CN103175879A - 基于纳米金和促红细胞生成素受体修饰的电极及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于纳米金和促红细胞生成素受体修饰的电极,具体是在沉积纳米金的电极表面通过ZnO溶胶-凝胶固定促红细胞生成素受体作为识别元件,再在电极表面沉积纳米金的玻碳电极;该电极的制备方法简单、性能稳定;以该电极为工作电极、铂电极为对电极、饱和甘汞电极为参比电极、含有2mmol/LK3[Fe(CN)6]-K4[Fe(CN)6]的磷酸盐缓冲液为测试底液组建电化学生物传感器,可以快速、特异、灵敏地检测促红细胞生成素(EPO)和/或重组人促红细胞生成素(rhEPO),特别适用于极低浓度EPO或rhEPO的检测,而且适用于体育竞技中对兴奋剂rhEPO的检测。
Description
技术领域
本发明属于电化学检测技术领域,涉及基于纳米金和促红细胞生成素受体修饰的电极及其制备方法,还涉及以修饰的电极作为工作电极组建的电化学生物传感器及其检测方法。
背景技术
促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)是一种糖蛋白激素,在人体内主要是由肾脏生成的一种造血生长因子,其生理功能是促进骨髓红细胞的生成和释放。1985年人类首次利用基因工程技术合成了重组人促红细胞生成素(Recombinant human erythropoietin,rhEPO),由于其具有分裂原和分化原的双重功能,能在不输血的情况下产生输血效应,使病人避免病毒感染和输血过量的危险,已在肾性贫血的治疗方面发挥出重要作用。同时,因其具有提高机体携氧能力、增强运动耐力的特性,rhEPO在体育运动中成为新的兴奋剂。2005年起,国际奥委会和世界反兴奋剂机构的禁用清单中,rhEPO被列为体育竞技中禁用的首个肽类物质。
由于rhEPO和EPO结构相似,功能一致,从而很难精确区分EPO与rhEPO,造成rhEPO在体育竞赛中的滥用。rhEPO和EPO唯一差别仅在于等电点不同,EPO的等电点为3.7~4.7,rhEPO的等电点为4.4~5.1。现有检测方法如等电聚焦、凝胶电泳等方法存在实验分离时间长、检测效率低、特异性差等缺点,不能满足快速、精确检测的要求。公开号为CN102854231A的中国专利公开了将促红细胞生成素受体通过ZnO溶胶-凝胶过固定在电极表面,然后将该电极能够组建成精确检测EPO和rhEPO的电化学生物传感器。但是制备的生物传感器在检测低浓度样品时,由于循环伏安曲线的峰电流值变化较小,检测的灵敏度较低。因此,急需研究一种能进一步提高检测EPO和rhEPO的灵敏度的方法及检测工具,对遏制rhEPO在体育竞赛中的滥用具有重要意义。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供基于纳米金和促红细胞生成素受体修饰的电极;本发明的目的之二在于提供基于纳米金和促红细胞生成素受体修饰的电极的制备方法;本发明的目的之三在于提供以修饰的电极作为工作电极组建的电化学生物传感器;本发明的目的之四在于提供利用电化学生物传感器检测促红细胞生成素和/或重组人促红细胞生成素的方法。
为达到上述目的,本发明提供如下技术方案:
1.基于纳米金和促红细胞生成素受体修饰的电极,所述电极是在沉积纳米金的电极表面通过ZnO溶胶-凝胶固定促红细胞生成素受体作为识别元件,再在电极表面沉积纳米金的玻碳电极。
2.所述基于纳米金和促红细胞生成素受体修饰的电极的制备方法,包括如下步骤:
a.将玻碳电极表面打磨,抛光,清洁,干燥,得预处理玻碳电极,备用;
b.将步骤a所得预处理玻碳电极浸入HAuCl4溶液中,电沉积,清洗,得沉积纳米金的玻碳电极,备用;
c.将乙酸锌溶于无水乙醇中,再在超声波作用下加入氢氧化锂,得ZnO溶胶-凝胶溶液,备用;
d.将步骤c所得ZnO溶胶-凝胶溶液与促红细胞生成素受体溶液混匀,滴加至步骤b所得沉积纳米金的玻碳电极表面,干燥成膜,洗涤,即制得促红细胞生成素受体修饰电极;
e.将步骤d所得促红细胞生成素受体修饰电极再次浸入HAuCl4 溶液中,电沉积,清洗,最后浸入BSA溶液中封闭非特异性位点,得纳米金和促红细胞生成素受体修饰的电极。
优选的,所述步骤a是用均相砂纸打磨玻碳电极,然后依次用加有0.3μm和0.05μm三氧化二铝的湿润抛光纸抛光,每次抛光后用水洗净,再依次于硝酸、丙酮和水中超声洗涤,干燥备用。
优选的,所述步骤b是将步骤a所得预处理玻碳电极浸入浓度为1-20 mmol/L的HAuCl4溶液中,电沉积20-100秒,然后用水清洗,备用。
更优选的,所述步骤b是将步骤a所得预处理玻碳电极浸入浓度为10 mmol/L的HAuCl4溶液中,电沉积60秒,然后用水清洗,备用。为了使电沉积效果更佳,使用恒电位进行电沉积,恒电位优选为0.6V。
优选的,所述步骤c是将乙酸锌溶于无水乙醇中制成浓度为0.1mol/L的溶液,再在超声波作用下加入氢氧化锂至终浓度为0.067mol/L,制得ZnO溶胶-凝胶贮备液,临用前用无水乙醇按体积比为2:1~1:3进行稀释,制得ZnO溶胶-凝胶溶液。
更优选的,临用前用无水乙醇按体积比为1:2进行稀释,制得ZnO溶胶-凝胶溶液。
优选的,所述步骤d是将步骤c所得的ZnO溶胶-凝胶溶液与浓度为10ng/L~100μg/L的促红细胞生成素受体溶液按照体积比为4:1~1:1.15混合均匀,再将混合液滴加在步骤b所得沉积纳米金的玻碳电极表面,空气中干燥,用磷酸盐缓冲液充分洗涤,制得促红细胞生成素受体修饰电极。
更优选的,所述步骤d是将步骤c所得的ZnO溶胶-凝胶溶液与浓度为1μg/L的促红细胞生成素受体溶液按照体积比为1:1混合均匀,再将混合液滴加在步骤b所得沉积纳米金的玻碳电极表面,空气中干燥,用磷酸盐缓冲液充分洗涤,制得促红细胞生成素受体修饰电极。
优选的,所述步骤e是将步骤d所得促红细胞生成素受体修饰电极再次浸入浓度为1-20mmol/L的HAuCl4 溶液中,电沉积10-50秒,清洗,最后浸入质量分数为2.5% 的BSA溶液中1小时,封闭非特异性位点,得纳米金和促红细胞生成素受体修饰的电极。
更优选的,所述步骤e是将步骤d所得促红细胞生成素受体修饰电极再次浸入浓度为10mmol/L的HAuCl4 溶液中,电沉积30秒,清洗,最后浸入质量分数为2.5% 的BSA溶液中1小时,封闭非特异性位点,得纳米金和促红细胞生成素受体修饰的电极。
3.促红细胞生成素和重组人促红细胞生成素电化学生物传感器,包括工作电极、对电极、参比电极和测试底液;所述工作电极为所述的纳米金和促红细胞生成素受体修饰的电极,对电极为铂电极,参比电极为饱和甘汞电极;所述测试底液为含有2mmol/L K3[Fe(CN)6]和2mmol/L K4[Fe(CN)6]且pH为6.2~9.0的磷酸盐缓冲液。
4. 利用所述的电化学生物传感器检测促红细胞生成素和/或重组人促红细胞生成素的方法,将纳米金和促红细胞生成素受体修饰电极与样品溶液共孵育20分钟以上,然后以纳米金和促红细胞生成素受体修饰电极为工作电极、铂电极为对电极、饱和甘汞电极为参比电极、含有2mmol/L K3[Fe(CN)6]和2mmol/L K4[Fe(CN)6]且pH为6.2~9.0的磷酸盐缓冲液为测试底液构建电化学生物传感器,采用循环伏安法进行扫描测定,电位扫描范围为-0.3V~0.7V,电位扫描速率为10mv/s ~100mv/s,根据电位0.14V~0.17V处的峰电流和促红细胞生成素标准曲线计算样品溶液中促红细胞生成素的浓度,和/或根据电位0.06V~0.09V处的峰电流和重组人促红细胞生成素标准曲线计算样品溶液中重组人促红细胞生成素的浓度。
本发明的有益效果在于:本发明公开了基于纳米金和促红细胞生成素受体修饰的电极,通过在玻碳电极表面沉积纳米金,由于ZnO溶胶-凝胶和纳米金之间具有很高的亲和性,为ZnO溶胶-凝胶固定EPOR提供了良好的生物学环境,而ZnO溶胶-凝胶具有很大的比表面积,为纳米金的第二次电沉积提供良好的生物兼容界面,最终使电极表面的EPOR的固载量成倍增加,能够提高EPOR-EPO/rhEPO复合物的数量,增加其峰电流值,从而提高检测极低浓度促红细胞生成素和/或重组人促红细胞生成素的灵敏度,对EPO/rhEPO的检出限均为0.1pg/L。
以制得基于纳米金和促红细胞生成素受体修饰的电极创建rhEPO/EPO电化学生物传感器,能够成倍放大检测信号,与未经纳米金修饰电极构建的电化学生物传感器相比,检测信号能放大约三倍,因此能够用于实现极低浓度rhEPO/EPO的灵敏检测。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚,本发明提供如下附图进行说明:
图1为第一次纳米金电沉积时间对玻碳电极峰电流的影响。
图2为第二次纳米金电沉积时间对玻碳电极峰电流的影响。
图3为HAuCl4浓度对玻碳电极峰电流的影响。
图4为ZnO溶胶-凝胶贮备液与无水乙醇的稀释比对纳米金和EPOR修饰电极电流响应的影响。
图5为ZnO溶胶-凝胶溶液与EPOR溶液的体积比对纳米金和EPOR修饰电极电流响应的影响。
图6为EPOR溶液浓度对纳米金和EPOR修饰电极电流响应的影响。
图7为纳米金和EPOR修饰的电极制备过程用循环伏安法(Cyclic Voltammetry,CV)表征的CV曲线图。
图8为EPOR修饰的电极(未经纳米金修饰)检测rhEPO/EPO的CV曲线图。
图9为纳米金和EPOR修饰电极与未经纳米金修饰的电极(EPOR修饰电极)检测rhEPO/EPO峰电流差值结果比较图(1:纳米金和EPOR修饰电极检测EPO;2:EPOR修饰电极检测EPO;3:纳米金和EPOR修饰电极检测rhEPO;4:EPOR修饰电极检测rhEPO)。
图10为测试底液的pH值对EPO和rhEPO纳米金电化学生物传感器电流响应的影响。
图11为工作电极在样品溶液中的孵育时间对EPO和rhEPO纳米金电化学生物传感器电流响应的影响。
图12为循环伏安法扫描电位对rhEPO/EPO纳米金电化学生物传感器电流响应的影响。
图13为纳米金和EPOR修饰电极在最佳条件下检测rhEPO/EPO获得的标准曲线(A:检测rhEPO获得的标准曲线;B:检测EPO获得的标准曲线)。
具体实施方式
下面将结合附图,对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例中使用的主要仪器与试剂来源如下:CHI760D型电化学工作站购自上海辰华仪器有限公司;KQ-5200B型超声器清洗器购自江苏省昆山市超声仪器有限公司;ZD-2自动电位滴定仪购自上海精科雷磁有限公司;一水氢氧化锂(LiOH·H2O)、二水乙酸锌(Zn(Ac)2·2H2O)购自上海生物生工有限公司;无水乙醇、硝酸、丙酮购自重庆川东集团有限公司化学试剂厂;铁氰化钾、亚铁氰化钾购自重庆东方试剂厂,玻碳电极、饱和甘汞电极、铂电极和0.3μm、0.05μm Al2O3粉末购自天津艾达恒昊科技发展有限公司;PBS粉末购自北京中杉金桥生物技术有限公司;EPO和EPOR购自美国Novus Biologicals公司;rhEPO标准品购自美国Abnova公司;氯金酸(HAuCl4)购自百灵威公司;牛血清白蛋白购自Sigma公司。
一、纳米金和促红细胞生成素受体修饰电极的制备方法及参数优化
纳米金和促红细胞生成素受体修饰电极的制备方法,包括如下步骤:
a.用润湿的均相砂纸打磨玻碳电极,然后依次用加有0.3μm和0.05μm Al2O3的润湿抛光纸抛光打磨,每次打磨后用超纯水洗净,再依次于硝酸、丙酮和超纯水中超声洗涤5分钟,得预处理玻碳电极,干燥备用;
b. 将步骤a所得预处理玻碳电极浸入浓度为10mmol/L的HAuCl4溶液中,在恒电位0.6V条件下电沉积60秒,然后用超纯水清洗后,得沉积纳米金的玻碳电极,保存备用;
c.将Zn(Ac)2·2H2O 2.20g(0.01mol)溶于100mL无水乙醇中,再在超声波作用下缓慢加入LiOH·H2O 0.28g(6.7mmol),制得ZnO溶胶-凝胶贮备液,4℃保存备用,使用时按照ZnO溶胶-凝胶贮备液与无水乙醇的体积比为1:2加入无水乙醇稀释,制得ZnO溶胶-凝胶溶液;
d.将浓度为1μg/L的EPOR溶液与步骤c制备的ZnO溶胶-凝胶溶液按体积比为1:1混合,然后取20μL含EPOR的ZnO溶胶-凝胶溶液加到步骤b所得沉积纳米金的玻碳电极表面,再在4℃冰箱中放置10小时,取出用超纯水清洗后,得促红细胞生成素受体修饰电极;
e.将步骤d所得促红细胞生成素受体修饰电极再次浸入浓度为10mmol/L的HAuCl4 溶液中,在恒电位0.6V条件下电沉积30秒,然后用超纯水清洗,最后将电极在4℃条件下浸入质量分数为2.5% BSA溶液中1小时,封闭非特异性位点,得纳米金和促红细胞生成素受体修饰的电极,将修饰好的电极悬置于PBS 溶液(pH7.4,0.05mol/L)中,4 ℃下储存,备用。
本发明在研究过程中对影响纳米金和促红细胞生成素受体修饰的电极电流响应的主要参数进行了优化。
以不同参数制备的纳米金修饰促红细胞生成素受体修饰的电极为工作电极、饱和甘汞电极作为参比电极、铂电极作为对电极组建电化学生物传感器检测系统,以含有2mmol/L K3[Fe(CN)6]-K4[Fe(CN)6]的PBS溶液(pH7.4,0.05mol/L)作为测试底液,在室温下采用循环伏安法进行扫描测定,电位扫描范围为-0.3V~0.7V,电位扫描速率为50mv/s。在电化学生物传感器检测过程中,以纳米金和促红细胞生成素受体修饰的电极测定的初始峰电流记为I 0;当EPOR-rhEPO/EPO杂交反应完成后,其检测峰电流记为I;则峰电流变化ΔI=I-I 0。本文以此为依据对待测样本中的rhEPO和EPO进行检测,其中ΔI 值越大,表明EPOR与rhEPO或EPO结合的量越多。
1、第一次纳米金电沉积时间的优化
将玻碳电极置于浓度为10 mmol/L的HAuCl4溶液中,在恒电位0.6V条件下分别电沉积20秒、40秒、60秒、80秒、100秒,之后清洗电极并将电极分别置于含有2mmol/L K3[Fe(CN)6]-K4[Fe(CN)6]的PBS溶液(pH7.4,0.05mol/L)中检测各自的CV曲线(图1)。结果显示,在电沉积20-100秒时传感器的峰电流值较大,但在60秒条件下峰电流值最大。并且电沉积时间从20秒增加到60秒时,随着电沉积时间的增大,传感器的峰电流值也逐渐增大,而电沉积时间从60秒增加到100秒时,随着电沉积时间增大,传感器的峰电流值却逐渐减小。其原因是HAuCl4沉积时间是影响纳米金厚度与数量的重要因素,在一定时间范围内,电沉积时间越长,HAuCl4还原生成的纳米金越多,电极表面沉积的纳米金越厚,峰电流值越大,放大效率越高。然而如果电沉积时间太长,则会阻碍电子传递。因此,第一次纳米金电沉积时间优选为20-100秒,更优选为60秒。
2、第二次纳米金电沉积时间的优化
将EPOR修饰电极置于10 mmol/L浓度的HAuCl4溶液中,在恒电位0.6V条件下分别电沉积10秒、20秒、30秒、40秒、50秒,然后清洗电极并将电极分别置于含有2mmol/L K3[Fe(CN)6]-K4[Fe(CN)6]的PBS溶液(pH7.4,0.05mol/L)中检测各自的CV曲线(图2)。结果显示,电沉积时间从10秒增加到30秒,传感器的峰电流值也随之逐渐增大;当电沉积时间从30秒增加到50秒,传感器峰电流值逐步下降,因此电沉积时间为30秒时其峰电流值最大。其原因是第二次电沉积HAuCl4后,电极表面所形成的是“三明治”式修饰层,纳米金的厚度对受体与待测样品的反应起着至关重要的作用。如果沉积时间较短,所形成纳米金层较薄,则不利于受体与待测样品发生反应;若电沉积时间较长,所形成的纳米金层较厚,则不利于电子传递。因此,第二次纳米金电沉积时间优选为10-50秒,最优选为30秒。
3、纳米金浓度的优化
将玻碳电极分别置于浓度为1mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、15 mmol/L、20 mmol/L的HAuCl4溶液中,在恒电位0.6V条件下第一次电沉积60秒,第二次电沉积30秒,然后清洗电极并将电极分别置于含有2mmol/L K3[Fe(CN)6]-K4[Fe(CN)6]的PBS溶液(pH7.4,0.05mol/L)中检测各自的峰电流值(图3)。结果显示,随着HAuCl4溶液浓度逐渐增大,传感器的峰电流先增大后减小,其中在10 mmol/L浓度的HAuCl4溶液中沉积的传感器峰电流最大,而其他浓度的HAuCl4溶液中沉积的传感器峰电流值均较小。原因是电极表面的纳米金厚度及数量与被还原的HAuCl4浓度有关,纳米金可以有效增大电极比表面积和受体固定量,在一定浓度范围内,HAuCl4的浓度越大,所生成的纳米金厚度越厚,数量越多,越有利于电子传递及放大生物反应信号;但若超出这个浓度范围,生成的纳米金厚度增加而阻碍了电子传递,并且电极表面纳米金太密集反而不利于受体的固定。因此,电沉积的纳米金优选HAuCl4浓度为1-20mmol/L,更优选的,HAuCl4的浓度为10 mmol/L。
同时ZnO溶胶-凝胶贮备液与无水乙醇的稀释比、ZnO溶胶-凝胶溶液与EPOR溶液的体积比、EPOR溶液的浓度都会影响纳米金和EPOR修饰电极的电流响应。通过优化可知,ZnO溶胶-凝胶贮备液与无水乙醇的稀释比优选为2:1~1:3,更优选为1:2(图4);ZnO溶胶-凝胶溶液与EPOR溶液的体积比优选为4:1~1:1.15,更优选为1:1(图5);EPOR溶液的浓度优选为10ng/L~100μg/L,更优选为1μg/L(图6)。
二、纳米金和促红细胞生成素受体修饰的电极制备过程中峰电流的变化
本发明研究了制备过程中电极的峰电流变化,用循环伏安法测定的CV曲线表征。按上述条件用循环伏安法分别测定玻碳电极、沉积纳米金的玻碳电极、促红细胞生成素受体修饰沉积纳米金的玻碳电极、第二次沉积纳米金的玻碳电极、纳米金和促红细胞生成素受体修饰的电极、纳米金和促红细胞生成素受体修饰的电极杂交rhEPO/EPO后峰电流变化,并根据峰电流变化绘制CV曲线(图7)。如图7所示,与玻碳电极得到CV曲线相比,沉积纳米金后,峰电流明显增大,而EPOR修饰沉积纳米金后,峰电流有所下降;第二次电沉积纳米金后,峰电流大幅增加;但是将第二次电沉积的玻碳电极用BSA封闭后,峰电流值有所减小,最后用制备的纳米金和促红细胞生成素受体修饰的电极杂交rhEPO或EPO,其峰电流进一步下降。产生上述现象的原因是当玻碳电极第一次电沉积纳米金后,纳米金可以促进电极表面的电子传递,因此传感器的峰电流增大;在沉积纳米金修饰电极上通过ZnO溶胶-凝胶固定EPOR后,由于电极表面形成的凝胶薄膜和EPOR在一定程度上阻碍了电极表面的电子传输,因此峰电流值减小;在电极表面第二次电沉积纳米金后,由于更多的纳米金进一步增大了电极比表面积,更有利于电子传递,故检测到传感器峰电流值增加;第二次电沉积纳米金电极用BSA封闭后,BSA蛋白封闭了非特异性吸附位点,同时又阻碍了电子的传输,因此传感器的峰电流值有所减小;最后,用制得的纳米金修饰促红细胞生成素受体修饰电极分别在含有rhEPO或EPO的待测样品中孵育20 分钟后,由于电极表面生成的蛋白质大分子EPOR-rhEPO/EPO复合物严重阻碍了电极表面的电子传输,因此传感器的峰电流进一步下降。
同时用未经纳米金修饰的电极作为对照(即公告号为102854231A的中国专利制备促红细胞生成素受体修饰电极),分别放入含有rhEPO或EPO的待测样品中检测,结果如图8所示。结果显示,促红细胞生成素受体修饰电极的电极峰电流值最大,而与rhEPO/EPO杂交后,峰电流值有所减小,可能是在电极表面形成的EPOR-rhEPO/EPO复合物在一定程度上阻碍了电极表面的电子传输。将本发明制备的纳米金和促红细胞生成素受体修饰电极与未经纳米金修饰的电极检测rhEPO和EPO,检测结果显示本发明制备的修饰电极的峰电流变化值放大了约3倍(图9)。因此,经纳米金修饰后电极的灵敏度高于未经纳米金修饰的电极。
三、rhEPO和/或EPO纳米金电化学生物传感器的构建及参数优化
将纳米金和促红细胞生成素受体修饰的电极与样品溶液孵育20分钟,然后以纳米金和促红细胞生成素受体修饰的电极为工作电极、饱和甘汞电极为参比电极、铂电极为对电极构建EPO和rhEPO电化学生物传感器,以含有2mmol/L K3[Fe(CN)6]-K4[Fe(CN)6]的PBS溶液(pH7.4,0.05mol/L)为测试底液,在室温下采用循环伏安法进行扫描测定,电位扫描范围为-0.3V~0.7V,电位扫描速率为50mv/s。
本发明在研究过程中对影响rhEPO和EPO纳米金电化学生物传感器电流响应的主要参数也进行了优化。结果显示,测试底液的pH值为6.2~9.0时传感器的峰电流较大,pH值为7.4时传感器的峰电流最大(图10)。因此,测试底液的pH值优选为6.2~9.0,更优选为7.4;纳米金和促红细胞生成素受体修饰的电极与500ng/L EPO或rhEPO标准品溶液的孵育时间从5分钟增加至20分钟,传感器的峰电流逐渐降低并达到最小值,之后继续增加孵育时间至40分钟,峰电流基本保持不变,说明20分钟时纳米金EPOR修饰电极上结合的EPO或rhEPO已达到饱和,因此纳米金EPOR修饰电极与样品溶液的孵育时间优选为20分钟以上,更优选为20分钟(图11)。此外,扫描电位的变化对K3[Fe(CN)6]-K4[Fe(CN)6]氧化还原峰的峰电位的影响不大,但对纳米金电化学传感器的电流响应的影响较为明显,在-0.3V~0.7V之间有最好的电流响应(图12)。电位扫描速率影响循环伏安曲线的形状,本发明研究发现,电位扫描速率在10mv/s~100 mv/s范围内都可行,当其为50 mv/s时循环伏安曲线最光滑。
四、rhEPO和EPO纳米金电化学生物传感器的检测性能
在最优实验条件下,使用纳米金修饰的电化学生物传感器检测不同浓度的rhEPO和EPO。实验结果表明,在杂交反应初始阶段,由于大分子EPOR-rhEPO/EPO复合物部分阻塞了电极表面的电子传输通道,与空白对照相比,其氧化还原峰电流值明显降低。随着rhEPO/EPO浓度的不断增加,其峰电流变化(ΔI)也随之增大。从图13A和图13B可以看出,rhEPO/EPO 浓度在0.5 pg/L ~500 ng/L的范围内时,其浓度的对数值与峰电流呈良好的线性关系。其中rhEPO的线性回归方程为:y = 3.7068x + 31.796,相关系数为0.9912;EPO的线性回归方程为:y = 3.4389x + 29.685,相关系数0.9925,二者的检测限均为0.1 pg/L。实验结果表明本发明制备的纳米金和EPOR修饰电极的电化学生物传感器与未经纳米金修饰电极的电化学生物传感器的检测结果相比,具有更宽的线性范围和更低的检出限。
最后说明的是,以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述,但本领域技术人员应当理解,可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变,而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.基于纳米金和促红细胞生成素受体修饰的电极,其特征在于:所述电极是在沉积纳米金的电极表面通过ZnO溶胶-凝胶固定促红细胞生成素受体作为识别元件,再在电极表面沉积纳米金的玻碳电极。
2.权利要求1所述基于纳米金和促红细胞生成素受体修饰的电极的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
a.将玻碳电极表面打磨,抛光,清洁,干燥,得预处理玻碳电极,备用;
b.将步骤a所得预处理玻碳电极浸入HAuCl4溶液中,电沉积,清洗,得沉积纳米金的玻碳电极,备用;
c.将乙酸锌溶于无水乙醇中,再在超声波作用下加入氢氧化锂,得ZnO溶胶-凝胶溶液,备用;
d.将步骤c所得ZnO溶胶-凝胶溶液与促红细胞生成素受体溶液混匀,滴加至步骤b所得沉积纳米金的玻碳电极表面,干燥成膜,洗涤,即制得促红细胞生成素受体修饰电极;
e.将步骤d所得促红细胞生成素受体修饰电极再次浸入HAuCl4 溶液中,电沉积,清洗,最后浸入BSA溶液中封闭非特异性位点,得纳米金和促红细胞生成素受体修饰的电极。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:所述步骤a是用均相砂纸打磨玻碳电极,然后依次用加有0.3μm和0.05μm三氧化二铝的湿润抛光纸抛光,每次抛光后用水洗净,再依次于硝酸、丙酮和水中超声洗涤,干燥备用。
4.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:所述步骤b是将步骤a所得预处理玻碳电极浸入浓度为1-20mmol/L的HAuCl4溶液中,电沉积20-100秒,然后用水清洗,备用。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于:所述步骤b是将步骤a所得预处理玻碳电极浸入浓度为10mmol/L的HAuCl4溶液中,电沉积60秒,然后用水清洗,备用。
6.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:所述步骤c是将乙酸锌溶于无水乙醇中制成浓度为0.1mol/L的溶液,再在超声波作用下加入氢氧化锂至终浓度为0.067mol/L,制得ZnO溶胶-凝胶贮备液,临用前用无水乙醇按体积比为2:1~1:3进行稀释,制得ZnO溶胶-凝胶溶液。
7.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:所述步骤d是将步骤c所得的ZnO溶胶-凝胶溶液与浓度为10ng/L~100μg/L的促红细胞生成素受体溶液按照体积比为4:1~1:1.15混合均匀,再将混合液滴加在步骤b所得沉积纳米金的玻碳电极表面,空气中干燥,用磷酸盐缓冲液充分洗涤,制得促红细胞生成素受体修饰电极。
8.根据权利要求2-7任一项所述的制备方法,其特征在于:所述步骤e是将步骤d所得促红细胞生成素受体修饰电极再次浸入浓度为1-20mmol/L的HAuCl4 溶液中,电沉积10-50秒,清洗,最后浸入质量分数为2.5% 的BSA溶液中1小时,封闭非特异性位点,得纳米金和促红细胞生成素受体修饰的电极。
9.促红细胞生成素和重组人促红细胞生成素电化学生物传感器,其特征在于:包括工作电极、对电极、参比电极和测试底液;所述工作电极为权利要求1所述的纳米金和促红细胞生成素受体修饰的电极,对电极为铂电极,参比电极为饱和甘汞电极;所述测试底液为含有2mmol/L K3[Fe(CN)6]和2mmol/L K4[Fe(CN)6]且pH为6.2~9.0的磷酸盐缓冲液。
10.利用权利要求9所述的电化学生物传感器检测促红细胞生成素和/或重组人促红细胞生成素的方法,其特征在于,将纳米金和促红细胞生成素受体修饰电极与样品溶液共孵育20分钟以上,然后以纳米金和促红细胞生成素受体修饰电极为工作电极、铂电极为对电极、饱和甘汞电极为参比电极、含有2mmol/L K3[Fe(CN)6]和2mmol/L K4[Fe(CN)6]且pH为6.2~9.0的磷酸盐缓冲液为测试底液构建电化学生物传感器,采用循环伏安法进行扫描测定,电位扫描范围为-0.3V~0.7V,电位扫描速率为10 mv/s ~100mv/s,根据电位0.14V~0.17V处的峰电流和促红细胞生成素标准曲线计算样品溶液中促红细胞生成素的浓度,和/或根据电位0.06V~0.09V处的峰电流和重组人促红细胞生成素标准曲线计算样品溶液中重组人促红细胞生成素的浓度。
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Cited By (4)
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---|---|---|---|---|
CN110133070A (zh) * | 2019-05-31 | 2019-08-16 | 西北农林科技大学 | 基于氢氧化钠的苯二酚电化学传感器的制备方法及检测方法 |
US10483532B2 (en) | 2012-08-07 | 2019-11-19 | Cornell University | Binder-free and carbon-free nanoparticle containing component, methods and applications |
CN111060700A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-04-24 | 湖南农业大学 | 一种植物生长素受体tir1修饰的生物传感器及其制备方法与应用 |
CN115128142A (zh) * | 2022-06-09 | 2022-09-30 | 河南师范大学 | 一种基于红细胞生物传感器的制备方法与应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1553186A (zh) * | 2003-06-02 | 2004-12-08 | 中国医学科学院药物研究所 | 一种兴奋剂快速检测生物芯片及其检测方法 |
CN102854231A (zh) * | 2012-09-07 | 2013-01-02 | 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 | 促红细胞生成素受体修饰电极及其制备方法和应用 |
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Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1553186A (zh) * | 2003-06-02 | 2004-12-08 | 中国医学科学院药物研究所 | 一种兴奋剂快速检测生物芯片及其检测方法 |
CN102854231A (zh) * | 2012-09-07 | 2013-01-02 | 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 | 促红细胞生成素受体修饰电极及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
王文珺等: ""基因兴奋剂检测的现状与展望"", 《色谱》 * |
邢延一等: ""人体尿液中新型促红细胞生成素受体激动剂的检测"", 《药学学报》 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10483532B2 (en) | 2012-08-07 | 2019-11-19 | Cornell University | Binder-free and carbon-free nanoparticle containing component, methods and applications |
CN110133070A (zh) * | 2019-05-31 | 2019-08-16 | 西北农林科技大学 | 基于氢氧化钠的苯二酚电化学传感器的制备方法及检测方法 |
CN111060700A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-04-24 | 湖南农业大学 | 一种植物生长素受体tir1修饰的生物传感器及其制备方法与应用 |
CN115128142A (zh) * | 2022-06-09 | 2022-09-30 | 河南师范大学 | 一种基于红细胞生物传感器的制备方法与应用 |
CN115128142B (zh) * | 2022-06-09 | 2023-06-20 | 河南师范大学 | 一种基于红细胞生物传感器的制备方法与应用 |
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