CN114858878B - 基于共振能量转移的电化学发光法检测四环素的传感器及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供基于共振能量转移的电化学发光法检测四环素的传感器及其制备方法和应用，包括作为能量共振转移中供体NH2‑SnS2QDs‑Ti3C2，作为能量共振转移中的受体的NH2‑WO3‑x，供体材料和受体材料之间通过两条互补DNA链连接，其中一条DNA链为四环素的适配体，连接在供体材料，修饰在玻碳电极上，另一条互补链连接在受体材料上，两条DNA链通过碱基互补配连接在一起；NH2‑SnS2QDs/Ti3C2复合材料是由SnS2QDs固定Ti3C2而得。本发明的基于共振能量转移的电化学发光传感器具有较高检测灵敏度，制备方法简单，在检测四环素的应用中，具有成本低、灵敏度高、特异性强的优点。
Description
技术领域
本发明属于电化学发光分析检测技术领域，涉及一种基于共振能量转移的电化学发光传感器及其制备方法和应用，具体涉及一种将NH2-SnS2 QDs-Ti3C2作为基底材料，具有特异性识别作用的适配体(apt)为识别元件，共同修饰在玻碳电极(GCE)上，然后以NH2-WO3-x/cDNA/apt/NH2-SnS2 QDs-Ti3C2/GCE为工作电极，定量检测鱼塘水中的四环素的电化学发光分析方法。
背景技术
抗生素(antibiotic)是从微生物或高等动植物体内提取的一类能够干扰其他生物细胞生长发育等正常生命活动的化学物质。目前抗生素已被广泛应用于临床、农业、养殖等行业。作为广谱抗菌药物，抗生素在治疗和预防疾病、促进动物生长等方面起着非常重要的作用，极大的促进了规模化养殖，提高了畜牧业、养殖业的经济效益。但是随着抗生素使用量的增加，它成为一种新型污染物存在于土壤、水体和食品中，对生物环境已经造成了潜在的风险，还能经过食物链传递对人类健康形成危害。
其中，四环素是四环素类广谱抗生素中的代表性抗生素，对革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物具有广泛的抗菌活性，并被广泛用于人类和兽药。此外，四环素是农业部门中促进牲畜生长的常见饲料添加剂。然而，四环素的滥用导致其在人体内积累，可能增加某些严重的风险，包括微生物菌株耐药、某些过敏个体的过敏或毒性反应、抑制骨生长等。欧盟已经规定了鸡蛋(小于440nM)、牛奶或肌肉组织(小于220nM)和蜂蜜(小于22nM)等中TCN的最大允许水平。因而发展快速简单、灵敏度好、选择性好的四环素检测方法对保障生态环境安全，维护人类健康具有重大意义。
目前，已经报导的测定四环素的方法主要有：微生物法，高效液相色谱法(HPLC)，液相色谱/质谱法(LC-MS)，薄层色谱法(TLC)，酶联免疫吸附法(ELISA)，毛细管电泳法(CE)，荧光光谱法(FL)和化学发光法(CL)等。然而这些传统的检测方法操作繁琐，仪器价格昂贵，需要耗费大量的劳动力和时间。与传统的检测方法相比，具有灵敏度高、反应可控性强、仪器设备简单等优点。共振能量转移是一种新兴的分子光谱分析方法，具体是指电子激发能在适当的能量供体和能量受体对之间的传递。而电致化学发光-共振能量转移(ECL-RET)结合了两者的优点，是一个很具有发展潜力的新领域。它既不需要激发光源，背景噪音较小，也避免了散射光的影响，已广泛地应用于生物传感器的构建。如何制备得到对四环素检测灵敏度高的生物传感器是本发明所要解决的技术问题。
本发明通过将NH2-SnS2 QDs-Ti3C2作为能量共振转移中的供体，NH2-WO3-x作为能量共振转移中的受体。将供体与受体之间通过两条DNA链连接(apt、cDNA)，共同修饰在玻碳电极(GCE)上，然后以NH2-WO3-x/cDNA/apt/SnS2QDs-Ti3C2/GCE为工作电极，定量检测河水中的四环素的电化学发光分析方法。由于SnS2 QDs与Ti3C2通过静电作用紧密结合，所以NH2-SnS2QDs-Ti3C2/GCE修饰电极的发光强度不但高且稳定，基于NH2-SnS2 QDs-Ti3C2与NH2-WO3-x之间的电化学发光共振能量转移，使得电化学发光强度降低，适配体与四环素的特异性结合后，抑制了共振能量的转移，从而使光强恢复，并且光强与四环素的浓度具有线性关系。本发明不仅具有电化学发光分析的灵敏度高、特异性强、线性范围宽和仪器简单等优点，同时对于河水中的四环素的特异性检测具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的在于针对四环素检测现有技术的不足，提供一种基于共振能量转移的电化学发光传感器及其制备方法和应用。本发明基于共振能量转移的电化学发光传感器是将NH2-SnS2 QDs-Ti3C2作为能量共振转移中的供体，NH2-WO3-x作为能量共振转移中的受体。
上述基于共振能量转移的电化学发光传感器的制备方法，包括如下步骤：
(1)NH2-SnS2 QDs-Ti3C2复合材料的制备：
将Ti3C2TX纳米片分散在体积比为1:2去离子水和NMP中，超声30min，得到浓度为1mg/mL的均匀悬浮液，随后，在上述溶液中加入SnCl2﹒2H2O，每25～30mL溶液中加入15～20mg，连续搅拌1h，然后加入半胱氨酸(C3H7NO2S)连续搅拌1h，半胱氨酸与SnCl2﹒2H2O的质量比为20～25：15～20，然后，将上述溶液放入反应釜中，并在180℃保持6h，水热反应后，将产物离心，用去离子水和乙醇反复洗涤，真空干燥制得黑色粉末，即SnS2 QDs/Ti3C2复合材料，最后，将其添加至乙醇中，超声分散30min，加入质量浓度4.5％(w/v)的APTMS(3-氨丙基三甲氧基硅烷)，超声30min后，将混合物在65℃下搅拌12h，产物离心，用去离子水和乙醇反复洗涤，真空干燥制得黑色粉末，即NH2-SnS2QDs-Ti3C2复合材料，并将NH2-SnS2 QDs-Ti3C2复合材料分散在DMF中以备使用；
(2)NH2-WO3-x/cDNA胶体溶液的制备：
将cDNA的Tris-HCl溶液(pH＝7.4)加入含有NH2-WO3-x的离心管中，得到浓度为10mg/mL的悬浮液，震荡反应16h后，以10000rpm的转速离心10min，取沉淀物溶于一定量的Tris-HCl溶液(pH＝7.4)中，将得到的胶体溶液超声处理10min，并在室温下震荡1h，得到NH2-WO3-x/cDNA，最后在4℃下储存，所述cDNA为用于连接受体的DNA链；
(3)基于共振能量转移的电化学发光传感器的制备：
将含有NHS和EDC的PBS缓冲液涂滴在干净的裸玻碳电极上，获得活化的玻碳电极，随后，将步骤(1)制得的NH2-SnS2 QD-Ti3C2复合材料的DMF分散液滴加在活化的玻碳电极上，得到NH2-SnS2 QDs-Ti3C2/GCE修饰电极；然后，依次滴涂含有适配体(apt)的Tris-HCl溶液和NH2-WO3-x/cDNA溶液，得到所述基于共振能量转移的电化学发光传感器NH2-WO3-x/cDNA/apt/NH2-SnS2QDs-Ti3C2/GCE；所述适配体为用于连接供体的DNA链。
进一步的，步骤(3)NH2-SnS2 QDs-Ti3C2分散液浓度为2.0mg/mL；适配体的浓度为2.0μmol/L，NH2-WO3-x/cDNA胶体溶液的浓度为2μmol/L。三种溶液等体积比混合。
作为优选：步骤(3)中NH2-SnS2 QDs-Ti3C2的涂滴量为6.0μL，浓度为2.0mg/mL；适配体的涂滴量为6.0μL浓度为2.0μmol/L，NH2-WO3-x/cDNA胶体溶液的涂滴量为6.0μL，浓度为2μmol/L。
上述基于共振能量转移的电化学发光传感器在电化学发光方法检测四环素中的应用，所述四环素适配体核苷酸序列如下所示：
适配体:5'-COOH CGT ACG GAA TTC GCT AGC CCC CCG GCA GGC CAC GGC TTGGGT TGG TCC CAC TGC GCG TGGATC CGA GCT CCA CGT G-3'cDNA：5'-COOH CAA CGTGCTAGC GAA’-3'。
进一步的，具体检测方法如下：
步骤1，配制一系列不同浓度的四环素标准溶液，浓度范围为1.0×10-14mol/L～1.0×10-5mol/L；
步骤2，将所述基于共振能量转移的电化学发光传感器作为工作电极，铂电极作为辅助电极，Ag/AgCl作为参比电极，组成三电极体系，将三电极体系置于步骤1制得的含一系列不同浓度四环素标准溶液中浸泡一定时间，在-2.0～0V的电化学窗口范围内，光电倍增管高压800V，扫速0.1V/s，进行循环伏安扫描，记录电位-发光强度曲线，建立加入四环素前后的发光强度差值与四环素浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程；
步骤3，样品检测，按照上述步骤2进行测试并获得发光强度，所得发光强度用步骤2中所得的线性回归方程进行计算，得出样品中四环素的浓度。
作为优选，步骤1中所述基于共振能量转移的电化学发光传感器浸泡时间为30min。
本发明的显著优点是开发了一种检测四环素的电化学发光传感器及其制备方法，与普通的电化学发光传感器相比，具有以下两方面的显著优点：SnS2 QDs作为共反应促进剂来提升了Ti3C2的光强；适配体的加入使得该传感器可以特异性检测四环素，且该供体-受体的制备更有利于四环素检测灵敏度的提高；共振能量转移系统的引入使得该传感器的灵敏度更高、特异性更强，且最低检测限为6.2×10-15mol/L。
附图说明
图1是该发明中的传感器的制备以及对四环素的检测的简要流程图。
图2是不同浓度四环素的ECL-时间图。
其中四环素的浓度按曲线峰值高低从上到下依次为：1.0×10-5mol/L(a)、1.0×10-6mol/L(b)、1.0×10-7mol/L(c)、1.0×10-8mol/L(d)、1.0×10-9mol/L(e)、1.0×10-10mol/L(f)、1.0×10-11mol/L(g)、和1.0×10-12mol/L(h)、1.0×10-13mol/L(i)、1.0×10-14mol/L(j)。
图3是加入四环素前后发光强度的差值和四环素浓度对数的标准曲线。
具体实施方式
本发明下面结合实施例作进一步详述：
实施例1：NH2-WO3-x/cDNA/apt/NH2-SnS2 QDs-Ti3C2/GCE的制备：
(1)NH2-SnS2 QDs-Ti3C2复合材料的制备：
将Ti3C2TX纳米片分散在体积比为1:2去离子水和NMP中，超声30min，得到浓度为1mg/mL的均匀悬浮液，随后，取25～30mL上述溶液加入15～20mg SnCl22H2O，连续搅拌1h，然后加入20～25mg的半胱氨酸(C3H7NO2S)连续搅拌1h，然后，将上述溶液放入100mL反应釜中，并在180℃保持6h，水热反应后，将产物离心，用去离子水和乙醇反复洗涤，真空干燥制得黑色粉末，即SnS2 QDs/Ti3C2复合材料，最后，将其添加至乙醇中，超声分散30min，加入1～2mL质量浓度为4.5％w/v的APTMS，超声30min后，将混合物在65℃下搅拌12h，产物离心，用去离子水和乙醇反复洗涤，真空干燥制得黑色粉末，即NH2-SnS2 QDs-Ti3C2复合材料，并将NH2-SnS2 QDs-Ti3C2复合材料分散在DMF中以备使用；
(2)NH2-WO3-x的制备：
首先，将0.5mM Na2WO4·2H2O、0.75mM CA、0.5mM葡萄糖与一定量超纯水混合，在室温下搅拌得到透明溶液。加入6M HCl后，将混合物持续搅拌30分钟。最后，将混合溶液倒入25mL内衬特氟隆的高压釜中，然后在120℃的温度下加热24h。自然冷却至室温后，过滤上清液，收集沉淀。收集的沉淀分别用乙醇和水洗涤至少4次。然后，收集所得沉淀物并在60℃的烘箱中干燥。
(3)NH2-WO3-x/cDNA的制备：
将cDNA的Tris-HCl溶液(pH＝7.4)加入含有NH2-WO3-x的离心管中，得到浓度为10mg/mL的悬浮液，震荡反应16h后，以10000rpm的转速离心10min，取沉淀溶于一定量的Tris-HCl溶液(pH＝7.4)中，将得到的胶体溶液超声处理10min，并在室温下震荡1h，得到NH2-WO3-x/cDNA，最后在4℃下储存，所述cDNA为用于连接受体的DNA链；
(4)基于共振能量转移的电化学发光传感器NH2-WO3-x/cDNA/apt/NH2-SnS2QDs-Ti3C2/GCE的制备：
将玻碳电极抛光，依次用硝酸和无水乙醇、去离子水分别超声，自然晾干待用，在室温条件下，将6μL含有0.005MNHS和0.01M EDC的0.01M PBS缓冲液(pH 7.4)涂滴在干净的裸玻碳电极上1h，目的是激活电极。随后，滴加6μL 2mg/mLNH2-SnS2 QDs-Ti3C2 DMF溶液于GCE上，得到NH2-SnS2 QDs-Ti3C2/GCE修饰电极。然后，再依次滴加6μL apt的Tris-HCl溶液(2μM)和6μL 2mg/mL的NH2-WO3-x/cDNA胶体溶液，得到NH2-WO3-x/cDNA/apt/NH2-SnS2QDs-Ti3C2/GCE修饰电极。最后，将NH2-WO3-x-cDNA/apt/NH2-SnS2 QDs-Ti3C2/GCE修饰电极在4℃的冰箱中放置6h，即得到基于共振能量转移的电化学发光传感器。
上述传感器中，适配体和cDNA序列如下所示：(订购于生工生物工程(上海)股份有限公司)
适配体:5'-COOH CGT ACG GAA TTC GCT AGC CCC CCG GCA GGC CAC GGC TTGGGT TGG TCC CAC TGC GCG TGGATC CGA GCT CCA CGT G-3'cDNA：5'-COOH CAA CGTGCTAGC GAA’-3'。
(5)标准曲线的绘制
配制一系列不同浓度的四环素标准溶液，将基于共振能量转移的电化学发光传感器NH2-WO3-x/cDNA/apt/NH2-SnS2 QDs-Ti3C2/GCE作为工作电极，铂电极作为辅助电极，Ag/AgCl作为参比电极，组成三电极体系，将三电极体系置于上述含一系列不同浓度四环素标准溶液中浸泡30min，并以含有0.1mol/L的K2S2O8的pH＝7.4的0.1mol/LPBS缓冲液作为空白溶液检测发光强度。
将三电极体系置于一系列四环素浓度(1.0×10-14mol/L、1.0×10-13mol/L、1.0×10-12mol/L、1.0×10-11mol/L、1.0×10-10mol/L、1.0×10-9mol/L、1.0×10-8mol/L、1.0×10- 7mol/L、1.0×10-6mol/L和1.0×10-5mol/L)的溶液中，在-2.0～0V的电化学窗口范围内，光电倍增管高压800V，扫速0.1V/s，记录时间-发光强度曲线(E-ECL)，建立加入四环素前后的发光强度差值与四环素浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程为：△IECL＝15206.60+1016.92LogC(mol/L)，相关系数(R)为0.9986。线性回归方程的检测范围为1.0×10-14～1.0×10-5mol/L，最低检测限为6.2×10-15mol/L。
(6)样品的检测
取一定量过滤除杂后的河水加入到含有0.1mol/L的K2S2O8的pH 7.4的0.1mol/LPBS的缓冲溶液中，用于电化学发光检测，按上述步骤(5)所对应的线性回归方程计算出待检测样品中四环素浓度，其结果列于表1中。
对比例1
(1)NH2-SnS2 QDs-Ti3C2/apt/GCE修饰电极的制备
将玻碳电极抛光，依次用硝酸和无水乙醇、去离子水分别超声，自然晾干待用。用微量进样器移取6.0μL 2.0mg/mLNH2-SnS2 QDs-Ti3C2复合材料的DMF溶液(NH2-SnS2 QDs-Ti3C2复合材料制备方法如实施例1)滴于洁净的玻碳电极表面，室温干燥后，再滴加6μL apt的Tris-HCl溶液(2μM)，得到NH2-SnS2QDs-Ti3C2/apt/GCE修饰电极，作为电化学发光测试的工作电极。
(2)标准曲线的绘制
以NH2-SnS2 QDs-Ti3C2/apt/GCE为工作电极，铂电极作为辅助电极，Ag/AgCl作为参比电极，组成三电极体系，用于一系列不同浓度四环素标准溶液的检测。检测方法同实施例1。
其结果列于表1中。
对比例2：
(1)NH2-WO3-x/apt/GCE修饰电极的制备
将玻碳电极抛光，依次用硝酸和无水乙醇、去离子水分别超声，自然晾干待用。用微量进样器移取6.0μL 2mg/mL NH2-WO3-x水溶液(NH2-WO3-x水溶液的制备方法如实施例1)滴于洁净的玻碳电极表面，室温干燥后，再滴加6μL apt的Tris-HCl溶液，得到NH2-WO3-x/apt/GCE修饰电极，作为电化学发光测试的工作电极。
(2)标准曲线的绘制
以NH2-WO3-x/apt/GCE修饰电极为工作电极，铂电极作为辅助电极，Ag/AgCl作为参比电极，组成三电极体系，用于一系列不同浓度四环素标准溶液的检测。检测方法同实施例1。
其结果列于表1中。
对比例3
对比例3与实施例1相比，区别在于：SnS2 QDs作为供体，制备得到NH2-WO3-x/cDNA/apt/SnS2 QDs/GCE传感器作为工作电极，检测方法同实施例1。检测结果表明，对比例3制备的传感器用于四环素检测时，光强很低，难以实现四环素的检测。
对比例4
对比例4与实施例1相比，区别在于：以Ti3C2作为供体，制备得NH2-WO3-x/cDNA/apt/NH2-Ti3C2/GCE传感器作为工作电极，检测方法同实施例1。检测结果表明，对比例4制备的传感器用于四环素检测时，难以发生共振转移，很难检测出四环素。
表1鱼塘水中四环素的测定结果
备注：a为三次测定的平均值。
如表1所示，样品平行检测3次，相对标准偏差小于5％，加标回收率范围为96％～102％。以上结果表明，不用NH2-WO3-x/cDNA/apt/NH2-SnS2 QDs-Ti3C2/GCE修饰而单独用WO3-x或是SnS2 QDs-Ti3C2修饰的玻碳电极无法检测四环素，本发明用于检测河水中的四环素是可行的。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种基于共振能量转移的电化学发光法检测四环素的传感器，其特征在于：NH2-SnS2QDs-Ti3C2复合材料作为能量共振转移中的供体，NH2-WO3-x材料作为能量共振转移中的受体，所述NH2-SnS2 QDs-Ti3C2复合材料和NH2-WO3-x之间通过两条DNA链连接并共同修饰在玻碳电极上，其中一条DNA链为适配体，另一条DNA链连接受体，得到NH2-WO3-x/cDNA/apt/ NH2-SnS2 QDs-Ti3C2 /GCE传感器。
2.如权利要求1所述的基于共振能量转移的电化学发光法检测四环素的传感器，其特征在于：
适配体核苷酸序列: 5'-COOH CGT ACG GAA TTC GCT AGC CCC CCG GCA GGC CAC GGCTTG GGT TGG TCC CAC TGC GCG TGG ATC CGA GCT CCA CGT G-3'；
cDNA序列：5'-COOH CAA CGT GCT AGC GAA’ -3'。
3.如权利要求1所述的基于共振能量转移的电化学发光法检测四环素的传感器的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）NH2-SnS2 QDs-Ti3C2复合材料的制备：
将Ti3C2TX 纳米片分散在去离子水和NMP混合溶液中，超声后得到均匀悬浮液，随后，在上述溶液中加入SnCl2﹒2H2O，连续搅拌，然后加入半胱氨酸，连续搅拌后，放入反应釜中，并在180 ℃保持6 h，水热反应后，将产物离心，洗涤，真空干燥制得黑色粉末，即SnS2 QDs/Ti3C2复合材料，最后，将其添加至乙醇中，超声分散后加入APTMS，将混合物在65 ℃下搅拌12 h，产物离心，洗涤，真空干燥制得黑色粉末，即NH2-SnS2 QDs-Ti3C2复合材料，并将NH2-SnS2 QDs-Ti3C2复合材料分散在DMF中以备使用；
（2）NH2-WO3-x /cDNA胶体溶液的制备：
将含有cDNA的Tris-HCl溶液加入含有NH2-WO3-x的离心管中，震荡反应16 h后，离心，取沉淀物溶于Tris-HCl溶液中，得到的胶体溶液并超声处理，在室温下震荡，得到NH2-WO3-x/cDNA胶体溶液，最后储存；
（3）基于共振能量转移的电化学发光传感器的制备：
将含有NHS和EDC的PBS缓冲液涂滴在干净的裸玻碳电极上，获得活化的玻碳电极，随后，将步骤（1）制得的所述NH2-SnS2 QD-Ti3C2复合材料的DMF分散液滴加在活化的玻碳电极上，得到NH2-SnS2 QDs-Ti3C2/GCE修饰电极；然后，依次滴涂含有适配体（apt）的Tris-HCl溶液和NH2-WO3-x/cDNA溶液，得到所述基于共振能量转移的电化学发光传感器NH2-WO3-x/cDNA/apt/NH2-SnS2 QDs-Ti3C2 /GCE。
4.如权利要求3所述的基于共振能量转移的电化学发光法检测四环素的传感器的制备方法，其特征在于：步骤（3）NH2-SnS2 QDs-Ti3C2分散液浓度为2.0 mg/mL；步骤（3）的含有适配体（apt）的Tris-HCl溶液的浓度为2.0 μmol/L，步骤（2）NH2-WO3-x/cDNA胶体溶液的浓度为2 μmol/L。
5.如权利要求1所述的基于共振能量转移的传感器在电化学发光法检测四环素中的应用，其特征在于：所述检测方法具体步骤如下：
（1）含过硫酸钾(K2S2O8)的磷酸盐(PBS)缓冲溶液的配制；
（2）含不同浓度四环素标准溶液的配制；
准确称取一定量的四环素，用去离子水配制1.0×10-5 mol/L溶液，得到一系列不同浓度的四环素标准溶液，浓度范围为1.0×10-14 mol/L~1.0×10-5 mol/L；
（3）标准曲线的绘制
将修饰电极NH2-WO3-x/cDNA/apt/ NH2-SnS2 QDs-Ti3C2 /GCE作为工作电极，铂电极作为辅助电极，Ag/AgCl作为参比电极，组成三电极体系，将三电极体系置于上述含一系列不同浓度四环素溶液中浸泡一定时间，在-2.0~0 V的电化学窗口范围内，光电倍增管高压800V，扫速0.1 V，记录时间-发光强度曲线，建立加入四环素前后的发光强度差值与四环素浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程；
（4）实际样品检测
实际样品先经过前处理，按照与上述步骤（3）同样的电化学发光测试条件进行测试，记录发光强度，用步骤（3）所得标准曲线所对应的线性回归方程计算出待测样品中四环素的浓度。
6.根据权利要求5所述的基于共振能量转移的传感器在电化学发光法检测四环素中的应用，其特征在于：步骤（3）所述的电极在四环素溶液中浸泡时间为30 min。
7.根据权利要求5所述的基于共振能量转移的传感器在电化学发光法检测四环素中的应用，其特征在于：最低检测限为6.2×10-15 mol/L。
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