Fig. 8 gezeigt. Wenn die EPO-Konzentration im Bereich zwischen 5 pg/L und 500 ng/L liegt, weisen der logarithmische Wert der EPO-Konzentration und der Spitzenstrom eine gute lineare Korrelation auf. Für EPO war die lineare Regressionsgleichung: y = 2.1674x + 17.691, der Korrelationskoeffizient ist 0.9966 und die Nachweisgrenze ist 0.5 pg/L. Wenn die rhEPO-Konzentration im Bereich zwischen 5 pg/L und 500 ng/L liegt, weisen der logarithmische Wert der rhEPO-Konzentration und der Spitzenstrom eine gute lineare Korrelation auf. Für rhEPO ergab sich die lineare Regressionsgleichung: y= 1.5737x + 14.765, wobei der Korrelationskoeffizient 0.9935 und die Nachweisgrenze 0.5 pg/L ist. Diese Resultate zeigen, dass sich der elektrochemische Biosensor für EPO und rhEPO durch einen breiten linearen Bereich und eine tiefe Nachweisgrenze auszeichnet.

3. Stabilität

[0028] Nach der Lagerung der frisch hergestellten EPOR-modifizierten Elektrode bei 4 °C in der Dunkelheit während 10, 20, 30, 40, 50, 60 Tagen, wird der elektrochemische Biosensor, welcher die modifizierte Elektrode, eine Platinelektrode und eine gesättigte Referenzelektrode umfasst, für einen zyklischen Voltammetrie-Scan in der Testbasislösung, welche eine 2 mMol/L K3[Fe(CN)6]-K4[Fe(CN)6] enthaltende PBS-Lösung (pH 7.4, 0.05 Mol/L) enthält, bei Raumtemperatur mit dem Potenzial-Scanbereich von –0.3V~0.7V und bei der Potenzial-Scangeschwindigkeit von 50 mV/s eingesetzt, um die Stabilität der EPOR-modifizierten Elektrode zu untersuchen. Die Resultate sind in Fig. 9 gezeigt. Nach 20-tägiger Lagerung beträgt der Antwortstrom der EPOR-modifizierten Elektrode ungefähr 95% des ursprünglichen Wertes; nach 40-tägiger Lagerung beträgt der Antwortstrom ungefähr 82% des ursprünglichen Wertes; nach 50-tägiger Lagerung beträgt der Antwortstrom ungefähr 77% des ursprünglichen Wertes. Diese Resultate zeigen, dass die EPOR-modifizierte Elektrode der vorliegenden Erfindung eine gute Stabilität und eine lange Lebensdauer hat.

[0029] Die obigen Ausgestaltungen sollen das technische Protokoll der Erfindung erklären und sind nicht beschränkend. Obwohl die Erfindung durch die bevorzugten Ausgestaltungen der Erfindung beschrieben wurde, sollten die auf diesem Gebiet tätigen Fachpersonen verstehen, dass verschiedene Abwandlungen bezüglich Form und Einzelheiten implementiert werden können, ohne vom Kern und Bereich der durch die beiliegenden Anspruchsformulierung umschriebenen Erfindung abzuweichen.

Claims

1. Erythropoietinrezeptor-modifizierte Elektrode, dadurch gekennzeichnet, dass die besagte modifizierte Elektrode eine mit einem an der Elektrodenoberfläche über ein ZnO-Sol-Gel fixierten Erythropoietinrezeptor als Erkennungselement versehene Glaskohlenstoffelektrode ist.

2. Herstellungsverfahren für die Erythropoietinrezeptor-modifizierte Elektrode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst: a. Vorbehandeln der Glaskohlenstoffelektrode: Die Oberfläche der Glaskohlenstoffelektrode wird poliert, gereinigt und für die spätere Verwendung getrocknet; b. Herstellen eines ZnO-Sol-Gels: Zinkacetat wird in absolutem Alkohol gelöst; während das Gemisch einem Ultraschall-Rühren unterzogen wird, wird Lithiumhydroxid zugegeben, woraus eine ZnO-Sol-Gel-Lösung zur späteren Verwendung erhalten wird; c. Erythropoietinrezeptor-Fixierung: Die im Schritt b hergestellte ZnO-Sol-Gel-Lösung und eine Erythropoietinrezeptor-Lösung werden vermischt, und die erhaltene Lösung wird auf die Oberfläche einer wie in Schritt a beschriebenen vorbehandelten Glaskohlenstoffelektrode aufgeträufelt, gefolgt von Trocknen und Waschen.

3. Herstellungsverfahren für die Erythropoietinrezeptor-modifizierte Elektrode nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt a wie folgt ist: Die Glaskohlenstoffelektrode wird zunächst mit 0.3 µm und dann mit 0.05 µm Aluminiumoxid-Pulver poliert; zwischen den Polierungen wird die Elektrode zunächst mit Wasser und dann in einem Ultraschallbad mit Salpetersäure, Aceton sowie Wasser gewaschen, gefolgt von Lufttrocknung.

4. Herstellungsverfahren für die Erythropoietinrezeptor-modifizierte Elektrode nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt b wie folgt ist: Zinkacetat wird in absolutem Alkohol gelöst, woraus sich eine 0.1 Mol/L-Lösung ergibt; während das Gemisch einem Ultraschall-Rühren unterzogen wird, wird Lithiumhydroxid zugegeben, woraus sich eine ZnO-Sol-Gel-Stammlösung mit einer Endkonzentration von 0.067 Mol/L ZnO ergibt; unmittelbar vor der Verwendung wird ZnO-Sol-Gel-Lösung durch Verdünnen der Stammlösung mit absolutem Alkohol in einem Vol/Vol-Verhältnis von 2:1 bis 1:3 hergestellt.

5. Herstellungsverfahren für die Erythropoietinrezeptor-modifizierte Elektrode nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt b wie folgt ist: Zinkacetat wird in absolutem Alkohol gelöst, woraus sich eine 0.1 Mol/L-Lösung ergibt; während das Gemisch einem Ultraschall-Rühren unterzogen wird, wird Lithiumhydroxid zugegeben, woraus sich eine ZnO-Sol-Gel-Stammlösung mit einer Endkonzentration von 0.067 Mol/L ZnO ergibt; unmittelbar vor der Verwendung wird ZnO-Sol-Gel-Lösung durch Verdünnen der Stammlösung mit absolutem Alkohol in einem Vol/Vol-Verhältnis von 1:2 hergestellt.

6. Herstellungsverfahren für die Erythropoietinrezeptor-modifizierte Elektrode nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt c wie folgt ist: Die im Schritt b hergestellte ZnO-Sol-Gel-Lösung und 10 ng/L bis 100 µg/L Erythropoietinrezeptor-Lösung werden bei einem Vol/Vol-Verhältnis von 4:1 bis 1:1.15 vermischt, und die erhaltene Lösung wird auf die Oberfläche einer wie in Schritt a beschriebenen vorbehandelten Glaskohlenstoffelektrode aufgeträufelt, gefolgt von Lufttrocknung und Waschen in einem Phosphatpuffer.

7. Herstellungsverfahren für die Erythropoietinrezeptor-modifizierte Elektrode nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt c wie folgt ist: Die im Schritt b hergestellte ZnO-Sol-Gel-Lösung und 1 µg/L Erythropoietinrezeptor-Lösung werden bei einem Vol/Vol-Verhältnis von 1:1 vermischt, und die erhaltene Lösung wird auf die Oberfläche einer wie in Schritt a beschriebenen vorbehandelten Glaskohlenstoffelektrode aufgeträufelt, gefolgt von Lufttrocknung und Waschen in einem Phosphatpuffer.

8. Elektrochemischer Biosensor für Erythropoietin und rekombinantes humanes Erythropoietin, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Arbeitselektrode, eine Gegenelektrode, eine Referenzelektrode und die Testbasislösung umfasst; die Arbeitselektrode ist die Erythropoietinrezeptor-modifizierte Elektrode nach Anspruch 1, die Gegenelektrode ist eine Platinelektrode, und die Referenzelektrode ist eine gesättigte Kalomelelektrode; die Testbasislösung ist ein 2 mMol/L K3[Fe(CN)6] und 2 mMol/L K4[Fe(CN)6] enthaltender Phosphatpuffer (pH = 6.2 bis 9.0).

9. Elektrochemischer Biosensor für Erythropoietin und rekombinantes humanes Erythropoietin nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Testbasislösung ein 2 mMol/L K3[Fe(CN)6] und 2 mMol/L K4[Fe(CN)6] enthaltender Phosphatpuffer (pH = 7.4) ist.

10. Verfahren zum Nachweis von Erythropoietin und/oder rekombinantem humanem Erythropoietin unter Verwendung des elektrochemischen Biosensors nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die folgende Prozedur ausgeführt wird: Die Erythropoietinrezeptor-modifizierte Elektrode und Probelösung werden während mehr als 20 Minuten ko-inkubiert, anschliessend wird unter Verwendung des elektrochemischen Biosensors, welcher die Erythropoietinrezeptor-modifizierte Elektrode als Arbeitselektrode, eine Platinelektrode als Gegenelektrode, eine gesättigte Kalomelelektrode als Referenzelektrode und einen 2 mMol/L K3[Fe(CN)6] und 2 mMol/L K4[Fe(CN)6] enthaltenden Phosphatpuffer (pH = 6.2 bis 9.0) als Testbasislösung umfasst, ein zyklischer Voltammetrie-Scan mit einem Potenzial-Scanbereich von –0.3 V bis 0.7 V und mit einer Potenzial-Scangeschwindigkeit von 10 mV/s bis 100 mV/s durchgeführt; die Erythropoietinkonzentration der Probelösung wird aufgrund des Spitzenstroms beim Potenzial von 0.14 V bis 0.17 V und der Erythropoietin-Standardkurve berechnet, und/oder die Konzentration der Probelösung an rekombinantem humanem Erythropoietin wird aufgrund des Spitzenstroms beim Potenzial von 0.06 V bis 0.09 V und der Standardkurve des rekombinanten humanen Erythropoietins berechnet.