CN115128142B - 一种基于红细胞生物传感器的制备方法与应用 - Google Patents

一种基于红细胞生物传感器的制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于红细胞生物传感器的制备方法与应用，以红细胞为基质，通过原位合成法在红细胞表面构筑一层纳米涂层（MnO2），合成的基于红细胞复合生物材料（RBC@MnO2）修饰电极构建生物传感器。该生物传感器由参比电极、对电极及复合生物材料修饰后的碳布电极组成。该发明所述的基于红细胞复合生物材料所构建的生物传感器用于检测多巴胺浓度，具有灵敏度高、检测下限低、生物相容性好、选择性高、稳定性好等优点，是红细胞独特性质的开发和应用，并为多巴胺的检测提供了新的思路。

Description

一种基于红细胞生物传感器的制备方法与应用
技术领域
本发明属于电化学传感器技术领域，具体涉及一种基于红细胞生物传感器的制备方法与应用，该生物传感器用于检测多巴胺浓度。
背景技术
多巴胺（DA）是一种重要的儿茶酚胺类神经递质。不同浓度水平的多巴胺在中枢神经、外周神经、心血管和内分泌系统发挥着不同的作用。低浓度水平的多巴胺可能导致帕金森病、抑郁症和多动症，高浓度水平多巴胺会导致药物成瘾、心率加快和心脏衰竭。因此，构建一种生物相容性好、高选择性和高灵敏度的可以实时监测多巴胺浓度水平的检测方法，无论从明确其作用机制和生理功能还是在临床应用方面都具有重要意义。
目前，常用的多巴胺检测方法有荧光分析法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、光谱法、比色法等。然而，这些方法检测成本高、灵敏度低、耗时，且需要进一步的分离过程。电化学分析法因具有操作简单、成本低、快速响应、低检测限、高灵敏度和高选择性等优点，是一种极具吸引力和竞争力的检测方法。虽然目前多巴胺电化学传感器研究已取得一定的进展，但大多采用无机纳米材料催化剂构建多巴胺电化学传感器，如Au、Co3O4、Ru等。它们具有大比表面积、高催化活性等优点，但面临一定的生物毒性、合成成本较高等挑战，对实现体内多巴胺浓度水平的实时监测形成障碍。
红细胞（RBC）是人体细胞中数量最多的细胞类型。由于其固有的生物相容性、循环半衰期长、电催化性能等特点而备受关注。红细胞作为可植入式生物燃料电池的天然生物正极电催化剂已被研究，然而其低催化活性以及易溶血性限制了以红细胞为基础的应用。用纳米材料合成红细胞的外骨骼以提高红细胞的稳定性和催化活性是一种切实可行的策略。纳米二氧化锰具有高效催化活性，对多种物质如双氧水、多巴胺等具有电化学响应，且可以在温和的生物相容性条件下原位合成，可能是实现这一目的最佳候选材料。因此，利用少量MnO2作为保护壳层不仅能保护红细胞，提高其稳定性；还可以利用红细胞与MnO2之间的协同作用设计合成以红细胞为基础的生物传感器。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供了一种具有较好生物相容性、高选择性、高灵敏度和高稳定性的基于红细胞生物传感器的制备方法与应用，该方法合成了RBC@MnO2复合生物材料，将其修饰电极构建生物传感器，用于检测多巴胺浓度。
本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种基于红细胞生物传感器的制备方法，其特征在于：以红细胞为基质，通过原位合成法在红细胞表面构筑一层功能纳米涂层，从而得到基于红细胞的复合生物材料（RBC@MnO2）；所述生物传感器由参比电极、对电极及复合生物材料修饰后的工作电极组成，其中修饰后的工作电极由碳布和生物相容性好的RBC@MnO2复合生物材料组成，其具体制备过程为：
步骤S1：将基底电极进行表面预处理；
步骤S2：从动物血或人血中离心去除上层血浆并用生理盐水洗涤多次得到压积红细胞，再用4 wt% 戊二醛溶液固定红细胞，随后依次用生理盐水和去离子水离心洗涤得到压积红细胞A；
步骤S3：在室温条件下，将四水合氯化锰溶于生理盐水溶液中得到溶液B；
步骤S4：在室温条件下，将步骤S2得到的压积红细胞A悬浮分散于步骤S3得到的溶液B中，再逐滴加入氢氧化钠溶液，然后将混合体系摇匀反应，再用去离子水离心洗涤两次，最后将离心产物悬浮分散于生理盐水溶液中得到修饰溶液；
步骤S5：将步骤S4得到的修饰溶液滴加到步骤S1预处理后的基底电极表面，室温晾干后即得到基于RBC@MnO2复合生物材料修饰的工作电极。
进一步限定，步骤S1中所述基底电极为碳布，其预处理过程为：将碳布依次在丙酮和乙醇中超声30 min，干燥后，再将碳布浸入浓硫酸和浓硝酸的混合酸溶液中处理24 h，然后用去离子水反复冲洗碳布直至中性，干燥后即得到表面预处理的碳布电极。
进一步限定，步骤S2中所述动物血为猪血、羊血、兔血或牛血。
进一步限定，步骤S2-S5的具体过程为：将3 mL 3% 比容的固定RBC水洗得到压积红细胞A；将0.0198 g四水合氯化锰溶于10 mL生理盐水中得到溶液B；将压积红细胞A悬浮分散于溶液B中，再逐滴加入100 μL浓度为10 mM的氢氧化钠溶液，然后将混合体系置于摇床上反应，之后通过离心洗涤除去未反应的MnO2前驱体，最后将离心产物悬浮分散于生理盐水中得到修饰溶液，于4 ℃保存备用；将30 μL 3% 比容的修饰溶液滴加到基底电极表面，室温下自然晾干即得基于RBC@MnO2复合生物材料修饰的工作电极。
进一步限定，所述生物传感器采用标准的三电极体系检测多巴胺的浓度，即以RBC@MnO2复合生物材料修饰的碳布电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂片（1 cm2）为对电极，电解液为0.1 M、pH=7.4的PBS缓冲液，差分脉冲伏安法（DPV）的测试是在氮气饱和的PBS缓冲液中进行。
本发明与现有技术相比具有以下优点和有益效果：
1. 本发明所述的生物传感器具有生物相容性好、高选择性、良好的重现性和稳定性，可以用于实时监测体内多巴胺浓度水平。
2. 本发明所述的生物传感器具有较强的抗干扰能力。
3. 本发明所述的生物传感器具有更好的电化学传感性能，实现了高灵敏度和低检测线。这应该归功于MnO2和RBC之间的协同效应，因此在电化学传感技术领域有广阔的应用前景。
附图说明
图1是RBC@MnO2复合生物材料的FESEM图。
图2是RBC@MnO2复合生物材料的XRD图。
图3是RBC@MnO2复合生物材料的EDS元素分布图。
图4是RBC@MnO2复合生物材料修饰工作电极在0.1 M PBS（pH=7.4）缓冲液中不同浓度的多巴胺DPV响应（a）以及对应的线性曲线图（b）。
图5是RBC@MnO2复合生物材料修饰工作电极对DA的选择性。
图6中（a）是一支RBC@MnO2复合生物材料修饰工作电极在含有100 μM DA的0.1 MPBS缓冲溶液中间隔一定时间多次DPV测试对应的电流响应柱状图；（b）是五支RBC@MnO2复合生物材料修饰工作电极对相同浓度DA 的电流响应柱状图。
图7是RBC@MnO2复合生物材料修饰工作电极长期稳定性测试柱状图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1
碳布电极的预处理
将商用碳布（CC）依次在丙酮和乙醇中超声处理30 min，自然晾干后，再将碳布浸入浓硫酸和浓硝酸的混合酸溶液中（浓硫酸：浓硝酸=3:1，v/v）处理24 h，随后将碳布上的混合酸用去离子水反复多次冲洗直至中性，干燥后即得到表面预处理的碳布。
制备RBC@MnO2复合生物材料
从猪血全血中离心去除上层血浆并用生理盐水洗涤三次得到压积红细胞，再用4wt% 戊二醛溶液固定红细胞，随后依次用生理盐水和去离子水离心洗涤多次得到压积红细胞A；将0.0198 g四水合氯化锰溶于10 mL生理盐水中得到溶液B；将压积红细胞A悬浮分散于溶液B中，再逐滴加入100 μL浓度为10 mM氢氧化钠溶液，然后将混合体系置于摇床上反应 5 min，之后通过离心洗涤除去未反应的MnO2前驱体；最后将离心产物悬浮分散于生理盐水中得到修饰溶液，于4℃保存备用。
图1是本实施例制得的RBC@MnO2复合生物材料的FESEM图，从图中可以看出RBC@MnO2呈现双凹圆盘形，其表面比较粗糙，每个细胞表面都均匀覆盖一层连续的纳米片，表明MnO2保护壳在红细胞表面成功形成。图2是本实施例制得的RBC@MnO2 复合生物材料的XRD谱图，它与纯MnO2的衍射峰一致，表明红细胞外纳米片的成分为MnO2。图3是本实施例制得的RBC@MnO2 复合生物材料的EDS元素分布图，从图中可以看出，每个细胞表面的Mn、O和C元素的分布是均匀的，这表明在每个细胞表面都形成了连续的MnO2保护壳。
制备RBC@MnO2复合生物材料修饰的工作电极
将30 μL 3% 比容的修饰溶液滴加到碳布电极表面，室温下自然晾干后即得到基于RBC@MnO2复合生物材料修饰的工作电极。
电化学测试
将上述得到的基于RBC@MnO2复合生物材料修饰的工作电极与对电极、参比电极组成三电极体系（铂片为对电极，Ag/AgCl为参比电极），然后在室温条件下进行电化学测试，电解液为0.1 M的磷酸盐缓冲溶液，测试之前先通N2 30 min，然后采用差分脉冲伏安法（DPV），进行测试。测试过程中，待稳定后滴加不同浓度的多巴胺溶液。
图4是本实施例制得的RBC@MnO2修饰工作电极在0.1 M PBS（pH=7.4）缓冲液中不同浓度多巴胺的DPV响应以及对应的线性曲线图，从图中可以看出，在2～12 μM范围内，多巴胺（DA）电流的响应随DA浓度的增加而线性增加，回归方程为I=0.00513CDA+0.04445(R2=0.9973)，使用检测限计算公式LOD=3S/b（其中S代表空白的标准偏差，b是浓度对峰值电流的线性方程的斜率）计算得到的检测下限（LOD）约为13 nM。
图5是本实施例制得的RBC@MnO2复合生物材料修饰工作电极对多巴胺的选择性，这是通过在含有100 μM DA的PBS缓冲液中添加KCl、NaCl、K2CO3、AA、L-Cys、Glu、GSH、Sucrose来进行的，电化学测试结果表明，这些物质不会对DA的测定造成明显的干扰，表明RBC@MnO2生物传感器对DA具有良好的选择性和抗干扰能力。
图6是本实施例制得的RBC@MnO2复合生物材料修饰工作电极的重现性测定。图6（a）是同一支RBC@MnO2复合生物材料修饰的工作电极在含有100 μM DA的0.1 M磷酸盐缓冲溶液中间隔一定的时间多次DPV测试所对应的电流响应柱状图。从图中可以看出，峰值电流强度没有发生明显的变化，通过8次测定结果计算出的相对标准偏差（RSD）仅为0.92%。图6（b）是平行制备的5支RBC@MnO2复合生物材料修饰的工作电极，在含有100 μM DA的0.1 M磷酸盐缓冲溶液中所做DPV测试取稳态电流值所做的电流响应柱状图，从图中可以看出响应电流值基本相同，5次电流值计算的相对标准偏差（RSD）仅为3.15%。综上两种测试表明RBC@MnO2复合生物材料修饰的工作电极对DA的检测具有良好的重现性。
图7是本实施例制得的RBC@MnO2复合生物材料修饰的工作电极每天的电流响应值I与第一天的电流响应值I0做比值所做的柱状图，从图中可以看出工作电极经过5天测试后，依然能保持第一天电流响应值的95.3%，表明RBC@MnO2复合生物材料修饰的工作电极对DA的检测具有良好的稳定性。
实施例2
碳布电极的预处理，其具体步骤同实施例1。
制备RBC@MnO2复合生物材料
从羊血全血中离心去除上层血浆并用生理盐水洗涤三次得到压积红细胞，再用4wt% 戊二醛溶液固定红细胞，随后依次用生理盐水和去离子水离心洗涤得到压积红细胞A；将0.0198 g四水合氯化锰溶于10 mL生理盐水中得到溶液B；将压积红细胞A悬浮分散于溶液B中，再逐滴加入100 μL浓度为10 mM氢氧化钠溶液，然后将混合体系置于摇床上反应 5min，之后通过离心洗涤除去未反应的MnO2前驱体；最后将离心产物悬浮分散于生理盐水中得到修饰溶液，于4℃保存备用。
制备RBC@MnO2复合生物材料修饰的工作电极，其具体步骤同实施例1。
电化学测试，其具体步骤同实施例1，所制备的基于RBC@MnO2复合生物材料的多巴胺生物传感器检出下限为13 nM，且具有良好的选择性、重现性和稳定性。
实施例3
碳布电极的预处理，其具体步骤同实施例1。
制备RBC@MnO2复合生物材料
从兔血全血中离心去除上层血浆并用生理盐水洗涤三次得到压积红细胞，再用4wt% 戊二醛溶液固定红细胞，随后依次用生理盐水和去离子水离心洗涤得到压积红细胞A；将0.0198 g四水合氯化锰溶于10 mL生理盐水中得到溶液B；将压积红细胞A悬浮分散于溶液B中，再逐滴加入100 μL浓度为10 mM氢氧化钠溶液，然后将混合体系置于摇床上反应 5min，之后通过离心洗涤除去未反应的MnO2前驱体；最后将离心产物悬浮分散于生理盐水中得到修饰溶液，于4℃保存备用。
制备RBC@MnO2复合生物材料修饰的工作电极，其具体步骤同实施例1。
电化学测试，其具体步骤同实施例1，所制备的基于RBC@MnO2复合生物材料的多巴胺生物传感器检出限为13 nM，且具有良好的选择性、重现性和稳定性。
实施例4
碳布电极的预处理，其具体步骤同实施例1。
制备RBC@MnO2复合生物材料
从牛血全血中离心去除上层血浆并用生理盐水洗涤三次得到压积红细胞，再用4wt% 戊二醛溶液固定红细胞，随后依次用生理盐水和去离子水离心洗涤得到压积红细胞A；将0.0198 g四水合氯化锰溶于10 mL生理盐水中得到溶液B；将压积红细胞A悬浮分散于溶液B中，再逐滴加入100 μL浓度为10 mM氢氧化钠溶液，然后将混合体系置于摇床上反应 5min，之后通过离心洗涤除去未反应的MnO2前驱体；最后将离心产物悬浮分散于生理盐水中得到修饰溶液，于4℃保存备用。
制备RBC@MnO2复合生物材料修饰的工作电极，其具体步骤同实施例1。
电化学测试，其具体步骤同实施例1，所制备的基于RBC@MnO2复合生物材料的多巴胺生物传感器检出限为13 nM，且具有良好的选择性、重现性和稳定性。
实施例5
碳布电极的预处理，其具体步骤同实施例1。
制备RBC@MnO2复合生物材料
从人血全血中离心去除上层血浆并用生理盐水洗涤三次得到压积红细胞，再用4wt% 戊二醛溶液固定红细胞，随后依次用生理盐水和去离子水离心洗涤得到压积红细胞A；将0.0198 g四水合氯化锰溶于10 mL生理盐水中得到溶液B；将压积红细胞A悬浮分散于溶液B中，再逐滴加入100 μL浓度为10 mM 氢氧化钠溶液，然后将混合体系置于摇床上反应 5min，之后通过离心洗涤除去未反应的MnO2前驱体；最后将离心产物悬浮分散于生理盐水中得到修饰溶液，于4℃保存备用。
制备RBC@MnO2复合生物材料修饰的工作电极，其具体步骤同实施例1。
电化学测试，其具体步骤同实施例1，所制备的基于RBC@MnO2复合生物材料的多巴胺生物传感器检出限为13 nM，且具有良好的选择性、重现性和稳定性。
以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。

Claims (5)

1.一种基于红细胞生物传感器的制备方法，其特征在于：以红细胞为基质，通过原位合成法在红细胞表面构筑一层功能纳米涂层，从而得到基于红细胞的复合生物材料；所述生物传感器由参比电极、对电极及复合生物材料修饰后的工作电极组成，其中修饰后的工作电极由碳布和生物相容性好的RBC@MnO2复合生物材料组成，其具体制备过程为：
步骤S1：将基底电极进行表面预处理；
步骤S2：从动物血或人血中离心去除上层血浆并用生理盐水洗涤多次得到压积红细胞，再用4 wt%戊二醛溶液固定红细胞，随后依次用生理盐水和去离子水离心洗涤得到压积红细胞A；
步骤S3：在室温条件下，将四水合氯化锰溶于生理盐水溶液中得到溶液B；
步骤S4：在室温条件下，将步骤S2得到的压积红细胞A悬浮分散于步骤S3得到的溶液B中，再逐滴加入氢氧化钠溶液，然后将混合体系摇匀反应，再用去离子水离心洗涤两次，最后将离心产物悬浮分散于生理盐水溶液中得到修饰溶液；
步骤S5：将步骤S4得到的修饰溶液滴加到步骤S1预处理后的基底电极表面，室温晾干后即得到基于RBC@MnO2复合生物材料修饰的工作电极。
2.根据权利要求1所述的一种基于红细胞生物传感器的制备方法，其特征在于步骤S1中所述基底电极为碳布，其预处理过程为：将碳布依次在丙酮和乙醇中超声30 min，干燥后，再将碳布浸入浓硫酸和浓硝酸的混合酸溶液中处理24 h，然后用去离子水反复冲洗碳布直至中性，干燥后即得到表面预处理的碳布电极。
3.根据权利要求1所述的一种基于红细胞生物传感器的制备方法与应用，其特征在于步骤S2中所述动物血为猪血、羊血、兔血或牛血。
4.根据权利要求1所述的一种基于红细胞生物传感器的制备方法与应用，其特征在于步骤S2-S4的具体过程为：将3 mL 3%比容的固定RBC水洗得到压积红细胞A；将0.0198 g四水合氯化锰溶于10 mL生理盐水溶液中得到溶液B；将压积红细胞A悬浮分散于溶液B中，再逐滴加入100 μL浓度为10 mM的氢氧化钠溶液，然后将混合体系置于摇床上反应，反应结束后，通过离心收集RBC@MnO2并洗涤去除未反应的MnO2前驱体，最后将离心产物悬浮分散于生理盐水溶液中得到修饰溶液，于4 ℃ 保存备用；将30 μL 3%比容的修饰溶液滴加到碳布电极表面，室温下自然晾干即得基于RBC@MnO2复合生物材料修饰的工作电极。
5.根据权利要求1所述的一种基于红细胞生物传感器的制备方法与应用，其特征在于：所述基于RBC@MnO2复合生物材料的生物传感器在多巴胺（DA）检测中的应用；采用标准的三电极体系进行多巴胺浓度检测，即以RBC@MnO2复合生物材料修饰的碳布电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂片为对电极，电解液为0.1 M、pH=7.4的PBS缓冲液，所有电化学测试均是在氮气饱和的PBS缓冲液中进行。
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基于RuO_2/RGO纳米复合材料的多巴胺电化学生物传感器;谢丽峰;郭春瑞;周晶晶;朱佩佩;缪谦;;辽宁化工(第07期);全文 *

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