CN101625334B - 一种基于溶胶凝胶层的酶修饰电极及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于溶胶凝胶层的酶修饰电极及其制备方法。其通过SiO2溶胶凝胶前驱体溶液的制备；碳纳米管分散液的制备；电极的处理；溶胶-凝胶/多壁碳纳米管膜的形成；酶的吸附；修饰电极后处理步骤，得到酶修饰电极。本发明通过溶胶凝胶层实现了辣根过氧化物酶的固定化，并在溶胶凝胶层中加入多壁碳纳米管，实现了酶与电极之间的直接电子传递，成功构建了一种高灵敏度的第三代生物传感器。
Description
技术领域
本发明涉及一种工艺简单，灵敏度高，生物相容性好的酶修饰电极及其制备方法。具体地说，本发明提供了无醇环境下，在硅酸盐溶胶凝胶层上将高活性酶固定在电极表面的一种方法。
背景技术
电化学生物传感器是指由生物体成分(酶、抗原、抗体、激素等)或生物体本身(细胞、细胞器、组织等)作为敏感元件，电极(固体电极、离子选择性电极、气敏电极等)作为转换元件，以电势或电流为特征检测信号的传感器。由于它响应快，灵敏度高，制作简单而被广泛研究和应用。利用酶在电极上的直接氧化或还原而构造成的生物传感器称为第三代生物传感器。在这类生物传感器中，电子传输与氧和其它电子受体无关，无需任何媒介体的加入，它克服了使用介体的第二代生物传感器存在的测量电位比较正、电活性物质干扰多、电极制作复杂、介体污染等缺点。
溶胶凝胶法是将金属醇盐等原料配制成均质溶液，在饱和条件下经水解缩聚等化学反应，生成物聚集成溶胶，再经蒸发干燥转变为凝胶。溶胶-凝胶由于其载体为无机多孔材料，具有物理刚性、化学惰性、溶剂中可以忽略的溶胀性等特性，在生物传感器的研制中备受重视。
碳纳米管可以实现直接电子传递，一方面是因为碳纳米管的表面缺陷导致了较高的表面活性，有利于酶和碳管之间的电子传递；另一方面，碳纳米管独特的纳米结构起到了“分子导线”的作用，将电子传递到酶的氧化还原中心。如它可实现对细胞色素C、天青蛋白、辣根过氧化物酶的直接电化学。近年来，基于溶胶凝胶体系或采用碳纳米管构建生物传感器的研究方法越来越被科研工作者重视。Tripathi等(Sensors and Aetuators B.2001，72，224-232.)将HRP夹心固定在溶胶-凝胶玻璃电极(ormosil)中，实现HRP的直接电子转移；汪尔康等(Electrochemistry Communications.2004，6，49-54.)用自组装方法在金电极上把金纳米固定在三维硅凝胶中，吸附细胞色素C成功制备了第三代生物传感器；赵广超等(Analytical Biochemist.2004，325285-292.)将十六烷基三甲基溴化铵分散的碳纳米管修饰于电极上，然后吸附Mb，实现了Mb的直接电化学；Alain Walcarius等(Langmuir 2006，228366-8373)采用正硅酸乙酯、MPTMS、乙醇、硝酸钠、盐酸制备了多孔三维溶胶凝胶层。但是，迄今为止，仍未有文献报道在无醇环境下使正硅酸乙酯水解，掺杂碳纳米管后通过电沉积方法形成三维多孔二氧化硅溶胶凝胶层，然后再固定辣根过氧化物酶制成酶修饰电极的方法。
发明内容
基于上述，本发明的目的在于提供一种基于溶胶凝胶层的酶修饰电极。
本发明的另一目的在于提供一种基于溶胶凝胶层的酶修饰电极的制备方法。利用这种方法制得的酶修饰电极不仅实现了酶与电极之间的直接电子转移，而且采用无醇溶胶凝胶前躯体溶液，使修饰电极具有更好的生物相容性。
本发明的技术方案是：
一种基于溶胶凝胶层的酶修饰电极，电极上覆盖有SiO2溶胶凝胶(sol-gel)层，层中同定有多壁碳纳米管(MWNT)，将溶胶-凝胶/多壁碳纳米管(sol-gel/MWNT)电极在辣根过氧化物酶的pH＝7.0的磷酸缓冲溶液中浸泡48小时后取出，用pH＝7.0的磷酸缓冲溶液冲洗干净，即得到酶修饰电极。
上述SiO2溶胶凝胶层的厚度为40～140nm。
一种基于溶胶凝胶层的酶修饰电极的制备方法，具体步骤为：
a.制备SiO2溶胶凝胶前驱体溶液：取pH为5.8～7.0的磷酸缓冲溶液(PBS)50mL，向其中加入200～300μL正硅酸乙酯(TEOS)，在搅拌状态下加入1.5～2.0mL、浓度为0.2mol/L的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，将配制好的溶液常温搅拌，使正硅酸乙酯充分水解；
b.碳纳米管分散液的制备：将多壁碳纳米管研细，酸化，用二次蒸馏水洗涤至中性，烘干，称取处理后的多壁碳纳米管15mg，超声分散在5mL 0.1％的聚乙烯基吡咯烷酮溶液(PVP)中，配制成3mg/mL的碳纳米管分散液；
c.电极的处理：将金电极、铂电极或碳电极先用0.3μm的三氧化二铝悬浊液在打磨布上处理，再用0.05μm的三氧化二铝悬浊液在打磨布上抛光成镜面，最后用乙醇、二次水超声清洗；
d.sol-gel/MWNT膜的形成：取5mL SiO2溶胶凝胶前驱体溶液，向其中加入100～500μL碳纳米管分散液，超声分散均匀后，采用金电极、铂电极或碳电极作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝作为对电极，将工作电极、参比电极和对电极插入溶液中形成三电极系统，采用恒电位技术在一定的阴极电位下沉积30s～100s；
e.酶的吸附：沉积完毕后，迅速将工作电极从溶液中取出，用大量二次水冲洗，晾干后将其浸泡在辣根过氧化物酶的pH＝7.0的磷酸缓冲溶液中，在4℃的冰箱中放置48小时；
f.修饰电极后处理：将吸附有辣根过氧化物酶的电极从酶溶液中取出，用pH＝7.0的磷酸缓冲溶液冲洗干净后即得到酶修饰电极。将酶修饰电极放置在4℃的冰箱中待用。
本发明的优点：
1、本发明在SiO2溶胶凝胶中加入碳纳米管，碳纳米管是晶形碳的一种同素异形体，因其独特的原子结构而表现为金属性或半导体性。这种独特的电子特性使得它能够促进实现酶与电极之间的直接电子转移，成功构建了第三代生物传感器。
2、本发明采用无醇溶胶凝胶前躯体溶液，使修饰电极具有更好的生物相容性。
3、本发明采用的酶固定方法将足够量的高活性酶尽可能牢固地固定在电极表面，制备的酶修饰电极灵敏度高，响应时间短，使用寿命长。本发明制备的辣根过氧化物酶修饰电极对过氧化氢的检测范围为1×10-9mol/L～1×10-3mol/L。
本发明的有益效果：
本发明采用的酶固定方法是在无醇条件下，通过硅酸醇盐的水解和缩聚、酶的吸附完成的，本方法提高了修饰电极对酶的相容性，有效保持了酶的活性。
附图说明
图1为本发明不同沉积时间的修饰电极在5mM的K3Fe(CN)6(含0.1MKCl)溶液中的CV图，其中，a.裸金电极，b.30s，c.50s，d.70s，e.80s，f.100s。
图2为本发明不同沉积时间的修饰电极在5mM的K3Fe(CN)6(含0.1MKCl)溶液中的交流阻抗图，其中，a.裸金电极，b.30s，c.50s，d.70s，e.80s，f.100s。
图3为本发明酶修饰电极在pH＝7.0的PBS溶液中对不同浓度的H2O2溶液的检测。其中，a.PBS溶液，b.PBS+1×10-9mol/L H2O2，c.PBS+1×10-7mol/L H2O2，d.PBS+1×10-5mol/L H2O2，e.PBS+1×10-4mol/L H2O2，f.PBS+1×10-3mol/L H2O2。
图4为本发明不同工作电极在1mM的K3Fe(CN)6(含0.1M KCl)溶液中的CV图。其中，a.裸金电极，b.溶胶凝胶层修饰的金电极，c.掺杂多壁碳纳米管的溶胶凝胶层修饰的金电极，d.固定有辣根过氧化物酶的溶胶凝胶/碳纳米管修饰的金电极。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明的内容，下面结合附图和具体的实施例对本发明再作进一步的说明：
实验过程中使用的水均为二次蒸馏水，实验所用的试剂均为分析纯。实验均在室温下进行。
(1)、本实施例所使用的仪器与试剂
多通道电化学工作站(VMP2，美国Princeton仪器公司)用于循环伏安实验和交流阻抗实验；CHI832电化学分析仪(上海辰华仪器公司)用于差示脉冲实验；饱和甘汞参比电极(上海日岛科学仪器有限公司)；石英管加热式自动双重纯水蒸馏器(1810B，上海亚太技术玻璃公司)用于制备二次蒸馏水；电子天平(北京赛多利斯仪器有限公司)用于称量药品；ML-902磁力搅拌器(上海浦江分析仪器厂)；超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；三氧化二铝打磨粉(0.30μm，0.05μm，上海辰华仪器试剂公司)用于处理金电极；正硅酸乙酯、聚乙烯基吡咯烷酮(上海试剂一厂)，十六烷基三甲基溴化铵、辣根过氧化物酶(上海伯奥生物科技有限公司)，磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钾、过氧化氢(30％)(西安化学试剂厂)，多壁碳纳米管(深圳纳米港有限公司)；高纯氮气(纯度为99.999％(O2≤0.001％))；ZSimpWin(Version 3.00，EChem Software，eDAQ Pty Ltd)。
(2)、酶修饰电极的制备
a.制备SiO2溶胶凝胶前驱体溶液：取pH＝5.8的磷酸缓冲溶液(PBS)50mL，向其中加入200μL正硅酸乙酯(TEOS)，在搅拌状态下加入1.5mL浓度为0.2mol/L的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，将配制好的溶液常温搅拌，使TEOS充分水解；
b.碳纳米管分散液的制备：将多壁碳纳米管研细，酸化，用二次蒸馏水洗涤至中性，烘干，称取处理后的多壁碳纳米管15mg，超声分散在5mL 0.1％的聚乙烯基吡咯烷酮溶液中，配制成3mg/mL的碳纳米管分散液；
c.电极的处理：将金电极先用0.3μm的三氧化二铝悬浊液在打磨布上处理，再用0.05μm的三氧化二铝悬浊液在打磨布上抛光成镜面，最后用乙醇、二次水超声清洗；
d.sol-gel/MWNT膜的形成：取5mL SiO2溶胶凝胶前驱体溶液，向其中加入300μL碳纳米管分散液，超声分散均匀后，采用金电极作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝作为对电极，将工作电极、参比电极和对电极插入溶液中形成三电极系统，采用恒电位技术在-1.3V阴极电位下沉积30s～100s；
e.酶的吸附：沉积完毕后，迅速将工作电极从溶液中取出，用大量二次水冲洗，晾干后将其浸泡在辣根过氧化物酶的pH＝7.0的磷酸缓冲溶液中，在4℃的冰箱中放置48小时；
f.修饰电极后处理：将吸附有辣根过氧化物酶的电极从酶溶液中取出，用pH＝7.0的磷酸缓冲溶液冲洗干净后即得到酶修饰电极。将酶修饰电极放置在4℃的冰箱中待用。
(3)酶修饰电极的表征及应用
本实施例的图1～图4选择ZSimpWin(Version 3.00，EChem Software，eDAQ Pty Ltd)电化学拟合软件，采用R(Q(RW))电路模型对交流阻抗实验数据进行拟合。采用origin6.0软件作图，绘制循环伏安图、交流阻抗图和差示脉冲图。
在电化学工作站的技术选项中选择循环伏安技术和交流阻抗技术，循环伏安技术的电位窗设置为-0.1V～0.5V，交流阻抗技术的频率范围设置为1kHz～0.1Hz，偏压设置为0.225V。将不同沉积时间的修饰电极在5mM的K3Fe(CN)6(含0.1M KCl)溶液中采用三电极系统扫描循环伏安图(图1)和交流阻抗图(图2)。图1、图2所示，在沉积时间为30s～100s范围内，随着沉积时间的延长，膜的厚度增加。
以电沉积时间为70s的酶修饰电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝为对电极，采用CHI832电化学分析仪，选用差示脉冲伏安技术，设置电位窗为-0.6V～0V，在pH＝7.0的PBS溶液中，对a.PBS溶液，b.PBS+1×10-9mol/L H2O2，c.PBS+1×10-7mol/L H2O2，d.PBS+1×10-5mol/L H2O2，e.PBS+1×10-4mol/L H2O2，f.PBS+1×10-3mol/L H2O2不同浓度的过氧化氢进行检测，整个检测过程在氮气氛中进行(图3)。从图3可以看出：本发明所制备的酶修饰电极对过氧化氢的检测范围是1×10-9mol/L～1×10-3mol/L。酶修饰电极灵敏度高。
分别以裸金电极、溶胶凝胶层修饰的金电极、掺杂多壁碳纳米管的溶胶凝胶层修饰的金电极、固定有辣根过氧化物酶的溶胶凝胶/碳纳米管修饰的金电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝为对电极，在1mM的K3Fe(CN)6(含0.1M KCl)溶液中扫描循环伏安图(图4)。在图4中，酶修饰电极的氧化峰电流较没有吸附酶的修饰电极明显降低。辣根过氧化物酶的活性中心是铁卟啉，结合到电极上时在K3Fe(CN)6溶液中会阻碍Fe3+/Fe2+之间的电子传递，使得氧化峰电流减小，说明辣根过氧化物酶已被成功修饰到电极表面。
文献nature materials/VOL 6/AUGUST 2007提供了在金电极、铂电极和碳电极上采用正硅酸乙酯的乙醇溶液为前驱体，用电沉积法制备溶胶凝胶层修饰电极的方法。文献中指出，金电极的沉积电位是-1.3V，铂电极的沉积电位是-0.9V，碳电极的沉积电位是-2.2V。本发明采用正硅酸乙酯为前驱体，在无醇条件下，以金电极为例成功制备了酶修饰电极。依文献nature materials/VOL 6/AUGUST 2007报道，以铂电极、碳电极为工作电极，采用a～f的步骤，同样可以制备酶修饰电极。
Claims (2)
1.一种基于溶胶凝胶层的酶修饰电极的方法，其步骤为：
a.制备SiO2溶胶凝胶前驱体溶液：取pH为5.8～7.0的磷酸缓冲溶液50mL，向其中加入200～300μL正硅酸乙酯，在搅拌状态下加入1.5～2.0mL、浓度为0.2mol/L的十六烷基三甲基溴化铵，将配制好的溶液常温搅拌，使正硅酸乙酯充分水解；
b.碳纳米管分散液的制备：将多壁碳纳米管研细，酸化，用二次蒸馏水洗涤至中性，烘干，称取处理后的多壁碳纳米管15mg，超声分散在5mL 0.1％的聚乙烯基吡咯烷酮溶液中，配制成3mg/mL的碳纳米管分散液；
c.电极的处理：将金电极、铂电极或碳电极先用0.3μm的三氧化二铝悬浊液在打磨布上处理，再用0.05μm的三氧化二铝悬浊液在打磨布上抛光成镜面，最后用乙醇、二次水超声清洗；
d.溶胶-凝胶/多壁碳纳米管膜的形成：取5mL SiO2溶胶凝胶前驱体溶液，向其中加入100～500μL碳纳米管分散液，超声分散均匀后，采用金电极、或铂电极、或碳电极作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝作为对电极，将工作电极、参比电极和对电极插入溶液中形成三电极系统，采用恒电位技术在一定的阴极电位下沉积30s～100s；
e.酶的吸附：沉积完毕后，迅速将工作电极从溶液中取出，用大量二次水冲洗，晾干后将其浸泡在辣根过氧化物酶的pH＝7.0的磷酸缓冲溶液中，在4℃的冰箱中放置48小时；
f.修饰电极后处理：将吸附有辣根过氧化物酶的电极从酶溶液中取出，用pH＝7.0的磷酸缓冲溶液冲洗干净后即得到酶修饰电极；将酶修饰电极放置在4℃的冰箱中待用。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：上述辣根过氧化物酶溶液的浓度为4mg/mL。
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